JPH02293665A - 腎疾患の検査方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は腎疾患の検査方法に関するものである。

〔従来の技術〕

糸球体腎炎の中にはその発症や進展に補体系が関与して
いるものがあることが多くの研究により明らかになって
いる。また、臨床的にも血清補体価や血中６３、Ｃ４濃
度の測定、蛍光抗体法によるＣ３の検討は診断や経過を
追うための重要な検査法となっている。

〔発明が解決しようとする課題〕

この血清補体価や血中０３、Ｃ４濃度は必ずしも腎局所
での補体活性を反映しているとは限らない。

また腎糸球体へのＣ３の沈着は腎生検時の補体活性を反
映しているのか否かも疑問である。そして腎生検は経過
を追う上で頻回にできる検査法ではない。

一方、尿中補体成分の測定は報告されているが、他の蛋
白と同様に尿蛋白として排泄されているにすぎないとす
る説（κ１ａｊｉａ＋ａｎ．Ａ．．　ｅｔ　ａｌ　Ｎｅ
ｐｈｒｏｎ．１６．３３３−３４３．　１９７６．阿部
理一郎ら、腎と透析、ｌ５；３５９−３６４．　１９８
３）や、腎局所での補体活性化を反映して尿中に排泄さ
れているとする（Ｃｕｍｍｉｎｇ．Ａ．Ｄ，，　ｅｔ　
ａｌ　Ｊ．　ＣＩｉｎ．Ｐａｔｈ．．　２９；６０１−
６０７．１９７６）説などがあり、腎疾患の検査方法と
して確立されるに至っていない。

〔課題を解決するための手段〕

本発明は上記のような問題点を解決して腎疾患を簡単に
検査しうる方法を提供するべくなされたものであり、尿
中補体成分を定量するのではなく補体活性化によって生
じた補体分解産物を酵素免疫測定法によって測定するこ
とによってかかる目的を達成したものである。

補体分解産物としてはＣ３、Ｃ４あるいはＢの分解産物
で、例えばｃ３ａ，　Ｃ３ｂ，　Ｃ３ｃ，　Ｃ３ｄ．．
ｉＣ３ｂ，　Ｃ４ａ，Ｃ４ｂ，　Ｃ４ｃ，　Ｃ４ｄ，　
Ｂａ，　Ｂｂ，これらのいずれかを含む複合体などであ
る。これらの中でＣ３ｂ，　Ｃ３ｃ、Ｃ３ｄ，　ｉＣ３
ｂ，　Ｃ４ｂＳＣ４ｃ，　Ｃ４ｄ．．Ｂｂなどが抗原が
安定で測定が容易なため好ましい。

酵素免疫測定法の種類は問うところではなく、例えば固
相法、二抗体法、ホモジニアス法、サンドインチ法等を
利用できる。酵素免疫測定法に利用される酵素はいかな
るものであってもよ《、例えば、β−Ｄ−ガラクトシダ
ーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、
グルコースオキシダーゼ、α−アミラーゼ等を用いるこ
とができる。抗体はポリクローナル抗体又はモノクロー
ナル抗体を使用できるが分析精度の点でモノクローナル
抗体が好ましい。抗体を結合させる抗体、基質その他の
試薬類、検出方法、操作方法等も公知の酵素免疫測定法
に従えばよい。補体分解産物のうちｉＣ３ｂ，　Ｃ４ｄ
，　Ｂｂ等は市販品（「イムザインｉＣ３ＢＪ、［イム
ザインＣ４ｄＪ、［イムザインＢｂＪ、いずれも富士レ
ビオ■製品）があるのでそれを利用することかできる。

腎疾患の種類は問うところではなく、本発明の方法によ
って腎疾患を広く検出することができる。

腎疾患の例を挙げると急性系球体腎炎、微少変化群、［
ｇＡ腎症、膜性増殖性糸球体腎炎、膜性腎症、メサンギ
ウム増殖性腎炎、巣状糸球体硬化症、ルーブス腎炎、糖
尿病性腎症、紫斑病性腎炎、妊娠中毒症、水腎症、慢性
腎不全、等を挙げることができる。

〔作用〕

補体系カスケードよりＣ４の分解産物であるＣ４ｄは古
典経路の活性化を反映し、Ｂ因子の活性化された形であ
るＢｂは第二経路の活性化を反映し、Ｃ３の分解産物で
あるｉｃ３ｂは両経路の活性化を反映していると思われ
る．そのため補体成分の定量より補体分解産物の定量の
方がより補体活性化を反映していると考えられる。尿中
補体分解産物の値を種々の条件で検討したが、条件によ
る有意な変動は認められなかった。しかし精製したＣ３
を分解産物陽性尿に加え３７゜Ｃ３時間反応させるとｉ
Ｃ３ｂの上昇を認めた。このことより尿中補体分解産物
の値は腎または血液中で補体系が活性化を受けた結果と
して検出されること以外に、腎より排泄された補体成分
が尿路系で分解され補体分解産物として検出される可能
性もありうる。

尿中補体分解産物は補体系の関与が強く示唆される疾患
により多《検出される傾向は認められなかった。統計的
には尿中補体分解産物と尿蛋白、腎機能との間には相関
を認めたが、個々の症例をみると必ずしも尿蛋白が多け
れば検出されるという状態ではなく、他の蛋白と一緒に
尿中に排泄されていることはむしろ否定的であった。尿
中補体分解産物は血中の補体分解産物の値よりも腎組織
の補体沈着とより強い相関が認められ、尿中補体分解産
物の値は腎臓での補体活性を反映している可能性が示唆
された。

〔実施例］ 正常者１０名、腎疾患患者１２８名の尿について測定し
た。腎疾患患者の内訳は急性糸球体腎炎２例、微少変化
群８例、ＩｇＡ腎症１４例、膜性増殖性糸球体腎炎５例
、膜性腎症９例、メザンギウム増殖性腎炎１９例、巣状
糸球体硬化症１例、ルーブス腎炎７例、糖尿病性腎症６
例、紫斑病性腎炎１例、妊娠中毒症８例、水腎症１例、
慢性腎不全１７例、及び尿所見異常を認め腎生検を施行
していない症例３０例である。

ＥＤＴＡ下に随時尿を採取し、遠心分離後上清を７０”
Ｃに保存し、検体とした。

ｉＣ３ｂＳＣ４ｄ，　Ｂｂの測定は各モノクローナル抗
体を利用した市販の酵素免疫測定法による測定試薬キッ
ト　（［イムザインｉｃ３ｂｌ、　「イムザインＣ４ｄ
ｌ、［イムザインＢｂＪ、いずれも富士レビオ■製品）
を用いて行った。すなわちｔｃ３ｂ，　Ｃ４ｄあるいは
Ｂｂのモノクローナル抗体が各ウエル面に固定されたマ
イクロプレートを用い、まず各ウエルに２００〜３００
μｅの洗浄液を加える。室温で１分間放置後洗浄液を吸
引除去する。この洗浄操作を３回繰返す。

ウエル内の残液を吸引紙で完全に除去してから各ウエル
にブランク液、標準液、陽性及び陰性対照液及び検体を
それぞれ１００ＩＩｊづつ別のウエルに入れてｉＣ３ｂ
及びＣ４ｄの場合は室温（１５〜３０゜Ｃ）でそしてＢ
ｂの場合は２〜８゜Ｃで３０分間インキユベートする。

反応液を吸引除去後２００〜３００μｇの洗浄液を加え
室温で１分間放置後洗浄液を吸引除去する操作を５回繰
返す。ウエル内の残液を吸引紙で完全に除去してから５
０μｇのワサビパーオキシダーゼ標識抗体を各ウエルに
入れてｉＣ３ｂ及びＣ４ｄの場合は室温（１５〜３０”
Ｃ）でそしてＢｂの場合は２〜８゜Ｃで３０分間インキ
エベートする。続いて、上記の洗浄操作を繰返した後各
ウエルに１００ｐｇの酵素基質液を加える。室温で３０
分間反応させた後５０μｅの反応停止液を加え、その後
１時間以内に４０５ｎｍにおける吸光度を測定する。こ
のようにして各検体のｉＣ３ｂ，　Ｃ４ｄ及びＢｂを測
定した。

尿中補体分解産物陽性症例については血漿補体分解産物
を同様のＥＬＩＳＡによる方法にて測定した。

その結果、尿中補体分解産物の値は尿の凍結解凍、６時
間までの室温及び４゜Ｃ保存、ｐＨ４〜８による変化を
受けなかった。ＰＢＳ、正常尿、分解産物陽性尿に精製
したＣ３、Ｃ４、Ｂ因子を加えて３７゜Ｃで３時間放置
し、ｉＣ３ｂ，　Ｃ４ｄ，　Ｂｂの変化を調べた結果を
第１図に示す。第１図（イ）はＣ３を（０）はＣ４をそ
して（ハ）はＢ因子について測定した結果をそれぞれ示
しており、各図において実線はＰＢＳを、鎖線は正常尿
を、そして点線は分解産物陽性尿をそれぞれ表わしてい
る。同図に示すように分解産物陽性尿にＣ３を加えた状
態ではｉｃ３ｂは約２μｇ／ｄ上昇した。他の条件では
ｆＣ３ｂＳＣ４ｄ、８ｂは変化しなかった。

次に、正常者、慢性腎不全患者並びに一次性、二次性糸
球体腎炎患者の尿のｉＣ３ｂ，　Ｃ４ｄ及びＢｂを測定
した結果を第２図に示す。同図（イ）はｉｃ３ｂを（［
Ｉ）はＣ４ｂをそして（ハ）はＢｂを測定した結果を示
している。これらの図に示すように、正常者では尿中ｉ
ｃ３ｂ．．Ｃ４ｄ，　Ｂｂは検出されなかった。慢性腎
不全患者、一次性、二次性糸球体腎炎患者で尿中ｉｃ３
ｂ，　Ｃ４ｄ，　Ｂｂが高値を示す症例が認められたが
、症患特異性は認められなかった。

尿中の補体分解産物と尿蛋白（Ｕ−Ｐ）、尿中赤血球（
Ｕ−ＲＢＣ）、血清クレアチニン（Ｃｒ）、糸球体のカ
価（ＧＦＲ）、尿中β２ミクログロプリン（Ｕ−βＺａ
＋）、尿中Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（Ｕ−ＮＡ
Ｇ）、Ｃ３、Ｃ４、血清補体価（ＣＨ５０）との相関を
求めた結果を下表に示す。

Ｕ−Ｐ　　　Ｕ−ＲＢＣ ｉｃ３ｂ　Ｐ＜０．００５　　Ｎ．Ｓ．Ｃ４ｄ　　Ｐ＜
０．００５　　Ｎ．Ｓ．Ｂｂ　　Ｐ＜０．００５　　Ｎ
．Ｓ． Ｃｒ．　　　　ＧＦＲ　　　　Ｕ−βｚｍＰ＜０．０１
　　　Ｎ．Ｓ．　　　Ｐ＜Ｏ．ＯＱ５Ｐ＜０．００５　
　Ｐ＜０．００５　　Ｐ＜０．０（）５Ｎ．Ｓ．　　　
Ｐ＜０．００５　Ｐ＜０．０Ｑ５Ｕ−ＮＡＧ　　Ｃ３．
Ｃ４，ＣＩｌ５０Ｎ．Ｓ．　　　Ｎ．Ｓ． Ｐ＜０．００５　　Ｎ．Ｓ． Ｐ＜Ｑ．ＯＩ　　Ｎ．Ｓ． 表中、Ｐは有意差検定の危険率を表し、Ｎ．Ｓ．は有意
差がないことを表している。上記の結果に示されている
ように、尿中補体分解産物と臨床検査との関係では、尿
中補体分解産物はいずれも尿蛋白、ＧＦＲ、血清タレア
チニン、尿中β２ミクログロプリン、尿中ＮＡＧと相関
し、血清補体価、血中０３、Ｃ４１度、血尿の程度とは
相関を認めなかった。

尿中ｉＣ３ｂとタレアチニンとの関係を第３図（イ）に
そして尿蛋白との関係を同図（［））に示す．尿中ｉｃ
３ｂとクレアチニンとの間には検体数１２４ケで　　＝
０．１８、Ｐ　＜０．０１、そして尿蛋白との間には　
　−０．３２１、Ｐ　＜　０　．００５なる関係が得ら
れ、両者間にはそれぞれ統計的には相関が認められた。

しかしながら、尿蛋白が多いのに尿中ｉＣ３ｂが低値の
症例や、尿中ｉＣ３ｂが高値にもかかわらず尿蛋白が少
ない症例もあり、クレアチニンについても同様の傾向が
認められた．尿蛋白５０（ｌｗｇ／ｄｉ以上の症例の尿
中ｉｃ３ｂとタレアチニンとの関係を第４図に示すが、
同図に示すように尿中ｉｃ３ｂとクレアチニンはｎ＝１
１で　　＝０．８９８、Ｐ　＜　０　．００５と良く相
関した。

血漿中のｉｃ３ｂと尿中のｉｃ３ｂとの関係を第５図に
示す。同図に示すように、尿中補体分解産物陽性者にお
いても血漿中の補体分解産物は６２％が正常範囲内であ
った。尿中補体分解産物と腎生検蛍光Ｃ３沈着を測定し
た結果を第６図に示す。同図に示すように、腎生検組織
での糸球体へのＣ３沈着と尿中補体分解産物の関係では
、腎糸球体に０３の沈着を認める症例で尿中補体分解産
物が高値を示す傾向が認められた。

また、膜性増殖性糸球体腎炎患者の尿中補体分解産物の
濃度と尿蛋白（鎖線）、血清クレアチニン（実線）及び
血清Ｃ３の各濃度の経過を測定した結果を第７図に示す
。同図に示すように、この例では尿蛋白、血清タレアチ
ニン、Ｃ３値の変動にともない尿中補体分解産物が変動
した。

この症例の臨床経過と尿中補体分解産物の推移を検討し
てみると、腎機能、尿蛋白の変動と尿中補体分解産物の
値は良く相関していることがわかる。従って、腎炎の経
過を追う上で有用な検査法になる可能性がある。

〔発明の効果〕

本発明の方法は、随時尿で容易に腎疾患の有無を検査す
ることができ、健康診断、特に幼児検診や学校検尿で二
次検診の手段として有用である。

また、疾患の活動性を追う上でも有用な検査法となり得
ると思われる。

【図面の簡単な説明】

第１図はＰＢＳ、正常尿及び分解産物陽性尿にＣ３、Ｃ
４、Ｂ因子を加えて補体分解産物の変化を測定した結果
を示す図であり、第２図は正常者、慢性腎不全患者及び
一次性、二次性糸球体腎炎患者の尿の補体分解産物を測
定した結果を示す図である。第３図は尿中のｉｃ３ｂと
クレアチニン、尿蛋白との相関関係を示す図であり、第
４図は尿蛋白高濃度患者の尿中ｉｃ３ｂとクレアチニン
の相関関係を示す図である．第５図は血漿中のｉＣ３ｂ
と尿中のｉＣ３ｂとの相関関係を示す図であり、第６図
は尿中補体分解崖物と腎生検蛍光ｃ３沈着の有無との関
係を示す図である。また、第７図は患者の尿中補体分解
産物の濃度と尿蛋白、血清クレアチニン及び血清Ｃ３の
臨床経過を示す図である。 特許出願人　富士レビオ株式会社 代　理　人　弁理士　田中　政浩　はか１名第１図 第３図 （イ） （口） Ｃｒ Ｕ−ｐｒｏｔｅｉｎ 第２図 第４図 （イ） （口） （ハ） ｉＣ３ｂ 第５図 ｉＣ３ｂ υｒｉｎｅ 第６図 ω＋ ロー ロ＋ ロー ω＋ Ω− 第７図 ｉＣ３ｂ Ｂｉｏμｓｙ

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 尿中の補体分解産物を酵素免疫測定方法で測定すること
   を特徴とする腎疾患の検査方法