WO2005124344A2 - Procede de detection d'anticorps anti-transglutaminase dans un echantillon de salive - Google Patents

Procede de detection d'anticorps anti-transglutaminase dans un echantillon de salive Download PDF

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WO2005124344A2
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transglutaminase
sample
iga
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Françoise MASCART
Annick Ocmant
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Universite Libre De Bruxelles
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/564—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for pre-existing immune complex or autoimmune disease, i.e. systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, rheumatoid factors or complement components C1-C9
    • G—PHYSICS
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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    • G01N2333/91—Transferases (2.)
    • G01N2333/91045—Acyltransferases (2.3)
    • G01N2333/91074—Aminoacyltransferases (general) (2.3.2)
    • G01N2333/9108—Aminoacyltransferases (general) (2.3.2) with definite EC number (2.3.2.-)

Definitions

  • the invention relates to a method for detecting anti-transglutaminase antibodies in saliva for the diagnosis or therapeutic monitoring of celiac disease. Technological background of the invention
  • Celiac disease is an autoimmune enteropathy induced by gluten in genetically predisposed subjects.
  • Gluten is the protein fraction of the endosperm of wheat, rye, barley and oats.
  • Wheat flour, made from the endosperm contains various proteins including gliadin, a protein from the prolamin family, which is the food antigen responsible for the disease.
  • the active phase of the disease is associated with the production of anti-gliadin antibodies, and autoantibodies, anti-endomysium antibodies. These autoantibodies are directed against the connective tissue that surrounds the smooth muscle fibers.
  • the antigen recognized by anti-endomysium antibodies is an enzyme, tissue transglutaminase, recently discovered by the Dieterich team. This enzyme seems to be involved in the pathogenesis of the disease: transglutaminase catalyzes the covalent bond of proteins between a lysine residue and a glutamine residue.
  • transglutaminase to gliadin or to certain gliadin peptides induces the formation of neo-antigens recognized by the immune system and thus the production of autoantibodies against transglutaminase.
  • celiac disease In its classic form, celiac disease is characterized by total or subtotal villous atrophy predominant in the proximal small intestine and secondary to the ingestion of gluten.
  • Symptoms of the disease in adults are very variable. The usual signs are, as in children, diarrhea and worrying weight loss. More often than in the latter, the disease is mono-symptomatic (iron deficiency anemia, osteoporosis, ...) or atypical (manifested by muscle cramps, aphthous stomatitis, menstrual irregularities or even repeated miscarriages, a depressed state ).
  • celiac disease In addition to the classic forms of the disease, which represent only a minority of cases, there are many patients who, in the absence of major clinical signs, exhibit significant villous atrophy of the jejunal mucosa. These pauci-symptomatic forms of celiac disease manifest themselves most often clinically in the form of anemia linked to an iron and / or folic acid deficiency or in the form of osteoporosis or osteomalacia. Some people are at high risk of celiac disease: family members of affected individuals, patients with herpetiform dermatitis, insulin-dependent diabetes, chronic autoimmune thyroiditis or selective IgA deficiency. These are mostly silent forms of celiac disease that predominate in these groups.
  • celiac disease Early detection of crude and even subclinical cases of celiac disease is therefore difficult and, however, important in order to avoid on the one hand the complications linked to the nutritional deficit secondary to malabsorption and on the other hand, the development of lymphomas or digestive carcinomas which could appear in 15% of untreated patients. Celiac disease is observed especially in Caucasians and more frequently in women. In general, it is revealed in early childhood. The prevalence of celiac disease in Europe, between 1/1000 and 1/2000 inhabitants, could in fact be much higher if one took into account the pauci-symptomatic and silent forms of the disease, which would reduce the prevalence of the disease between 1/200 to 1/400.
  • Anti-endomysium IgA represent the most reliable marker for the detection of celiac disease.
  • the sensitivity of this test is more than 90% and its specificity is close to 100%.
  • These antibodies are sought by an indirect immunofluorescence technique on sections of primate esophagus or on sections of human umbilical cords.
  • the presence in the serum of patients with celiac disease of anti-gliadin antibodies has been known for a long time, the detection of these is done by immunoassays, but the lack of specificity of this test makes it a little diagnostic tool reliable if used alone.
  • the search for anti-gliadin IgG is a sensitive but not very specific test, while that of IgA is more specific but less sensitive, among other things because of the high frequency of IgA deficiency in celiac patients.
  • transglutaminase either from guinea pig liver or recombinant human, the latter making it possible to obtain a specificity comparable to that of anti-endomysium.
  • the only element of formal diagnosis is based on the histology of the intestinal mucosa.
  • the intestinal involvement is located in the proximal small intestine and characteristically associates subtotal or total villous atrophy, crypt hypertrophy, massive lymphocytic infiltration of the epithelium and lymphoplasmocytic infiltrate of the chorion, all of which are responsible. malabsorption syndrome.
  • the basis of treatment for celiac disease patients is the strict gluten-free diet, which is particularly difficult to follow properly.
  • the characteristic antibodies of celiac disease gradually disappear from the serum, thus making it possible to assess the degree of adherence to the diet.
  • this again requires a blood test.
  • the purpose of the present invention is to provide a non-invasive solution for the diagnosis and monitoring of celiac disease, by an economic and efficient diagnostic test, capable of remedying, at least partially the drawbacks of the solutions known in the art prior.
  • the subject of the present invention is a method for detecting and / or assaying anti-transglutaminase antibodies in a saliva sample capable of containing said antibodies, characterized in that the saliva is collected in a saliva collector avoiding the degradation of the antibodies, that the saliva sample is subjected to a pretreatment, and then that said antibodies are detected in the saliva pretreated by an immune reaction with transglutaminase under conditions suitable for the formation of immunocomplex with said antibodies.
  • the present invention comprises an effective non-radioactive immunoenzymatic technique for the detection of anti transglutaminase IgA in saliva including a pretreatment of saliva with a solution of mucolytic compound, preferably N-acetyl-cysteine, after collecting these appropriately.
  • a pretreatment of saliva with a solution of mucolytic compound, preferably N-acetyl-cysteine after collecting these appropriately.
  • the samples are collected in a particular way avoiding the degradation of the antibodies.
  • the method comprises the collection of saliva in a sampling device and then the pretreatment of the sampled saliva which comprises bringing the saliva into contact with a mucolytic compound.
  • the compound can be selected from the group consisting of N-acetyl-cysteine, nacystelyn, dithiothreitol, gelsolin, thioredoxin and EDTA.
  • This involves treating saliva with a mucolytic compound, preferably N-acetylcysteine in order to degrade the chemical bonds between the IgA molecules and the mucins present in the saliva.
  • This treatment makes it possible to release the IgA from the mucins, thus avoiding joint non-specific sticking of the mucins on the microtitration plates and increasing the detectability of the anti transglutaminase IgAs.
  • This pretreatment makes it possible to reduce the non-specific fixation of samples not containing anti-transglutaminase antibodies and to increase the signal of the samples containing anti-transglutaminase antibodies, thus making it possible to greatly improve the discrimination between positive and negative saliva for presence of anti transglutaminase IgA.
  • a prior step of the process according to the invention consists not only in collecting the saliva in special tubes provided for this purpose (sampling device), but also in subjecting the saliva to be pretreated before the search for antibodies by an immunoassay technique. enzyme.
  • the saliva sampling device comprises: a sample collector which selectively receives a saliva sample; and an indicator activated by a preselected amount of the received saliva sample to indicate that the amount of the collected biological fluid sample is adequate.
  • the method is characterized in that it comprises the collection of saliva in sampling devices as described in documents WO95 / 02996, US Patent No. 5,260,031, such as Omni -SAL ®, in WO97 / 24979, WO96 / 04850, WO95 / 27205 such as OraSure ®, in US Patent No. 4,774,962 as Salivette ®.
  • the sampling device is selected from the group comprising: Omni-SAL ® (Saliva
  • FIG. 1 represents a diagram illustrating the principle of anti-transglutaminase ELISAs according to a particular embodiment of the invention.
  • FIG. 2 represents a graph comparing different concentrations of N-acetylcysteine according to a particular embodiment of the invention.
  • FIG. 3 represents a graph comparing saliva untreated and treated with N-acetylcysteine according to a particular embodiment of the invention.
  • FIG. 4 represents a graph comparing untreated saliva treated with N-acetylcysteine according to a particular embodiment of the invention with TG from guinea pig liver.
  • Figures 5 and 6 show graphs comparing saliva untreated and treated with N-acetyl-cysteine according to particular embodiments of the invention with a pre-existing kit for assaying anti-TG antibodies in serum (Celikey, Pharmacia Diagnostics).
  • Figures 7 and 8 show graphs comparing the level of anti-TG IgA in saliva not treated and treated with N-acetyl-cysteine in healthy control subjects ( Figure 7) and in untreated celiac patients (Figure 8), according to particular embodiments of the invention.
  • FIG. 9 represents a graph comparing the level of anti-TG IgA in saliva not treated and treated with N-acetyl-cysteine in healthy control subjects and in untreated celiac patients, according to a particular embodiment of the invention.
  • FIG. 10 represents a graph comparing the level of anti-TG IgA in saliva treated with N-acetyl-cysteine at the level of serum anti-TG IgA, according to a particular embodiment of the invention.
  • FIG. 11 represents a graph comparing the level of anti-TG IgA in saliva treated with N-acetyl-cysteine in healthy control subjects, in pathological control subjects and in celiac patients not treated according to a particular embodiment of the invention.
  • FIG. 12 represents a graph comparing the level of anti-TG IgA in saliva treated with N-acetyl-cysteine in healthy control subjects, in untreated celiac patients and in celiac patients on a diet, according to one embodiment particular of the invention. Detailed description of the invention.
  • the method of the invention uses human saliva as a non-invasive source, instead of invasive serum or blood, to detect and / or assay anti-transglutaminase antibodies.
  • IgA are the predominant immunoglobulins in secretions where they play a key role in the defense of the body against external aggressions. Most of the IgA in saliva is present in a dimeric form: secretory IgA or slgA, consisting of two monomeric IgA joined by a small molecule called "chain J" and a secretory glycoprotein called Secretory Component. IgA maintained as a dimer by the J chain is secreted by subepithelial plasma cells; it binds to the secretory component and then crosses the epithelial barrier. The secretory component facilitates the transport of IgA in the secretions and protects it against proteolysis.
  • the present invention makes it possible to assay the anti-transglutaminase IgA antico ⁇ s by the ELIS A technique on salivary samples.
  • the present invention relates to a method for detecting anti-transglutaminase antico ⁇ s in a saliva sample capable of containing said antico ⁇ s, characterized in that the saliva sample is subjected to a pretreatment.
  • the method comprises on the one hand the collection of saliva in a sampling device such as Omni-SAL ® salivettes and on the other hand the pretreatment which comprises bringing the saliva into contact with a compound mucolytic such as N-acetyl cysteine.
  • the transglutaminase used according to the invention can be of human, animal, synthetic or recombinant origin.
  • Detection can be carried out in an immunoassay, for example, by direct or indirect coupling of a reaction partner having an easily detectable labeling substance.
  • the detection is carried out in an ELIS A test.
  • the immunocomplexes formed can be brought into contact with a conjugate consisting of a labeled antico ⁇ s directed against said antico ⁇ s, under conditions suitable for the formation of labeled immunocomplexes, then the labeled immunocomplexes are detected and quantified.
  • the conjugate can be an anti-immunoglobulin antico ⁇ s labeled with alkaline phosphatase or peroxidase, then the formation of labeled immuno-complexes is detected and quantified by colorimetry or fluorimetry.
  • the present method allows the detection of gluten-induced diseases such as celiac disease.
  • the present process also makes it possible to follow a gluten-free diet during which the antico ⁇ s should normally disappear.
  • the present invention therefore also relates to a method of diagnosis or therapeutic monitoring of celiac disease, characterized in that antico ⁇ s anti-transglutaminase is detected in a saliva sample capable of containing said antico ⁇ s, characterized in that one subjects the saliva sample to a pretreatment, then in that said antico ⁇ s is detected in the saliva pretreated by an immune reaction with transglutaminase under conditions suitable for the formation of immunocomplexes with said antico ⁇ s.
  • the method is characterized in that it comprises the collection of saliva in sampling devices as described in documents WO95 / 02996, US Patent No. 5,260,031, such as Omni-SAL ® salivets then pretreatment which includes bringing saliva into contact with N-acetyl-cysteine.
  • the present invention also relates to a diagnostic kit for the diagnosis or therapeutic monitoring of celiac disease.
  • the present invention also relates to a method screening and / or detection and / or monitoring of celiac disease in an individual, said method comprising the detection of antico ⁇ s anti-transglutaminase in a saliva sample from the individual.
  • the present invention relates to a method which, without the need to use a blood sample, is able to facilitate the diagnosis of celiac disease and monitor the progress of the disease.
  • the present invention is suitable both for screening and for monitoring the development in celiac patients on a gluten-free diet. It also makes it possible to diagnose all diseases accompanied by an immune reaction against transglutaminase or corresponding antigenic structures or the like.
  • the tests are carried out on saliva samples, taken using the Omni-SAL "salivettes.
  • the salivette collecting pad is placed under the tongue until the indicator turns blue.
  • the soaked tampon is then replaced in a tube containing a conservation liquid buffered to neutral pH and the saliva is extracted from it using a piston-type filter.
  • the saliva is aliquoted and frozen at -80 ° C.
  • the principle of anti-transglutaminase ELISA is schematically illustrated in Figure 1.
  • the transglutaminase antigen either purified from guinea-pig liver (homemade technique), or recombinant human (Celikey TM PHARMACIA Diagnostics), has been adsorbed to well of a microtiter plate.
  • the anti-transglutaminase antibodies which may be present in the samples are fixed to the transglutaminase on the solid phase.
  • the apparatuses used for the implementation of the experiments include: ELISA plate reader, PC with processing software for the ELISA reader (KC 4 V3.1), Refrigerator 2-8 ° C, Freezer -25 ° C, 37 ° C oven, Vortex, Balance, pH meter.
  • the small equipment used includes: ELISA plate (Nalge Nunc International) Nunc IMMUNO Plate Brand Products Maxisorb surface, Micropipettes from 0 to 10, from 10 to 40, from 50 to 200, from 200 to 1000 ⁇ l, Multichannel micropipettes (8 channels) from 50 to 200 ⁇ l, Aspirates and vacuum pipettes for pipettes from 2 to 10 ml, Disposable pipets from 2 to 10 ml, Plastic tubes with bottom conical from 5 to 10 ml, Microtubes.
  • reagents used during these experiments include: Tris HCl, NaCl, CaCl 2; HCl 5N, EDTA (Kestranal A), Tween 20, Sodium citrate dihydrate, distilled H 2 O, purified guinea-pig liver transglutaminase (Sigma T5398), Standard IgA anti-transglutaminase at 10,000 AU dilution Vz in ethylene glycol ⁇ 5,000 AU, Ethylene glycol 99% (14,675.28 Janssen Chimica), Conjugate anti-human IgA-peroxidase (anti-IgA HRP) of rabbit (Dako P216), OPD (Sigma P6912), H 2 O 2 30%.
  • the following buffers were used:
  • Coating buffer pH 7.5 CaCl 2 (0.7g), brought to 1 liter with distilled H 2 O and adjusted to pH 7.5 with 5N HCl.
  • Tris pH 7.4 dilution buffer Tris HCl (6.06g), NaCl (8.8g), EDTA (Kestranal A) (2.9g), brought to 1 liter with distilled H 2 O, supplemented with 1 ml of Tween 20, and adjusted to pH 7.4 with 5N HCl.
  • OPD substrate Citrate buffer pH 4.2: C 6 H 5 Na 3 O 7 .2H 2 O (29.4g), brought to 1 liter with distilled H 2 O and adjusted to pH 4.2 with 5N HCl.
  • the blank consists of the dilution buffer. 100 ⁇ l of each point on the curve (1/100, 1/400, 1/800, 1/1600, 1/6400), samples (undiluted saliva) and blank were distributed by well, then incubated for 2 h at room temperature, then washed 3 times with the dilution buffer.
  • the conjugate was prepared at a 1/1000 dilution of the conjugate in the dilution buffer. 100 ⁇ l of this solution were distributed per well, then incubated for 1 hour at room temperature, then washed 3 times with the dilution buffer.
  • the substrate was prepared at the rate of 20 ml of a solution of OPD at 1 mg / ml in the citrate buffer and in which 40 ⁇ l of H 2 O were added. 200 ⁇ l of this solution were distributed per well. The coloring is left to develop for 30 minutes at room temperature in the dark.
  • the apparatuses used for the implementation of these experiments include: ELISA plate reader, PC with processing software for the ELISA reader (KC 4 V3.1), Refrigerator 2-8 ° C, Vortex.
  • the small equipment used includes: Microtiter well covered with recombinant human transglutaminase, Micropipettes from 0 to 10, from 10 to 40, from 50 to 200, from 200 to 1000 ⁇ l, Multichannel micropipettes (8 channels) from 50 to 200 ⁇ l, Suction and vacuum pipettes for pipettes from 2 to 10 ml, Disposable pipettes from 2 to 10 ml, Plastic tubes with conical bottom from 5 to 10 ml, Microtubes.
  • Reagents used during the experiments include: 6 anti-transglutaminase calibrators at concentrations of 0-3-7-16-40-100 U / ml in PBS containing BSA, 0.095% sodium azide ( w / v), detergent and human serum, 1 ml each, ready to use.
  • the positive control consisted of a buffer containing BSA, 0.095% sodium azide (w / v), detergent and human serum, 1 ml each, ready to use.
  • the negative control consisted of a buffer containing BSA, 0.095% sodium azide (w / v), detergent and human serum, 1 ml, ready to use.
  • the concentrated wash buffer consisted of 20x concentrated PBS containing 0.095% sodium azide (w / v) and detergent, 50 ml.
  • the HRP IgA conjugate consisted of anti-human HRP IgA conjugate HRP, 15 ml, ready to use.
  • TMB substrate ready to use 15 ml.
  • the stop solution consisted of H 2 SO 4 0.5 M, 10 ml, ready to use.
  • the first tests were carried out using, strictly speaking, the ELISA protocol described below.
  • NAC N-Acetyl-Cysteine
  • the optimal concentration of NAC is 13.23 g / L of dilution buffer, in fact, it is at this concentration that the ODs of the controls are most bass. Comparison of treated and untreated saliva
  • the sensitivity and specificity of the test with TG for guinea pig liver are therefore 30% and 100% respectively without treatment with NAC and 60% and 100% with treatment.
  • Saliva pretreatment with NAC increased the signal of celiac patients since, out of 7 patients, 6 saw their signal increase with NAC (see Figure 5).
  • the threshold value (1.6 U / ml) was calculated from a preliminary test carried out on a larger series of samples. This threshold value was also used for NAC-treated saliva.
  • an ELISA has been developed for the detection of anti-transglutaminase (TG) IgA on saliva samples.
  • Trials carried out using the anti-TG IgA research protocol in serum have shown little discrimination between the results of control individuals and celiac patients.
  • One of the objectives therefore fried to reduce the signal of controls.
  • the advantage of saturation with BSA or Casein has been evaluated and the uselessness of a saturation step has been demonstrated.
  • Different concentrations (lml / L and 50 ml / L) of Tween 20 were compared using as dilution buffer either Tris or PBS. The decomplementation proved to be unsuitable, indeed, it causes a drop in the signal of positive controls.
  • NAC N-Acetyl-Cysteine
  • the value of saliva treatment with NAC has also been confirmed by using Celikey, an anti-transglutaminase ELISA using recombinant human TG as an antigen.
  • the present invention allows screening for celiac disease using saliva samples.
  • FIGS. 7 and 8 represent graphs comparing the level of anti-TG IgA in saliva not treated and treated with N-acetyl-cysteine in healthy control subjects (FIG. 7) and in untreated celiac patients (Figure 8).
  • FIG. 9 represents a graph comparing the level of anti-TG IgA in saliva untreated and treated with N-acetyl-cysteine in healthy control subjects and in untreated celiac patients, the cut-off values being represented by the thin lines on the graph.

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Abstract

La présente invention concerne un procédé de détection d'anticorps anti-transglutaminase dans un échantillon de salive susceptible de contenir lesdits anticorps, caractérisé en ce que l'on soumet l'échantillon de salive à un prétraitement avec un composé mucolytique, puis en ce que l’on détecte lesdits anticorps dans la salive prétraitée par une réaction immune avec de la transglutaminase dans des conditions appropriées pour la formation d’immuno-complexes avec lesdits anticorps. Elle concerne aussi un procédé de diagnostic ou de suivi thérapeutique de la maladie coeliaque.

Description

Procédé de détection d'anticorps anti-transglutaminase
Domaine de l'invention
L'invention concerne un procédé de détection d'anticorps anti-transglutaminase dans la salive pour le diagnostic ou le suivi thérapeutique de la maladie coeliaque. Arrière plan technologique de l'invention
La maladie coeliaque est une entéropathie auto-immune induite par le gluten chez des sujets génétiquement prédisposés. Le gluten est la fraction protéique de l'endosperme du blé, du seigle, de l'orge et de l'avoine. La farine de blé, fabriquée à partir de l'endosperme, contient diverses protéines dont la gliadine, protéine de la famille des prolamines, qui est l'antigène alimentaire responsable de la maladie.
Il y a d'une part des facteurs génétiques prédisposants à la maladie coeliaque, en effet, la contribution des gènes HLA est bien démontré, et il y a d'autre part, un ou des facteurs déclenchants environnementaux d'origine indéterminée.
La phase active de la maladie est associée à la production d'anticorps anti-gliadine, et d'auto-anticorps, les anticorps anti-endomysium. Ces auto-anticorps sont dirigés contre le tissu conjonctif qui entoure les fibres de muscle lisses. L'antigène reconnu par les anticorps anti-endomysium est une enzyme, la transglutaminase tissulaire, découverte récemment par l'équipe de Dieterich. Cette enzyme semble être impliquée dans la pathogénèse de la maladie : la transglutaminase catalyse la liaison covalente des protéines entre un résidu lysine et un résidu glutamine. Il a donc été suggéré que la liaison de la transglutaminase à la gliadine ou à certains peptides de la gliadine induit la formation de néo-antigènes reconnus par le système immunitaire et ainsi la production d'auto-anticorps contre la transglutaminase.
Dans sa forme classique, la maladie coeliaque est caractérisée par une atrophie villositaire totale ou subtotale prédominant au niveau de l'intestin grêle proximal et secondaire à l'ingestion de gluten.
Le nourrisson ou le jeune enfant présente une diarrhée chronique avec le plus souvent un ralentissement de la croissance et un abdomen ballonné. Plus rarement, chez l'enfant plus âgé, la maladie peut être moins typique, limitée à une petite taille isolée, une anémie ferriprive chronique, des anomalies de l'émail dentaire ou des arthralgies.
Les symptômes de la maladie, chez l'adulte, sont quant à eux très variables. Les signes habituels sont, comme chez l'enfant, la diarrhée et un amaigrissement inquiétant. Plus souvent que chez ce dernier, la maladie est mono-symptomatique (anémie ferriprive, ostéoporose,...) ou atypique (se manifestant par des crampes musculaires, une stomatite aphteuse, des irrégularités menstruelles voire des fausses couches à répétition, un état dépressif).
A côté des formes classiques de la maladie qui ne représenteraient qu'une minorité des cas, nombreux sont les malades qui en l'absence de signes cliniques majeurs, présentent une atrophie villositaire importante de la muqueuse jéjunale. Ces formes pauci-symptomatiques de la maladie coeliaque se manifestent cliniquement le plus souvent sous forme d'une anémie liée à une carence en fer et/ou en acide folique ou sous forme d'une ostéoporose ou d'une ostéomalacie. Certaines personnes présentent un risque élevé de maladie coeliaque: membres de la famille des sujets atteints, malades présentant une dermatite herpétiforme, un diabète insulino-dépendant, une thyroïdite chronique auto-immune ou un déficit sélectif en IgA. Ce sont surtout des formes silencieuses de maladie coeliaque qui prédominent dans ces groupes. La détection précoce des foraies frustes voir infracliniques de la maladie coeliaque est donc difficile et, cependant, importante afin d'éviter d'une part les complications liées au déficit nutritionnel secondaire à la malabsorption et d'autre part, le développement de lymphomes ou de carcinomes digestifs qui pourraient apparaître chez 15% des malades non traités. La maladie coeliaque est observée surtout chez les caucasiens et plus fréquemment chez la femme. En général, elle se révèle dans la petite enfance. La prévalence de la maladie coeliaque en Europe, comprise entre 1/1000 et 1/2000 habitants, pourrait être en fait beaucoup plus élevée si on tenait compte des formes pauci-symptomatiques et silencieuses de la maladie, ce qui ramènerait la prévalence de la maladie entre 1/200 à 1/400. La détection de deux types d'anticorps sériques, les anticorps anti-endomysium d'une part, les anticorps anti-gliadine d'autre part, constitue à l'heure actuelle un bon test de dépistage de la maladie coeliaque. Les IgA anti-endomysium représentent le marqueur le plus fiable pour la détection de la maladie coeliaque. La sensibilité de ce test est supérieure à 90% et sa spécificité est proche de 100%. Ces anticorps sont recherchés par une technique d'immunofluorescence indirecte sur coupes d'oesophage de primates ou sur des coupes de cordons ombilicaux humains. La présence dans le sérum des patients atteints de la maladie coeliaque d'anticorps anti-gliadine est connue depuis longtemps, la détection de ceux-ci se fait par immuno-essais, mais le manque de spécificité de ce test en fait un outil diagnostique peu fiable s'il est utilisé isolément. La recherche des IgG anti-gliadine est un test sensible mais peu spécifique, alors que celle des IgA est plus spécifique mais moins sensible, entre autre du fait de la fréquence élevée du déficit en IgA chez les patients coeliaques.
Il existe également des immuno-essais permettant la mise en évidence d'anticorps IgA anti-transglutaminase dans le sérum. Ces tests utilisent de la transglutaminase soit de foie de cobaye, soit humaine recombinante, cette dernière permettant d'obtenir une spécificité comparable à celle des anti-endomysium.
Le seul élément de diagnostic formel repose sur l'histologie de la muqueuse intestinale. L'atteinte intestinale siège au niveau de l'intestin grêle proximal et associe de façon caractéristique une atrophie villositaire subtotale ou totale, une hypertrophie des cryptes, une infiltration lymphocytaire massive de l'épithélium et un infiltrât lymphoplasmocytaire du chorion, tous ces éléments sont responsables du syndrome de malabsorption.
Le fondement du traitement des patients atteints de la maladie coeliaque repose sur le régime strict sans gluten, régime qui est particulièrement difficile à suivre correctement. Lors de l'établissement du régime, les anticorps caractéristiques de la maladie coeliaque disparaissent progressivement du sérum, permettant ainsi d'évaluer le degré d'adhérence au régime. Ceci nécessite cependant à nouveau de réaliser une prise de sang.
La recherche des IgA anti-endomysium ou des IgA anti-transglutaminase dans le sang est une aide très précieuse au diagnostic de l'intolérance au gluten qui atteint en Europe environ une personne sur 300. Cependant, afin d'éviter de devoir réaliser une prise de sang, il serait intéressant de disposer d'un test réalisable sur des échantillons de salive. Malheureusement, lorsque ce test a été précédemment appliqué par une technique de type ELISA à des échantillons de salive, les résultats obtenus ne permettaient pas de différencier les patients intolérants au gluten de ceux qui ne le sont pas. La technique RIA récemment décrite limite quant à elle son application à des laboratoires utilisant des produits radioactifs.
Le but de la présente invention est d'apporter une solution non-invasive pour le diagnostic et le suivi de la maladie coeliaque, par un test diagnostic économique et performant, susceptible de remédier, au moins partiellement aux inconvénients des solutions connues de l'art antérieur. Bref résumé de l'invention
Le but ci-dessus est atteint par l'invention telle que définie par le jeu de revendications ci- joint.
A cet effet la présente invention a pour objet un procédé de détection et/ou dosage d'anticorps anti-transglutaminase dans un échantillon de salive susceptible de contenir lesdits anticorps, caractérisé en ce que l'on collecte la salive dans un collecteur de salive évitant la dégradation des anticorps, que l'on soumet l'échantillon de salive à un prétraitement, puis en ce que l'on détecte lesdits anticorps dans la salive prétraitée par une réaction immune avec de la transglutaminase dans des conditions appropriée pour la formation d'immuno-complexes avec lesdits anticorps. Dans un mode de réalisation particulier, la présente invention comprend une technique immuno-enzymatique non radioactive performante pour la recherche des IgA anti transglutaminase dans la salive incluant un prétraitement des salives par une solution de composé mucolytique, de préférence la N-acétyl-cystéine, après avoir collecté celles-ci de façon appropriée. Les échantillons sont collectés d'une façon particulière évitant la dégradation des anticorps.
Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, le procédé comprend la collection des salives dans un dispositif d'échantillonnage puis le prétraitement de la salive échantillonnée qui comprend la mise en contact de la salive avec un composé mucolytique. Le composé peut être sélectionné dans le groupe comprenant la N-acétyl-cystéine, la nacystelyn, le dithiothreitol, gelsolin, thioredoxin et EDTA. Il s'agit de traiter les salives avec un composé mucolytique, de préférence de la N-acétyl- cystéine afin de dégrader les liaisons chimiques entre les molécules d'IgA et les mucines présentes dans la salive. Ce traitement permet de libérer les IgA des mucines, évitant ainsi un collage non spécifique conjoint des mucines sur les plaques de microtitration et augmentant la détectabilité des IgA anti transglutaminase.
Ce prétraitement permet de diminuer la fixation non spécifique d'échantillons ne contenant pas d'anticorps anti-transglutaminase et d'augmenter le signal des échantillons contenant des anticorps anti transglutaminase permettant ainsi d'améliorer fortement la discrimination entre les salives positives et négatives pour la présence des IgA anti transglutaminase.
En ne permettant que la fixation des IgA spécifiques sur une plaque couverte de transglutaminase et en améliorant la détection des IgA anti transglutaminase, nous obtenons une meilleure discrimination entre les salives des personnes intolérantes au gluten et celles de personnes qui ne sont pas intolérantes. Une étape préalable du procédé selon l'invention consiste non seulement à collecter les salives dans des tubes spéciaux prévus à cet usage (dispositif d'échantillonnage), mais aussi à faire subir aux salives un prétraitement avant la recherche des anticorps par une technique immuno-enzymatique.
Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, le dispositif d'échantillonnage de salive comprend: un collecteur d'échantillon qui reçoit sélectivement un échantillon de salive; et un indicateur activé par une quantité présélectionnée de l'échantillon de salive reçu pour indiquer que la quantité de l'échantillon de fluide biologique recueilli est adéquate. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, le procédé est caractérisé en ce qu'il comprend la collection des salives dans des dispositifs d'échantillonnages tels que décrit dans les documents WO95/02996, U.S. Patent No. 5,260,031, tels que Omni-SAL®, dans les documents WO97/24979, WO96/04850, WO95/27205 tels que OraSure®, dans le document U.S. Patent No. 4,774,962 tel que Salivette®. De préférence, le dispositif d'échantillonnage est sélectionné dans le groupe comprenant : Omni-SAL® (Saliva
Diagnostic Systems, Inc.), Salivette® (Sarstedt Ltd.), Orapette® (Trinity Biotech) and OraSure® (Epitope, Inc.), de préférence Omni-Sal®. D'autres particularités et avantages de la présente invention apparaîtront à la lecture de la description qui va suivre et des exemples qui l'illustreront.
Brève description des figures :
La Figure 1 représente un schéma illustrant le principe des ELISA anti-transglutaminase selon un mode de réalisation particulier de l'invention.
La Figure 2 représente un graphe comparant différentes concentrations en N-acétyl- cystéine selon un mode de réalisation particulier de l'invention.
La Figure 3 représente un graphe comparant des salives non traitées et traitées au N-acétyl- cystéine selon un mode de réalisation particulier de l'invention. La Figure 4 représente un graphe comparant des salives non traitées et traitées au N-acétyl- cystéine selon un mode de réalisation particulier de l'invention avec de la TG de foie de cobaye.
Les Figures 5 et 6 représentent des graphes comparant des salives non traitées et traitées au N-acétyl-cystéine selon des modes de réalisation particuliers de l'invention avec un kit pré- existant de dosage des anticorps anti- TG dans le sérum (Celikey, Pharmacia Diagnostics).
Les Figures 7 et 8 représentent des graphes comparant le niveau d'IgA anti-TG dans des salives non traitées et traitées au N-acétyl-cystéine chez des sujets contrôles en bonne santé (Figure 7) et chez des patients coeliaques non traités (Figure 8), selon des modes de réalisation particuliers de l'invention. La Figure 9 représente un graphe comparant le niveau d'IgA anti-TG dans des salives non traitées et traitées au N-acétyl-cystéine chez des sujets contrôles en bonne santé et chez des patients coeliaques non traités, selon un mode de réalisation particulier de l'invention.
La Figure 10 représente un graphe comparant le niveau d'IgA anti-TG dans des salives traitées au N-acétyl-cystéine au niveau d'IgA anti-TG sérique, selon un mode de réalisation particulier de l'invention.
La Figure 11 représente un graphe comparant le niveau d'IgA anti-TG dans des salives traitées au N-acétyl-cystéine chez des sujets contrôles sains, chez des sujets contrôles pathologiques et chez des patients coeliaques non traités selon un mode de réalisation particulier de l'invention. La Figure 12 représente un graphe comparant le niveau d'IgA anti-TG dans des salives traitées au N-acétyl-cystéine chez des sujets contrôles sains, chez des patients coeliaques non traités et chez des patients coeliaques sous régime, selon un mode de réalisation particulier de l'invention. Description détaillée de l'invention.
La méthode de l'invention utilise la salive humaine comme source non invasive, en lieu et place du sérum ou du sang invasif, pour détecter et/ou doser des anticorps anti- transglutaminase.
Les IgA sont les immunoglobulines prédominantes dans les sécrétions où elles jouent un rôle primordial dans la défense de l'organisme contre les agressions externes. L'essentiel des IgA dans la salive est présent sous une forme dimérique: l'IgA sécrétoire ou slgA, constituée de deux IgA monomériques jointes par une petite molécule appelée "chaîne J" et d'une glycoprotéine sécrétoire appelée Composante Sécrétoire. L'IgA maintenue sous forme de dimère par la chaîne J est sécrétée par les plasmocytes sous-épithéliaux; elle se lie à la composante sécrétoire et traverse alors la barrière épithéhale. La composante sécrétoire facilite le transport de l'IgA dans les sécrétions et la protège contre la protéolyse.
La mise en évidence de la maladie coeliaque chez les patients présentant des formes pauci- symptomatiques ou silencieuses de maladie coeliaque est souvent difficile et retardée. Néanmoins, ces patients voient une amélioration de leur état général lorsqu'ils sont mis sous régime.
Le dépistage à grande échelle se justifie donc au sein de la population générale mais ne peut se concevoir qu'en utilisant des tests peu invasifs. La présente invention perniet de doser les anticoφs IgA anti-transglutaminase par la technique ELIS A sur des prélèvements salivaires. La présente invention concerne un procédé de détection d'anticoφs anti-transglutaminase dans un échantillon de salive susceptible de contenir lesdits anticoφs, caractérisé en ce que l'on soumet l'échantillon de salive à un prétraitement. Dans un mode de réalisation préférée le procédé comprend d'une part la collection des salives dans un dispositif d'échantillonnage tel que des salivettes Omni-SAL® et d'autre part le prétraitement qui comprend la mise en contact de la salive avec un composé mucolytique tel que la N-acétyl cystéine. La transglutaminase utilisée selon l'invention peut être d'origine humaine, animale, synthétique ou recombinante.
La détection peut être effectuée dans un immuno-essai, par exemple, par couplage direct ou indirect d'un partenaire de réaction ayant une substance de marquage facilement détectable.
Selon un mode de réalisation préférée, la détection s'effectue dans un test ELIS A. Par exemple, on peut mettre en contact les immuno-complexes formés avec un conjugué constitué par un anticoφs marqué dirigé contre lesdits anticoφs, dans des conditions appropriées pour la formation d'immuno-complexes marqués, puis on détecte et on quantifie les immuno-complexes marqués. Par exemple le conjugué peut être un anticoφs anti-immunoglobuline marqué à la phosphatase alcaline ou à la peroxydase, puis on détecte et on quantifie la formation d'immuno-complexes marqués par colorimétrie ou fluorimétrie.
Le présent procédé permet la détection de maladies induites par le gluten telle que la maladie coeliaque.
Le présent procédé permet aussi le suivi d'un régime sans gluten au cours duquel les anticoφs doivent normalement disparaître.
La présente invention concerne donc aussi un procédé de diagnostic ou de suivi thérapeutique de la maladie coeliaque, caractérisé en ce qu'on détecte des anticoφs anti- transglutaminase dans un échantillon de salive susceptible de contenir lesdits anticoφs, caractérisé en ce que l'on soumet l'échantillon de salive à un prétraitement, puis en ce que l'on détecte lesdits anticoφs dans la salive prétraitée par une réaction immune avec de la transglutaminase dans des conditions appropriées pour la formation d'immuno-complexes avec lesdits anticoφs. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, le procédé est caractérisé en ce qu'il comprend la collection des salives dans des dispositifs d'échantillonnages tels que décrit dans les documents WO95/02996, U.S. Patent No. 5,260,031, tels que des salivettes Omni-SAL® puis le prétraitement qui comprend la mise en contact de la salive avec de la N-acétyl-cystéine.
La présente invention concerne aussi un kit diagnostique pour le diagnostic ou le suivi thérapeutique de la maladie coeliaque. La présente invention concerne aussi une méthode de dépistage et/ou de détection et/ou de surveillance de la maladie coeliaque chez un individu, ladite méthode comprenant la détection d'anticoφs anti-transglutaminase dans un échantillon de salive provenant de l'individu. La présente invention se rapporte à une méthode qui, sans qu'il soit nécessaire d'utiliser un prélèvement de sang, est à même de faciliter le diagnostic d'une maladie coeliaque et de surveiller l'évolution de la maladie.
Ainsi, la présente invention se prête tant au dépistage qu'au contrôle de l'évolution chez les malades coeliaques sous régime sans gluten. Elle permet aussi de diagnostiquer toutes les maladies accompagnées d'une réaction immunitaire contre la transglutaminase ou des structures antigéniques ou analogues correspondantes.
Exemple 1
1. Matériels et méthodes
Prélèvements
Les tests sont effectués sur des échantillons de salive, prélevés en utilisant les salivettes Omni-SAL" . Le tampon collecteur des salivettes est placé sous la langue jusqu'à ce que l'indicateur devienne bleu. Le tampon imbibé est alors replacé dans un tube contenant un liquide de conservation tamponné à pH neutre et la salive en est extraite à l'aide d'un filtre de type piston. La salive est aliquotée et congelée à -80°C.
Principe des ELISA anti-transglutaminase Le principe des ELISA anti-transglutaminase est schématiquement illustré à la Figure 1. L'antigène transglutaminase soit purifié de foie de cobaye (technique maison), soit humain recombinant (Celikey™ PHARMACIA Diagnostics), a été adsorbé aux puits d'une plaque de microtitration. Pendant une première incubation, les anticoφs anti-transglutaminase éventuellement présents dans les échantillons sont fixés à la transglutaminase sur la phase solide. Après lavage, une deuxième incubation permet à un conjugué anti-IgA humaines marqué à la peroxydase de se fixer sur l'anticoφs anti-transglutaminase préalablement immobilisé. Un lavage élimine le conjugué en excès. En présence du substrat chromogène, les complexes antigène-anticoφs-conjugué sont révélés par une réaction enzymatique colorée. L'intensité de la coloration, mesurée au spectrophotomètre, est reportée sur une courbe standard permettant ainsi une estimation de la concentration en anticoφs anti- transglutaminase.
ELISA utilisant la transglutaminase purifiée de foie de cobaye selon un mode de réalisation de l'invention.
Matériel, Appareillage et Réactifs Les appareillages utilisés pour la mise en œuvre des expériences comprennent: Lecteur de plaques ELISA, PC avec logiciel de traitement pour le lecteur ELISA (KC4V3.1), Réfrigérateur 2-8°C, Congélateur -25°C, Etuve 37°C, Vortex, Balance, pH mètre.
Le petit matériel utilisé comprend : Plaque ELISA (Nalge Nunc International) Nunc IMMUNO Plate Brand Products Maxisorb surface, Micropipettes de 0 à 10, de 10 à 40, de 50 à 200, de 200 à 1000 μl, Micropipettes à multicanaux (8 canaux) de 50 à 200 μl, Aspire et vide pipettes pour pipettes de 2 à 10 ml, Pipetes à usage unique de 2 à 10 ml, Tubes en plastique à fond conique de 5 à 10 ml, Microtubes.
Les réactifs commerciaux utilisés aux cours des ces expériences comprennent : Tris HCl, NaCl, CaCl2; HCl 5N, EDTA (Kestranal A), Tween 20 , Citrate de sodium dihydraté, H2O distillée, Transglutaminase purifiée de foie de cobaye (Sigma T5398), Standard IgA anti- transglutaminase à 10 000 UA dilution Vz dans l'éthylène glycol → 5 000 UA, Ethylène glycol 99% (14.675.28 Janssen Chimica), Conjugué anti-IgA humaines-peroxydase (anti- IgA HRP) de lapin (Dako P216), OPD (Sigma P6912), H2O2 30%. Les tampons suivants ont été employés :
Tampon de coating pH 7.5: CaCl2 (0.7g), amené à 1 litre avec H2O distillée et ajusté à pH 7.5 avec HCl 5N.
Tampon de dilution Tris pH 7.4 : Tris HCl (6.06g), NaCl (8.8g), EDTA (Kestranal A) (2.9g), amené à 1 litre avec H2O distillée, additionné d'1 ml de Tween 20, et ajusté à pH 7.4 avec HCl 5N.
Tampon Citrate du substrat OPD pH 4.2 : C6H5Na3O7.2H2O (29.4g), amené à 1 litre avec H2O distillée et ajusté à pH 4.2 avec HCl 5N.
Procédure
Coating des plaques 100 μl d'une solution de transglutaminase à 10 μg/ml de tampon de dilution ont été distribué par puits, la plaque a été couverte et incubée une nuit à 4°C La plaque a ensuite été lavée 3 fois avec le tampon de dilution. 100 μl de tampon de dilution sont distribués par puit et la plaque est incubée 2 heures à 37°C.
Dépôt des échantillons, de la courbe standard et du blanc Dilutions du standard dans le tampon de dilution : Dilution 1/100 (100.00 UA) Dilution 1/400 (25.00 UA) Dilution 1/800 (12.50 UA) Dilution 1/1600 (6.25 UA) Dilution 1/6400 (1.56 UA). La fourchette des concentrations s'étend de 1.56 UA à 100 UA.
Le blanc est constitué du tampon de dilution. 100 μl de chaque point de la courbe (1/100, 1/400, 1/800, 1/1600, 1/6400), des échantillons (salive non diluée) et du blanc ont été distribués par puit, puis incubés 2 h à T° ambiante, puis lavés 3 fois avec le tampon de dilution.
Détection et révélation Le conjugué a été préparé a raison d'une dilution 1/1000 du conjugué dans le tampon de dilution. lOOμl de cette solution ont été distribué par puits, puis incubé 1 heure à T° ambiante, puis lavés 3 fois avec le tampon de dilution.
Le substrat a été préparé a raison de 20 ml d'une solution d'OPD à 1 mg/ml dans le tampon citrate et dans laquelle 40μl d'H O2 ont été ajoutés. 200 μl de cette solution ont été distribué par puits. La coloration est laissée se développer pendant 30minutes à T° ambiante à l'abri de la lumière.
Lecture : L'absorbance a été mesurée à 450 nm.
ELISA utilisant la transglutaminase recombinante humaine (Celikey™ Pharmacia Diagnostics) Matériel, Appareillage et Réactifs
Les appareillages utilisés pour la mise en œuvre de ces expériences comprennent: Lecteur de plaques ELISA, PC avec logiciel de traitement pour le lecteur ELISA (KC4V3.1), Réfrigérateur 2-8°C, Vortex.
Le petit matériel utilisé comprend : Puits de microtitration recouverts de transglutaminase recombinante humaine, Micropipettes de 0 à 10, de 10 à 40, de 50 à 200, de 200 à 1000 μl, Micropipettes à multicanaux (8 canaux) de 50 à 200 μl, Aspire et vide pipettes pour pipettes de 2 à 10 ml, Pipettes à usage unique de 2 à 10 ml, Tubes en plastique à fond conique de 5 à 10 ml, Microtubes.
Les réactifs utilisés aux cours des expériences comprennent : 6 calibrateurs anticoφs anti-transglutaminase à des concentrations de 0-3-7-16-40-100 U/ml dans du PBS contenant de la BSA, de l'azide de sodium 0.095 % (p/v), du détergent et du sérum humain, 1 ml chacun, prêt à l'emploi.
Le contrôle positif était constitué d'un tampon contenant de la BSA, de l'azide de sodium 0.095 % (p/v), du détergent et du sérum humain, 1 ml chacun, prêt à l'emploi. Le contrôle négatif était constitué d'un tampon contenant de la BSA, de l'azide de sodium 0.095 % (p/v), du détergent et du sérum humain, 1 ml, prêt à l'emploi.
Le tampon de lavage concentré était constitué de PBS concentré 20x contenant de l'azide de sodium 0.095 % (p/v) et du détergent, 50 ml. Le conjugué HRP IgA était constitué de conjugué anticoφs anti-IgA humaines HRP, 15 ml, prêt à l'emploi.
Substrat TMB prêt à l'emploi 15 ml.
La solution d'arrêt était constituée de H2SO4 0.5 M, 10 ml, prêt à l'emploi.
Procédure Les puits ont été rincés une fois avec du tampon de lavage immédiatement avant de les utiliser, puis 100 μl de calibrateurs, de contrôle et d'échantillons (salive non diluée) ont été distribués par puits. Les plaques Elisa ont été incubées pendant 30 minutes à T° ambiante, puis lavées 3 fois avec du tampon de lavage. 100 μl de solution de conjugué ont été distribués par puits, puis incubés pendant 30 minutes à T° ambiante et lavés 3 fois avec le tampon de lavage. 100 μl de solution de substrat ont été ensuite distribués par puits, puis incubés 10 min à l'abri de la lumière à T° ambiante. 50 μl de solution d'arrêt sont finalement distribués par puits et l'absorbance a été mesurée à 450 nm entre 10 et 30 minutes après l'addition de la solution d'arrêt.
2. Résultats 2.1 Mise au point de l'ELISA anti-transglutaminase sur des prélèvements salivaires selon un des modes de réalisation de la présente invention.
Les premiers essais ont été réalisés en utilisant, stricto sensu, le protocole ELISA décrit ci- dessous.
Les concentrations d'IgA totales dans le sérum (75 à 400 mg/100 ml) étaient environ 10 fois plus élevées que dans la salive (9 à 32 mg/lOOml). Les résultats obtenus ont donc été comparés en testant la salive telle quelle (diluée 1/1) et la salive diluée 10 fois, cette dernière dilution équivalent donc à la dilution 1/100 d'un échantillon sérique telle que préconisée dans la technique initiale. Quatre coeliaques (C) et quatre individus contrôles (N) ont été testés. Il est apparu (Tableau 1) que la dilution 1/10 de la salive diminuait trop la sensibilité puisque les DO, en particulier celles des cœliaques, étaient effondrées. La suite des expériences a été effectuée avec la dilution 1/1 (salive pure).
Figure imgf000015_0001
Tableau 1. : Comparaison des dilutions 1/1 (non diluée) et 1/10 de la salive
Les différentes étapes du protocole ont été examinées afin de trouver les conditions optimales tant en terme de sensibilité qu'en terme de spécificité.
Pré-traitement de la salive à la NAC
La NAC (N-Acetyl-Cystéine) est un agent réducteur connu pour diminuer la viscosité des sécrétions bronchiques. Les mucines, glycoprotéines présentes dans la salive, peuvent d'une part fixer les IgA et d'autre part se déposer sur les plaques de microtitration et de ce fait être à l'origine du bruit de fond observé pour les échantillons négatifs.
Dans un premier lieu la concentration optimale de NAC nécessaire a été déterminée.
Les résultats de la détermination de la concentration optimale en NAC sont montrés au Tableau 2 et à la Figure 2.
Figure imgf000015_0002
Tableau 2 Evaluation de la concentration optimale en NAC Dans un mode de réalisation préférée de l'invention la concentration optimale est de 13.23 g/L de tampon de dilution, en effet, c'est à cette concentration que les DO des contrôles sont les plus basses. Comparaison des salives traitées aux non traitées
5μl d'une solution de NAC (Sigma Grade A7250) à 13.23 g/L dans le tampon de dilution pour lOOμl de salive ont été utilisé pour obtenir une concentration finale de 0.625 g/L de salive, l'incubation des échantillons en présence de la NAC a été faite à T° ambiante durant 20 minutes.
Figure imgf000016_0001
Tableau 3 Comparaison des salives non traitées et traitées NAC
Le pré-traitement des salives à la NAC a permit de diminuer le signal des contrôles négatifs et d'augmenter celui des cœliaques, cet effet suφrenant mène à une meilleure détection de ceux-ci et une discrimination plus importante entre les deux populations.
Pour démontrer l'effet de la NAC, c'est à dire la transformation des dimères d'IgA sécrétoires en monomères, une immunodiffusion radiale a été réalisée. La salive a été déposée sur un gel contenant un anticoφs reconnaissant exclusivement les IgA sécrétoires. Après 5 jours d'incubation, un halo de précipitation a été observé pour les salives non traitées à la NAC correspondant à la réaction des IgA sécrétoires présentes dans la salive 16 avec l'anticoφs inclus dans le gel. Par contre, pour les salives traitées à la NAC, le halo n'est pas observé ce qui signe l'absence d'IgA sécrétoires. 2.2 Comparaison des ELISA utilisant la transglutaminase soit purifiée de foie de cobaye (TG), soit humaine recombinante (Celikey™ l? ar acia.Diagnostics) (TG Celikey) Le bénéfice du pré-traitement des échantillons à la NAC a été évalué sur le Celikey, celui- ci utilisant la transglutaminase humaine recombinante. Il est actuellement admis, pour les échantillons sériques, que les ELISA utilisant la TG recombinante humaine sont plus spécifiques que ceux utilisant la TG de cobaye. Les résultats obtenus sont montrés au Tableau 4 et aux Figures 4 (IgA anti TG), 5 (IgA anti TG Celikey) et 6.
Figure imgf000017_0001
Tableau 4 Tableau récapitulatif des résultats sanguins et salivaires Le traitement des salives à la NAC entraîne une diminution du signal des contrôles (voir Figure 4) : la médiane des concentrations en IgA anti-TG passe de 12.4 UA à 11.5 UA après traitement. Par contre, il y a une augmentation du signal des patients coeliaques, la médiane des concentrations passant de 18.7 UA à 23.5 UA. Les valeurs seuils (moyenne des contrôles + 2DS), sont de 21 UA sans traitement et de 17 UA avec le traitement.
La sensibilité et la spécificité du test avec la TG de foie de cobaye sont donc respectivement de 30 % et 100 % sans traitement à la NAC et de 60% et 100% avec traitement.
Deux patients cœliaques n'étant pas sous régime ne sont pas détectés, même après traitement des échantillons salivaires à la NAC. Pour l'un deux, les tests sériques positifs en anti-TG laissaient présager une réponse positive également sur salive. Pour ces 2 patients, par technique d'immnodiffusion, les IgA sécrétoires dans la salive non traitée n'ont pas été mise en évidence, démontrant la dégradation probable de ces échantillons salivaires. Néanmoins, également par immunodiffusion, il a été démontré que celles-ci contenaient toujours de l'IgA. Sachant que ces prélèvements ont subi plusieurs cycles de congélation/décongélation, une dégradation est donc fort probable et permettrait d'expliquer les résultats négatifs de ces patients.
L'effet suφrenant du prétraitement au NAC a été aussi confirmé pour le test Celikey.
L'augmentation de la médiane des contrôles après traitement était due aux résultats d'un seul échantillon (MR) qui a donné une réponse légèrement plus élevée après traitement (0 U/ml et 0.77 U/ml).
Le prétraitement de la salive à la NAC a permis d'augmenter le signal des patients cœliaques puisque, sur 7 patients, 6 ont vu leur signal augmenter avec la NAC (voir Figure5). Ici, la valeur seuil (1.6 U/ml) a été calculée à partir d'un essai préliminaire réalisé sur une série d'échantillons plus importante. Cette valeur seuil a été utilisée également pour les salives traitées NAC.
En conclusion, un ELISA a été mis au point pour la recherche des IgA anti- transglutaminase (TG) sur des prélèvements salivaires. Les essais réalisés en utilisant le protocole de recherche des IgA anti-TG dans le sérum, ont montré une faible discrimination entre les résultats des individus contrôles et les patients cœliaques. Un des objectifs frit donc de diminuer le signal des contrôles. L'intérêt d'une saturation par BSA ou Caséine a été évalué et l'inutilité d'une étape de saturation a été démontrée. Différentes concentrations (lml/L et 50 ml/L) de Tween 20 ont été comparées en utilisant comme tampon de dilution soit du Tris soit du PBS. La décomplémentation s'est avérée inadaptée, en effet, celle-ci provoque une chute du signal des témoins positifs.
Le pouvoir réducteur de la N-Acetyl-Cystéine (NAC) a permis de transformer les IgA sécrétoires (dimériques) en monomères et d'améliorer ainsi la réponse des patients cœliaques. Par ailleurs, cet agent rompt les liaisons IgA-mucines à l'origine des fixations non spécifiques. Après traitement à la NAC, une siuprenante discrimination des deux populations est observée, le signal des contrôles diminuant et la réponse des cœliaques augmentant après traitement de la salive.
L'intérêt du traitement des salives à la NAC a été aussi confirmé en utilisant le Celikey, ELISA anti-transglutaminase utilisant comme antigène de la TG recombinante humaine. La présente invention permet le dépistage de la maladie coeliaque en utilisant des prélèvements salivaires.
Exemple 2 :
Confirmation de l'effet favorable du traitement par la NAC sur un plus grand nombre d'échantillons
La discrimination entre patients coeliaques et sujets contrôles en bonne santé a été évaluée : - selon que les échantillons de salive étaient ou non traités par la NAC - en testant les salives de 15 patients coeliaques non traités et celles de 25 sujets contrôles en bonne santé en récoltant toutes les salives sur salivettes Les Figures 7 et 8 représentent des graphes comparant le niveau d'IgA anti-TG dans des salives non traitées et traitées au N-acétyl-cystéine chez des sujets contrôles en bonne santé (Figure 7) et chez des patients coeliaques non traités (Figure 8). Les résultats illustrés aux Figures 7 et 8 montrent que l'effet de la NAC est très important sur les salives contrôles, diminuant de façon significative (P=0.0038) les valeurs obtenues pour les salives contrôles. Ceci permet de diminuer la valeur choisie comme « cut-off » pour déterminer qu'un échantillon de salive contient des IgA anti-TG. En effet, si on désire obtenir pour le test une spécificité de 100 % correspondant à la totalité des salives contrôles négatives, le « cut-off » doit être fixé au-dessus de 5.1 U en l'absence de traitement par la NAC et il peut être abaissé à 3.7 U lors d'un traitement par la NAC. Sensibilité et spécificité de la détection des IgA anti-TG dans la salive pour le diagnostic de la coeliaquie non traitée La sensibilité et la spécificité de la détection des IgA anti-TG dans la salive pour le diagnostic de la coeliaquie non traitée sont montrées au Tableau 5 et à la Figure 9. La Figure 9 représente un graphe comparant le niveau d'IgA anti-TG dans des salives non traitées et traitées au N-acétyl-cystéine chez des sujets contrôles en bonne santé et chez des patients coeliaques non traités, les valeurs cut-off étant représentées par les lignes fines sur le graphe.
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Tableau 5 Sensibilité et spécificité de la détection des IgA anti-TG dans la salive pour le diagnostic de la coeliaquie non traitée En conclusion, le test salivaire de dosage des IgA anti-TG dans la salive développé ici offre pour le diagnostic de la coeliaquie non traitée une sensibilité comparable à celle décrite dans la littérature pour les tests sériques, et ce avec une spécificité de 100%. Par ailleurs les résultats salivaires ont été comparés aux résultats sériques pour 16 personnes. Les résultats obtenus et illustrés à la Figure 10 montrent une excellente corrélation (test de corrélation de Spearman : r = 0.68 , p=0.0039 ). Les échantillons repris dans ce graphe ont été collectés chez des patients coeliaques soit avant instauration du régime, soit au cours du traitement. Le critère d'inclusion est un délai de moins d'un mois entre la collection de la salive et celle du sérum. Il ne s'agit donc pas nécessairement des mêmes échantillons que ceux repris dans le graphe de la Figure 9. Utilité diagnostique du test développé au sein d'une population de malades Dans le paragraphe précédent, la spécificité et la sensibilité du test développé pour le diagnostic de la coeliaquie ont été calculées en comparant les résultats obtenus chez les coeliaques à ceux obtenus chez des personnes saines, comme il est habituel de procéder.
Ici, ont été testés des échantillons de salive prélevés chez 37 patients se présentant à la consultation de gastroentérologie avec des plaintes cliniques compatibles avec une coeliaquie. Chez 17 d'entre eux, le diagnostic de coeliaquie a été sérieusement évoqué et confirmé par le résultat d'une biopsie intestinale. Chez les vingt autres, le diagnostic de coeliaquie a été rejeté par le clinicien sur base d'une biopsie intestinale qui n'était pas compatible avec un diagnostic de coeliaquie. Lorsqu'on compare les résultats obtenus dans ces deux groupes de patients, on obtient à nouveau une excellente discrimination sur base des taux d'IgA anti-TG détectés dans la salive. Les résultats obtenus chez les contrôles sains et chez les contrôles « pathologiques » ne sont pas significativement différents. Seuls deux patients classés comme non coeliaques étaient positifs. Les résultats de cette comparaison sont représentés à la Figure 11. Evaluation du test chez les coeliaques qui suivent un régime sans gluten
Une fois le diagnostic de coeliaquie posé, les patients doivent suivre un régime strict sans gluten et les IgA anti-transglutaminase deviennent non détectables dans le sérum, après des temps variables selon les individus et selon la compliance au régime.
Les IgA anti-TG dans la salive de 16 patients coeliaques sous régime ont aussi été dosées. Les résultats illustrés à la Figure 12 montrent que la plupart des salives sont devenues négatives si bien que ce test peut être utilisé aussi pour le monitoring (suivi) du régime sans gluten.

Claims

Revendications
1. Procédé de détection et/ou dosage d'anticoφs anti-transglutaminase dans un échantillon de salive susceptible de contenir lesdits anticoφs, caractérisé en ce que l'on soumet l'échantillon de salive à un prétraitement, puis en ce que l'on détecte lesdits anticoφs dans la salive prétraitée par une réaction immune avec de la transglutaminase dans des conditions appropriée pour la formation d'immuno-complexes avec lesdits anticoφs.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le procédé comprend la collection des salives dans un dispositif d'échantillonnage puis le prétraitement qui comprend la mise en contact de la salive avec un composé mucolytique.
3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le dispositif d'échantillonnage de salive comprend: un collecteur d'échantillon qui reçoit sélectivement un échantillon de salive; et un indicateur activé par une quantité présélectionnée de l'échantillon de salive reçu pour indiquer que la quantité de l'échantillon de fluide biologique recueilli est adéquate.
4. Procédé selon la revendication 3 caractérisé en ce que le dispositif d'échantillonnage est sélectionné dans le groupe comprenant : Omni-SAL® (Saliva Diagnostic Systems, Inc.), Salivette® (Sarstedt Ltd.), Orapette® (Trinity Biotech) and OraSure® (Epitope, Inc.), de préférence Omni-Sal®.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 4, caractérisé en ce que le composé mucolytique est sélectionné dans le groupe comprenant la N-acétyl-cystéine, la nacystelyn, le dithiothreitol, gelsolin, thioredoxin et EDTA.
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 5, caractérisé en ce que le composé mucolytique est la N-acétyl-cystéine.
7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que la transglutaminase est d'origine humaine, animale, synthétique ou recombinante.
8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que la détection est effectuée dans un immuno-essai, de préférence par couplage direct ou indirect d'un partenaire de réaction ayant une substance de marquage facilement détectable.
9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que la détection s'effectue dans un test ELISA.
10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce qu'on met en contact les immuno-complexes formés avec un conjugué constitué par un anticoφs marqué dirigé contre lesdits anticoφs, dans des conditions appropriées pour la formation d'immuno-complexes marqués, puis on détecte et on quantifie les immuno- complexes marqués.
11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que le conjugué est un anticoφs anti-immunoglobuline marqué à la phosphatase alcaline ou à la peroxydase, puis on détecte et on quantifie la formation d'immuno-complexes marqués par colorimétrie ou fluorimétrie.
12. Utilisation du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11 pour la détection de maladies induites par le gluten.
13. Utilisation selon la revendication 12, caractérisée en ce que la maladie à détecter est la maladie coeliaque.
14. Utilisation du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11 pour le monitoring d'un régime sans gluten.
15. Procédé de diagnostic ou de suivi thérapeutique de la maladie coeliaque, caractérisé en ce que on détecte des anticoφs anti-transglutaminase dans un échantillon de salive susceptible de contenir lesdits anticoφs, caractérisé en ce que l'on soumet l'échantillon de salive à un prétraitement, puis en ce que l'on détecte lesdits anticoφs dans la salive prétraitée par une réaction immune avec de la transglutaminase dans des conditions appropriée pour la formation d'immuno-complexes avec lesdits anticoφs.
16. Procédé de diagnostic ou de contrôle selon la revendication 15, caractérisé en ce que le procédé comprend la collection de la salive dans un dispositif d'échantillonnage puis le prétraitement qui comprend la mise en contact de la salive avec un composé mucolytique.
17. Procédé de diagnostic ou de contrôle selon la revendication 16, caractérisé en ce que le dispositif d'échantillonnage de salive comprend: un collecteur d'échantillon qui reçoit sélectivement un échantillon de salive; et un indicateur activé par une quantité présélectionnée de l'échantillon de salive reçu pour indiquer que la quantité de l'échantillon de fluide biologique recueilli est adéquate.
18. Procédé de diagnostic ou de contrôle selon la revendication 17, caractérisé en ce que le dispositif d'échantillonnage est sélectionné dans le groupe comprenant : Omni-SAL® (Saliva Diagnostic Systems, Inc.), Salivette® (Sarstedt Ltd.), Orapette® (Trinity Biotech) and OraSure® (Epitope, Inc.), de préférence Omni-Sal®.
19. Procédé de diagnostic ou de contrôle selon l'une quelconque des revendications 16 à 18, caractérisé en ce que le composé mucolytique est sélectionné dans le groupe comprenant la N-acétyl-cystéine, la nacystelyn, le dithiothreitol, gelsolin, thioredoxin et EDTA.
20. Procédé de diagnostic ou de contrôle selon l'une quelconque des revendications 16 à 19, caractérisé en ce que le composé mucolytique est la N-acétyl-cystéine.
21. Kit diagnostique pour le diagnostic ou le suivi thérapeutique de la maladie coeliaque selon l'une quelconque des revendications 15 à 20.
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