WO1999040442A1 - Dosage des troponines sans interferences dues a l'heparine - Google Patents

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WO1999040442A1
WO1999040442A1 PCT/FR1999/000198 FR9900198W WO9940442A1 WO 1999040442 A1 WO1999040442 A1 WO 1999040442A1 FR 9900198 W FR9900198 W FR 9900198W WO 9940442 A1 WO9940442 A1 WO 9940442A1
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WO
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heparin
troponin
tnl
polybrene
cardiac
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PCT/FR1999/000198
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Isabelle Karine Giuliani
Catherine Christiane Marie Larue
Maurice Petitou
Sylvie Marie-France Trinquier
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Bio-Rad Pasteur
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Publication date
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6887—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids from muscle, cartilage or connective tissue
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    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
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    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis

Definitions

  • the present invention relates to a method for assaying troponins in biological media making it possible to avoid interference due to heparin.
  • troponin is a myofib llar protein complex, made up of three proteins, troponins I, T and C. This protein complex helps to regulate muscle contraction by the Ca 2+ ion, interacting with myosin and actin. More precisely, it is known that when a nerve impulse arrives at the level of the motor plaque of a muscle, there is generation of an action potential which is transmitted to the sarcoplasmic reticulum. Ca 2+ is then released into the cytosol and binds to troponin C, which leads to a strengthening of the interaction between troponin I and troponin C and, consequently, a change in conformation of the troponin I, T complex. , C. There is then release of the actin-myosin interaction sites, which allows the muscle to contract.
  • the muscle When the muscle is damaged, irreversibly, it is the heart muscle, during myocardial necrosis following a myocardial infarction, or it is the skeletal muscle during prolonged physical exertion, the released troponins appear (more or less quickly) into the bloodstream.
  • the dosage of troponin has recently been advocated for the early diagnosis of myocardial infarction, whether that of troponin T in Circulation (1991,) 83, pp. 902-912, or troponin I in Am. Heart J. (1987), VW, pp. 1333-1344, and Molecular Immunology (1992), 29 (2). pp. 271-278.
  • the assay of cardiac troponin T has been proposed to measure the success of thrombolytic therapy following a myocardial infarction in Br. Heart J., (1994), T ⁇ , pp. 242-248, as well as the assay of skeletal troponin I for the measurement of skeletal muscle damage (D. Rama et al, Clinical Chemistry (1996), 42 n "12. p. 2033). It should be noted that the dosage of
  • heparin-containing equipment heparinized tubes, etc.
  • heparin in addition, before angioplasty or after a myocardial infarction or during certain treatments for cardiovascular conditions, patients are administered significant amounts of heparin and this treatment is often extended beyond 24 hours. Depending on the dose administered, the concentration of heparin in the plasma one hour after administration can vary between 0.1 to 2 IU / ml. The presence of heparin in the blood samples due to the treatment of the patient constitutes an important problem for the dosage of troponins. - 3 -
  • the present invention relates more specifically to an immunological assay method for troponin I (cardiac or skeletal), T or C, and troponins I, T or C associated together in the form of dimers (IT, IC or TC) or in the form trimer (ITC) in a biological sample containing heparin, characterized in that the immunoassay is carried out in the presence of hexadimethrin bromide (polybrene).
  • hexadimethrin bromide polybrene
  • the amount of polybrene used during the immunoassay of troponin I (cardiac or skeletal), T or C, and troponins I, T or C associated with one another in the form of dimers (IT, IC or TC) or under Trimer form (ITC) may vary depending on the immunoassay procedure used.
  • the ratio [molar concentration of the polybrene used / molar concentration of heparin present in the sample to be analyzed] can be from 1 to 1000. Depending on the dosage, it can more specifically be - 4 -
  • the polybrene can be added directly to the biological sample containing or likely to contain heparin or it can be further added to one of the immunoassay reagents such as buffer solutions, solution of the conjugate reagent, etc. It is preferred to add the polybrene in buffer solutions used during the immunoassay.
  • buffer solution includes any solution used in the early immunoassay steps present with the plasma sample. Washing solutions are excluded from this term.
  • the present invention can be implemented with any immunological method allowing the evaluation of troponin I (cardiac or skeletal), T or C, and troponins I, T or C associated with one another in the form of dimers (IT, IC or TC) or in the form of trimer (ITC).
  • troponin I cardiac or skeletal
  • T or C troponins I, T or C associated with one another in the form of dimers (IT, IC or TC) or in the form of trimer (ITC).
  • immunoenzymatic methods are preferred which allow the determination of troponin I (cardiac or skeletal), T or C or of dimers or trimers thereof in a biological sample, which use polybrene to suppress interference due to heparin.
  • the sandwich type methods are preferred.
  • the sandwich type processes can be carried out in one or more stages (two stages, three stages etc.) and use two or more monoclonal or polyclonal antibodies.
  • Patent application WO 96/22535 also describes an immunoenzymatic assay method of the sandwich type allowing the quantitative assay of the cardiac troponin I
  • This method uses for the enzymatic revelation a chemiluminescent substrate, chosen from derivatives of a diacylhydrazine, ie a derivative of 1, 2-d ⁇ oxetane and can be carried out either by a manual system (diagnostic assay kit) or by an automated system Depending on the embodiment, it is possible to carry out either a one-time dosage or a two time
  • a kit allowing the immunoenzymatic assay of troponin T is also commercially available. It is the kit "Troponine T / ES 300 Analyzer” marketed by Boeh ⁇ nger Mannheim, Mannheim Germany (N Genser et al, Clin. Chem Acta (1997). ), 265, pp. 207-217, H Baum et al, Clin Chem (1997), 43/10, p 1877-1977) - 6 -
  • Patent application WO 96/33415 also describes sandwich-type immunoassays for evaluating the amounts of troponins I and T or of troponin I, C and or T complexes in biological media
  • the method according to the invention can be applied as indicated above to any type of troponin immunological method
  • the method according to the invention can be applied during immunoassays (for example as described by C Lame et al in L'Information cardiohack (1991) vol XV n "1. pp 17-21) and fluoroimmunoassays (L Bellanger et al, Clin Chem (1997), vol 43 n ° 6. p S159, n ° 240)
  • troponin I cardiomyalpha-1 (cardiac or skeletal), T or C, and troponins I, T or C associated together in the form of dimers (IT, IC or TC) or in the form of trimer (ITC), to avoid interference due to heparin is part of the present invention
  • the invention also relates to immunoassay kits for troponin I (cardiac or skeletal), T or C and troponins I, T or C associated between - 7 -
  • dimers in the form of dimers (IT, IC or TC) or in the form of trimer (ITC), containing among the immunoassay reagents polybrene.
  • heparin lithium heparinase I
  • heparinase I heparinase I from Flavobacterium heparinum Sigma ref. H 2519
  • L-histidine Sigma ref. H 8000
  • protamine sulfate protamine sulfate grade X from salmon Sigma ref. P 4020
  • antithrombin III antithrombin III from huma ⁇ plasma Sigma ref. A 7388
  • cation exchange resins QSFF (Q Sepharose Fast Flow, Pharmacia Biotech ref. 17051001) and DEAE (DEAE Sepharose Fast Flow, Pharmacia Biotech ref. 17070901).
  • the automated system used for the enzyme immunoassay is the Access® immunoassay system, system marketed by Beckman.
  • the kit used is the Access-Troponin I kit, marketed by the same company.
  • the assay is carried out as follows: into the assay cup are introduced 50 ⁇ l of the sample to be assayed, 25 ⁇ l of a solution - 8 -
  • mouse immunoglobulin 4 mg / ml 10 ⁇ l of a 0.1 M succinic acid solution containing the heparin inhibitor and 50 ⁇ l of the mouse cardiac anti-troponin I monoclonal antibody conjugate 8E1 -phosphatase alkaline (concentration: 5 ⁇ g / ml). After incubation for 5 minutes at 37 ° C., 50 ⁇ l of ferric latex beads are introduced (Rhône Poulenc ref. MI-070/60) to which are fixed by covalent bonds monoclonal anti-troponin I cardiac antibodies of mice 11 E12 .
  • the cardiac anti-troponin I antibodies of mouse heart 8E1 and 11 E12 are part of the Troponin I kit.
  • the mixture is incubated for 36 seconds at 37 ° C., then the ferric latex beads are separated using a magnetic field.
  • the washing is carried out using a Tris pH 8 buffer solution, then 200 ⁇ l of Lumi-Phos® 530 substrate are added. This substrate is also part of the Access-Troponin I kit.
  • the development is carried out at 37 ° C. and the luminescence generated by the reaction is measured with a luminometer.
  • the total analysis time is 15 minutes.
  • a calibration range is carried out corresponding to concentrations between 0 and 50 ⁇ g / l.
  • Heparinase I heparinase I 2 IU / mI 7 IU / ml
  • the Troponine I Pasteur kit was used (Sanofi Diagnostics Pasteur, Marnes-la Coquette, France). The assay is carried out as follows:
  • 150 ⁇ l of a succinate buffer solution comprising polybrene and containing 0.2% Tween® 20, mouse immunoglobulins, are introduced into polystyrene tubes coated with 8E1 mouse cardiac anti-troponin I monoclonal antibodies. non-specific and 0.1% Kathon®, 50 ⁇ l of the anti-troponin I monoclonal antibody conjugate mouse heart 1 1 E12- peroxidase, and 200 ⁇ l of sample to be assayed or of a standard solution used for the range of calibration.
  • human serum containing from 0 to 1.74 ⁇ g / l of purified human cardiac troponin I is used.
  • washing is carried out by adding 1 ml of 0.1 M phosphate buffer, pH 6.8 containing 0.1% Tween® 20 and 0.3% Kathon, keeping the temperature of the washing solution at most 8 ° C. This step is repeated 4 times.
  • the enzymatic development is carried out using 600 ⁇ l of a mixture consisting of 1 part of tetramethylbenzydine and 100 parts of citrate buffer containing 4% DMSO and 0, 03% hydrogen peroxide.
  • Tnl positive serum + diluent 1 160 1,240 Tnl positive serum + heparin 40IU / ml 0.480 1.170
  • the troponin I assay is performed with the Troponine I Pasteur kit (Sanofi Diagnostics Pasteur, Marnes-la Coquette, France).
  • the automated system used for the enzyme immunoassay is the Access® immuoassay system, a system marketed by Beckman.
  • the immunoassay method is that described in Example I.
  • Plasmas from five patients containing heparin were analyzed. The results of this study are given in Table VIII. From this study it emerges that when the automated system described above for the determination of Troponin I is used, it is necessary to use from 60 to 120 mol of polybrene per mol of heparin present in the sample.

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Abstract

L'invention concerne un procédé de dosage immunologique de la troponine I, cardiaque ou squelettique, T ou C et des troponines I, T ou C associées entre elles sous forme de dimères IT, IC ou TC ou sous forme de trimère ITC dans un échantillon biologique contenant de l'héparine, caractérisé en ce que l'on effectue le dosage immunologique en présence de polybrène.

Description

DOSAGE DES TROPONINES SANS INTERFERENCES DUES A L'HEPARINE
La présente invention concerne un procédé de dosage des troponines dans les milieux biologiques permettant d'éviter les interférences dues à l'héparine.
On sait que la troponine est un complexe protéique myofib llaire, constitué de trois protéines, les troponines I, T et C. Ce complexe protéique permet de contribuer à la régulation de la contraction du muscle par l'ion Ca2+, en interagissaπt avec la myosine et l'actine. De façon plus précise, on sait que lorsqu'un influx nerveux arrive au niveau de la plaque motrice d'un muscle, il y a génération d'un potentiel d'action qui est transmis au reticulum sarcoplasmique. Le Ca2+ est alors libéré dans le cytosol et se fixe sur la troponine C, ce qui entraîne un renforcement de l'interaction entre la troponine I et la troponine C et, par suite, un changement de conformation du complexe troponine I, T, C. Il y a alors libération des sites d'interaction actine - myosine, ce qui permet le mouvement de contraction du muscle.
Lorsque le muscle est endommagé, de manière irréversible que ce soit le muscle cardiaque, lors d'une nécrose myocardique consécutive à un infarctus du myocarde, ou que ce soit le muscle squelettique lors d'efforts physiques prolongés, les troponines alors libérées apparaissent (plus ou moins rapidement) dans la circulation sanguine.
Ainsi on a récemment préconisé le dosage de la troponine pour le diagnostic précoce de l'infarctus du myocarde, que ce soit celui de la troponine T dans Circulation (1991,) 83, pp. 902-912, ou de la troponine I dans Am. Heart J. (1987), VW, pp. 1333-1344, et Molecular Immunology (1992), 29 (2). pp. 271-278. De même, on a proposé le dosage de la troponine T cardiaque pour mesurer le succès de la thérapie thrombolytique suite à un infarctus du myocarde dans Br. Heart J., (1994), T±, pp. 242-248, ainsi que le dosage de la troponine I squelettique pour la mesure du dommage des muscles squelettiques (D. Rama et al, Clinical Chemistry (1996), 42 n" 12. p. 2033). Il est à noter que le dosage des
FEUlU€DεflEMPLACΘMÎ {REGLE 26) - 2 -
différentes troponines cardiaques et squelettiques est aujourd'hui un moyen très utile pour le diagnostic de diverses pathologies humaines et animales.
Pour évaluer les différentes troponines cardiaques, on utilise d'habitude des prélèvements sanguins (sérum, plasma ou encore sang total). Toutefois, ce choix peut être limité par la méthode mise en oeuvre, puisqu'on sait que le sérum est un échantillon biologique inapproprié pour certaines méthodes d'évaluation de la troponine, par exemple avec des procédés d'évaluation rapide de la troponine T, et que le sang total ne permet pas toujours de procéder à un dosage quantitatif. En ce qui concerne les immunoessais effectués avec du plasma contenant de l'héparine, souvent, on est confronté à des résultats peu fiables, même lorsque les méthodes utilisées sont très performantes. Ce problème est généralement rencontré dans le cas où la concentration des troponines dans le plasma est peu élevée (P. 0. Collison et al., Ann. Clin. Biochem., (1995), 32, PP- 454-458). En effet, on sait que la présence de l'héparine dans le prélèvement sanguin peut interférer lors des différents immunodosages et modifier ainsi de manière considérable le résultat final et, de ce fait, le diagnostic clinique du praticien. Or, le dosage des troponines est effectué pour le diagnostic ou le suivi des maladies graves ce qui impose l'obtention de résultats très précis. De ce fait, l'utilisation de matériel contenant de l'héparine (tubes héparinés etc.) doit être souvent évitée aussi bien pour effectuer les prélèvements biologiques que pour effectuer les immunodosages.
Par ailleurs, avant une angioplastie ou après un infarctus du myocarde ou encore lors de certains traitements des affections cardio-vasculaires, on administre chez les patients des quantités importantes d'héparine et ce traitement est souvent prolongé au-delà de 24 heures. En fonction de la dose administrée, la concentration de l'héparine dans le plasma une heure après administration, peut varier entre 0,1 à 2 Ul/ml. La présence de l'héparine dans les prélèvements sanguins due au traitement du malade constitue un problème important pour le dosage des troponines. - 3 -
On connaît un certain nombre de produits susceptibles soit de dégrader soit de capter l'héparine tels que l'héparinase I, la L-histidine, le sulfate de protamine, des résines échangeuses de cations etc. Ces produits sont couramment utilisés en biologie comme inhibiteurs de l'héparine. Toutefois, leur utilisation lors de la mise en oeuvre d'un immunoessai, ne permet pas toujours obtenir la suppression des interférences dues à l'héparine et souvent leur présence lors de l'immunodosage peut générer des interférences additionnelles (E. W. Nielsen ét al., J. Immunological Methods, (1994), 173, pp. 245-251).
Il a maintenant été trouvé qu'il est possible éviter les interférences dues à l'héparine lors des immunoessais des différentes troponines. Grâce à l'invention, on est maintenant capable d'effectuer le dosage des troponines sur des échantillons biologiques héparinés ou provenant des malades traités à l'héparine avec une très grande précision, sans diminution des valeurs réelles trouvées dans la circulation sanguine et ceci indépendamment du procédé immunologique utilisé.
La présente invention concerne plus spécialement un procédé de dosage immunologique de la troponine I (cardiaque ou squelettique), T ou C, et des troponines I, T ou C associées entre elles sous forme de dimères (IT, IC ou TC) ou sous forme de trimère (ITC) dans un échantillon biologique contenant de l'héparine, caractérisé en ce que l'on effectue le dosage immunologique en présence de bromure d'hexadiméthrine (polybrene).
La quantité du polybrene mise en oeuvre lors de l'immunodosage de la troponine I (cardiaque ou squelettique), T ou C, et des troponines I, T ou C associées entre elles sous forme de dimères (IT, IC ou TC) ou sous forme de trimère (ITC) peut varier en fonction du procédé de l'immunodosage utilisé. De manière avantageuse, le rapport [concentration molaire du polybrene mis en oeuvre / concentration molaire de l'héparine présente dans l'échantillon à analyser] peut être de 1 à 1000. Selon le dosage, il peut être plus spécialement de - 4 -
30 à 300, de préférence de 60 à 180 ou encore seulement de 1 à 10, de préférence de 4 à 10.
Le polybrene peut être ajouté directement dans le prélèvement biologique contenant ou susceptible de contenir l'héparine ou il peut être encore ajouté dans un des réactifs de l'immunodosage tels que solutions tampons, solution du réactif conjugué etc. On préfère additionner le polybrene dans des solutions tampons utilisées lors de l'immunodosage. Le terme solution tampon inclut toute solution utilisée lors des premières étapes d'immunodosage présente en même temps que l'échantillon plasmatique. Les solutions de lavage sont exclues de ce terme.
La présente invention peut être mise en oeuvre avec tout procédé immunologique permettant l'évaluation de la troponine I (cardiaque ou squelettique), T ou C, et des troponines I, T ou C associées entre elles sous forme de dimères (IT, IC ou TC) ou sous forme de trimère (ITC).
Selon l'invention, on préfère des procédés immunoenzymatiques permettant le dosage de la troponine I (cardiaque ou squelettique), T ou C ou de dimères ou de trimères de ces dernières dans un échantillon biologique, qui utilisent le polybrene pour supprimer les interférences dues à l'héparine. Parmi ces procédés, on préfère les procédés de type sandwich. Les procédés de type sandwich peuvent être réalisés en un ou plusieurs temps (deux temps, trois temps etc.) et mettre en oeuvre deux ou plusieurs anticorps monoclonaux ou polyclonaux.
On connaît déjà des méthodes immunoenzymatiques permettant la détermination de la troponine I. C. La e et al dans Mol. Immunol. (1992), 29(2). pp. 271-278 et Clin. Chem. (1993), 39/6, pp. 972-979 décrivent un procédé de dosage immunoenzymatique de type sandwich qui utilise pour la révélation enzymatique le substrat chromogène tetraméthylbenzydiπe (TMB)- H2O2. Après la révélation, la lecture de l'absorbance est faite à 450 nm et la limite de détection, - 5 -
selon les auteurs, est de 0,2 μg/l Une trousse de dosage mettant en oeuvre cette méthode est disponible dans le commerce (Sanofi Diagnostics Pasteur, Marnes-la Coquette, France) La limite de détection de cette trousse est de l'ordre de 0,03 à 0,04 μg/l (J Mair et al Clin Chim Acta (1996), 245, pp 19-38)
Un autre procédé immunoenzymométπque de la troponine I est décrit par Bodor et al Ce procédé permet de détecter cette dernière à des concentrations de l'ordre de 1 ,5 à 3,1 μg/l (Bodor et al, Clin Chem (1992), 38/11. p 2203-2214 , Adams J et al, Circulation (1993), 88(1). pp 101-106) Ce dosage utilise pour la révélation enzymatique un substrat chromogène de la phosphatase alcaline, le p-nitrophénylphosphate, et la mesure est effectuée à 405 nm
La demande de brevet WO 96/22535 décrit également un procédé de dosage immunoenzymatique de type sandwich permettant le dosage quantitatif de la troponine I cardiaque Ce procédé utilise pour la révélation enzymatique un substrat chimioluminescent, choisi parmi des dérivés d'une diacylhydrazine, soit un dérivé de 1 ,2-dιoxetane et peut être réalisé soit par un système manuel (kit de dosage de diagnostic), soit par un système automatisé Selon le mode de réalisation, il est possible d'effectuer soit un dosage en un temps soit un dosage en deux temps
On connaît aussi le procédé immunoenzymatique utilisé pour le dosage quantitatif automatisé de la troponine I et commercialisé par Dade Diagnostics, Munich Allemagne (L.P Kuhr et al, Eur J Chem Clin Biochem (1997), 35(5). p 399-404)
Une trousse permettant le dosage immunoenzymatique de la troponine T est aussi disponible dans le commerce II s'agit de la trousse « Troponine T / ES 300 Analyzer » commercialisée par Boehπnger Mannheim, Mannheim Allemagne (N Genser et al, Clin. Chem Acta (1997), 265, pp. 207-217 , H Baum et al, Clin Chem (1997), 43/10, p 1877-1977) - 6 -
La demande de brevet WO 96/33415 décrit également des procédés d'immunodosage de type sandwich permettant d'évaluer les quantités des troponines I et T ou de complexes de troponines I, C et ou T dans les milieux biologiques
Un procédé de dosage immunoenzymatique de la troponine I squelettique est décrit par Rama et al dans Clin Chem (1996), 42 n° 2. p 2033
Les procédés immunoenzymatiques pour l'évaluation de la troponine I, cardiaque ou squelettique, T ou C en protéines individuelles, diméπques ou tπdiméπques, cités ci-dessus sont donnés à titre d'exemple et ne constituent pas une liste exhaustive des procédés immunoenzymatiques des troponines connus par l'homme du métier
Le procédé selon l'invention peut être appliqué comme indiqué ci- dessus à tout type de procédé immunologique des troponines
Par exemple, le procédé selon l'invention peut être appliqué lors des immunoessais (par exemple tels que décrits par C Lame et al dans L'information cardiologique (1991) vol XV n" 1. pp 17-21) et les fluoroimmunoessais (L Bellanger et al, Clin Chem (1997), vol 43 n° 6. p S159, n° 240)
L'utilisation du polybrene lors de dosage immunologique de la troponine I (cardiaque ou squelettique), T ou C, et des troponines I, T ou C associées entre elles sous forme de dimères (IT, IC ou TC) ou sous forme de trimère (ITC), pour éviter les interférences dues à l'héparine fait partie de la présente invention
L'invention vise aussi des trousses d'immunodosage de la troponine I, (cardiaque ou squelettique), T ou C et des troponines I, T ou C associées entre - 7 -
elles sous forme de dimères (IT, IC ou TC) ou sous forme de trimère (ITC), contenant parmi les réactifs d'immunodosage du polybrene.
Les exemples suivants sont donnés à titre non limitatif pour illustrer
'invention.
EXEMPLE I
Dosage de la troponine I cardiaque en utilisant des sérums et plasmas surchargés d'héparine - traitement des échantillons avec différents inhibiteurs de l'héparine.
Des sérums humains contenant éventuellement de la troponine I ont été surchargés en héparine une partie des sérums sans héparine a été conservée comme témoin et dosée en même temps. Différents inhibiteurs de l'héparine (héparine lithium) ont été testés notamment l'héparinase I (heparinase I from Flavobacterium heparinum Sigma réf. H 2519), la L-histidine (Sigma réf. H 8000), le sulfate de protamine (protamine sulfate grade X from salmon Sigma réf. P 4020), l'antithrombine III (antithrombine III from humaπ plasma Sigma réf. A 7388) et les résines échangeuses de cations QSFF (Q Sepharose Fast Flow, Pharmacia Biotech réf. 17051001 ) et DEAE (DEAE Sepharose Fast Flow, Pharmacia Biotech réf. 17070901).
Le système automatisé utilisé pour le dosage immunoenzymatique est le système Access® immunoassay, système commercialisé par Beckman. La trousse utilisée est la trousse Access-Troponine I, commercialisée par la même société.
Le dosage est effectué de la manière suivante : dans la cupule du dosage sont introduits 50 μl de l'échantillon à doser, 25 μl d'une solution - 8 -
d'immunoglobulines de souris à 4 mg/ml, 10 μl d'une solution d'acide succinique 0,1 M contenant l'inhibiteur de l'héparine et 50 μl du conjugué anticorps monoclonal anti-troponine I cardiaque de souris 8E1 -phosphatase alcaline (concentration : 5 μg/ml). Après incubation pendant 5 minutes à 37°C, sont introduits 50 μl de billes de latex ferriques (Rhône Poulenc réf. MI-070/60) sur lesquelles sont fixés par des liaisons covalentes des anticorps monoclonaux anti-troponine I cardiaque de souris 11 E12.
Les anticorps monoclonaux anti-troponine I cardiaque de souris 8E1 et 11 E12 font partie de la trousse Troponine I.
Le mélange est incubé pendant 36 secondes à 37°C, puis les billes de latex ferriques sont séparées à l'aide d'un champ magnétique. On procède au lavage à l'aide d'une solution tampon Tris pH 8 on ajoute ensuite 200 μl de substrat Lumi-Phos® 530. Ce substrat fait aussi partie de la trousse Access- Troponine I.
La révélation est effectuée à 37°C et on mesure la luminescence générée par la réaction avec un luminomètre.
Le temps total d'analyse est de 15 minutes.
Pour la gamme d'étalonnage on utilise des solutions de la troponine I cardiaque humaine.
On effectue une gamme d'étalonnage correspondant à des concentrations comprises entre 0 et 50 μg/l.
Les résultats de cette étude sont donnés dans les tableaux I à VI ci- après. TABLEAU I : Essai avec l'héparinase I
Sans Héparinase I Héparinase I héparinase I 2 UI/mI 7 UI/ml
Echantillon C** (ng/ml) C** (ng/ml) C** (ng/ml)
Sérum négatif en Tnl* 0,005 0,000 0,008
Sérum négatif en Tnl+héparine 0,005 0,000 0,011 30UI/ml
Extrait de Tnl+diluant 7,929 8,646 9,148
Extrait de Tnl+ héparine 30UI/ml 2,225 2,506 2,742
Extrait de Tnl+ héparine 60UI/ml 1,913 2,052 2,205
Sérum positif en Tnl+diluant 1,002 1,035 0,975
Sérum positif en Tnl+héparine 0,231 0,252 0,331 30UI/ml
Sérum positif en Tnl+héparine 0,175 0,216 0,286
Figure imgf000011_0001
όOUI/ml
* Tnl = Troponine I
**C = concentration en troponine I
TABLEAU II : Essai avec la L-histidine
Sans L-histidine L-histidine L-histidine x 1000*** 3000***
Echantillon C** (ng/ml) C** (ng/ml) C** (ng/ml)
Sérum négatif en Tnl* 0,014 0,011 0,016
Sérum négatif en Tnl+héparine 20UI/ml 0,012 0,01 1 0,010
Sérum négatif en Tnl+héparine 40UI/ml 0,015 0,013 0,014
Extrait de Tnl+diluant 5,440 5,312 4,794
Extrait de Tnl+ héparine 20UI/ml 1,723 1,721 1,617
Extrait de Tnl+ héparine 40UI/ml 1,497 1,403 1,498
Sérum positif en Tnl+diluant 0,861 0,872 0,925
Sérum positif en Tnl+héparine 20UI/ml 0,256 0,264 0,317
Figure imgf000011_0002
Sérum positif en Tnl+héparine 40UI/ml 0,213 0,249 0,290
* Tnl = Troponine I
** C = concentration en troponine I
*** mol L-histidine / mol héparine 10 -
TABLEAU III Essai avec le sulfate de protamine (protamine)
Sans Protamine Protamine protamine x 1*** 5***
Echantillon C** (ng/ml) C** (ng/ml) C** (ng/ml)
Sérum négatif en Tnl* 0,010 0,000 0,000
Sérum négatif en Tnl+héparine 40UI/ml 0,020 0,000 0,000
Extrait de Tnl+diluant 0,310 0,200 0,050
Extrait de Tnl+ héparine 40UI/ml 0,070 0,020 0,000
Sérum positif en Tnl+diluant 0,570 0,340 0, 100
Figure imgf000012_0001
Sérum positif en Tnl+héparine 40UI ml 0,120 0,050 0,000 -
* Tnl = Troponine I
** C = concentration en troponine I
*** mol sulfate de protamine / mol héparine
TABLEAU IV Essai avec l'antithrombine III
Sans Antithrombine Antithrombine antithrombine HI m ni
2UI/ml 7UI/ml
Echantillon C** (ng/ml) C** (ng/ml) C** (ng/ml)
Sérum négatif en Tnl* 0,000 0,000 0,000
Sérum négatif en Tnl+héparine 0,000 0,000 0,000 30UI/ml
Extrait de Tnl+diluant 11,600 12,130 11,370
Extrait de Tnl+ héparine 30UI/ml 2,800 3,130 2,830
Sérum positif en Tnl+diluant 0,800 0,830 0,830
Sérum positif en Tnl+héparine 0,200 0,200 0,280
Figure imgf000012_0002
30UI/ml
* Tnl = Troponine I
** C = concentration en troponine I - 11
TABLEAU V Essai avec la résine echangeuse de cations QSFF
Echantillon C** (ng/ml)
Sérum négatif en Tnl* 0,000
Sérum négatif en Tnl+héparine 40UI ml 0,010
Sérum négatif en Tnl+héparine 40UI/ml+résine 50mg 0,000
Sérum négatif en Tnl+résine 50mg 0,000
Sérum positif en Tnl+diluant 0,950
Sérum positif en Tnl+héparine 40UI/ml 0, 180
Sérum positif en Tnl+héparine 40UI/ml+résine 50mg 0,110
Sérum positif en Tnl+résine 50mg 0,960
Extrait de Tnl+diluant 5,270
Extrait de Tnl+ héparine 40UI/ml 1,580
Extrait de Tnl+ héparine 40UI/ml+résine 50mg 1,240
Figure imgf000013_0001
Extrait de Tnl+résine 50mg 5, 160
* Tnl = Troponine I
** C = concentration en troponine I
TABLEAU VI Essai avec la résine echangeuse de cations DEAE
Echantillon C** (ng/ml)
Sérum négatif en Tnl* 0,010
Sérum négatif en Tnl+héparine 40UI ml 0,010
Sérum négatif en Tnl+héparine 40UI/ml+résine lmg 0,018
Sérum négatif en Tnl+résine lmg 0,014
Sérum positif en Tnl+diluant 0,910
Sérum positif en Tnl+héparine 40UI ml 0,200
Sérum positif en Tnl+héparine 40UI/ml+résine lmg 0,310
Sérum positif en Tnl+résine lmg 0,410
Extrait de Tnl+diluant 6,080
Extrait de Tnl+ héparine 40UI ml 1,540
Extrait de Tnl+ héparine 40UI/ml+résine lmg 2,610
Figure imgf000013_0002
Extrait de Tnl+résine lmg 3,600
* Tnl = Troponine I
** C = concentration en troponine I - 12 -
Les résultats de cette étude démontrent que ni les inhibiteurs de l'héparine utilisés ni les résines echangeuses de cations ne permettent d'inhiber les interférences dues à l'héparine. Par ailleurs, il a été observé que le sulfate de protamine I entraîne une augmentation importante du bruit de fond (résultats non mentionnés dans le tableau III).
EXEMPLE II
Dosage de la troponine I cardiaque avec un kit immunoenzymatique en utilisant le polybrene pour éviter les interférences dues à l'héparine
Pour l'immunodosage, il a été utilisé la trousse Troponine I Pasteur (Sanofi Diagnostics Pasteur, Marnes-la Coquette, France). Le dosage est effectué de la manière suivante :
Dans des tubes en polystyrène revêtus d'anticorps monoclonaux anti- troponine I cardiaque de la souris 8E1 , on introduit 150 μl d'une solution de tampon succinate comportant du polybrene et contenant du Tween® 20 à 0,2 %, des immunoglobulines de souris non spécifiques et 0,1 % de Kathon®, 50 μl du conjugué anticorps monoclonal anti-troponine I cardiaque de souris 1 1 E12- peroxydase, et 200 μl d'échantillon à doser ou d'une solution étalon utilisée pour la gamme d'étalonnage.
Pour la gamme étalonnage, on utilise du sérum humain contenant de 0 à 1 ,74 μg/l de troponine I cardiaque humaine purifiée.
On incube 15 minutes précisément sous agitation horizontale à température ambiante, puis on procède au lavage des tubes de la façon suivante : - on renverse le contenu des tubes dans un récipient et on éponge les tubes sur un papier absorbant, 13
on procède au lavage en ajoutant 1 ml de tampon phosphate 0, 1 M, pH 6,8 contenant du Tween® 20 à 0,1 % et 0,3 % de Kathon, en maintenant la température de la solution de lavage au plus à 8°C. On répète cette étape 4 fois.
Après avoir procédé au lavage et éliminé toute trace de la solution utilisée pour ce dernier, la révélation enzymatique est effectuée en utilisant 600 μl d'un mélange constitué de 1 partie de tetramethylbenzydine et 100 parties de tampon citrate contenant 4% de DMSO et 0,03% d'eau oxygénée.
On laisse à température ambiante et à l'obscurité pendant 15 minutes et on mesure l'absorbance à λ = 450 nm.
Les résultats de cette étude sont indiqués dans le tableau VII.
TABLEAU VII
Sans Polybrene polybrene x lO***
Echantillon C** (ng/ml) C** (ng/ml)
Sérum négatif en Tnl* 0,000 0,020
Sérum négatif en Tnl+héparine 40UI/ml 0,000 0,000
Extrait de Tnl+diluant 0,950 0,990
Extrait de Tnl+ héparine 40UI/ml 0,410 1,040
Sérum positif en Tnl+diluant 1, 160 1,240
Figure imgf000015_0001
Sérum positif en Tnl+héparine 40UI/ml 0,480 1, 170
* Tnl = Troponine I
** C = concentration en Troponine I
*** mol polybrene / mol héparine
Les résultats du tableau VII démontrent que le polybrene permet d'éviter les interférences dues à l'héparine. Une concentration molaire 10 fois supérieure à celle de l'héparine présente dans l'échantillon est nécessaire lorsque - 14 -
le dosage de la troponine I est effectué avec la trousse Troponine I Pasteur (Sanofi Diagnostics Pasteur, Marnes-la Coquette, France).
EXEMPLE III
Dosage de la troponine I cardiaque avec un système automatisé
Le système automatisé utilisé pour le dosage immunoenzymatique est le système Access® immuoassay, système commercialisé par Beckman. Le procédé de l'immunodosage est celui décrit dans l'exemple I.
Des plasmas de cinq patients contenant de l'héparine ont été analysés. Les résultats de cette étude sont donnés dans le tableau VIII. De cette étude il ressort que lorsque le système automatisé décrit ci-dessus pour le dosage de la Troponine I est employé, il est nécessaire d'utiliser de 60 à 120 mol de polybrene par mol d'héparine présente dans l'échantillon.
TABLEAU VIII
Sans polybrene Polybrene Polybrene Polybrene 60 mois/mol 90 mois/mol 120 mois/mol d'héparine d'héparine d'héparine
Echantillon C* (ng/ml) C* (ng/ml) C* (ng/ml) C* (ng/ml)
1 0,139 0,649 0,800 0,868
2 0,066 0,439 0,520 0,595
3 0,044 0,441 0,541 0,585
4 0,046 0,486 0,660 0,736
Figure imgf000016_0001
5 0,085 0,367 0,471 0,570
C = concentration en Troponine I

Claims

- 15 -
REVENDICATIONS
1 Procédé de dosage immunologique de la troponine I, cardiaque ou squelettique, T ou C et des troponines I, T ou C associées entre elles sous forme de dimères IT, IC ou TC ou sous forme de trimère ITC dans un échantillon biologique contenant de l'héparine, caractérisé en ce que l'on effectue le dosage immunologique en présence de polybrene
2 Procédé de dosage immunologique de la troponine I, cardiaque ou squelettique, T ou C et des troponines I, T ou C associées entre elles sous forme de dimères IT, IC ou TC ou sous forme de trimère ITC selon la revendication 1 caractérisé en ce que le rapport [concentration molaire du polybrene mis en oeuvre / concentration molaire de l'héparine présente dans l'échantillon à analyser] est de 1 à 1000
3 Procédé de dosage immunologique selon les revendications 1 ou 2 caractérise en ce que le rapport [concentration molaire du polybrene mis en oeuvre / concentration molaire de l'héparine présente dans l'échantillon à analyser] est de 1 à 10, de préférence de 4 à 10
4 Procédé de dosage immunologique selon les revendications 1 ou 2 caractérisé en ce que le rapport [concentration molaire du polybrene mis en oeuvre / concentration molaire de l'héparine présente dans l'échantillon à analyser] est de 30 à 300, plus spécialement de 60 à 180
5 Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 caractérisé en ce que le polybrene est additionné dans des solutions utilisées lors des premières étapes du dosage immunologique - 16 -
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 caractérisé en ce que le dosage de la troponine I, cardiaque ou squelettique, T ou C et des troponines I, T ou C associées entre elles sous forme de dimères IT, IC ou TC ou sous forme de trimère ITC est un procédé immunoenzymatique.
7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le procédé immunoenzymatique est de type sandwich.
8. Utilisation du polybrene lors de dosage immunologique de la troponine I, cardiaque ou squelettique, T ou C et des troponines I, T ou C associées entre elles sous forme de dimères IT, IC ou TC ou sous forme de trimère ITC pour éviter les interférences dues à l'héparine.
9. Trousses d'immunodosage de la troponine I, cardiaque ou squelettique, T ou C et des troponines I, T ou C associées entre elles sous forme de dimères IT, IC ou TC ou sous forme de trimère ITC contenant parmi les réactifs d'immunodosage du polybrene.
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