FR3132356A1 - Méthode d’analyse de l’activation plaquettaire héparine dépendante - Google Patents
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Abstract
Méthode d’analyse de l’activation plaquettaire héparine dépendante La présente invention concerne une méthode d’analyse de l’activation plaquettaire induite par des anticorps dirigés contre le facteur plaquettaire 4 (FP4) modifié par un polyanion, de préférence dirigés contre le complexe FP4/héparine, ainsi qu’un procédé de diagnostic in vitro d’une thrombopénie induite par l’héparine ou d’un diagnostic d’exclusion d’une thrombopénie induite par l’héparine chez un patient, comprenant des étapes spécifiques. Figure pour l'abrégé : néant
Description
La présente invention concerne une méthode d’analyse de l’activation plaquettaire induite par des anticorps dirigés contre le facteur plaquettaire 4 (FP4) modifié par un polyanion, de préférence dirigés contre le complexe FP4/héparine, ainsi qu’un procédé de diagnosticin vitrod’une thrombopénie induite par l’héparine ou d’un diagnostic d’exclusion d’une thrombopénie induite par l’héparine chez un patient, comprenant des étapes spécifiques.
La Thrombopénie Induite par l’Héparine (TIH) est une complication sévère des traitements par les héparines. Elle est la conséquence d’une réponse immunitaire atypique caractérisée par la synthèse d’anticorps de classe IgG spécifiquement dirigés contre le facteur plaquettaire 4 (FP4) modifié par un polyanion, par exemple l’héparine (H). Ces anticorps anti-FP4 modifié par un polyanion activent les plaquettes via le récepteur FcγRIIA.
L’héparine est très utilisée en hémodialyse, en chirurgie cardiaque notamment avec Circulation Extra-Corporelle (CEC), dans les procédures d’oxygénation par membrane extracorporelle (ECMO) et en soins intensifs. En pratique courante, une TIH est fréquemment suspectée chez des patients hospitalisés et traités par une héparine, mais ce diagnostic n’est confirmé que chez approximativement 1 à 3% des patients recevant un traitement par héparine non fractionnée (HNF), et plus rarement chez ceux traités par une héparine de bas poids moléculaire (HBPM).
Il est important de souligner que parmi les patients traités par héparine, certains développent des anticorps anti-FP4 modifié par un polyanion qui n’induisent pas d’activation plaquettaire. Ils ne sont pas pathogènes et donc pas responsables d’une TIH. Cela est notamment le cas lors de procédures d’ECMO ou de CEC, lors desquelles près de 50% des patients développent des anticorps anti-FP4 modifié par un polyanion, mais ces anticorps ne sont capables d’activer les plaquettes que dans 2 à 3 % des cas.
La TIH est de fait considérée comme un syndrome clinico-biologique, dont le diagnostic complet repose sur :
1. l’apparition d’un ou plusieurs évènements cliniques associés à la TIH (thrombopénie, thromboses…), et
2. la mise en évidence, dans le plasma ou le sérum du patient, d’anticorps anti-FP4 modifié par un polyanion capables d’activerin vitroles plaquettes en présence d’héparine.
Deux types de tests sont ainsi utilisés pour le diagnostic biologique d’une TIH :
- les tests immunologiques, qui détectent la présence d’anticorps anti-FP4 modifié par un polyanion, quelle que soit leur capacité à activer les cellules ; et
- les tests fonctionnels, qui mettent en évidence une activation héparine-dépendante des plaquettes par ces anticorps. En pratique, une activation plaquettaire est mise en évidence en présence de concentrations thérapeutiques d’héparine (i.e. comprises entre 0.1 et 1 UI/ml d’héparine), alors qu’elle est complètement inhibée par une forte concentration d’héparine (i.e. comprise entre 10 et 100 UI/ml).
L’avantage principal des tests immunologiques est leur grande sensibilité (avec une excellente valeur prédictive négative), expliquant qu’un résultat négatif permette dans une grande majorité des cas d’exclure la maladie. Néanmoins, en raison de leur valeur prédictive positive insuffisante, un résultat positif doit être, dans la grande majorité des cas, associé à un test fonctionnel pour confirmer ou non le caractère pathogène des anticorps et donc le diagnostic de TIH. La combinaison de ces deux types de tests est nécessaire pour affirmer une TIH, ou tout au moins pour améliorer considérablement la spécificité du diagnostic biologique.
A ce jour, tous les tests fonctionnels disponibles nécessitent des plaquettes fraîches ou du sang de donneurs sains. L’effet du plasma ou du sérum des patients sur l’activation des plaquettes est étudié en présence d’héparine. Certains tests ajoutent également du FP4 exogène afin de sensibiliser la détection de l’activation plaquettaire induite par les anticorps pathogènes.
Les tests les plus performants sont le test de libération de sérotonine radiomarquée (SRA ou Serotonin Release Assay) et le test HIPA (Heparin Induced Platelet Agreggation Assay), tous deux réalisés avec des plaquettes lavées fraîches obtenues à partir d’un ou plusieurs donneurs sains. La sensibilité et la spécificité du SRA et du HIPA sont supérieures à 95%.
D’autres tests fonctionnels qui utilisent également des plaquettes de sujets sains sont également disponibles mais présentent de moins bonnes performances. A ce jour, deux tests commerciaux utilisent la technique de cytométrie en flux : Emo-test HIT Confirm® (5-Diagnostics, Basel, Switzerland) et HITAlertTM KIT (IQ Products, DL Groningen, Pays-Bas).
Les performances des tests fonctionnels aujourd’hui disponibles sont variables, avec une hétérogénéité des résultats due à l’utilisation de méthodologies différentes, de la variabilité des plaquettes lavées de donneurs sains, mais également de critères de positivité différents pour confirmer la TIH.
De plus, de nombreux travaux ont mis en évidence une réactivité variable des plaquettes aux anticorps de TIH, ce qui implique qu’il est souvent nécessaire de réaliser ces tests avec les plaquettes de plusieurs sujets sains avant de conclure avec fiabilité à un résultat négatif pour un patient.
L’utilisation de plaquettes de sujets sains comporte de fait plusieurs écueils :
- l’accord préalable des sujets sains doit être obtenu avant prélèvement ;
- la grande difficulté d’accès aux donneurs sains ;
- la sélection des donneurs, en raison d’une grande variabilité de réponse des plaquettes d’un sujet à l’autre ; et
- l’étape de lavage qui peut avoir un impact sur l’activité des paquettes.
Enfin, la grande majorité des tests aujourd’hui disponibles sont réalisés après une étape d’isolement des plaquettes. Or, la TIH résulte d’une activation pluricellulaire induite par les anticorps anti-FP4/H pathogènes. Ainsi, les monocytes et les polynucléaires neutrophiles sont également stimulés par ces anticorps et peuvent potentialiser l’activation plaquettaire. Actuellement, seul un test fonctionnel pour le diagnostic de TIH est réalisé sur sang total (HIMEA: Heparin-Induced Multiple Electrode Aggregometry), mais il nécessite aussi un prélèvement sur un sujet sain.
Il existe donc un très fort besoin, en particulier des laboratoires d’hémostase, pour un test fonctionnel sensible et spécifique, qui ne nécessite pas le prélèvement de donneurs sains et qui ne nécessite également pas d’étape d’isolement des plaquettes.
Le manque de standardisation des tests fonctionnels de diagnostic d’une TIH est aussi un écueil majeur. Les laboratoires d’hémostase ont besoin d’un test fonctionnel dont l’interprétation des résultats soit standardisée et dont le délai de rendu de résultats soit assez court (tel que par exemple moins de 24h à 48h hors week-end).
La présente invention permet de répondre à ces attentes.
La présente invention a ainsi pour objet une méthode d’analyse de l’activation plaquettaire chez un patient suspecté d’avoir une thrombopénie induite par des anticorps anti-FP4 modifié par un polyanion, en particulier des anticorps dirigés contre le facteur FP4 modifié par l’héparine.
La présente invention a également pour objet une méthode de diagnosticin vitrod’une TIH ou de confirmation de diagnostic d’une TIH chez un patient suspecté d’avoir une TIH.
Elle a également pour objet une méthode pour un diagnostic in vitro d’exclusion d’une TIH chez un patient suspecté d’avoir une TIH.
Selon son premier mode de réalisation, la présente invention a pour objet une méthode d’analyse de l’activation plaquettaire héparine dépendante chez un patient suspecté d’avoir une thrombopénie induite par des anticorps anti-FP4 modifié par un polyanion, en particulier des anticorps dirigés contre le facteur FP4 modifié par l’héparine, comprenant les étapes suivantes :
1) la préparation d’une série de tests nécessaires à la validation et à la standardisation, ci-après dénommée série Validation/Standardisation (VS), ladite série Validation/Standardisation comprenant :
- le mélange d’un échantillon de sang total dudit patient, dilué dans un tampon acceptable, en présence de facteur plaquettaire 4 (FP4) exogène, et d’un anticorps monoclonal dirigé spécifiquement contre le facteur plaquettaire 4 modifié par un polyanion, de préférence par l’héparine, ou l’un de ses fragments afin d’obtenir un mélange 1a ;
- au moins un mélange d’un échantillon de sang total dudit patient, dilué dans un tampon acceptable, avec du FP4 exogène, un anticorps monoclonal dirigé spécifiquement contre le FP4 modifié par un polyanion, ou l’un de ses fragments, et de l’héparine en une concentration comprise entre 0.01 et 1 UI/ml, afin d’obtenir au moins un mélange 1b ;
- au moins un mélange d’un échantillon de sang total dudit patient, dilué dans un tampon acceptable, avec du FP4 exogène, un anticorps monoclonal dirigé spécifiquement contre le FP4 modifié par un polyanion, ou l’un de ses fragments, et de l’héparine en une concentration comprise entre 10 et 200 UI/ml, afin d’obtenir au moins un mélange 1c ;
2) la préparation d’une série Test Patient (TP), ladite série Test Patient comprenant :
- le mélange d’un échantillon de sang total dudit patient, dilué dans un tampon acceptable, avec un activateur plaquettaire ou un agoniste fort, afin d’obtenir un mélange Ago ;
- le mélange d’un échantillon de sang total dudit patient, dilué dans un tampon acceptable, afin d’obtenir le mélange Basal ;
- le mélange d’un échantillon de sang total dudit patient, dilué dans un tampon acceptable, avec du FP4, afin d’obtenir un mélange 2a ;
- au moins un mélange d’un échantillon de sang total dudit patient, dilué dans un tampon acceptable, avec du FP4 et de l’héparine en concentration égale à celle utilisée pour le mélange 1b, afin d’obtenir un mélange 2b ;
- au moins un mélange d’un échantillon de sang total dudit patient, dilué dans un tampon acceptable, avec du FP4 et de l’héparine en concentration égale à celle utilisée pour le mélange 1c, afin d’obtenir un mélange 2c ;
3) l’incubation de tous les mélanges des séries VS et TP puis le marquage de la population plaquettaire et le marquage spécifique des plaquettes activées dans cette population dans chaque mélange ; et
4) l’analyse de tous les mélanges obtenus à l’étape 3).
La méthode selon l’invention est une méthodein vitro.
De préférence l’étape 4) d’analyse de tous les mélanges obtenus à l’étape 3) comprend la mesure de l’intensité de marquage spécifique des plaquettes activées dans la population plaquettaire de chaque mélange de la série VS (1a à 1c) et de la série TP (Ago, Basal, et 2a à 2c).
De préférence la méthode de l’invention est une méthode d’analyse par cytométrie en flux.
De préférence, la méthode de l’invention comprend les étapes 1) à 4) énoncées ci-dessus, ainsi que l’étape 5) supplémentaire suivante, suite à l’étape 4) :
5) la validation de la série VS.
Selon l’invention on considère que la série VS est validée si l’on observe :
- une activation des plaquettes de l’échantillon de cette série induite par un anticorps ou fragment d’anticorps dirigé spécifiquement contre le FP4 modifié par un polyanion, en l’absence d’héparine et/ou en présence de faibles concentrations d’héparine, et
- une inhibition de cette activation en présence de fortes concentrations d’héparine.
De préférence, l’étape 5) consiste en la validation de la série VS par le calcul du ratio d’activation de cette série et le calcul du ratio d’inhibition de cette même série.
Au sens de la présente invention, on entend par « activation plaquettaire héparine dépendante » une activation plaquettaire induite par des anticorps (ou fragments d’anticorps) anti-FP4 modifié par un polyanion, ou des anticorps (ou fragments d’anticorps) mimant des anticorps anti-FP4 modifié par un polyanion, qui est observée en l’absence d’héparine et/ou en présence de faibles concentrations d’héparine, et qui est inhibée en présence de fortes concentrations d’héparine.
Par « faible concentration d’héparine », on entend une concentration typiquement comprise entre 0.01 et 1 UI/ml.
Par « forte concentration d’héparine », on entend une concentration typiquement comprise entre 10 et 200 UI/ml.
Suite à l’étape 5), la méthode de l’invention comprend de préférence une étape 5’) de calcul du taux d’activation plaquettaire anticorps-dépendante (nommé APA) des mélanges Ago, 2a, 2b et 2c de la série TP.
Avantageusement la méthode de l’invention est mise en œuvre pour le diagnostic d’exclusion d’une TIH, ou la confirmation d’un diagnostic de TIH chez un patient suspecté d’avoir la maladie.
Dans ce cas la méthode de l’invention comprend les étapes 1) à 5’) énoncées ci-dessus, ainsi qu’une étape d’interprétation des résultats obtenus sur la série TP pour l’établissement d’un diagnostic d’une TIH ou d’une exclusion de TIH.
Selon un mode de réalisation particulier de cette application, la méthode de l’invention comprend les étapes 1) à 5’) énoncées ci-dessus, ainsi qu’une étape 6), dans laquelle l’étape 6) est la suivante :
6) l’interprétation des taux d’activation plaquettaire anticorps-dépendante (APA) calculés dans chaque mélange de la série TP pour l’établissement d’un diagnostic d’une TIH ou d’une exclusion de TIH.
Le procédé selon l’invention, ses étapes et ses conditions opératoires, vont maintenant être détaillés selon les indications ci-dessous.
Le procédé selon l’invention utilise des échantillons de sang total d’un patient. Par « sang total », on entend un échantillon de sang comprenant le plasma et ses éléments figurés (globules rouges, globules blancs et plaquettes et microparticules dérivées).
L’utilisation de sang total du patient permet de s’affranchir de la variabilité de réponse aux anticorps de TIH des plaquettes issues de donneurs sains. Ainsi, le caractère activateur réel des anticorps du patient est directement évalué sur ses propres plaquettes.
Par ailleurs, l’utilisation de sang total du patient permet de bénéficier de la coopération multicellulaire souvent mise en jeu au cours d’une TIH.
In fine, les conséquences d’une activation héparine-dépendante et multicellulaire induite par les anticorps anti- FP4 modifié par un polyanion du patient sur ses propres plaquettes sont évaluées.
De préférence, chaque échantillon est obtenu à partir d’échantillons sanguins dont le prélèvement est réalisé en présence d’un composé empêchant au sang de coaguler. Le composé généralement utilisé est le citrate de sodium, mais d’autres composés tels que l’hirudine ou le mélange acide citrique-citrate trisodique-glucose (ACD) peuvent également être utilisés à cet effet. De tels composés sont connus depuis longtemps de l’état de l’art pour permettre l’étude des fonctions plaquettaires.
De préférence, le volume total d’échantillon de sang total du patient est compris entre 500 µL et 2 ml.
L’échantillon de sang total peut être dilué dans tout tampon physiologiquement acceptable.
On utilise de préférence du sérum physiologique (i.e. solution aqueuse de NaCl 9 g/l), mais d’autres tampons tels que par exemple du tampon PBS avec différentes compositions (par exemple NaN310X ou Citrate NaN310X) peuvent également être utilisés pour la dilution de l’échantillon sanguin.
Tous les échantillons de sang total du patient utilisés dans le procédé selon l’invention sont utilisés non dilués ou dilués jusqu’au 1/10ème, préférentiellement dilués de la proportion 1/2 à 1/10ème, et de préférence au quart, dans du sérum physiologique. Une telle dilution permet d’utiliser du sang thrombopénique (i.e. dans lequel la quantité de plaquettes inférieure à 150 Giga/L).
Typiquement, tous les mélanges des étapes 1) et 2) (séries VS et TP) du procédé de l’invention sont effectués avec le même tampon.
Composition et préparation de la série Validation/Standardisation (VS, étape 1)
La série VS comprend au moins 3 mélanges :
- le mélange 1a, qui correspond au mélange d’un échantillon de sang total dudit patient, dilué dans un tampon acceptable, avec du FP4 exogène et un anticorps monoclonal dirigé spécifiquement contre le FP4 modifié par un polyanion, ou l’un de ses fragments;
- au moins un mélange 1b, qui correspond au mélange d’un échantillon de sang total dudit patient, dilué dans un tampon acceptable, avec du FP4 exogène, un anticorps monoclonal dirigé spécifiquement contre le FP4 modifié par un polyanion, ou l’un de ses fragments, et de l’héparine en une concentration comprise entre 0.01 et 1 UI/ml ; et
- le mélange 1c, qui correspond au mélange d’un échantillon de sang total dudit patient, dilué dans un tampon acceptable, avec du FP4 exogène, un anticorps monoclonal dirigé spécifiquement contre le FP4 modifié par un polyanion, ou l’un de ses fragments, et de l’héparine en une concentration comprise entre 10 et 200 UI/ml.
De préférence, chacun des mélanges 1a à 1c présente un volume compris entre 20 et 200 µl.
En pratique, l’anticorps précité mime parfaitement les effets des anticorps de TIH développés par les patients. Il est utilisé comme contrôle interne de qualité positif et permet ainsi la validation technique du test, ainsi qu’une expression standardisée des résultats, ce qui contribue au caractère innovant de l’invention.
De préférence, la préparation de la série de VS comprend la préparation d’au moins 4 mélanges :
- le mélange d’un échantillon de sang total dudit patient, dilué dans un tampon acceptable, avec du FP4 exogène et un anticorps monoclonal dirigé spécifiquement contre le FP4 modifié par un polyanion, ou l’un de ses fragments, afin d’obtenir le mélange 1a ;
- au moins deux mélanges d’échantillons de sang total dudit patient, dilué dans un tampon acceptable, avec du FP4 exogène, un anticorps monoclonal dirigé spécifiquement contre le FP4 modifié par un polyanion, ou l’un de ses fragments, et de l’héparine en une concentration comprise entre 0.01 et 1 UI/ml, la concentration d’héparine étant différente pour chaque mélange, afin d’obtenir au moins deux mélanges 1b ; et
- le mélange d’un échantillon de sang total dudit patient, dilué dans un tampon acceptable, avec du FP4 exogène, un anticorps monoclonal dirigé spécifiquement contre le FP4 modifié par un polyanion, ou l’un de ses fragments, et de l’héparine en une concentration comprise entre 10 et 200 UI/ml, afin d’obtenir un mélange 1c.
Préférentiellement, deux mélanges 1b (i.e. mélanges 1b’ et 1b’’) sont effectués d’une part avec une concentration en héparine comprise entre 0.01 et 0.1 UI/ml pour le premier mélange 1b’, et d’autre part comprise entre 0.2 et 1 UI/ml pour le second mélange 1b’’. Plus préférentiellement, les deux mélanges 1b sont effectués avec une concentration en héparine comprise entre 0.02 et 0.08 UI/ml, de préférence environ 0.05 UI/ml, pour le premier mélange 1b’ ; et d’autre part avec une concentration en héparine comprise entre 0.3 et 0.8 UI/ml, de préférence environ 0.5 UI/ml, pour le second mélange 1b’’.
Le mélange 1c est obtenu plus préférentiellement avec une concentration en héparine comprise entre 50 et 150 UI/ml, de préférence entre 80 et 120 UI/ml, de préférence environ 100 UI/ml.
Les mélanges 1b (1b’ et 1b’’) miment les effets de faibles concentrations d’héparine, tandis que le mélange 1c mime les effets d’une forte concentration d’héparine.
Anticorps monoclonal dirigé spécifiquement contre le FP4
modifié par un polyanion
Par « anticorps monoclonal dirigé spécifiquement contre le FP4 modifié par un polyanion, ou l’un de ses fragments », on entend un anticorps ou l’un de ses fragments actifs (i) qui se lie au FP4 modifié par un polyanion, et qui ne se lie pas, ou se lie de manière non significative, au FP4 seul, et (ii) qui induit une activation et une agrégation plaquettaire en l’absence et/ou en présence de faibles concentrations d’héparine, et dont l’action est inhibée en présence de fortes concentrations d’héparine. De préférence, un tel anticorps ou l’un de ses fragments actifs (i) se lie au complexe FP4/héparine (« complexe FP4/H »), et ne se lie pas, ou se lie de manière non significative, au FP4 seul, et (ii) induit une activation et une agrégation plaquettaire en l’absence et/ou en présence de faibles concentrations d’héparine, et dont l’action est inhibée en présence de fortes concentrations d’héparine.
Comme cela apparaitra ci-après dans la description de l’invention, les faibles concentrations d’héparine en présence desquelles un tel anticorps active les plaquettes sont généralement comprises entre 0.01 et 1 UI/ml. Les fortes concentrations en présence desquelles on observe une inhibition de l’effet activateur dudit anticorps sont généralement comprises entre 10 et 200 UI/ml, typiquement de l’ordre de 100 UI/ml.
De préférence, cet anticorps est un anticorps entier. De préférence, cet anticorps est une IgG, de préférence une IgG1. Cet anticorps peut être chimérique, humanisé, ou humain. Préférentiellement il comprend un Fc humain.
Par « anticorps », on entend un tétramère fait de deux chaînes lourdes de 50-70 kDa chacune (dites les chaînes H pour Heavy) et de deux chaînes légères d’environ 25 kDa chacune (dites les chaînes L pour Light), liées par des ponts disulfures intra et inter-caténaires et identiques entre elles. Ce tétramère comprend au moins deux régions variables à l’extrémité N-terminale de chaque chaîne (dites VL pour les chaînes légères et VH pour les chaînes lourdes) et une région constante en extrémité C-terminale, constituée d’un seul domaine dit CL pour la chaîne légère et de trois ou quatre domaines pour la chaîne lourde appelés CH1, CH2, CH3 et éventuellement CH4. La région qui détermine la spécificité de l’anticorps pour l’antigène est portée par les parties variables VH et VL, ce sont ces parties qui sont responsables de la reconnaissance de l'antigène. Dans chaque région variable VH et VL, trois boucles sont rassemblées pour former un site de liaison à l'antigène. Chacune des boucles est appelée une Région Déterminant la Complémentarité (ou CDR).
L’assemblage des chaînes qui composent un anticorps permet de définir une structure tridimensionnelle caractéristique en Y, où
- la base du Y correspond à la région constante Fc, ou fragment Fc : elle est reconnue par des protéines du complément et les récepteurs Fc afin de médier les fonctions effectrices de l’anticorps, et
- les extrémités des bras du Y correspondent à l’assemblage respectif de la région variable VL d’une chaîne légère et de la région variable VH d’une chaîne lourde, lesdites extrémités constituant la région Fab et déterminant la spécificité de l’anticorps pour l’antigène.
Le fragment Fab a la même affinité pour l'antigène que l'anticorps complet. Le fragment Fab est formé de la chaîne légère en entier (VL+CL) et d'une partie de la chaîne lourde (VH+CH1). Il est monovalent.
De préférence, l’anticorps monoclonal (ou l’un de ses fragments) dirigé spécifiquement contre le FP4 modifié par un polyanion, et de préférence contre le complexe FP4/H, comprend les séquences VH et VL codées par les séquences nucléiques suivantes :
Séquence nucléique codant pour la région variable VL (VJ) :
GAAATTGTGCTCACCCAGTCTCCAACCACCATGGCTGCATCTCCCGGGGAGAAGATCACTATCACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTATAAGTTCCAATTACTTGCATTGGTATCAGCAGAAGCCAGGATTCTCCCCTAAACTCTTGATTTATAGGACATCCAATCTGGCTTCTGGAGTCCCAGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATTGGCACCATGGAGGCTGAAGATGTTGCCACTTACTACTGCCAGCAGGGTAGTAGTATACCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGG (SEQ ID NO :1)
Séquence nucléique codant pour la région variable VH (VDJ) :
GATGTGCAGCTTCAGGAGTCAGGACCTGACCTGGTGAAACCTTCTCAGTCACTTTCACTCACCTGCACTGTCACTGGCTACTCCATCACCAGTGGTTATAGCTGGCACTGGATCCGGCAGTTTCCAGGAAACAAACTGGAATGGATGGGCTACATACACTACAGTGGTAGCACTAACTACAACCCATCTCTCAAAAGTCGAATCTCTATCACTCGAGACACATCCAAGAACCAGTTCTTCCTGCAGTTGAATTCTGTGACTACTGAGGACACAGCCACATATTACTGTGCAAGAGAACTACGGCTACGGTACTTCGATGTCTGGGGCGCAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCC (SEQ ID NO :2)
De préférence, l’anticorps monoclonal (ou l’un de ses fragments) dirigé spécifiquement contre le FP4 modifié par un polyanion, et de préférence contre le complexe FP4/H selon l’invention comprend :
- comme région variable VH, la séquence d’acides aminés codée par SEQ ID NO :2, et
- comme région variable VL, la séquence d’acides aminés codée par SEQ ID NO :1.
Un tel anticorps est notamment l’anticorps 5B9, décrit en particulier dans Kizlik-Masson et al (Journal of Thrombosis and Haemostasis, 15: 2065–2075, 2017, 5B9, a monoclonal antiplatelet factor 4/heparin IgG with a human Fc fragment that mimics heparin-induced thrombocytopenia antibodies).
Comme indiqué ci-dessus, un tel anticorps est utilisé dans le procédé selon l’invention en tant que contrôle interne de qualité positif, ce qui permet une expression standardisée des résultats en tenant compte de l’activation plaquettaire mesurée avec cet anticorps.
Composition et préparation de la série Test Patient (TP, étape 2)
La série Test Patient (TP) comprend 5 mélanges dont 2 supplémentaires par rapport à la série Validation/Standardisation : le mélange Ago et le mélange Basal.
Les mélanges 2a, 2b (éventuellement 2b’ et 2b’’) et 2c sont similaires aux mélanges 1a, 1b (éventuellement 1b’ et 1b’’) et 1c respectivement (i.e. mêmes quantités, mêmes ingrédients et mêmes volumes). Les 5 mélanges de la série Test Patient (TP) ne comprennent toutefois pas l’ajout d’anticorps monoclonal dirigé spécifiquement contre le FP4 modifié par un polyanion, ou l’un de ses fragments.
La série Test Patient permet d’évaluer la capacité des anticorps anti-FP4 modifié par un polyanion présents dans le sang du patient à induire (i) l’activation des plaquettes en l’absence d’héparine et/ou en présence de faibles concentrations d’héparine, et (ii) leur inactivation en présence de fortes concentrations d’héparine.
La présence d’un activateur plaquettaire ou agoniste fort dans le mélange Ago a pour but d’activer l’ensemble de la population plaquettaire, et constitue un contrôle d’activation plaquettaire non spécifique permettant de définir le seuil de positivité du marqueur de l’activation des plaquettes.
L’agoniste fort est connu dans l’état de la technique. Parmi les différents agonistes forts, on peut notamment citer les TRAP (thrombin receptor activator peptides, avec 6 ou 14 acides aminés), le calcium ionophore A23187 (formule chimique ci-après), l’acide arachidonique, l’adénosine diphosphate (ADP), ou bien la thrombine et ses dérivés. De préférence, deux types d’agonistes forts sont utilisés selon le marquage final de l’activation plaquettaire : de préférence, l’agoniste fort est choisi parmi les TRAP (thrombin receptor activator peptides, avec 6 ou 14 acides aminés) ou le calcium ionophore A23187, dont la formule chimique est indiquée ci-dessous :
Le mélange Basal est un contrôle réalisé afin d’avoir le niveau basal d’activation plaquettaire. Le tampon du mélange Basal est un tampon connu de l’art antérieur. De préférence le tampon du mélange Basal est un tampon salin tel qu’un tampon PBS, un tampon PBS-BSA 1%, un tampon de Tyrodes HEPES-BSA 1%, un tampon PBS-BSA-NaN310X, un tampon PBS-citrate-NaN310X ou un tampon PBS 10X-NaN3.
Ces deux contrôles (Ago et Basal) permettent de positionner les seuils de positivité des marqueurs utilisés pour déterminer le taux d’activation plaquettaire anticorps-dépendante.
De préférence, la préparation de la série Test Patient comprend :
- le mélange d’un échantillon de sang total dudit patient, dilué dans un tampon acceptable, avec l’agoniste fort, afin d’obtenir le mélange Ago ;
- le mélange d’un échantillon de sang total dudit patient, dilué dans un tampon acceptable, avec un tampon, afin d’obtenir un mélange Basal ;
- le mélange d’un échantillon de sang total dudit patient, dilué dans un tampon acceptable, avec du FP4, afin d’obtenir le mélange 2a ;
- au moins un mélange d’un échantillon de sang total dudit patient, dilué dans un tampon acceptable, avec du FP4 et de l’héparine en concentration égale à celle utilisée pour le mélange 1b, afin d’obtenir un mélange 2b. De préférence, on réalise au moins deux mélanges d’un échantillon de sang total dudit patient, dilué dans un tampon acceptable, avec du FP4 et de l’héparine, afin d’obtenir au moins deux mélanges 2b (2b’ et 2b’’), la concentration d’héparine de chaque mélange 2b étant égale à celle de chaque mélange 1b ;
- le mélange d’un échantillon de sang total dudit patient, dilué dans un tampon acceptable, avec du FP4 et de l’héparine en concentration égale à celle utilisée pour le mélange 1c, afin d’obtenir un mélange 2c.
De préférence, les étapes 1) et 2) du procédé selon l’invention sont réalisées après 4h, de préférence après 12h, de préférence après 24h après l’obtention des échantillons de sang total du patient. De préférence, les étapes 1) et 2) du procédé selon l’invention sont réalisées au plus tard 72h, de préférence au plus tard 48h après l’obtention des échantillons de sang total du patient.
Le procédé selon l’invention permet ainsi de générer une activation plaquettaire héparine-dépendante, directement évaluée dans le sang total du patient, sur ses propres plaquettes. Ceci confère à l’invention un avantage considérable par rapport aux tests proposés dans l’état de l’art, puisqu’elle s’affranchit des contraintes liées à la fourniture de lots de plaquettes de donneurs sains, fourniture jusqu’alors requise par les tests antérieurs à l’invention.
Une fois chaque série préparée, tous les mélanges des étapes 1) et 2) sont incubés, puis les plaquettes activées sont marquées.
L’incubation est typiquement réalisée pendant une durée de 10 minutes à 4 heures à une température comprise entre 18°C et 37°C.
De préférence, le marquage des plaquettes est effectué en utilisant au moins un marqueur spécifique de la population plaquettaire et au moins un marqueur spécifique de l’état d’activation des plaquettes. Le marquage des plaquettes peut être effectué en utilisant au moins un marqueur spécifique de la population plaquettaire et possiblement deux marqueurs spécifiques de l’état d’activation des plaquettes.
Ce marquage par un marqueur spécifique de l’état d’activation des plaquettes consiste à révéler et quantifier la présence de tout composé ou molécule dont l’expression, la synthèse ou l’activation est induite lorsque les plaquettes sont dans un état activé et dont le taux d’expression de synthèse ou d’activation peut permettre d’évaluer le taux d’activation plaquettaire.
De préférence le composé est choisi parmi des molécules ou antigènes exprimées à la surface des plaquettes, tels que la P-sélectine (ou CD62P), la phosphatidylsérine (PS), la protéine LAMP-3 (ou CD63), l’ADP, l’ATP, des protéines phosphorylées ou leurs combinaisons. De préférence, les composés utilisés pour le marquage sont la P-sélectine (ou CD62P) et la phosphatidylsérine (PS).
Afin d’identifier et/ou de quantifier ce(s) composé(s), on utilise préférentiellement des anticorps ou fragments d’anticorps dirigés contre ce(s) dernier(s), ou des molécules capables de reconnaître spécifiquement le(s) composé(s) choisi(s) et de le mettre en évidence.
Typiquement, le CD62P (ou P-sélectine) est un candidat pertinent pour évaluer l’activation plaquettaire. CD62P est en effet une protéine contenue dans les granules alpha des plaquettes, qui est exprimée à la surface des plaquettes au cours de l’activation plaquettaire.
Un anticorps anti-CD62P est donc préférentiellement utilisé pour marquer l’expression de CD62P.
En complément au CD62P, ou bien alternativement à celui-ci, la protéine Annexine V (ou AnxV) peut également permettre de mettre en évidence l’activation des plaquettes. Elle possède une forte affinité pour la phosphatidylsérine (PS), qui, initialement localisée dans le feuillet cytoplasmique de la cellule au repos, est exposée à la surface des plaquettes activées.
Lorsque l’Annexine V est utilisée comme marqueur, tous les mélanges utilisés dans le procédé selon l’invention (étapes 1 et 2) sont effectués en ajoutant un inhibiteur de la thrombine. Un tel inhibiteur de la thrombine est de préférence un inhibiteur direct de la thrombine, préférentiellement l’hirudine ou l’argatroban. L’ajout de cet inhibiteur évite la formation de thrombine, et secondairement de fibrine. Par ailleurs, lorsque l’Annexine V est utilisée comme marqueur, tous les mélanges utilisés dans le procédé selon l’invention (étapes 1 et 2) sont effectués en ajoutant un tampon calcique. En effet, l’ajout d’un tampon calcique est indispensable à l’exposition des phosphatidylsérines et donc au marquage par l’Annexine V.
En parallèle, un marquage spécifique de la population plaquettaire est utilisé, en ciblant un composé exprimé à la surface par toutes les plaquettes. Un tel composé est par exemple le marqueur CD41, le marqueur CD61 ou encore la combinaison de ces marqueurs CD41/CD61. De préférence, un anticorps anti-CD41 est utilisé pour le marquage spécifique des plaquettes dans l’échantillon.
De préférence, les marqueurs utilisés sont couplés avec des fluorochromes, par exemple des protéines fluorescentes. De tels fluorochromes sont bien connus dans l’état de la technique, et sont par exemple l’allophycocyanine (APC), la phycoérythrine (PE), la phycoérythrine (PE)-Cy5 ou Cy7, la PerCP, la PerCP-Cy5.5, la fluorescéine (FITC) ou encore les Alexa Fluor dyes.
L’utilisation de deux témoins d’activation plaquettaire (par exemple CD62P et PS) peut permettre d’optimiser les performances du procédé, en particulier en termes de spécificité et de sensibilité.
De préférence, avant l’analyse de l’ensemble des mélanges, préférentiellement sur un cytomètre en flux, un important volume de tampon acceptable, typiquement compris entre 100 µl et 5 ml, est ajouté dans chaque mélange. Cette dernière étape permet de ralentir l’activation des plaquettes induites au cours des étapes 1 et 2, avant l’analyse. Le tampon est de préférence le même que celui utilisé spécifiquement pour le marquage de la P-sélectine ou des phosphatidylsérines par l’Annexine V.
Analyse des mélanges incubés
avec des marqueurs
et
calcul du taux d’activation plaquettaire à partir de la
mesure de l’intensité de marquage spécifique des plaquettes activées dans la population plaquettaire de chaque mélange (étape
s 4 et
5
’
)
Une fois les marquages des plaquettes effectués, ces derniers sont analysés, et ce de préférence en cytométrie en flux.
En effet, la technique de cytométrie en flux est un outil particulièrement efficace pour évaluer une activation des plaquettes en présence d’un nombre réduit d’éléments cellulaires. Cela est d’intérêt majeur en l’espèce, puisque le sang des patients avec une suspicion de TIH est le plus souvent thrombopénique.
Ainsi, selon ce mode de réalisation préféré, l’étape 4) d’analyse de tous les mélanges obtenus à l’étape 3) comprend la mesure du taux d’expression de CD62P et/ou l’exposition de la phosphatidylsérine à la surface des plaquettes (via le marquage par l’Annexine V) de chaque mélange.
Optionnellement, la méthode comprend en outre une étape 5’) de calcul du taux d’activation plaquettaire anticorps-dépendante (APA) dans chacun de ces mélanges.
Selon un mode de réalisation préféré, l’analyse des plaquettes des mélanges de chacune des 2 séries Validation/Standardisation et Test Patient (étape 4) ainsi que le calcul du taux d’activation plaquettaire anticorps-dépendante (APA) des mélanges Ago, 2a, 2b et 2c de la série TP (étape 5’) sont réalisées selon une stratégie de fenestrage présentée dans l’exemple, dont la description est donnée plus en détails ci-après.
Brièvement, la stratégie de fenestrage proposée comporte les étapes ci-après :
- a) un premier tri est effectué à partir de la mesure de l’intensité de marquage d’un composé spécifique de la population plaquettaire pour ne sélectionner que les plaquettes parmi les autres éléments du sang de chaque mélange, sur le pic d’un premier histogramme ;
- b) dans la population plaquettaire sélectionnée, la médiane d’intensité de marquage d’un composé exprimé par les plaquettes activées (i.e. marqueur spécifique de l’état d’activation des plaquettes), par exemple CD62P et/ou PS via le marquage par l’annexine V, est mesurée pour l’ensemble des mélanges de chaque série sur le pic d’un second histogramme ;
- c) on détermine un seuil permettant de distinguer les plaquettes non activées des plaquettes activées sur un troisième histogramme, placé à l’intersection entre le pic obtenu avec le mélange Ago (i.e. état d’activation maximal des plaquettes) dans l’étape précédente b) et le pic obtenu avec le mélange Basal (i.e. état basal d’activation plaquettaire) ; et
- d) après avoir repositionné ce seuil sur le second histogramme, le pourcentage de plaquettes activées doublement marquées (i.e. événements cellulaires à droite du seuil) est calculé pour chacun des mélanges de chacune des 2 séries.
Selon un mode préféré d’expression des résultats, on calcule dans l’étape b) la médiane d’intensité de marquage total du composé exprimé par les plaquettes activées (i.e. marqueur spécifique de l’état d’activation des plaquettes). Le marquage étant de préférence réalisé avec des marqueurs fluorescents, on mesure donc la médiane d’intensité de fluorescence (MFI).
Dans ce cas, pour chacune des conditions, les résultats sont exprimés en multipliant le pourcentage (%) de cellules doublement positives pour le marqueur de la population plaquettaire et pour le marqueur spécifique de l’état d’activation des plaquettes (i.e. par exemple CD41+/CD62P+), par la MFI totale du marqueur spécifique de l’état d’activation des plaquettes dans la population plaquettaire (i.e. MFI du marquage total CD62P/CD41+) (%×MFI). Ces résultats sont exprimés en unités arbitraires (UA).
Validation technique de la série Validation/Standardisation (étape 5)
De préférence, la méthode de l’invention comprend les étapes 1) à 5’) énoncées ci-dessus.
Selon l’invention, on considère que la série VS est validée si l’on observe :
- une activation des plaquettes de l’échantillon de cette série induite par un anticorps ou fragment d’anticorps dirigé spécifiquement contre le FP4 modifié par un polyanion en l’absence d’héparine et/ou en présence de faibles concentrations d’héparine, et
- une inhibition de cette activation en présence de fortes concentrations d’héparine.
De préférence, l’étape 5) consiste en la validation de la série VS par le calcul du ratio d’activation de cette série et du ratio d’inhibition de cette même série. Ainsi, selon ce mode de réalisation, deux critères sont pris en compte pour valider techniquement la série Validation/Standardisation :
Premièrement, dans la série VS, une activation doit être observée avec l’ajout de l’anticorps monoclonal dirigé spécifiquement contre le FP4 modifié par un polyanion, ou l’un de ses fragments, de préférence l’anticorps 5B9, et de FP4 en absence et/ou en présence de faibles concentrations d’héparine. Ainsi, le ratio d’activation de la série VS est calculé entre le mélange Basal en l’absence d’héparine et de FP4, et le maximum d’activation plaquettaire obtenu en présence de faibles concentrations d’héparine testée, indiqués mélanges 1b. Ce ratio d’activation de la série VS est calculé avec la formule suivante :
Dans un deuxième temps, la dépendance à l’héparine de l’activation plaquettaire induite par l’anticorps monoclonal dirigé spécifiquement contre le FP4 modifié par un polyanion, ou l’un de ses fragments, de préférence l’anticorps 5B9, est évaluée en calculant le ratio d’inhibition en présence de la forte concentration d’héparine testée. Ce ratio d’inhibition de la série VS est calculé avec la formule suivante :
La série Validation/Standardisation est validée uniquement si les deux critères précédents sont remplis :
- Ratio d’activation série VS ≥ valeur-seuil, ladite valeur-seuil étant définie à partir de moyenne obtenue avec population éch et en écartant les valeurs aberrantes; et
- Ratio d’inhibition série VS supérieur ou égal à une valeur-seuil, ladite valeur-seuil étant comprise entre 0,3 et 0,7, de préférence entre 0,4 et 0,6, de préférence environ 0,5.
De préférence, le seuil de positivité du ratio d’activation de la série VS est d’au moins 5 pour le protocole CD62P et d’au moins 4 pour le protocole Annexine V.
Interprétation des résultats de la série Test Patient pour le diagnostic de la Thrombopénie Induite par l’Héparine
ou pour un diagnostic d’exclusion
(étape
s 5’ et
6)
Les résultats validés de la série Validation/Standardisation permettent de calculer le taux d’activation plaquettaire anticorps-dépendante (dénommé APA) pour les mélanges Basal, 2a, 2b et 2c de la série Test Patient (étape 5’). Ce taux, exprimé ici en pourcentage, est calculé à partir des résultats bruts (% x MFI) exprimés en UA obtenus sur les deux séries grâce à la formule suivante :
Ce calcul permet de s’affranchir d’une réactivité variable des plaquettes d’un patient à l’autre et d’une manipulation à une autre en standardisant l’expression des résultats obtenus sur la série Test Patient.
En parallèle, il est également possible, si l’APA maximal est supérieur au seuil défini, de calculer le pourcentage d’inhibition de la série TP selon la formule suivante :
Les pourcentages d’activation et d’inhibition ainsi calculés sont comparés à des valeurs-seuils de positivité et d’inhibition établies à partir de cohortes d’échantillons contrôles positifs et négatifs, ces valeurs-seuils étant fonction du marqueur considéré et de son taux d’expression à la surface des plaquettes.
Selon les résultats fournis par ce mode de réalisation, l’invention permet donc de diagnostiquer une TIH chez un patient ou d’exclure un diagnostic de TIH chez un patient suspecté d’avoir la maladie. De préférence, un diagnostic d’exclusion d’une TIH est établi lorsque aucune activation plaquettaire n’est observée en présence de faibles concentrations d’héparine sur la série TP du patient. De préférence, un diagnostic de TIH chez un patient suspecté d’avoir la maladie est confirmé lorsque l’on observe une activation plaquettaire de la série TP du patient en présence de faibles concentrations d’héparine, et une inhibition de l’activation plaquettaire en présence de fortes concentrations d’héparine.
Les résultats d’analyse ainsi obtenus sont interprétés de la façon suivante (étape 6) :
I/ Un diagnostic positif de TIH est confirmé lorsque les deux conditions ci-dessous sont vérifiées pour la série Test Patient :
- une forte activation plaquettaire (valeur supérieure ou égale au seuil de positivité) doit être observée en présence de faibles concentrations d’héparine (mélange 2b) ; et
- une inhibition de cette activation plaquettaire (valeur supérieure ou égale au seuil d’inhibition) doit être observée en présence de la forte concentration d’héparine testée (mélange 2c). Cette deuxième condition permet de vérifier la dépendance à l’héparine de l’activation plaquettaire induite par les anticorps anti-FP4 modifié par un polyanion présents dans le sang du patient.
II/ Un diagnostic d’exclusion de la TIH est établi dans les deux cas de figures suivants :
- si l’APA est inférieur au seuil de positivité en présence de faibles concentrations d’héparine (mélange 2b) ; ou
- si l’APA est supérieur au seuil de positivité, mais que le pourcentage d’inhibition est inférieur au seuil de négativité.
III/ Le test est considéré douteux si l’APA est supérieur ou égal au seuil de positivité en présence de faibles concentrations d’héparine (mélange 2b), mais que le pourcentage d’inhibition à la forte concentration d’héparine (mélange 2c) est dans la zone grise, c’est-à-dire compris entre le seuil de négativité et le seuil de positivité. Dans ce cas, le test devra être réitéré de préférence sur un nouveau prélèvement.
Lorsque la méthode est mise en œuvre avec le marquage du CD62P ou avec l’annexine V, les résultats sont interprétés comme suit :
I/ Le test est considéré positifsi l’APA est supérieur ou égal au seuil défini en présence de faibles concentrations d’héparine (mélange 2b) et que le pourcentage d’inhibition en présence de la forte concentration d’héparine (mélange 2c) est supérieur ou égal à 50 %.
Le seuil de positivité de l’APA sera défini sur une population de n malades sous traitements par héparine avec une thrombopénie ou une chute de la numération plaquettaire supérieure ou égale à 40 % après instauration du traitement héparinique. Deux méthodologies différentes peuvent être utilisées :
- Le seuil de positivité de l’APA peut être défini à l’aide d’une courbe ROC en privilégiant une spécificité supérieure à 95 %. Pour cela, les patients avec un ELISA négatif et un SRA négatif sont considérés comme ne présentant pas la maladie, alors que les patients avec un ELISA positif et un SRA positif sont considérés comme présentant la maladie. Cette méthodologie permet de définir le seuil de positivité de l’APA max à 20 % d’activation plaquettaire anticorps-dépendante.
- Le seuil de positivité de l’APA peut également être défini par la moyenne et l’écart-type des valeurs d’APA mesurées dans une population de patients ayant une suspicion de TIH avec un test ELISA négatif et un test SRA négatif.
II/ Le test est considéré négatifdans les deux cas de figures suivants :
- si l’APA est inférieur au seuil défini en présence de faibles concentrations d’héparine (mélange 2b) ; ou
- si l’APA est supérieur au seuil défini en présence de faibles concentrations d’héparine (mélange 2b), mais que le pourcentage d’inhibition est inférieur au seuil de négativité.
III/ Le test est considéré douteuxsi l’APA est supérieur ou égal au seuil défini en présence de faibles concentrations d’héparine (mélange 2b) mais que le pourcentage d’inhibition à la forte concentration d’héparine (mélange 2c) est compris entre 30 et 50 %. Dans ce cas, le test devra être réitéré de préférence sur un nouveau prélèvement.
I/ Le test est considéré positifsi l’APA est supérieur ou égal au seuil défini en présence de faibles concentrations d’héparine (mélange 2b) et que le pourcentage d’inhibition en présence de la forte concentration d’héparine (mélange 2c) est supérieur ou égal à 50 %.
Le seuil de positivité de l’APA sera défini sur une population de n malades sous traitements par héparine avec une thrombopénie ou une chute de la numération plaquettaire supérieure ou égale à 40 % après instauration du traitement héparinique. Deux méthodologies différentes peuvent être utilisées :
- Le seuil de positivité de l’APA peut être défini à l’aide d’une courbe ROC en privilégiant une spécificité supérieure à 95 %. Pour cela, les patients avec un ELISA négatif et un SRA négatif sont considérés comme ne présentant pas la maladie alors que les patients avec un ELISA positif et un SRA positif sont considérés comme présentant la maladie. Cette méthodologie permet de définir le seuil de positivité de l’APA max à 27 % d’activation plaquettaire anticorps-dépendante.
- Le seuil de positivité de l’APA peut également être défini par la moyenne et l’écart-type des valeurs d’APA mesurées dans une population de patients ayant une suspicion de TIH avec un test ELISA négatif et un test SRA négatif.
II/ Le test est considéré négatifdans les deux cas de figures suivants :
- si l’APA est inférieur au seuil défini en présence de faibles concentrations d’héparine (mélange 2b) ; ou
- si l’APA est supérieur au seuil défini en présence de faibles concentrations d’héparine (mélange 2b) mais que le pourcentage d’inhibition est inférieur au seuil de négativité.
III/ Le test est considéré douteuxsi l’APA est supérieur ou égal au seuil défini en présence de faibles concentrations d’héparine (mélange 2b) mais que le pourcentage d’inhibition à la forte concentration d’héparine (mélange 2c) est compris entre 30 et 50 %. Dans ce cas, le test devra être réitéré de préférence sur un nouveau prélèvement.
L’invention est maintenant illustrée avec l’exemple suivant, lequel exemple décrit un mode de réalisation de l’invention par cytométrie en flux avec les marqueurs CD62P et Annexine V, selon une stratégie de fenestrage et une méthode d’interprétation des résultats telles qu’indiquées ci-dessus pour l’établissement d’un diagnostic d’exclusion de TIH ou de confirmation de diagnostic de TIH.
Exemple : Mise en œuvre d’un procédé selon l’invention
| Nom | Fournisseur | Composition |
| Sérum physiologique | Laboratoire Aguettant | NaCl 9 g/l |
| Anticorps 5B9 | Diagnostica Stago | Anticorps monoclonal anti-FP4/H lyophilisé en tampon Hepes - Tréhalose - BSA |
| TRAP-6 | Agro-Bio | |
| TRAP-14 | PolyPeptide Laboratories | |
| Héparine sodique | PANPHARMA | |
| FP4 | Diagnostica Stago | |
| PBS | Immuno Concepts | |
| Calcium ionophore A23187 | Sigma | |
| Tampon calcique | 1.4 M de NaCl, 25 mM de CaCl2, 0.1 M d’HEPES, pH 7.4 | |
| Arganova | Laboratoire Aguettant | Argatroban |
| Hirudin | Diagnostica Stago | |
| Anticorps anti-CD41-APC | Miltenyi | |
| Anticorps anti-CD41-PE | BioCytex | |
| Anticorps anti-CD62P-PE | BioCytex | |
| Annexine V-FITC | Miltenyi Biotech |
2/ Description du test (procédé selon l’invention) :
Le test selon l’invention est réalisé avec le sang total du patient prélevé sur citrate de sodium (3.2%, 1:9, 0.109 mmol/l) et dilué dans du sérum physiologique (NaCl 9 g/l).
A partir du sang du patient, deux séries de tests sont réalisées :
- la série Validation/Standardisation est réalisée après ajout dans le sang total du patient de l’anticorps monoclonal chimérique 5B9, qui mime les anticorps de TIH développés par les patients. Cette série permet :
o d’une part, de valider la technique en évaluant la capacité des plaquettes du patient à être activées par l’anticorps monoclonal 5B9 en présence de faibles concentrations d’héparine ; et
o d’autre part, de standardiser l’expression des résultats de la série Test Patient qui est réalisée en parallèle ;
- et la série Test Patient permet d’évaluer la capacité des anticorps anti-FP4/H présents dans le sang du patient à induire l’activation des plaquettes en présence de faibles et forte concentrations d’héparine.
Pour une meilleure compréhension des exemples, il est précisé que dans les tableaux 2 à 14 qui vont suivre, les tubes 1 et 7 des premières colonnes correspondent respectivement aux mélanges 1a et 2a des séries Validation/Standardisation (VS) et Test Patient (TP), les tubes 2-3 et 8-9 aux mélanges 1b et 2b, les tubes 4 et 10 aux mélanges 1c et 2c, le tube 5 au mélange Ago et le tube 6 au mélange Basal.
-
Marquage de l’expression de la P-sélectine (CD62P) :
Une première série Validation/Standardisation est réalisée avec le sang du patient dilué (dilution 1/4) après addition de l’anticorps monoclonal 5B9 et incubé avec du facteur plaquettaire 4 (FP4) exogène (10 μg/mL) et différentes concentrations d’héparine (0 ; 0,05 ; 0,5 et 100 UI/ml) (série VS, étape 1).
Une deuxième série de tests (Test Patient) est réalisée dans les mêmes conditions mais sans ajout de l’anticorps 5B9 (série TP, étape 2). Lors de la série TP, un contrôle d’activation plaquettaire non spécifique (mélange Ago) est réalisé avec un agoniste puissant (TRAP, 50 µM). Un contrôle en présence de tampon salin PBS (mélange Basal) est également réalisé afin d’avoir le niveau basal d’activation des plaquettes du patient. Ces deux contrôles permettent de positionner les seuils de positivité des marqueurs de fluorescence utilisés.
Après incubation, le marquage des plaquettes activées est réalisé à l’aide des anticorps marqués anti-CD41-APC et anti-CD62P-PE (étape 3). L’utilisation de l’anticorps anti-CD41 permet un marquage spécifique des plaquettes dans l’échantillon, alors que l’anticorps anti-CD62P est un marqueur reconnu pour évaluer l’activation plaquettaire.
Les deux séries de tests sont ensuite analysées en cytométrie en flux (étape 4).
-
Marquage de l’exposition de la phosphatidylsérine par l’Annexine V :
Une première série Validation/Standardisation est réalisée avec le sang du sang du patient dilué (dilution 1/4) après addition de l’anticorps monoclonal 5B9 et incubé avec du facteur plaquettaire 4 (FP4) exogène (10 μg/ml), différentes concentrations d’héparine (0 ; 0,05 ; 0,5 et 100 UI/ml), d’un inhibiteur de la thrombine (hirudin ou argatroban), de TRAP (100 μM) et de tampon calcique (série VS, étape 1).
Une seconde série de tests est réalisée dans les mêmes conditions mais en l’absence de l’anticorps monoclonal 5B9 (série TP, étape 2). Un contrôle d’activation plaquettaire non spécifique (mélange Ago) est réalisé avec un agoniste puissant (Calcium ionophore A23187, 5 μM). Un contrôle en présence de tampon salin PBS (mélange Basal) est également réalisé afin d’avoir le niveau basal d’activation plaquettaire. Ces deux contrôles permettent de positionner les seuils de positivité des marqueurs de fluorescence utilisés.
Après incubation, l’anticorps marqué anti-CD41-APC et l’Annexine V-FITC sont ajoutés (étape 3). L’Annexine V permet de mettre en évidence l’exposition de phospatidylsérine à la surface des plaquettes activées.
Les deux séries de tests sont ensuite analysées en cytométrie en flux (étape 4).
Un exemple de plan expérimental réalisé pour la procédure CD62P ou Annexine V est illustré dans le tableau 2 :
| Tube | Composition | SERIE |
| 1 | Sang dilué + 5B9 + FP4 (= mélange 1a) |
Validation/ Standardisation |
| 2 | Sang dilué + 5B9 + FP4 + héparine 0.05 UI/ml (= premier mélange 1b’) |
|
| 3 | Sang dilué + 5B9 + FP4 + héparine 0.5 UI/ml (= second mélange 1b’’) |
|
| 4 | Sang dilué + 5B9 + FP4 + héparine 100 UI/ml (= mélange 1c) |
|
| 5 | Sang dilué + agoniste fort (TRAP ou Ca ionophore) (= mélange Ago) |
Test Patient |
| 6 | Sang dilué + PBS (= mélange Basal) |
|
| 7 | Sang dilué + FP4 (= mélange 2a) |
|
| 8 | Sang dilué + FP4 + héparine 0.05 UI/ml (= premier mélange 2b’) |
|
| 9 | Sang dilué + FP4 + héparine 0.5 UI/ml (= second mélange 2b’’) |
|
| 10 | Sang dilué + FP4 + héparine 100 UI/ml (= mélange 2c) |
4/ Stratégie de fenestrage (par exemple pour le marquage du CD62P) :
Dans un premier temps, sur un premier histogramme CD41-APC versus Count, un seuil est positionné pour distinguer les plaquettes (CD41+) des autres cellules sanguines qui n’expriment pas ce marqueur (CD41-) :
- Analyse des plaquettes
Ensuite, parmi l’ensemble des cellules CD41+, la médiane d’intensité de fluorescence (MFI) totale du marqueur CD62P est mesurée sur un second histogramme :
- Mesure de la MFI des cellules CD41+/CD62P
Le seuil permettant de distinguer les cellules CD41+/CD62P- (plaquettes non activées) des cellules doubles positives CD41+/CD62P+ (plaquettes activées) est positionné à l’intersection des deux pics entre la condition activée avec le TRAP (tube 5) et la condition repos (tube 6) sur le troisième histogramme CD62P-PE versus Count. Après avoir repositionné ce seuil sur le second histogramme, le pourcentage de cellules doubles positives CD41+/CD62P+ est calculé pour chaque condition testée :
- Mesure du pourcentage de cellules double positives CD41+/CD62P+.
Selon l’un des modes de calcul et d’expression des résultats tel que proposé dans la description ci-dessus, il est rappelé que :
a/ Pour chacune des conditions, les résultats sont exprimés en multipliant le pourcentage de cellules activées CD41+/CD62+ par leur MFI (MFI CD62P). Ce produit est noté « % x MFI » et exprimé en unité arbitraire (UA) ;
b/ Afin de s’affranchir d’une réactivité variable des plaquettes d’un patient à l’autre et d’une manipulation à une autre, les résultats bruts (% x MFI) obtenus sur la série Validation/Standardisation permettent de standardiser l’expression des résultats obtenus sur la série Test Patient en effectuant le calcul suivant pour chaque tube :
c/ Le pourcentage d’inhibition de la série TP est également calculé avec la formule :
6/ Exemple de résultats obtenus chez deux patients ayant une suspicion de TIH :
Les légères diff
érences
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les
tableau
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suivants
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les
calculs
donnés par les formules ci-dessus
sont inhérentes à l’appareil utilisé
,
qui réalise des ajustements automatiques de valeurs.
Les résultats obtenus pour le marqueur du CD62P du patient 1 sont les suivants :
| PATIENT 1 | Tube | Héparine (UI/ml) | FP4 | % CD41+ / CD62P+ | MFI CD62P | % x MFI (UA) | Validation technique de la série VS : Ratio d'Activation / Ratio d'Inhibition | % Activation Plaquettaire Ac-dépendante (APA) | Interprétation de la série TP : Maximum APA / % d'inhibition | Conclusion |
| Série Validation Standardisation | 1 | 0 | + | 65% | 5592 | 3634,80 | 299,8 | Série VS validée | ||
| 2 | 0.05 | + | 66% | 5606 | 3699,96 | |||||
| 3 | 0.5 | + | 70% | 6982 | 4887,40 | |||||
| 4 | 100 | + | 48% | 1272 | 610,56 | 0,88 | ||||
| Série Test Patient | 5 | TRAP (hep 0) | - | 76% | 8214 | 6242,64 | ||||
| 6 | 0 (basal) | - | 10% | 163 | 16,30 | 0% | Série TP positive | |||
| 7 | 0 | + | 47% | 1443 | 678,21 | 14% | ||||
| 8 | 0.05 | + | 54% | 2528 | 1365,12 | 28% | 28% | |||
| 9 | 0.5 | + | 53% | 2414 | 1279,42 | 26% | ||||
| 10 | 100 | + | 27% | 377 | 101,79 | 2% | 94% |
Les résultats obtenus pour le marqueur du CD62P du patient 2 sont les suivants :
| PATIENT 2 | Tube | Héparine (UI/ml) | FP4 | % CD41+ / CD62P+ | MFI CD62P | % x MFI (UA) | Validation technique de la série VS : Ratio d'Activation / Ratio d'Inhibition | % Activation Plaquettaire Ac-dépendante (APA) | Interprétation de la série TP : Maximum APA / % d'inhibition | Conclusion |
| Série Validation Standardisation | 1 | 0 | + | 15% | 201 | 30,15 | 13,2 | Série VS validée | ||
| 2 | 0.05 | + | 22% | 280 | 61,60 | |||||
| 3 | 0.5 | + | 33% | 404 | 133,32 | |||||
| 4 | 100 | + | 8% | 165 | 13,20 | 0,90 | ||||
| Série Test Patient | 5 | TRAP (hep 0) | - | 89% | 6487 | 5773,43 | ||||
| 6 | 0 (basal) | - | 7% | 144 | 10,08 | 0% | Série TP négative | |||
| 7 | 0 | + | 7% | 156 | 10,92 | 1% | ||||
| 8 | 0.05 | + | 7% | 153 | 10,71 | 1% | 1% | |||
| 9 | 0.5 | + | 6% | 149 | 8,94 | -1% | ||||
| 10 | 100 | + | 6% | 149 | 8,94 | -1% | * |
b/
Résultats obtenus avec le marqueur Annexine V (AnxV) :
Avec le marquage par l’Annexine V, une stratégie de fenestrage et une expression des résultats similaires à celle présentée pour le protocole CD62P sont appliquées.
Les résultats obtenus pour le marqueur Annexine V du patient 1 sont les suivants :
| PATIENT 1 | Tube | Héparine (UI/ml) | FP4 | % CD41+ / AnxV+ | MFI AnxV | % x MFI (UA) | Validation technique de la série VS : Ratio d'Activation / Ratio d'Inhibition | % Activation Plaquettaire Ac-dépendante (APA) | Interprétation de la série TP : Maximum APA / % d'inhibition | Conclusion |
| Série Validation Standardisation | 1 | 0 | + | 31% | 537 | 166,47 | 95,9 | Série VS validée | ||
| 2 | 0.05 | + | 31% | 474 | 146,94 | |||||
| 3 | 0.5 | + | 35% | 567 | 198,45 | |||||
| 4 | 100 | + | 12% | 247 | 29,64 | 0,85 | ||||
| Série Test Patient | 5 | Ca iono (hep 0) | - | 99% | 38310 | 37926,90 | ||||
| 6 | 0 (basal) | - | 3% | 69 | 2,07 | 0% | Série TP positive | |||
| 7 | 0 | + | 37% | 722 | 267,14 | 135% | ||||
| 8 | 0.05 | + | 36% | 625 | 225,00 | 114% | 215% | |||
| 9 | 0.5 | + | 43% | 985 | 423,55 | 215% | ||||
| 10 | 100 | + | 10% | 197 | 19,70 | 9% | 96% |
Les résultats obtenus pour le marqueur Annexine V du patient 2 sont les suivants :
| PATIENT 2 | Tube | Héparine (UI/ml) | FP4 | % CD41+ / AnxV+ | MFI AnxV | % x MFI (UA) | Validation technique de la série VS : Ratio d'Activation / Ratio d'Inhibition | % Activation Plaquettaire Ac-dépendante (APA) | Interprétation de la série TP : Maximum APA / % d'inhibition | Conclusion |
| Série Validation Standardisation | 1 | 0 | + | 13% | 201 | 26,13 | 11,3 | Série VS validée | ||
| 2 | 0.05 | + | 10% | 217 | 21,70 | |||||
| 3 | 0.5 | + | 10% | 193 | 19,30 | |||||
| 4 | 100 | + | 5% | 154 | 7,70 | 0,65 | ||||
| Série Test Patient | 5 | Ca iono (hep 0) | - | 100% | 34310 | 34310,00 | ||||
| 6 | 0 (basal) | - | 3% | 64 | 1,92 | 0% | Série TP négative | |||
| 7 | 0 | + | 4% | 117 | 4,68 | 14% | ||||
| 8 | 0.05 | + | 4% | 147 | 5,88 | 20% | 20% | |||
| 9 | 0.5 | + | 3% | 147 | 4,41 | 13% | ||||
| 10 | 100 | + | 4% | 143 | 5,72 | 19% | * |
c/ Interprétation des résultats CD62P et Annexine V :
Pour ces 2 patients, les séries Validation/Standardisation (VS) objectivent une augmentation du paramètre « % x MFI » exprimé en UA en présence de FP4 et de faibles concentrations d’héparine (0.05 et/ou 0.5 UI/ml, tubes 2 et 3 respectivement (mélanges 1b)) comparativement à la condition basale (PBS, tube 6, mélange Basal), avec une inhibition de l’activation plaquettaire en présence de 100 UI/ml d’héparine (tube 4, mélange 1c) pour les 2 marqueurs étudiés.
Pour le marquage de la P-sélectine (CD62P), un ratio d’activation de la série VS de 299,8 et 13,2, respectivement pour les patients 1 et 2, met en évidence une activation plaquettaire en présence de faibles concentrations d’héparine (seuil de positivité 5).
Pour ces 2 patients, un ratio d’inhibition de la série VS égal à 0,88 et 0,9, respectivement, est obtenu démontrant une inhibition de l’activation induite par l’anticorps 5B9 en présence de la forte concentration d’héparine (seuil ≥ 0.5).
Pour le marquage de l’exposition des phosphatidylsérines par l’Annexine V, un ratio d’activation de la série VS de 95,9 et 11,3, respectivement pour les patients 1 et 2 met en évidence une activation plaquettaire en présence de faibles concentrations d’héparine (seuil de positivité 4). Pour ces 2 patients un ratio d’inhibition de la série VS égal à 0,85 et 0,65, respectivement est obtenu démontrant une inhibition de l’activation induite par l’anticorps 5B9 en présence de la forte concentration d’héparine (seuil ≥ 0.5).
Ces résultats obtenus avec les séries VS en présence de l’anticorps monoclonal 5B9 démontrent que le procédé selon l’invention permet de mettre en évidence une activation plaquettaire induite par la présence d’anticorps anti-FP4 modifié par un polyanion activateurs dans le sang du patient testé et permet d’interpréter les résultats de la série TP.
Pour le marquage de l’expression de CD62P de série TP du patient 1, le taux maximum d’activation plaquettaire anticorps-dépendante (APA) calculé en présence de faibles concentrations d’héparine (0.05 et/ou 0.5 UI/ml, mélanges 2b) (selon la formule décrite Math 3 ci-dessus) est égal à 28% (seuil de positivité ≥ 20 %), avec une inhibition de 94% (seuil ≥ 50%) en présence de la forte concentration d’héparine testée (100 UI/ml, mélange 2c). Pour ce paramètre, la série TP est positive montrant une activation plaquettaire héparine-dépendante.
En revanche, pour le patient 2, aucune activation plaquettaire n’est objectivée présence de faibles concentrations d’héparine (0.05 et/ou 0.5 UI/ml, mélanges 2b) : APA maximum à 1% donc inférieur au seuil de positivité du test. Pour ce paramètre, la série TP est négative. Le résultat de ce test fonctionnel est en défaveur du diagnostic de TIH.
Pour le marquage de l’exposition des phosphatidylsérines par l’Annexine V de série TP du patient 1, le pourcentage d’activation plaquettaire anticorps-dépendante calculé est égal à 215% (seuil de positivité ≥ 27 %), avec une inhibition de 96% (seuil ≥ 50%) en présence de la forte concentration d’héparine testée (100 UI/ml, mélange 2c). Pour ce paramètre, la série TP est positive. Le résultat de ce test fonctionnel est en faveur du diagnostic de TIH.
En revanche, pour le patient 2, aucune activation plaquettaire n’est objectivée en présence de faibles concentrations d’héparine (0.05 et/ou 0.5 UI/ml, mélanges 2b) : APA maximum à 16 % donc inférieur au seuil de positivité du test. Pour ce paramètre, la série TP est négative. Le résultat de ce test fonctionnel est en défaveur du diagnostic de TIH.
Ces résultats (patients 1 et 2) ont été confirmés avec le test d’activation plaquettaire de référence pour le diagnostic de TIH : le test de libération de sérotonine (Serotonine Release Assay, SRA).
Pour rappel le SRA est un test fonctionnel pour le diagnostic des TIH. Ce test repose sur la mesure de la libération, lors de l’activation plaquettaire, de sérotonine radiomarquée (14C-sérotonine), préalablement incorporée dans les granules denses. Les étapes de lavages plaquettaires permettent l’élimination de la matrice plasmatique. L’ajout de différentes concentrations d’héparine permet la formation de complexes FP4/H à la surface des plaquettes du donneur sain. Les anticorps pathogènes reconnaissent, par leur fragment Fab, les complexes macromoléculaires FP4/H et activent les plaquettes via leur fragment Fc qui se fixe au récepteur FcγIIA. Le contenu des granules est libéré dans le milieu réactionnel et la radioactivité mesurée dans le surnageant est directement proportionnelle à l’activation plaquettaire.
7/ Exemple de résultats obtenus chez quatre patients (patients 3 à 6) ayant une suspicion de TIH :
Les légères différences susceptibles d’être relevées entre les tableaux suivants et les calculs donnés par les formules ci-dessus sont inhérentes à l’appareil utilisé, qui réalise des ajustements automatiques de valeurs.
Les résultats obtenus pour le marqueur du CD62P du patient 3 sont les suivants :
| PATIENT 3 | Tube | Héparine (UI/ml) | FP4 | % CD41+ / CD62P+ | MFI CD62P | % x MFI (UA) | Validation technique de la série VS : Ratio d'Activation / Ratio d'Inhibition | % Activation Plaquettaire Ac-dépendante (APA) | Interprétation de la série TP : Maximum APA / % d'inhibition | Conclusion |
| Série Validation Standardisation | 1 | 0 | + | 54% | 802 | 433,08 | 94,2 | Série VS validée | ||
| 2 | 0.05 | + | 54% | 749 | 404,46 | |||||
| 3 | 0.5 | + | 54% | 785 | 423,90 | |||||
| 4 | 100 | + | 44% | 415 | 182,60 | 0,57 | ||||
| Série Test Patient | 5 | TRAP (hep 0) | - | 88% | 7409 | 6519,92 | ||||
| 6 | 0 (basal) | - | 5% | 90 | 4,50 | 0% | Série TP positive | |||
| 7 | 0 | + | 49% | 563 | 275,87 | 65% | ||||
| 8 | 0.05 | + | 50% | 604 | 302,00 | 71% | 71% | |||
| 9 | 0.5 | + | 41% | 352 | 144,32 | 33% | ||||
| 10 | 100 | + | 35% | 273 | 95,55 | 22% | 69% |
Les résultats obtenus pour le marqueur du CD62P du patient 4 sont les suivants :
| PATIENT 4 | Tube | Héparine (UI/ml) | FP4 | % CD41+ / CD62P+ | MFI CD62P | % x MFI (UA) | Validation technique de la série VS : Ratio d'Activation / Ratio d'Inhibition | % Activation Plaquettaire Ac-dépendante (APA) | Interprétation de la série TP : Maximum APA / % d'inhibition | Conclusion |
| Série Validation Standardisation | 1 | 0 | + | 52% | 2152 | 1119,04 | 281,3 | Série VS validée | ||
| 2 | 0.05 | + | 56% | 2618 | 1466,08 | |||||
| 3 | 0.5 | + | 68% | 5274 | 3586,32 | |||||
| 4 | 100 | + | 29% | 708 | 205,32 | 0,94 | ||||
| Série Test Patient | 5 | TRAP (hep 0) | - | 91% | 9726 | 8850,66 | ||||
| 6 | 0 (basal) | - | 5% | 255 | 12,75 | 0% | Série TP négative | |||
| 7 | 0 | + | 6% | 283 | 16,98 | 0% | ||||
| 8 | 0.05 | + | 8% | 299 | 23,92 | 0% | 0% | |||
| 9 | 0.5 | + | 5% | 269 | 13,45 | 0% | ||||
| 10 | 100 | + | 5% | 291 | 14,55 | 0% | * |
Les résultats obtenus pour le marqueur du CD62P du patient 5 sont les suivants :
| PATIENT 5 | Tube | Héparine (UI/ml) | FP4 | % CD41+ / CD62P+ | MFI CD62P | % x MFI (UA) | Validation technique de la série VS : Ratio d'Activation / Ratio d'Inhibition | % Activation Plaquettaire Ac-dépendante (APA) | Interprétation de la série TP : Maximum APA / % d'inhibition | Conclusion |
| Série Validation Standardisation | 1 | 0 | + | 46% | 1400 | 644,00 | 52,7 | Série VS validée | ||
| 2 | 0.05 | + | 46% | 1386 | 637,56 | |||||
| 3 | 0.5 | + | 52% | 2361 | 1227,72 | |||||
| 4 | 100 | + | 32% | 598 | 191,36 | 0,84 | ||||
| Série Test Patient | 5 | TRAP (hep 0) | - | 71% | 7308 | 5188,68 | ||||
| 6 | 0 (basal) | - | 10% | 233 | 23,30 | 0% | Série TP positive | |||
| 7 | 0 | + | 41% | 989 | 405,49 | 32% | ||||
| 8 | 0.05 | + | 40% | 946 | 378,40 | 29% | 35% | |||
| 9 | 0.5 | + | 42% | 1060 | 445,20 | 35% | ||||
| 10 | 100 | + | 25% | 474 | 118,50 | 8% | 77% |
Les résultats obtenus pour le marqueur du CD62P du patient 6 sont les suivants :
| PATIENT 6 | Tube | Héparine (UI/ml) | FP4 | % CD41+ / CD62P+ | MFI CD62P | % x MFI (UA) | Validation technique de la série VS : Ratio d'Activation / Ratio d'Inhibition | % Activation Plaquettaire Ac-dépendante (APA) | Interprétation de la série TP : Maximum APA / % d'inhibition | Conclusion |
| Série Validation Standardisation | 1 | 0 | + | 42% | 1013 | 425,46 | 117,1 | Série VS validée | ||
| 2 | 0.05 | + | 44% | 1125 | 495,00 | |||||
| 3 | 0.5 | + | 55% | 1842 | 1013,10 | |||||
| 4 | 100 | + | 18% | 359 | 64,62 | 0,94 | ||||
| Série Test Patient | 5 | TRAP (hep 0) | - | 92% | 7273 | 6691,16 | ||||
| 6 | 0 (basal) | - | 5% | 173 | 8,65 | 0% | Série TP négative | |||
| 7 | 0 | + | 13% | 268 | 34,84 | 3% | ||||
| 8 | 0.05 | + | 17% | 331 | 56,27 | 5% | 5% | |||
| 9 | 0.5 | + | 8% | 211 | 16,88 | 1% | ||||
| 10 | 100 | + | 6% | 204 | 12,24 | 0% | * |
b/
Résultats obtenus avec le marqueur Annexine V :
Les résultats obtenus pour le marqueur par l’AnxV du patient 3 sont les suivants :
| PATIENT 3 | Tube | Héparine (UI/ml) | FP4 | % CD41+ / AnxV+ | MFI AnxV | % x MFI (UA) | Validation technique de la série VS : Ratio d'Activation / Ratio d'Inhibition | % Activation Plaquettaire Ac-dépendante (APA) | Interprétation de la série TP : Maximum APA / % d'inhibition | Conclusion |
| Série Validation Standardisation | 1 | 0 | + | 16% | 263 | 42,08 | 21,7 | Série VS validée | ||
| 2 | 0.05 | + | 17% | 271 | 46,07 | |||||
| 3 | 0.5 | + | 18% | 286 | 51,48 | |||||
| 4 | 100 | + | 7% | 193 | 13,51 | 0,74 | ||||
| Série Test Patient | 5 | Ca iono (hep 0) | - | 97% | 45498 | 44133,06 | ||||
| 6 | 0 (basal) | - | 3% | 79 | 2,37 | 0% | Série TP positive | |||
| 7 | 0 | + | 19% | 283 | 53,77 | 105% | ||||
| 8 | 0.05 | + | 17% | 283 | 48,11 | 93% | 93% | |||
| 9 | 0.5 | + | 17% | 273 | 46,41 | 90% | ||||
| 10 | 100 | + | 6% | 192 | 11,52 | 19% | 80% |
Les résultats obtenus pour le marqueur par l’AnxV du patient 4 sont les suivants :
| PATIENT 4 | Tube | Héparine (UI/ml) | FP4 | % CD41+ / AnxV+ | MFI AnxV | % x MFI (UA) | Validation technique de la série VS : Ratio d'Activation / Ratio d'Inhibition | % Activation Plaquettaire Ac-dépendante (APA) | Interprétation de la série TP : Maximum APA / % d'inhibition | Conclusion |
| Série Validation Standardisation | 1 | 0 | + | 40% | 1837 | 734,80 | 411,7 | Série VS validée | ||
| 2 | 0.05 | + | 32% | 624 | 199,68 | |||||
| 3 | 0.5 | + | 46% | 2721 | 1251,66 | |||||
| 4 | 100 | + | 15% | 392 | 58,80 | 0,95 | ||||
| Série Test Patient | 5 | Ca iono (hep 0) | - | 99% | 38047 | 37666,53 | ||||
| 6 | 0 (basal) | - | 4% | 76 | 3,04 | 0% | Série TP négative | |||
| 7 | 0 | + | 5% | 135 | 6,75 | 0% | ||||
| 8 | 0.05 | + | 8% | 176 | 14,08 | 1% | 1% | |||
| 9 | 0.5 | + | 5% | 212 | 10,60 | 1% | ||||
| 10 | 100 | + | 8% | 256 | 20,48 | 1% | * |
Les résultats obtenus pour le marqueur par l’AnxV du patient 5 sont les suivants :
| PATIENT 5 | Tube | Héparine (UI/ml) | FP4 | % CD41+ / AnxV+ | MFI AnxV | % x MFI (UA) | Validation technique de la série VS : Ratio d'Activation / Ratio d'Inhibition | % Activation Plaquettaire Ac-dépendante (APA) | Interprétation de la série TP : Maximum APA / % d'inhibition | Conclusion |
| Série Validation Standardisation | 1 | 0 | + | 33% | 572 | 188,76 | 8,6 | Série VS validée | ||
| 2 | 0.05 | + | 35% | 710 | 250,10 | |||||
| 3 | 0.5 | + | 38% | 860 | 328,67 | |||||
| 4 | 100 | + | 26% | 497 | 126,74 | 0,61 | ||||
| Série Test Patient | 5 | Ca iono (hep 0) | - | 98% | 17737 | 17387,09 | ||||
| 6 | 0 (basal) | - | 19% | 197 | 38,34 | 0% | Série TP positive | |||
| 7 | 0 | + | 40% | 983 | 396,34 | 123% | ||||
| 8 | 0.05 | + | 38% | 880 | 335,71 | 102% | 169% | |||
| 9 | 0.5 | + | 43% | 1233 | 528,83 | 169% | ||||
| 10 | 100 | + | 25% | 463 | 114,36 | 26% | 85% |
Les résultats obtenus pour le marqueur par l’AnxV du patient 6 sont les suivants :
| PATIENT 6 | Tube | Héparine (UI/ml) | FP4 | % CD41+ / AnxV+ | MFI AnxV | % x MFI (UA) | Validation technique de la série VS : Ratio d'Activation / Ratio d'Inhibition | % Activation Plaquettaire Ac-dépendante (APA) | Interprétation de la série TP : Maximum APA / % d'inhibition | Conclusion |
| Série Validation Standardisation | 1 | 0 | + | 17% | 229 | 38,93 | 26,5 | Série VS validée | ||
| 2 | 0.05 | + | 17% | 219 | 37,23 | |||||
| 3 | 0.5 | + | 20% | 258 | 51,60 | |||||
| 4 | 100 | + | 9% | 143 | 12,87 | 0,75 | ||||
| Série Test Patient | 5 | Ca iono (hep 0) | - | 98% | 27925 | 27366,50 | ||||
| 6 | 0 (basal) | - | 3% | 65 | 1,95 | 0% | Série TP négative | |||
| 7 | 0 | + | 7% | 127 | 8,89 | 14% | ||||
| 8 | 0.05 | + | 7% | 134 | 9,38 | 15% | 15% | |||
| 9 | 0.5 | + | 7% | 130 | 9,10 | 14% | ||||
| 10 | 100 | + | 7% | 118 | 8,26 | 13% | * |
c/ Interprétation des résultats CD62P et Annexine V :
Pour les patients 3 à 6, les séries VS objectivent :
- une augmentation du paramètre « % x MFI » exprimé en UA en présence de FP4 et en présence de faibles concentrations d’héparine (0.05 et/ou 0.5 UI/ml, tubes 2 et/ou 3 respectivement, mélanges 1b) comparativement à la condition basale (PBS, tube 6, mélange Basal) grâce au ratio d’activation de la série VS supérieur au seuil,
- et une inhibition de l’activation plaquettaire en présence de 100 UI/ml d’héparine (tube 4, mélange 1c) pour les 2 marqueurs étudiés avec le ratio d’inhibition de la série VS supérieur au seuil. Cette inhibition de l’activation plaquettaire en présence d’une forte concentration d’héparine est caractéristique des anticorps de TIH.
Ces résultats obtenus avec les séries VS en présence de l’anticorps monoclonal 5B9 démontrent que le procédé selon l’invention permet de mettre en évidence une activation plaquettaire induite par la présence d’anticorps anti-FP4/H activateurs dans le sang du patient testé.
Concernant les résultats obtenus pour les séries TP avec le sang des patients 3 et 5, une augmentation de l’APA est observée, en présence de faibles concentrations d’héparine (0.05 et/ou 0.5 UI/ml, tube(s) 8 et/ou 9 respectivement, soit mélange(s) 2b) comparativement à la condition basale (tube 6, PBS, mélange Basal). L’inhibition de l’activation plaquettaire en présence de 100 UI/ml d’héparine (tube 10, mélange 2c) est observée pour les 2 marqueurs étudiés. Ces résultats témoignent de la présence d’anticorps anti-FP4 activateurs (pathogènes) et héparine-dépendants dans ce prélèvement. Les résultats obtenus pour les patients 3 et 5 sont en faveurs du diagnostic de TIH. Les résultats des tests biologiques sont à confronter avec les données cliniques afin de confirmer ou exclure le diagnostic de Thrombopénie Induite par l’Héparine.
En revanche, pour les patients 4 et 6, aucune activation plaquettaire n’est objectivée, quel que soit le marqueur utilisé, ce qui démontre l’absence d’anticorps activateurs (pathogènes) dans le sang de ces patients. Les résultats obtenus pour les patients 4 et 6 sont en défaveur du diagnostic de TIH.
Ces résultats (patients 3 à 6) ont été confirmés avec le test de référence (SRA, Serotonine Release Assay).
Claims (15)
- Méthode d’analyse de l’activation plaquettaire héparine dépendante chez un patient suspecté d’avoir une thrombopénie induite par des anticorps anti- facteur plaquettaire 4 (FP4) modifié par un polyanion, comprenant les étapes suivantes :
1) la préparation d’une série de tests nécessaires à la validation et à la standardisation, ci-après dénommée série Validation/Standardisation (VS), ladite série Validation/Standardisation comprenant :
- le mélange d’un échantillon de sang total dudit patient, dilué dans un tampon acceptable, en présence de facteur plaquettaire (FP4) exogène, et d’un anticorps monoclonal dirigé spécifiquement contre le facteur plaquettaire 4 modifié par un polyanion, de préférence par l’héparine, ou l’un de ses fragments afin d’obtenir un mélange 1a ;
- au moins un mélange d’un échantillon de sang total dudit patient, dilué dans un tampon acceptable, avec du FP4 exogène, un anticorps monoclonal dirigé spécifiquement contre le FP4 modifié par un polyanion, ou l’un de ses fragments, et de l’héparine en une concentration comprise entre 0.01 et 1 UI/ml, afin d’obtenir au moins un mélange 1b ;
- au moins un mélange d’un échantillon de sang total dudit patient, dilué dans un tampon acceptable, avec du FP4 exogène, un anticorps monoclonal dirigé spécifiquement contre le FP4 modifié par un polyanion, ou l’un de ses fragments, et de l’héparine en une concentration comprise entre 10 et 200 UI/ml, afin d’obtenir au moins un mélange 1c ;
2) la préparation d’une série Test Patient (TP), ladite série Test Patient comprenant :
- le mélange d’un échantillon de sang total dudit patient, dilué dans un tampon acceptable, avec un activateur plaquettaire ou un agoniste fort, afin d’obtenir un mélange Ago ;
- le mélange d’un échantillon de sang total dudit patient, dilué dans un tampon acceptable, afin d’obtenir le mélange Basal ;
- le mélange d’un échantillon de sang total dudit patient, dilué dans un tampon acceptable, avec du FP4, afin d’obtenir un mélange 2a ;
- au moins un mélange d’un échantillon de sang total dudit patient, dilué dans un tampon acceptable, avec du FP4 et de l’héparine en concentration égale à celle utilisée pour le mélange 1b, afin d’obtenir un mélange 2b ;
- au moins un mélange d’un échantillon de sang total dudit patient, dilué dans un tampon acceptable, avec du FP4 et de l’héparine en concentration égale à celle utilisée pour le mélange 1c, afin d’obtenir un mélange 2c ;
3) l’incubation de tous les mélanges des séries VS et TP puis le marquage de la population plaquettaire et le marquage spécifique des plaquettes activées dans cette population dans chaque mélange ; et
4) l’analyse de tous les mélanges obtenus à l’étape 3). - Méthode d’analyse selon la revendication 1, dans laquelle le patient est suspecté d’avoir une thrombopénie induite par des anticorps dirigés contre le facteur FP4 modifié par l’héparine.
- Méthode selon la revendication 1 ou 2 comprenant la préparation d’au moins deux mélanges 1b dans l’étape 1), de préférence deux mélanges 1b (i.e. mélanges 1b’ et 1b’’) sont effectués d’une part avec une concentration en héparine comprise entre 0.01 et 0.1 UI/ml, de préférence entre 0.02 et 0.08 UI/ml, pour le premier mélange 1b’, et d’autre part comprise entre 0.2 et 1 UI/ml, de préférence entre 0.3 et 0.8 UI/ml pour le second mélange 1b’’.
- Méthode selon l’une des revendications 1 à 3, comprenant, suite à l’étape 4), l’étape 5) supplémentaire de validation de la série VS par le calcul du ratio d’activation de cette série et le calcul du ratio d’inhibition de cette même série.
- Méthode selon la revendication 4, dans laquelle la série VS est validée si l’on observe :
- une activation des plaquettes de l’échantillon de cette série induite par un anticorps ou fragment d’anticorps dirigé spécifiquement contre le FP4 modifié par un polyanion, en l’absence d’héparine et/ou en présence de faibles concentrations d’héparine, et
- une inhibition de cette activation en présence de fortes concentrations d’héparine. - Méthode selon l’une des revendications 1 à 5, qui est une méthode d’analyse par cytométrie en flux.
- Méthode selon l’une des revendications 4 à 6, comprenant, suite à l’étape 5), une étape 5’) de calcul du taux d’activation plaquettaire anticorps-dépendante (nommé APA) des mélanges Ago, 2a, 2b et 2c de la série TP.
- Méthode selon l’une des revendications précédentes, dans laquelle tous les échantillons de sang total du patient utilisés sont dilués jusqu’au 1/10ème, préférentiellement dilués de la proportion 1/2 à 1/10ème, et de préférence au quart, dans du sérum physiologique.
- Méthode selon l’une des revendications précédentes, dans laquelle l’anticorps monoclonal dirigé spécifiquement contre le FP4 modifié par un polyanion comprend :
- comme région variable VH, la séquence d’acides aminés codée par SEQ ID NO :2, et
- comme région variable VL, la séquence d’acides aminés codée par SEQ ID NO :1. - Méthode selon l’une des revendications précédentes, dans laquelle le marquage des plaquettes de l’étape 3) est effectué en utilisant au moins un marqueur spécifique de la population plaquettaire et au moins un marqueur spécifique de l’état d’activation des plaquettes, de préférence en utilisant au moins un marqueur spécifique de la population plaquettaire et possiblement deux marqueurs spécifiques de l’état d’activation des plaquettes.
- Méthode selon la revendication 10, dans laquelle le marquage des plaquettes de l’étape 3) est effectué en utilisant au moins un marqueur spécifique de la population plaquettaire choisi parmi le marqueur CD41, le marqueur CD61 et la combinaison de ces marqueurs CD41/CD61, et au moins un marqueur spécifique de l’état d’activation des plaquettes, de préférence deux, choisi parmi la P-sélectine et la phosphatidylsérine.
- Méthode de diagnostic d’exclusion d’une thrombopénie induite par l’héparine (TIH) chez un patient, comprenant la méthode selon l’une des revendications 7 à 11, ainsi qu’une étape 6) de comparaison des taux d’activation plaquettaire anticorps-dépendante (APA) calculés dans chaque mélange de la série TP pour l’établissement d’un diagnostic d’une exclusion de TIH.
- Méthode selon la revendication 12, caractérisée en ce qu’un diagnostic d’exclusion d’une TIH est établi lorsque aucune activation plaquettaire n’est observée en présence de faibles concentrations d’héparine sur la série TP du patient.
- Méthode de confirmation d’un diagnostic de TIH chez un patient suspecté d’avoir la maladie, comprenant la méthode selon l’une des revendications 7 à 11, ainsi qu’une étape 6) de comparaison des taux d’activation plaquettaire anticorps-dépendante (APA) calculés dans chaque mélange de la série TP pour l’établissement d’un diagnostic d’une TIH.
- Méthode selon la revendication 14, caractérisée en ce qu’un diagnostic de TIH chez un patient suspecté d’avoir la maladie est confirmé lorsque l’on observe une activation plaquettaire de la série TP du patient en présence de faibles concentrations d’héparine, et une inhibition de l’activation plaquettaire en présence de fortes concentrations d’héparine.
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