JP7166364B2 - Ｃ反応性タンパク質を全域検出する方法及び対応するキット - Google Patents

Ｃ反応性タンパク質を全域検出する方法及び対応するキット Download PDF

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Description

本発明は、化学発光イムノアッセイの技術分野に属し、特に、Ｃ反応性タンパク質を全域検出する方法及び対応するキットに関する。
Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）は、１９３０年にTillet及びFrancisによって発見された急性期反応タンパク質であり、このタンパク質はＣａ２＋の存在下でストレプトコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）のＣ多糖類と反応して複合体を形成し得る。血清ＣＲＰは、ＩＬ－６、ＩＬ－２、及びＴＮＦの刺激下で肝細胞によって合成され、炎症性の局所マクロファージも少量産生される。ＣＲＰは約１１５ＫＤの分子量を有し、５つの同一の非グリコシル化ポリペプチドサブユニットからなり、各サブユニットは２０４個のアミノ酸を含み、これらのサブユニットは非共有結合によって接続されて環状五量体を形成し、この五量体タンパク質は、鎖間ジスルフィド結合により顕著な耐熱性及びタンパク質分解耐性を有する。
ＣＲＰは体内に広く分布している。ＣＲＰは、血液に加えて、胸膜液、腹水、心膜液、及び関節液においても検出され得る。
ＣＲＰは重要な急性反応タンパク質である。ＣＲＰは細菌感染の発生後６時間～８時間で増加し始め、２４時間～４８時間でピークに達する。感染が解消された後に、その含有量は急激に低下し、１週間以内に正常に戻る。
ＣＲＰの臨床的利用は、主に細菌感染又はウイルス感染を特定するだけでなく、疾患の変化及び術後感染を監視し、抗生物質の有効性を動的に観察し、治療を指導及び監視するため等の第一選択指標として使用される。ＣＲＰはまた、心血管疾患、冠状動脈性心疾患、及び急性冠症候群にも関連しており、ここでは、患者のＣＲＰのレベルは、しばしば著しく上昇し、レベルの上昇の程度は、冠状動脈閉塞の程度、冠状動脈性心疾患及び鬱血性心不全の終了事象の発生及び予後と有意に相関する。さらに、ＣＲＰはまた、心房細動の独立した予測因子でもあり、血清ＣＲＰ濃度と高血圧との間には或る特定の相関がある。高血圧患者の収縮期血圧レベル及び拡張期血圧レベルは、血清ＣＲＰ濃度の増加と共に高まる。
現在、市場に出回るＣＲＰ検出法には、主に超高感度ＣＲＰ（ｈｓＣＲＰ）検出、従来のＣＲＰ検出、及び全域ＣＲＰ検出が含まれる。超高感度ＣＲＰ検出は、主に心血管事象の発生及び発症を診断及び予測するために使用されるのに対して、従来のＣＲＰ検出は、主に細菌感染、様々な炎症過程、組織壊死及び組織損傷（例えば、術後損傷）だけでなく、回復期間の間のスクリーニング、監視、疾患評価、及び有効性判断のために使用される。初期の従来のＣＲＰ検出法は、主に免疫散乱比濁法又は免疫透射比濁（immuno-transmitting turbidity）法に基づき、５ｍｇ／Ｌを超える検出能を有するが、これらは高感度ではないため、心血管疾患のリスクを予測することは困難である。その後の研究開発により、免疫増強比濁法が得られ、その分析感度は大幅に向上し、検出下限は０．０２ｍｇ／Ｌに達し得る。低濃度のためのこの超高感度ＣＲＰ検出は、超高感度ＣＲＰ検出と呼ばれる。技術の継続的な革新及び改善により、化学発光検出法及び免疫蛍光検出法等の幾つかの検出法は、超高感度及び全域ＣＲＰの検出線形性を一度に満たすことができる。検出の線幅は０．０２ｍｇ／Ｌ～１００ｍｇ／Ｌに達し得る。
現在、全域ＣＲＰ検出法では、通常、競合する遊離抗体の添加が使用される。例えば、特許文献１では、遊離モノクローナル抗体又はコーティング若しくは標識と競合し得る抗体の添加の使用について述べられている。しかしながら、そのような方法は、試薬安定性等の操作の困難性を高める。特許文献２は、酸破壊後にアルカリ中和を用いて全域検出の目的が達成される方法を開示しているが、その方法は依然として安定しておらず使いやすくない。したがって、当該技術分野では、全域ＣＲＰ検出法を改善して、全域ＣＲＰ検出法を安定した使いやすい検出方式で実現することが依然として求められている。
米国特許出願公開第２０１４／００１７７１２号明細書 中国特許出願公開第１０５９８８００３号明細書
本発明の目的は、従来技術の不利点を克服して、Ｃ反応性タンパク質を全域検出する安定した使いやすい方法及び対応するキットを提供することである。
本発明の技術的な解決手段は、以下の通りである。
一態様では、本発明は、Ｃ反応性タンパク質の全域検出のためのキットであって、
第１抗体でコーティングされた０．５ｍｇ／ｍＬ～１ｍｇ／ｍＬの磁性粒子、０．０４％（Ｗ／Ｖ）～０．０６％（Ｗ／Ｖ）の界面活性剤（前記界面活性剤は、任意にＴｗｅｅｎ－２０である）、及び８％（Ｗ／Ｖ）～１２％（Ｗ／Ｖ）のスクロースを含み、その溶剤がｐＨ＝７．０～８．０を有するリン酸緩衝液であり、前記第１抗体のコーティング量は５μｇ～２０μｇ／ｍｇ磁性粒子である、Ｍ試薬と、
０．１Ｍ～１Ｍの濃度、ｐＨ＝３．０～４．０を有するクエン酸溶液であって、試料処理溶液であるＲ１試薬と、
第２抗体でコーティングされたアクリジニウムエステル、０．５％～１％のカゼイン、及び０．５％～１％のウシ血清アルブミンを含み、その溶剤がｐＨ＝７．０～８．０を有するリン酸緩衝液であり、前記第２抗体のコーティング量は０．３μｇ～０．９μｇ／μｇアクリジニウムエステルである、Ｒ２試薬と、
予備励起溶液及び励起溶液と、
を含み、前記第１抗体及び前記第２抗体は、両者ともＣ反応性タンパク質と特異的に反応することができるモノクローナル抗体であり、前記第１抗体及び前記第２抗体は異なるエピトープに対する抗体である、キットを提供する。
別の態様では、本発明は、Ｃ反応性タンパク質の全域検出のためのキットであって、
第１抗体のコーティング量が１００ｎｇ／ウェル～５００ｎｇ／ウェル（任意に、５００ｎｇ／ウェル）であり、コーティング緩衝液はｐＨ＝７．０～８．０を有するリン酸緩衝液であり、ブロッキング溶液は、５％（Ｗ／Ｖ）～８％（Ｗ／Ｖ）のブロッキング血清又はブロッキングタンパク質（前記ブロッキング血清は、任意に仔ウシ血清である）及び０．０２％（Ｗ／Ｖ）のアジ化ナトリウムを含む７．２～７．４のｐＨを有する５０ｍＭのリン酸緩衝液である、第１抗体でコーティングされた、プレート型発光プレート（任意に、９６ウェル、３８４ウェル、又は他のプレート型発光プレート）を含む平底プレート型の化学発光プレートと、
０．１Ｍ～１Ｍの濃度、ｐＨ＝３～４を有するクエン酸溶液である試料処理溶液と、
西洋ワサビペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼで標識された第２抗体を含み、１ｍｇ／ｍＬの第２抗体が西洋ワサビペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼで同じ割合で標識される標識量を有する、標識酵素溶液と、
発色溶液であって：前記標識酵素が西洋ワサビペルオキシダーゼである場合に、前記発色溶液は発色溶液Ａ及び発色溶液Ｂを含み、前記発色溶液Ａは、過酸化水素（任意に、前記発色溶液Ａの配合：１３．６ｇの酢酸ナトリウム、１．６ｇのクエン酸、０．３ｍｌの３０％の過酸化水素であり、蒸留水を配合して５００ｍｌとする）であり、前記発色溶液Ｂは、ｏ－フェニレンジアミン（任意に、前記発色溶液Ｂの配合：０．２ｇのエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム、０．９５ｇのクエン酸、５０ｍｌのグリセロール、９．１５ｇのテトラメチルベンジジンであり、蒸留水を配合して５００ｍｌとする）であり；前記標識酵素が、アルカリホスファターゼである場合に、前記発色溶液は、市販の試薬である；発色溶液と、
を含み、前記第１抗体及び前記第２抗体は、両者ともＣ反応性タンパク質と特異的に反応することができるモノクローナル抗体であり、前記第１抗体及び前記第２抗体は異なるエピトープに対する抗体である、キットを提供する。
幾つかの実施の形態では、前記クエン酸溶液のｐＨは、リン酸水素二ナトリウム十二水和物によって調整され、好ましくは、前記クエン酸溶液のｐＨは、３．０～３．５であり、より好ましくは、前記クエン酸溶液のｐＨは、３．２、３．３、３．４、又は３．５である。
他の実施の形態では、前記クエン酸の濃度は、０．５ｍｏｌ／Ｌである。
幾つかの実施の形態では、前記予備励起溶液は、１％（Ｗ／Ｖ）の過酸化水素溶液であり、前記励起溶液は、１ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム溶液であり、前記第１抗体は、１０Ｃ１１であり、前記第２抗体は、１４Ｄ９－２である。
更に他の実施の形態では、前記Ｍ試薬を調製する方法は、前記第１抗体及び前記磁性粒子をｐＨ＝５．０～６．０を有する２－モルホリンエタンスルホン酸緩衝液中で混合し、２５℃～３７℃で１時間～３時間コーティングし、ｐＨ＝８．０～９．０を有する０．１％（Ｗ／Ｖ）～０．５％（Ｗ／Ｖ）のウシ血清アルブミンリン酸緩衝液を添加して、１時間～３時間にわたり停止を行い、コーティングされた磁性粒子を分離し、ｐＨ＝７．０～８．０を有するリン酸緩衝液中に分散させた後に、０．０４％（Ｗ／Ｖ）～０．０６％（Ｗ／Ｖ）の界面活性剤（前記界面活性剤は、任意にＴｗｅｅｎ－２０であり、一実施の形態では、前記界面活性剤は、０．０５％（Ｗ／Ｖ）のＴｗｅｅｎ－２０である）及び８％（Ｗ／Ｖ）～１２％（Ｗ／Ｖ）のスクロース（任意に、１０％（Ｗ／Ｖ）のスクロース）を添加することで、前記Ｍ試薬を得ることを含み、
前記Ｒ２試薬を調製する方法は、前記第２抗体及びアクリジニウムエステルをｐＨ＝８．０～９．０を有するリン酸緩衝液中で混合し、２５℃～３７℃で１時間～３時間コーティングした後に、０．１％（Ｗ／Ｖ）～０．５％（Ｗ／Ｖ）のウシ血清アルブミンを含むｐＨ＝８．０～９．０を有するＴｒｉｓ緩衝液を添加して、１時間～３時間にわたり停止を行い、ストック溶液を得て、前記ストック溶液をｐＨ＝７．０～８．０を有するリン酸緩衝液で１：１００～５００に希釈することで、前記Ｒ２試薬を得ることを含む。
他の実施の形態では、前記発光プレートのコーティング源を調製する方法は、前記コーティングされる第１抗体を、コーティング緩衝液としてのｐＨ＝７．０～８．０を有するリン酸緩衝液で１００ｎｇ／ウェル～５００ｎｇ／ウェル（任意に、５００ｎｇ／ウェル）に希釈し、前記発光プレートに１ウェル当たり１００μＬを加え、３７℃で２時間又は４℃で一晩インキュベートし、前記コーティング緩衝液を注ぎ出し、５％（Ｗ／Ｖ）～８％（Ｗ／Ｖ）の仔ウシ血清及び０．０２％（Ｗ／Ｖ）のアジ化ナトリウムを含む２００μＬのブロッキング溶液を使用して、３７℃で２時間インキュベートし、前記ウェル内のその液体を注ぎ出し、前記プレートを乾燥させ、真空下にアルミニウムフィルムで密封し、乾燥した場所で４℃にて貯蔵することを含み、
前記標識酵素溶液を調製する方法は、前記第２抗体と西洋ワサビペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼとを１：１の比で混合して標識し、ｐＨ＝９．６を有する炭酸緩衝液中で透析し、前記透析緩衝液を４時間毎に三度にわたって交換し、酵素標識された第２抗体を収集してストック溶液とした後に、前記ストック溶液を市販の酵素希釈液で１：５００に希釈することで、前記標識酵素溶液を得ることを含む。
更に別の態様では、本発明は、本発明のキットを使用することにより実施される、Ｃ反応性タンパク質を全域検出する方法であって、
（１）２０μＬの試料を採取し、１００μＬの前記Ｒ１試薬に添加して前記試料を処理する工程と、
（２）次いで、５０μＬの前記Ｍ試薬を添加し、一緒に１５分間インキュベートする工程と、
（３）工程（２）の後に、０．０５％（Ｗ／Ｖ）～０．０８％（Ｗ／Ｖ）のＴｗｅｅｎ－２０を含むリン酸緩衝液で洗浄を行い、次いで、５０μＬの前記Ｒ２試薬を添加して１０分間インキュベートする工程と、
（４）工程（３）の後に、０．０５％（Ｗ／Ｖ）～０．０８％（Ｗ／Ｖ）のＴｗｅｅｎ－２０を含むリン酸緩衝液で洗浄を行い、１００μＬの前記予備励起溶液を添加して、予備励起を行う工程と、
（５）前記予備励起溶液を除去した後に、１００μＬの前記励起溶液を添加して、励起及び検出を行う工程と、
を含む、方法を提供する。
別の態様では、本発明は、Ｃ反応性タンパク質の全域検出のためのキットの製造における試料処理溶液としてのクエン酸溶液の使用を提供する。
幾つかの実施の形態では、前記クエン酸溶液は、０．１Ｍ～１Ｍの濃度、ｐＨ＝３～４を有するクエン酸溶液であり、好ましくは、前記クエン酸溶液のｐＨは、リン酸水素二ナトリウム十二水和物によって調整され、より好ましくは、前記クエン酸溶液のｐＨは、３．０～３．５であり、より好ましくは、前記クエン酸溶液のｐＨは、３．２、３．３、３．４、又は３．５である。
一態様では、本発明は、Ｃ反応性タンパク質の全域検出（直接的化学発光、すなわち、磁性粒子化学発光法）のためのキットであって、以下の構成要素：
第１抗体でコーティングされた０．５ｍｇ／ｍＬ～１ｍｇ／ｍＬの磁性粒子、０．０４％（Ｗ／Ｖ）～０．０６％（Ｗ／Ｖ）の界面活性剤（前記界面活性剤は、任意にＴｗｅｅｎ－２０である）、及び８％（Ｗ／Ｖ）～１２％（Ｗ／Ｖ）のスクロースを含み、その溶剤がｐＨ＝７．０～８．０を有するリン酸緩衝液であり、前記第１抗体のコーティング量は５μｇ～２０μｇ／ｍｇ磁性粒子である、Ｍ試薬と、
０．１Ｍ～１Ｍの濃度、ｐＨ＝３．０～４．０を有するクエン酸溶液であるＲ１試薬、つまり試料処理溶液と、
第２抗体でコーティングされたアクリジニウムエステル、０．５％～１％のカゼイン、及び０．５％～１％のウシ血清アルブミンを含み、その溶剤がｐＨ＝７．０～８．０を有するリン酸緩衝液であり、前記第２抗体のコーティング量は０．３μｇ～０．９μｇ／μｇアクリジニウムエステルである、Ｒ２試薬と、
予備励起溶液及び励起溶液と、
を含み、前記第１抗体及び前記第２抗体は、両者ともＣ反応性タンパク質と特異的に反応することができるモノクローナル抗体であり、前記第１抗体及び前記第２抗体は異なるエピトープに対する抗体である、キットを提供する。
アクリジン化合物の発光メカニズム：アルカリ性過酸化水素溶液中で、アクリジン化合物の分子は過酸化水素イオンによって攻撃されて不安定なペルオキシ化合物を形成し、この化合物はＣＯ２と電子的に励起されたＮ－メチルアクリドンとに分解し、Ｎ－メチルアクリドンは、基底状態に戻る際に４３０ｎｍの最大発光波長を有する光子を放出する。Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、Ｔｗｅｅｎ－２０、ＣＴＡＣ（ヘキサデシルトリメチルアンモニウムクロリド、陽イオン性界面活性剤）等の界面活性剤は、発光を増強することができる。
本発明の好ましい実施の形態では、Ｒ１試薬は、０．５Ｍのクエン酸溶液（ｐＨ＝３～３．５）である。
更に好ましくは、Ｒ１試薬のｐＨは、リン酸水素二ナトリウム十二水和物によって調整される。
一実施の形態では、前記クエン酸溶液のｐＨは、リン酸水素二ナトリウム十二水和物によって調整される。好ましくは、前記クエン酸溶液のｐＨは、３．０～３．５であり、より好ましくは、前記クエン酸溶液のｐＨは、３．２、３．３、３．４、又は３．５である。
更に別の実施の形態では、前記クエン酸の濃度は、０．５ｍｏｌ／Ｌである。
更に好ましくは、Ｍ試薬は、０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０及び１０％のスクロースを含有する。
更に好ましくは、Ｍ試薬を調製する方法は、第１抗体及び磁性粒子をｐＨ＝５．０～６．０を有する２－モルホリンエタンスルホン酸緩衝液中で混合し、２５℃～３７℃で１時間～３時間コーティングし、ｐＨ＝８．０～９．０を有する０．１％～０．５％（Ｗ／Ｖ）のウシ血清アルブミンリン酸緩衝液を添加して、１時間～３時間にわたりコーティングを停止させ、コーティングされた磁性粒子を分離し、ｐＨ＝７．０～８．０を有するリン酸緩衝液中に分散させた後に、Ｔｗｅｅｎ－２０及びスクロースを添加することで、Ｍ試薬を得ることを含む。
更に好ましくは、Ｒ２試薬を調製する方法は、第２抗体及びアクリジニウムエステルをｐＨ＝８．０～９．０を有するリン酸緩衝液中で混合し、２５℃～３７℃で１時間～３時間コーティングした後に、０．１％～０．５％（Ｗ／Ｖ）のウシ血清アルブミンを含むｐＨ＝８．０～９．０を有するＴｒｉｓ緩衝液を添加して、１時間～３時間にわたりコーティングを停止させて、ストック溶液を得た後に、ストック溶液をｐＨ＝７．０～８．０を有するリン酸緩衝液で１：１００～５００に希釈することで、Ｒ２試薬を得ることを含む。
更に好ましくは、予備励起溶液は、１％（Ｗ／Ｖ）の過酸化水素溶液である。
さらに、励起溶液は１ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム溶液である。
別の態様では、本発明は、Ｃ反応性タンパク質の全域検出（酵素的化学発光、すなわち、西洋ワサビペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼプレート型の化学発光法）のためのキットであって、以下の構成要素：
第１抗体のコーティング量が１００ｎｇ／ウェル～５００ｎｇ／ウェル（任意に、５００ｎｇ／ウェル）であり、コーティング緩衝液はｐＨ＝７．０～８．０を有するリン酸緩衝液であり、ブロッキング溶液は、５％（Ｗ／Ｖ）～８％（Ｗ／Ｖ）のブロッキング血清又はブロッキングタンパク質（前記ブロッキング血清は、任意に仔ウシ血清である）及び０．０２％（Ｗ／Ｖ）のアジ化ナトリウムを含む７．２～７．４のｐＨを有する５０ｍＭのリン酸緩衝液である、第１抗体でコーティングされた、プレート型発光プレート（任意に、９６ウェル、３８４ウェル、又は他のプレート型発光プレート）を含む平底の化学発光プレートと、
０．１Ｍ～１Ｍの濃度、ｐＨ＝３～４を有するクエン酸溶液である試料処理溶液と、
西洋ワサビペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼで標識された第２抗体を含み、１ｍｇ／ｍＬの第２抗体が西洋ワサビペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼで同じ割合で標識される標識量を有する、標識酵素溶液と、
発色溶液であって：前記標識酵素が西洋ワサビペルオキシダーゼである場合に、前記発色溶液は発色溶液Ａ及び発色溶液Ｂを含み、前記発色溶液Ａは、過酸化水素（１３．６ｇの酢酸ナトリウム、１．６ｇのクエン酸、０．３ｍｌの３０％の過酸化水素であり、蒸留水を配合して５００ｍｌとする）であり、前記発色溶液Ｂは、ｏ－フェニレンジアミン（前記発色溶液Ｂの配合：０．２ｇのエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム、０．９５ｇのクエン酸、５０ｍｌのグリセロール、９．１５ｇのテトラメチルベンジジンであり、蒸留水を配合して５００ｍｌとする）であり；前記標識酵素が、アルカリホスファターゼである場合に、前記発色溶液は、市販の試薬（製品番号１８０３０９－０１、Xiamen Boson Biotechnology Co., Ltd.社から購入）である；発色溶液と、
を含む、キットを提供する。
検出：自動式化学発光分析装置（Yantai Add care Biotechnology Co., Ltd.社から購入）を使用して、発光値を読み取る。
上述の第１抗体及び第２抗体は、両者ともＣ反応性タンパク質と特異的に反応することができるモノクローナル抗体である。
本発明の好ましい実施の形態では、試料処理溶液は、３～３．５のｐＨを有する０．５Ｍのクエン酸溶液である。
更に好ましくは、試料処理溶液のｐＨは、リン酸水素二ナトリウム十二水和物によって調整される。
一実施の形態では、前記クエン酸溶液のｐＨは、リン酸水素二ナトリウム十二水和物によって調整される。好ましくは、前記クエン酸溶液のｐＨは、３．０～３．５であり、より好ましくは、前記クエン酸溶液のｐＨは、３．２、３．３、３．４、又は３．５である。
更に別の実施の形態では、前記クエン酸の濃度は、０．５ｍｏｌ／Ｌである。
更に好ましくは、第１抗体でコーティングされた平底型の化学発光プレートは、５％～８％の仔ウシ血清及び０．０２％のアジ化ナトリウムを含む。
更に好ましくは、第１抗体でコーティングされた平底型の化学発光プレートを作製する方法は、コーティングされる第１抗体を、コーティング緩衝液としてのｐＨ＝７．０～８．０を有するリン酸緩衝液で５μｇ／ｍＬまで、すなわち５００ｎｇ／ウェルに希釈し、発光プレートに１ウェル当たり１００μＬを加え、３７℃で２時間又は４℃で一晩インキュベートし、コーティング緩衝液を注ぎ出し、２００μＬのブロッキング溶液（５％（Ｗ／Ｖ）～８％（Ｗ／Ｖ）の仔ウシ血清及び０．０２％（Ｗ／Ｖ）のアジ化ナトリウム）を使用して、３７℃で２時間インキュベートし、ウェル内の液体を注ぎ出し、プレートを乾燥させ、真空下にアルミニウムフィルムで密封し、乾燥した場所で４℃にて貯蔵することを含む。
更に好ましくは、標識酵素溶液を調製する方法は、第２抗体と西洋ワサビペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼとを１：１の比で混合して標識し、ｐＨ＝９．６を有する炭酸緩衝液中で透析し、透析緩衝液を４時間毎に三度にわたって交換し、酵素標識された第２抗体を収集してストック溶液とした後に、ストック溶液を市販の酵素希釈液で１：５００に希釈することで、標識酵素溶液を得ることを含む。
更に好ましくは、標識酵素が西洋ワサビペルオキシダーゼである場合に、発色溶液Ａは過酸化水素であり、発色溶液Ｂはｏ－フェニレンジアミンであり、標識酵素がアルカリホスファターゼである場合に、発色溶液は市販の試薬である。
さらに、内容物は自動式化学発光分析装置によって直接測定される。
本発明の有益な効果は、本発明のキットの検出範囲が、本発明のキットの反応過程の間に試料処理溶液（０．１Ｍ～１Ｍの濃度、ｐＨ３～４を有するクエン酸溶液）を一段階で加えた後に０．０２ｍｇ／Ｌ～１００ｍｇ／Ｌであり得ることであり、こうして、該キットはＣ反応性タンパク質の全域検出の要件を満たすことができる。
組み合わせ検出用の較正物質の曲線である、組み合わされた用量反応曲線を示す図である。左の画像は１０Ｃ１１－７Ｄ９についての組み合わされた用量反応曲線を表し、右の画像は１０Ｃ１１－１４Ｄ９－２についての組み合わされた用量反応曲線を表す。 試料値とバックグラウンド値との間の相関を評価する組み合わせ検出結果の相関分析を示す図である。左の画像は１０Ｃ１１－７Ｄ９についての組み合わせ検出結果の相関分析を表し、右の画像は１０Ｃ１１－１４Ｄ９－２についての組み合わせ検出結果の相関分析を表す。
本発明の技術的な解決手段を、以下で特定の実施形態によって更に例示して説明する。
試薬は分析グレードであり、特段の指定がない限り、Xiamen Xuong Chemical Co., Ltd.社から購入した。
一実施形態では、本発明のＣ反応性タンパク質の全域検出（直接的化学発光、すなわち、磁性粒子化学発光法）のためのキットは、以下の構成要素：
Ｍ試薬（第１抗体でコーティングされた０．８ｍｇ／ｍＬの磁性粒子、０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０及び１０％のスクロースを含み、その溶剤はｐＨ＝７．５を有するリン酸緩衝液であり、ここで、第１抗体のコーティング量は１２μｇ／μｇ磁性粒子であり、磁性粒子はThermo Fisher Scientific社から購入され、Ｆｅ3Ｏ4コアを有するナノスケールの超常磁性粒子であった。Ｍ試薬を調製する方法は、第１抗体及び磁性粒子をｐＨ＝５．５を有する２－モルホリンエタンスルホン酸緩衝液中で混合し、３２℃で１時間～３時間コーティングし、０．３％のウシ血清アルブミンを含むｐＨ＝８．５を有するリン酸緩衝溶液を添加して、２時間にわたりコーティングを停止させ、コーティングされた磁性粒子を分離し、ｐＨ＝７．５を有するリン酸緩衝溶液中に分散させた後に、Ｔｗｅｅｎ－２０及びスクロースを添加することで、Ｍ試薬を得ることを含んでいた）と；
Ｒ１試薬（リン酸水素二ナトリウム十二水和物で調整された、ｐＨ＝３．２、０．５Ｍの濃度を有するクエン酸溶液）と；
Ｒ２試薬（第２抗体でコーティングされたアクリジニウムエステル、０．８％のカゼイン、及び０．８％のウシ血清アルブミンを含み、その溶剤はｐＨ＝７．５を有するリン酸緩衝液であり、第２抗体のコーティング量は０．３μｇ～０．９μｇ／μｇアクリジニウムエステルであった。Ｒ２試薬を調製する方法は、第２抗体及びアクリジニウムエステルをｐＨ＝８．５を有するリン酸緩衝液中で混合し、３２℃で１時間～３時間コーティングし、０．３％のウシ血清アルブミンを含むｐＨ＝８．５を有するＴｒｉｓ緩衝溶液を添加して、２時間にわたりコーティングを停止させ、ストック溶液を得て、ストック溶液をｐＨ＝７．５を有するリン酸緩衝液で１：３００に希釈することで、Ｒ２試薬を得ることを含んでいた）と；
予備励起溶液（１％（Ｗ／Ｖ）の過酸化水素溶液）と；
励起溶液（１ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム溶液）と；
を含み、上述の第１抗体及び第２抗体は、Ｃ反応性タンパク質と特異的に反応することができるモノクローナル抗体であった。第１抗体は１０Ｃ１１であり、第２抗体は１４Ｄ９－２であり、その両者ともXiamen Innova Biotech Co., Ltd.社から購入した。
Ｃ反応性タンパク質の全域検出のための上記キットを使用する検出方法は、以下の工程：
（１）２０μＬの試料（試料は血清又は抗原標準曲線を作成するための標準Ｃ反応性タンパク質）を採取し、１００μＬのＲ１試薬に添加して試料を処理する工程と、
（２）次いで、５０μＬのＭ試薬を添加し、一緒に１５分間インキュベートする工程と、
（３）工程（２）の後に、０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０を含むリン酸緩衝液で洗浄を行い、次いで、５０μＬのＲ２試薬を添加して１０分間インキュベートする工程と、
（４）工程（３）の後に、０．０５％（Ｗ／Ｖ）～０．０８％（Ｗ／Ｖ）のＴｗｅｅｎ－２０を含むリン酸緩衝液で洗浄を行い、１００μＬの予備励起溶液を添加して、予備励起を行う工程と、
（５）予備励起溶液を除去し、１００μＬの励起溶液を添加して、励起及び検出を行う工程と、
を含んでいた。
別の実施形態では、本発明のＣ反応性タンパク質の全域検出（酵素的化学発光、すなわち、西洋ワサビペルオキシダーゼプレート型の化学発光法）のためのキットは、以下の構成要素：
発光プレートのコーティング源（luminescent plate coating source）（９６ウェルプレートの発光プレートを含み、ここで、第１抗体のコーティング量は、５００ｎｇ／ウェルであり、コーティング緩衝液は、ｐＨ＝７．５を有するリン酸緩衝液であり、ブロッキング溶液は、６％の仔ウシ血清及び０．０２％のアジ化ナトリウムを含む７．３のｐＨを有する５０ｍＭのリン酸緩衝液であった。発光プレートのコーティング源を調製する方法は、第１抗体を、コーティング緩衝液としてのｐＨ＝７．５を有するリン酸緩衝液で５μｇ／ｍＬ（すなわち、５００ｎｇ／ウェル）に希釈し、発光プレートに１ウェル当たり１００μＬを加え、３７℃で２時間又は４℃で一晩インキュベートし、コーティング緩衝液を注ぎ出し、６％の仔ウシ血清及び０．０２％のアジ化ナトリウムを含む２００μＬのブロッキング溶液を使用して、３７℃で２時間インキュベートし、ウェル内の液体を注ぎ出し、プレートを乾燥させ、真空下にアルミニウムフィルムで密封し、乾燥した場所で４℃にて貯蔵することを含んでいた）と；
試料処理溶液（リン酸水素二ナトリウム十二水和物で調整された、ｐＨ＝３．２、０．５Ｍの濃度を有するクエン酸溶液である）と；
標識酵素溶液（西洋ワサビペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼで標識された第２抗体を含み、１ｍｇ／ｍＬの第２抗体が西洋ワサビペルオキシダーゼ及びアルカリホスファターゼで同じ割合で標識される標識量を有する。標識酵素溶液を調製する方法は、第２抗体と西洋ワサビペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼとを１：１の比で混合して標識し、ｐＨ＝９．６の炭酸緩衝液中で透析し、透析緩衝液を４時間毎に１回、三度にわたって交換し、酵素標識第２抗体を収集してストック溶液を得た後に、ストック溶液を市販の酵素希釈液（カタログ番号ＥＤ－１１、Beijing Yantai Biopharmaceutical Co., Ltd.社から購入）で１：５００に希釈することで、標識酵素溶液を得ることを含んでいた）と；
発色溶液（標識酵素が西洋ワサビペルオキシダーゼであった場合に、発色溶液Ａは過酸化水素であり、発色溶液Ｂはｏ－フェニレンジアミンであり、標識酵素がアルカリホスファターゼであった場合に、発色溶液は購入した試薬（Xiamen Boson Biotechnology Co., Ltd.社から購入）であった）と；
を含んでいた。
検出：自動式化学発光分析装置（Yantai Add care Biotechnology Co., Ltd.社から購入）を使用して、発光値を読み取った。
上述の第１抗体及び第２抗体は、Ｃ反応性タンパク質と特異的に反応することができるモノクローナル抗体であった。第１抗体は１０Ｃ１１であり、第２抗体は１４Ｄ９－２であり、その両者ともXiamen Innova Biotech Co., Ltd.社から購入した。
Ｃ反応性タンパク質の全域検出のための上述のキットを使用する検出方法は、以下の工程：
（１）２０μＬの試料を採取し、１００μＬの試料処理溶液に添加して試料を処理する工程と、
（２）次いで、発光プレートのコーティング源に添加し、一緒に３７℃で４０分間インキュベートする工程と、
（３）工程（２）の後に、０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０を含むリン酸緩衝液で洗浄を５回行い、発光プレートを乾くまで上下逆さまにし、次いで、１００μＬの標識酵素溶液を添加して３７℃で４０分間インキュベートする工程と、
（４）工程（３）の後に、０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０を含むリン酸緩衝液で洗浄を５回行い、発光プレートを乾くまで上下逆さまにし、標識酵素が西洋ワサビペルオキシダーゼであった場合に、５０μＬの発色溶液Ａ及び５０μＬの発色溶液Ｂを添加し、室温で５分間反応させ、標識酵素がアルカリホスファターゼであった場合に、１００μＬの発色溶液（Xiamen Boson Biotechnology Co., Ltd.社から購入）を添加し、室温で５分間反応させ、最後に、自動式化学発光分析装置を使用して、検出を実行して、発光値を読み取る工程と、
を含んでいた。
実施例１
種々のｐＨ値の０．１Ｍのクエン酸及び０．１Ｍのグリシンを、それぞれ処理溶液として選択し、酵素イムノアッセイシステム（ｐＨ範囲は２～６であった）に添加して、勾配希釈されたＣ反応性タンパク質抗原を評価した。相対的なＯＤ値を以下の表１及び表２に示した。
Figure 0007166364000001
Figure 0007166364000002
表１及び表２は、処理溶液が種々のｐＨ値（リン酸水素二ナトリウム十二水和物で種々のｐＨ値に調整）を有する０．１Ｍのクエン酸であった場合の、及び、処理溶液が種々のｐＨ値を有する０．１Ｍのグリシンであった場合の、酵素イムノアッセイシステムにおけるＣ反応性タンパク質の全域検出の追跡抗原の検出結果を示した。それらの結果により、ｐＨ３～４の間で検出において明らかな傾向が存在するのに対して、他のｐＨ範囲は理想的ではないことが示された。表１及び表２から、処理溶液の処理ｐＨとしてｐＨ３～４の範囲を選択した場合に、試料検出は高から低への傾向を示し、これは他のｐＨ範囲よりも優れていることが分かった。しかしながら、酵素イムノアッセイシステムの線幅は全域検出には十分ではなかったため、化学発光プラットフォームの探求のために最適なｐＨ範囲は３～４であると考えられ、後続の実験にはクエン酸を使用した。
実施例２
実施例１に基づいて、クエン酸濃度（０．１Ｍ、０．５Ｍ、１Ｍのクエン酸濃度）及びｐＨ範囲（ｐＨ３及びｐＨ３．５、ｐＨ４）の改善及び調整を行った。酵素イムノアッセイシステムの相対的な線幅は比較的狭く、好ましい溶液を化学発光プラットフォームで調整した。種々のモル濃度及びｐＨ３～４を有するクエン酸溶液を処理溶液として選択し、化学発光検出システム（すなわち、磁性粒子化学発光プラットフォーム）に添加して、勾配希釈されたＣ反応性タンパク質抗原を評価した。種々のｐＨ及び種々の濃度を有するクエン酸を使用することによって、勾配希釈されたＣ反応性タンパク質抗原を処理し、磁性粒子化学発光プラットフォーム又は酵素的な西洋ワサビペルオキシダーゼ化学発光プラットフォームを検出に使用して検出結果を得た。得られた結果を標準曲線とした。次に、（廈門中山附属医院（Xiamen Zhongshan Affiliated Hospital）及び西京医院（Xining Hospital）から）収集された１８個の臨床試料の相対発光強度を、個別に以下の表３及び表４に示した。
Figure 0007166364000003
Figure 0007166364000004
表３及び表４は、３、３．５、及び４の３つのｐＨ範囲に固定し、種々のクエン酸濃度（０．１Ｍ、０．５Ｍ、及び１Ｍ）が使用される場合に、発光プラットフォームを使用して、全域Ｃ反応性タンパク質の追跡抗原を検出し、１８個の試料を評価することを示した。０．５Ｍの濃度及びｐＨ３～３．５を有するクエン酸がより良好な結果を示すことが判明した。表３から、上記濃度及びｐＨの下では、血清間の相関はｐＨ３から３．５の間で比較的良好であることが分かり、０．５Ｍのクエン酸が好ましく、０．５Ｍのクエン酸の場合にｐＨ３～３．５の間で変動が比較的小さかったため、比較的安定しているとみなされた。
実施例３
０．５Ｍのクエン酸を選択して、ｐＨ濃度を更に最適化して精査した（ｐＨ２．８～４）。種々のｐＨの０．５Ｍのクエン酸を処理溶液として使用して、勾配希釈されたＣ反応性タンパク質抗原を処理し、磁性粒子化学発光プラットフォーム又は酵素的な西洋ワサビペルオキシダーゼ化学発光プラットフォームを検出に使用して、検出結果を得た後に、その結果を標準曲線とした。次いで、収集された１８個の臨床試料を検出し、検出結果を表５及び表６に示した。
Figure 0007166364000005
Figure 0007166364000006
表５及び表６は、事前に調査された最適なクエン酸濃度が使用される場合に、ｐＨ濃度を慎重に調査し、リン酸水素二ナトリウム十二水和物を選択して、種々のｐＨ値（ｐＨ２．８～４を含む）を調整し、発光プラットフォームを使用して、全域Ｃ反応性タンパク質の追跡抗原を検出することを示した。ｐＨ（３．０～３．５）の試験試料がより良好な相関を示し、ここで、磁性粒子化学発光プラットフォームは、ｐＨ３．４で最良であり、最良の線形検出結果を示すことが判明した。
上記のｐＨ範囲で、表５の結果と組み合わせると、ｐＨは３．０～３．５の範囲内であり、Ｃ反応性タンパク質のシングル血清は０．９６を上回る線形相関ｒ２を有し、最終的な好ましい条件はｐＨ（３．４）を有する０．５Ｍのクエン酸であり、１８個の血清試料の検出における相関は０．９７を上回った。表６の結果から、酵素的な西洋ワサビペルオキシダーゼ発光プラットフォームは、ｐＨ３．２で最良の線形検出結果を示した。１５個の血清試料の相関は０．９５９を上回った。
実施例４
最適化された検出システムを使用して、勾配希釈されたＣ反応性タンパク質抗原を検出して、標準曲線を作成し、その後に、収集された４７個の臨床試料を検出し、標準曲線を介してそれらの濃度値を計算し、臨床的バックグラウンド値に対する相関評価を行い、結果を以下の表７に示した（磁性粒子化学発光プラットフォーム）：
表７
Figure 0007166364000007
相関評価によって、これら２つの相関式はｙ＝０．８１５１ｘ＋０．２１７９であり、相関係数ｒ２＝０．９６９２であったことから、これら２つが良好な相関を有したことが示される。
最適化された検出システムを使用して、勾配希釈されたＣ反応性タンパク質抗原を検出して、標準曲線を作成し、その後に、収集された７３個の臨床試料を検出し、標準曲線を介してそれらの濃度値を計算し、臨床的バックグラウンド値に対する相関評価を行い、結果を以下の表８に示した（酵素的な西洋ワサビペルオキシダーゼ化学発光プラットフォーム）：
表８
Figure 0007166364000008
Figure 0007166364000009
相関評価によって、これら２つの間の相関式はｙ＝１．０５６ｘ＋０．０６１９であり、相関係数ｒ２＝０．９５０６であったことから、これら２つが良好な相関を有したことが示される。
実施例５
最適化された検出システムと特許文献２の公開番号を有する特許出願で述べられた酸処理試薬とアルカリ中和試薬とを使用して、勾配希釈されたＣ反応性タンパク質抗原を検出して、標準曲線を作成し、その後に、収集された４８個の臨床試料を検出し、標準曲線を介してそれらの濃度値を計算し、臨床的バックグラウンド値に対して相関を評価し、これら２つの間の性能差を評価し、結果を図１及び図２に示した（磁性粒子化学発光プラットフォーム）。
追跡抗原の線幅の比較において、２つの試薬は市場の需要（０．０２ｍｇ／Ｌ～１００ｍｇ／Ｌ）を満たすことができ、２つの試薬は試料相関の評価において同等の性能を示した。
本発明のキットの検出範囲は、本発明のキットの反応過程において試料処理溶液（０．１Ｍ～１Ｍの濃度、ｐＨ３～４を有するクエン酸溶液）を一段階で加えた後に、０．０２ｍｇ／Ｌ～１００ｍｇ／Ｌに達することができるため、該キットはＣ反応性タンパク質の全域検出の要件を満たすことが分かった。
上記は本発明の好ましい例であるにすぎず、本発明の実施範囲はそれに応じて限定され得ない。すなわち、本発明の範囲及び本明細書の内容に従って加えられた同等の変化及び変更は、依然として本発明が対象とする範囲内に含まれるべきである。

Claims (18)

  1. Ｃ反応性タンパク質の全域検出のためのキットであって、
    第１抗体でコーティングされた０．５ｍｇ／ｍＬ～１ｍｇ／ｍＬの磁性粒子、０．０４％（Ｗ／Ｖ）～０．０６％（Ｗ／Ｖ）の界面活性剤、及び８％（Ｗ／Ｖ）～１２％（Ｗ／Ｖ）のスクロースを含み、その溶剤がｐＨ＝７．０～８．０を有するリン酸緩衝液であり、前記第１抗体のコーティング量は５μｇ～２０μｇ／ｍｇ磁性粒子であり、前記界面活性剤はＴｗｅｅｎ－２０である、Ｍ試薬と、
    ０．１Ｍ～１Ｍの濃度、ｐＨ＝３．０～４．０を有するクエン酸溶液であって、試料処理溶液である、Ｒ１試薬と、
    第２抗体でコーティングされたアクリジニウムエステル、０．５％～１％のカゼイン、及び０．５％～１％のウシ血清アルブミンを含み、その溶剤がｐＨ＝７．０～８．０を有するリン酸緩衝液であり、前記第２抗体のコーティング量は０．３μｇ～０．９μｇ／μｇアクリジニウムエステルである、Ｒ２試薬と、
    予備励起溶液及び励起溶液と、
    を含み、前記第１抗体及び前記第２抗体は、両者ともＣ反応性タンパク質と特異的に反応することができるモノクローナル抗体であり、前記第１抗体及び前記第２抗体は異なるエピトープに対する抗体である、キット。
  2. Ｃ反応性タンパク質の全域検出のためのキットであって、
    第１抗体のコーティング量が１００ｎｇ／ウェル～５００ｎｇ／ウェルであり、コーティング緩衝液はｐＨ＝７．０～８．０を有するリン酸緩衝液であり、ブロッキング溶液は、５％（Ｗ／Ｖ）～８％（Ｗ／Ｖ）のブロッキング血清又はブロッキングタンパク質及び０．０２％（Ｗ／Ｖ）のアジ化ナトリウムを含む７．２～７．４のｐＨを有する５０ｍＭのリン酸緩衝液である、第１抗体でコーティングされた、平底プレート型の化学発光プレートと、
    ０．１Ｍ～１Ｍの濃度、ｐＨ＝３～４を有するクエン酸溶液である試料処理溶液と、
    西洋ワサビペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼで標識された第２抗体を含み、１ｍｇ／ｍＬの第２抗体が西洋ワサビペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼで同じ割合で標識される標識量を有する、標識酵素溶液と、
    発色溶液であって：前記第２抗体が西洋ワサビペルオキシダーゼで標識される場合に、前記発色溶液は発色溶液Ａ及び発色溶液Ｂを含み、前記発色溶液Ａは、過酸化水素であって、前記発色溶液Ａの配合：１３．６ｇの酢酸ナトリウム、１．６ｇのクエン酸、０．３ｍｌの３０％の過酸化水素であり、蒸留水を配合して５００ｍｌとし、前記発色溶液Ｂは、ｏ－フェニレンジアミンであって、前記発色溶液Ｂの配合：０．２ｇのエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム、０．９５ｇのクエン酸、５０ｍｌのグリセロール、９．１５ｇのテトラメチルベンジジンであり、蒸留水を配合して５００ｍｌとする；発色溶液と、
    を含み、前記第１抗体及び前記第２抗体は、両者ともＣ反応性タンパク質と特異的に反応することができるモノクローナル抗体であり、前記第１抗体及び前記第２抗体は異なるエピトープに対する抗体である、キット。
  3. 前記化学発光プレートは９６ウェル又は３８４ウェルプレートであり、前記第１抗体のコーティング量は、５００ｎｇ／ウェルであり、前記ブロッキング血清は、仔ウシ血清である、請求項２に記載のキット。
  4. 前記クエン酸溶液のｐＨは、リン酸水素二ナトリウム十二水和物によって調整される、請求項１～３のいずれか一項に記載のキット。
  5. 前記クエン酸溶液のｐＨは、３．０～３．５である、請求項１～３のいずれか一項に記載のキット。
  6. 前記クエン酸溶液のｐＨは、３．２、３．３、３．４、又は３．５である、請求項５に記載のキット。
  7. 前記クエン酸溶液の濃度は、０．５ｍｏｌ／Ｌである、請求項１～３のいずれか一項に記載のキット。
  8. 前記予備励起溶液は、１％（Ｗ／Ｖ）の過酸化水素溶液であり、前記励起溶液は、１ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム溶液である、請求項１に記載のキット。
  9. 前記第１抗体は、１０Ｃ１１であり、前記第２抗体は、１４Ｄ９－２である、請求項１～８のいずれか一項に記載のキット。
  10. 前記Ｍ試薬を調製する方法は、前記第１抗体及び前記磁性粒子をｐＨ＝５．０～６．０を有する２－モルホリンエタンスルホン酸緩衝液中で混合し、２５℃～３７℃で１時間～３時間コーティングし、ｐＨ＝８．０～９．０を有する０．１％（Ｗ／Ｖ）～０．５％（Ｗ／Ｖ）のウシ血清アルブミンリン酸緩衝液を添加して、１時間～３時間にわたり停止を行い、コーティングされた磁性粒子を分離し、ｐＨ＝７．０～８．０を有するリン酸緩衝液中に分散させた後に、０．０４％（Ｗ／Ｖ）～０．０６％（Ｗ／Ｖ）の、Ｔｗｅｅｎ－２０である界面活性剤及び８％（Ｗ／Ｖ）～１２％（Ｗ／Ｖ）のスクロースを添加することで、前記Ｍ試薬を得ることを含み、
    前記Ｒ２試薬を調製する方法は、前記第２抗体及びアクリジニウムエステルをｐＨ＝８．０～９．０を有するリン酸緩衝液中で混合し、２５℃～３７℃で１時間～３時間コーティングした後に、０．１％（Ｗ／Ｖ）～０．５％（Ｗ／Ｖ）のウシ血清アルブミンを含むｐＨ＝８．０～９．０を有するＴｒｉｓ緩衝液を添加して、１時間～３時間にわたり停止を行い、ストック溶液を得て、前記ストック溶液をｐＨ＝７．０～８．０を有するリン酸緩衝液で１：１００～５００に希釈することで、前記Ｒ２試薬を得ることを含む、請求項１に記載のキット。
  11. 前記界面活性剤は、０．０５％（Ｗ／Ｖ）のＴｗｅｅｎ－２０であり、１０％（Ｗ／Ｖ）のスクロースが添加される、請求項１０に記載のキット。
  12. 前記化学発光プレートのコーティング源を調製する方法は、前記コーティングされる第１抗体を、コーティング緩衝液としてのｐＨ＝７．０～８．０を有するリン酸緩衝液で１００ｎｇ／ウェル～５００ｎｇ／ウェルに希釈し、前記化学発光プレートに１ウェル当たり１００μＬを加え、３７℃で２時間又は４℃で一晩インキュベートし、前記コーティング緩衝液を注ぎ出し、５％（Ｗ／Ｖ）～８％（Ｗ／Ｖ）の仔ウシ血清及び０．０２％（Ｗ／Ｖ）のアジ化ナトリウムを含む２００μＬのブロッキング溶液を使用して、３７℃で２時間インキュベートし、前記ウェル内のその液体を注ぎ出し、前記化学発光プレートを乾燥させ、真空下にアルミニウムフィルムで密封し、乾燥した場所で４℃にて貯蔵することを含み、
    前記標識酵素溶液を調製する方法は、前記第２抗体と西洋ワサビペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼとを１：１の比で混合して標識し、ｐＨ＝９．６を有する炭酸緩衝液中で透析し、前記炭酸緩衝液を４時間毎に三度にわたって交換し、酵素標識された第２抗体を収集してストック溶液とした後に、前記ストック溶液を市販の酵素希釈液で１：５００に希釈することで、前記標識酵素溶液を得ることを含む、請求項２又は３に記載のキット。
  13. 前記コーティングされる第１抗体が、コーティング緩衝液としてのｐＨ＝７．０～８．０を有するリン酸緩衝液で５００ｎｇ／ウェルに希釈される、請求項１２に記載のキット。
  14. 請求項１に記載のキットを使用することにより実施される、Ｃ反応性タンパク質を全域検出する方法であって、
    （１）２０μＬの試料を採取し、１００μＬの前記Ｒ１試薬に添加して前記試料を処理する工程と、
    （２）次いで、５０μＬの前記Ｍ試薬を添加し、一緒に１５分間インキュベートする工程と、
    （３）工程（２）の後に、０．０５％（Ｗ／Ｖ）～０．０８％（Ｗ／Ｖ）のＴｗｅｅｎ－２０を含むリン酸緩衝液で洗浄を行い、次いで、５０μＬの前記Ｒ２試薬を添加して１０分間インキュベートする工程と、
    （４）工程（３）の後に、０．０５％（Ｗ／Ｖ）～０．０８％（Ｗ／Ｖ）のＴｗｅｅｎ－２０を含むリン酸緩衝液で洗浄を行い、１００μＬの前記予備励起溶液を添加して、予備励起を行う工程と、
    （５）前記予備励起溶液を除去した後に、１００μＬの前記励起溶液を添加して、励起及び検出を行う工程と、
    を含む、方法。
  15. Ｃ反応性タンパク質の全域検出のためのキットの製造における試料処理溶液としてのクエン酸溶液の使用であって、前記クエン酸溶液は、０．１Ｍ～１Ｍの濃度、ｐＨ＝３～４を有するクエン酸溶液である、使用。
  16. 前記クエン酸溶液のｐＨは、リン酸水素二ナトリウム十二水和物によって調整される、請求項１５に記載の使用。
  17. 前記クエン酸溶液のｐＨは、３．０～３．５である、請求項１５又は１６に記載の使用。
  18. 前記クエン酸溶液のｐＨは、３．２、３．３、３．４、又は３．５である、請求項１５又は１６に記載の使用。
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