KR102459248B1 - C-반응성 단백질의 전 범위 검출 방법 및 해당 키트 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 화학 발광 면역 분석에 기초한 C-반응성 단백질의 전 범위 검출용 키트 및 C-반응성 단백질의 전 범위 검출방법을 제공한다. 키트는 R1 시약, M 시약, R2 시약, 예비 여기 용액 및 여기 용액을 포함한다. 시료 처리 용액인 R1 시약은 0.5M 시트르산 용액(pH 3.0-3.5, 인산수소이나트륨 12수화물로 조절됨)이다. 또한, 본 발명은 제 1 항체가 코팅된 평평한 바닥 플레이트형 화학 발광 플레이트, 샘플 처리 용액, 호스래디시 퍼옥시다제(HRP) 또는 알칼리성 포스파타제(AP)로 표지된 제 2 항체, 발색 용액을 포함하는 C-반응성 단백질의 전 범위 검출용 키트를 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 키트를 사용하는 C-반응성 단백질의 전 범위 검출 방법을 제공한다. 제 1 항체 및 제 2 항체 모두 C-반응성 단백질과 특이적으로 반응할 수 있는 단일 클론 항체이다.
Description
본 발명은 화학 발광 면역 분석 기술 분야에 속하는 것이고, 특히 C-반응성 단백질의 전 범위 검출 방법 및 해당 키트에 관한 것이다.
C-반응성 단백질 (C-Reactive protein, CRP)은 1930 년에 Tillet과 Francis가 발견한 급성 반응 단백질로, Ca2+의 존재하에 폐렴 구균 C(Streptococcus pneumoniae C) 다당류와 반응하여 복합체를 형성 할 수 있다; 혈청 CRP는 IL-6, IL-2 및 TNF의 자극하에 간세포에 의해 합성되고, 염증성 국소 대식세포도 소량 생산된다. CRP는 분자량이 약 115KD이고 5 개의 동일한 비당화 폴리펩티드 서브 유닛으로 구성되며, 각 서브 유닛은 204개의 아미노산을 포함하고, 이러한 서브 유닛은 비공유 결합으로 연결되어 고리형 오량체를 형성하며, 사슬간 이황화 결합을 통해 오량체 단백질은 뛰어난 내열성 및 단백질 분해 저항성을 갖는다.
CRP는 신체에 널리 분포되어 있다. 혈액 외에도 흉막액, 복수, 심낭액 및 관절액에서 발견될 수 있다.
CRP는 중요한 급성 반응 단백질이다. CRP는 세균 감염 발생 후 6-8 시간에 증가하기 시작하여 24-48 시간에 최고점에 도달한다. 감염이 소멸되면 CRP는 급격히 감소하고 일주일 이내에 정상으로 돌아온다.
CRP의 임상 적용은 주로 박테리아 또는 바이러스 감염을 식별하기 위한 1차 적인 지표로 사용될 뿐 아니라, 질병 변화 및 수술 후 감염을 모니터링하고, 항생제의 효능을 동적으로 관찰하고, 치료를 가이드하고 모니터링하기위한 우선 지표로 사용된다. 또한, CRP는 심혈관 질환, 관상 동맥 심장 질환 및 급성 관상 동맥 증후군과 관련이 있으며, 환자의 CRP 수준은 종종 현저하게 상승하며, CRP의 상승 수준은 관상 동맥 폐쇄 정도, 관상 동맥 심장병의 말기 단계의 발생 및 예후, 울혈성 심부전과 유의하게 상관 관계가 있다. 또한, CRP는 심방 세동의 독립적인 예측 인자이며, 혈청 CRP 농도와 고혈압 사이에는 일정한 상관 관계가 있다. 고혈압 환자의 수축기 및 확장기 혈압 수준은 혈청 CRP 농도가 증가함에 따라 증가한다.
현재, 시장에 나와있는 CRP 검출 방법은 주로 과민성 CRP(hsCRP) 검출, 전통적인 CRP 검출 및 전-범위 CRP 검출이 포함된다. 과민성 CRP 검출은 주로 심혈관 질환의 발생 및 진행을 진단하고 예측하는 데 사용되는 반면, 전통적인 CRP 검출은 주로 세균 감염, 다양한 염증 과정, 조직 괴사 및 조직 손상 (예: 수술 후 손상)뿐만 아니라 회복 기간 동안 선별, 모니터링, 질병 평가 및 유효성 판단에 사용된다. 초기의 전통적인 CRP 검출 방법은 주로 면역-산란 혼탁도(immuno-scattering turbidity) 또는 면역-투과 혼탁도(immuno-transmitting turbidity) 방법을 기반으로 하며, 검출 능력이 5 mg/L 이상이지만 민감도가 낮아 심혈관 질환의 위험을 예측하기 어렵다. 후속 연구 개발은 분석 감도가 크게 향상되고 검출 하한이 0.02 mg/L에 해당하는 면역 강화 혼탁도 측정 방법을 제공한다. 이들 저농도를 위한 과민성 CRP 검출은 과민성 CRP 검출이라고 한다. 기술의 지속적인 혁신과 개선을 통해 일부 검출 방법은 화학 발광 검출 방법 및 면역 형광 검출 방법과 같은 과민성 및 전-범위 CRP의 검출 선형성을 한 번에 포함한다. 검출선 폭(line width of detection)은 0.02-100 mg/L에 도달할 수 있다.
현재, 전 범위 CRP 검출 방법은 일반적으로 경쟁 유리 항체(competing free antibodies)를 첨가하는 단계를 사용한다. 예를 들어, 미국 공개 특허 2014-0017712 A1은 코팅하는 단계 또는 표지하는 단계와 경쟁할 수 있는 유리 단일 클론 항체 또는 항체를 첨가하는 단계의 사용을 언급한다. 그러나, 이러한 방법은 시약 안정성과 같은 작업의 어려움을 증가시킨다. 중국 공개 특허 CN105988003A은 산 분해(acid destruction) 후 알칼리 중화를 이용하여 전 범위 검출의 목적을 달성하는 방법을 개시하고 있으나, 여전히 안정적이지 않고 편리하지 않다. 따라서, 안정적이고 편리한 검출 모드에서 전 범위 CRP 검출 방법을 실현하기 위해 전 범위 CRP 검출 방법을 개선할 필요성이 당 업계에 존재한다.
본 발명의 목적은 종래 기술의 결함을 극복하고 안정적이고 편리한 C-반응성 단백질의 전 범위 검출을 위한 방법 및 이에 해당하는 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 기술적 해결방법은 다음과 같다:
일 양태에서, 본 발명은 다음을 포함하는 C-반응성 단백질의 전 범위 검출용 키트를 제공한다:
제 1 항체가 코팅된 자성 입자 0.5~1 mg/mL, 0.04~0.06% (w/v) 계면활성제(상기 계면활성제는 선택적으로 Tween-20 임), 및 8~12% (w/v) 수크로스(sucrose)를 포함하는 M 시약(M reagent), 용매는 pH가 7.0 ~ 8.0 인 인산염 버퍼이다; 상기 제 1 항체의 코팅 양은 5~20 μg/mg 자성입자이다;
pH=3.0~4.0이고, 0.1 ~ 1M 농도의 시트르산 용액인 시료 처리 용액인 R1 시약;
제 2 항체가 코팅된 아크리디늄 에스테르(acridinium ester), 0.5-1% 카제인 및 0.5-1% 소 혈청 알부민을 포함하는 R2 시약, 용매는 pH가 7.0-8.0인 인산염 버퍼고, 상기 제 2 항체의 코팅 양은 0.3-0.9 μg/μg 아크리디늄 에스테르이다;
예비-여기 용액(pre-excitation solution) 및 여기 용액;
상기 제 1 항체 및 제 2 항체는 모두 C-반응성 단백질과 특이적으로 반응할 수 있는 단일 클론 항체이고, 상기 제 1 항체 및 제 2 항체는 상이한 에피토프에 대한 항체이다.
다른 양태에서, 본 발명은 다음을 포함하는 C-반응성 단백질의 전 범위 검출용 키트를 제공한다:
플레이트형 발광 플레이트(선택적으로 96 웰, 384 웰 또는 다른 플레이트형 발광 플레이트)를 포함하는 제 1 항체로 코팅된 평평한-바닥 플레이트형 화학 발광 플레이트(flat-bottomed plate-type chemiluminescence plate), 상기 제 1 항체의 코팅 양은 100~500 ng/웰이고(선택적으로 500 ng/웰), 코팅 버퍼는 pH = 7.0~8.0의 인산염 버퍼이고, 블로킹 용액은 5-8% (w/v) 블로킹 혈청 또는 블로킹 단백질(블로킹 혈청은 선택적으로 송아지 혈청임) 및 0.02% (w/v) 아지드화 나트륨을 포함하는 pH 7.2-7.4인 50mM 인산염 버퍼이다;
pH=3~4이고, 0.1~1M 농도의 시트르산 용액인 시료 처리 용액;
호스래디시 퍼옥시다제(horseradish peroxidase) 또는 알칼리성 포스파타제(alkaline phosphatase)로 표지된 제 2 항체를 포함하고, 호스래디시 퍼옥시다제 또는 알칼리성 포스파타제가 동일한 비율로 표지된 제 2 항체가 1 mg/mL의 표지 양을 갖는 표지 효소 용액;
발색 용액: 표지 효소가 호스래디시 퍼옥시다제인 경우, 발색 용액은 발색 용액 A 및 발색 용액 B를 포함하고, 발색 용액 A는 과산화수소(선택적으로, 발색 용액 A의 조성: 13.6g 아세트산 나트륨, 1.6g 시트르산, 0.3ml의 30% 과산화수소, 증류수 500ml로 조성)이고, 발색 용액 B는 o-페닐렌다이아민(o-phenylenediamine) (선택적으로, 발색 용액 B의 조성: 0.2 g 에틸렌디아민사아세트산이나트륨(disodium ethylenediaminetetraacetate), 0.95g 시트르산, 50ml 글리세롤, 9.15g 테트라메틸벤지딘(tetramethylbenzidine), 증류수 500ml로 조성)이다; 표지 효소가 알칼리성 포스파타제인 경우, 발색 용액은 시판되는 시약이다;
상기 제 1 항체 및 제 2 항체는 모두 C-반응성 단백질과 특이적으로 반응할 수 있는 단일 클론 항체이고, 상기 제 1 항체 및 제 2 항체는 상이한 에피토프에 대한 항체이다.
일부 구체예에서, 상기 시트르산 용액의 pH는 인산수소이나트륨 12수화물(disodium hydrogen phosphate dodecahydrate)에 의해 조절되고; 바람직하게는, 시트르산 용액의 pH는 3.0-3.5이고; 및 보다 바람직하게는, 시트르산 용액의 pH는 3.2, 3.3, 3.4 또는 3.5인 것이다.
다른 구체예에서, 상기 시트르산의 농도는 0.5 mol/L이다.
일부 구체예에서, 상기 예비-여기 용액은 1% (w/v) 과산화수소 용액이고, 상기 여기 용액은 1 mol/L 수산화 나트륨 용액이고, 상기 제 1 항체가 10C11이고, 상기 제 2 항체는 14D9-2인 것이다.
또 다른 구체예에서, 상기 M 시약을 제조하는 방법은 다음을 포함하는 것이다: 제 1 항체 및 자성 입자를 pH = 5.0 ~ 6.0의 2-모르폴린에탄술폰산 버퍼(2-morpholineethanesulfonic acid buffer)에 혼합하고, 25-37 ℃에서 1-3 시간 동안 코팅하고, 1~3 시간동안 반응을 중단하기 위해 pH = 8.0 ~ 9.0인 0.1% ~ 0.5% (w/v)의 소 혈청 알부민 인산염 버퍼를 첨가하고, 상기 코팅된 자성 입자를 분리하여 pH = 7.0 ~ 8.0인 인산염 버퍼에 분산시킨 후, 0.04~0.06% (w/v) 계면활성제(계면 활성제는 선택적으로 Tween-20 임; 일 구체예에서 계면 활성제는 0.05% (w/v) Tween-20 임) 및 8~12% (w/v) 수크로스(선택적으로, 10% (w/v) 수크로스)를 첨가하여 M 시약을 얻는 방법;
상기 R2 시약을 제조하는 방법은 다음을 포함하는 것이다: 제 2 항체 및 아크리디늄 에스테르를 pH=8.0~9.0의 인산염 버퍼에서 혼합하고, 25-37 ℃에서 1-3 시간 동안 코팅한 후, 1~3 시간 동안 반응을 중단하기 위해 0.1%~0.5% (w/v) 소혈청 알부민을 포함하고 pH=8.0~9.0을 가지는 트리스 버퍼를 첨가하여 스톡 용액을 얻고, 상기 스톡 용액은 pH=7.0~8.0인 인산염 버퍼로 1:100~500로 희석하여 R2 시약을 얻는 방법.
다른 구체예에서, 상기 발광 플레이트 코팅 소스를 제조하는 방법은 다음을 포함하는 것이다: 코팅된 제 1 항체는 코팅 버퍼로서 pH = 7.0-8.0을 갖는 인산염 버퍼로 100-500 ng/웰 (선택적으로, 500 ng/웰)로 희석하고, 웰당 100 μL로 발광 플레이트에 첨가하고, 37 ℃에서 2 시간 또는 4 ℃에서 밤새 배양하고, 코팅 버퍼를 쏟아 내고, 5-8% (w/v) 송아지 혈청과 0.02% (w/v) 아지드화 나트륨을 포함하는 블로킹 용액 200μL를 사용하여 37 ℃에서 2 시간 동안 배양하고, 웰에 있는 액체를 붓고, 플레이트를 건조하고 알루미늄 필름으로 진공 상태에서 밀봉한 다음 4 ℃의 건조한 장소에 보관하는 방법;
표지 효소 용액의 제조 방법은 다음을 포함하는 것이다: 1:1 비율의 제 2 항체 및 호스래디시 퍼옥시다제 또는 알칼리성 포스파타제를 pH = 9.6의 탄산염 완충액에서 혼합하고 표지하고 투석하고, 투석 버퍼를 4 시간 마다 3회 교체하고, 효소로 표지된 제 2 항체를 수집하여 스톡 용액으로 한 후, 스톡 용액을 시판되는 효소 희석제로 1:500으로 희석하여 표지 효소 용액을 얻는 방법.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 키트를 사용하여 수행되는 다음을 포함하는 C-반응성 단백질의 전 범위 검출 방법을 제공한다:
(1) 시료 20 μL를 채취하고, 시료를 처리하기 위해 R1 시약 100 μL을 첨가하는 단계;
(2) M 시약 50 μL를 첨가한 후 15분 동안 배양하는 단계;
(3) 단계 (2) 이후, 0.05 ~ 0.08% (w/v) Tween-20을 포함하는 인산염 버퍼로 세척한 후, R2 시약 50 μL을 첨가하고 10 분 동안 배양하는 단계;
(4) 단계 (3) 이후, 0.05 ~ 0.08% (w/v) Tween-20을 포함하는 인산 버퍼로 세척하고, 예비 여기를 수행하기 위해 예비 여기 용액 100 μL를 첨가하는 단계;
(5) 예비 여기 용액을 제거하고, 여기 용액 100 μL을 추가하여 여기 및 검출하는 단계.
다른 양태에서, 본 발명은 C-반응성 단백질의 전 범위 검출을 위한 키트 제조 시 시료 처리 용액으로써 시트르산 용액의 용도를 제공한다.
일부 구체예에서, 상기 시트르산 용액은 pH = 3 ~ 4이고, 0.1 ~ 1M의 농도를 갖는 시트르산 용액이고; 바람직하게는 시트르산 용액의 pH는 인산수소이나트륨 12수화물에 의해 조절되고, 보다 바람직하게는 시트르산 용액의 pH는 3.0-3.5이고, 보다 바람직하게는 시트르산 용액의 pH는 3.2, 3.3, 3.4 또는 3.5인 것이다.
일 양태에서, 본 발명은 하기 성분을 포함하는 C-반응성 단백질의 전 범위 검출용 키트(직접 화학 발광, 즉 자기 입자-화학 발광법)를 제공한다.
제 1 항체가 코팅된 자성 입자 0.5~1 mg/mL, 0.04~0.06% (w/v) 계면활성제(상기 계면활성제는 선택적으로 Tween-20 임), 및 8~12% (w/v) 수크로스(sucrose)를 포함하는 M 시약(M reagent), 용매는 pH가 7.0 ~ 8.0 인 인산염 버퍼이다; 상기 제 1 항체의 코팅 양은 5~20 μg/mg 자성입자이다;
pH=3.0~4.0이고, 0.1 ~ 1M 농도의 시트르산 용액인 시료 처리 용액인 R1 시약;
제 2 항체가 코팅된 아크리디늄 에스테르, 0.5-1% 카제인 및 0.5-1% 소 혈청 알부민을 포함하는 R2 시약, 용매는 pH가 7.0-8.0인 인산염 버퍼고, 상기 제 2 항체의 코팅 양은 0.3-0.9 μg/μg 아크리디늄 에스테르이다;
예비-여기 용액 및 여기 용액;
상기 제 1 항체 및 제 2 항체는 모두 C-반응성 단백질과 특이적으로 반응할 수 있는 단일 클론 항체이고, 상기 제 1 항체 및 제 2 항체는 상이한 에피토프에 대한 항체이다.
아크리딘 화합물의 발광 메커니즘은 다음과 같다: 알칼리 과산화수소 용액에서, 아크리딘 화합물의 분자는 과산화수소 이온에 의해 불안정한 퍼옥시 화합물을 형성하며, 이는 CO2로 분해되고 전기적으로 여기된 N-메틸-아크리돈이 바닥 상태로 돌아오면 최대 방출 파장이 430 nm인 광자를 방출한다. Triton X-100, Tween-20, CTAC(헥사데실트리메틸암모늄 클로라이드, hexadecyltrimethylammonium chloride, 양이온성 계면 활성제)와 같은 계면 활성제는 발광을 향상시킬 수 있다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 상기 R1 시약은 0.5M 시트르산 용액, pH = 3 ~ 3.5이다.
더 바람직하게는, 상기 R1 시약은 인산수소이나트륨 12수화물로 조절된다.
일 구체예에서, 상기 시트르산 용액의 pH는 인산수소이나트륨 12수화물로 조절된다. 바람직하게는, 시트르산 용액의 pH는 3.0-3.5 이고, 보다 바람직하게는, 시트르산 용액의 pH는 3.2, 3.3, 3.4 또는 3.5이다.
또 다른 구체예에서, 상기 시트르산의 농도는 0.5 mol/L이다.
더 바람직하게는, 상기 M 시약은 0.05% Tween-20 및 10% 수크로스를 포함한다.
더 바람직하게는, 상기 M 시약을 제조하는 방법은 다음을 포함하는 것이다: 제 1 항체 및 자성 입자를 pH = 5.0 ~ 6.0의 2-모르폴린에탄술폰산 버퍼에 혼합하고, 25-37 ℃에서 1-3 시간 동안 코팅하고, 1~3 시간동안 코팅을 중단하기 위해 pH = 8.0 ~ 9.0인 0.1% ~ 0.5% (w/v)의 소 혈청 알부민 인산염 버퍼를 첨가하고, 상기 코팅된 자성 입자를 분리하여 pH = 7.0 ~ 8.0인 인산염 버퍼에 분산시킨 후, 계면활성제 및 수크로스를 첨가하여 M 시약을 얻는 방법.
더 바람직하게는, 상기 R2 시약을 제조하는 방법은 다음을 포함하는 것이다: 제 2 항체 및 아크리디늄 에스테르를 pH=8.0~9.0의 인산염 버퍼에서 혼합하고, 25-37 ℃에서 1-3 시간 동안 코팅한 후, 1~3 시간동안 코팅을 중단하기 위해 0.1%~0.5% (w/v) 소혈청 알부민을 포함하고 pH=8.0~9.0을 가지는 트리스 버퍼를 첨가하여 스톡 용액을 얻고, 상기 스톡 용액은 pH=7.0~8.0인 인산염 버퍼로 1:100~500로 희석하여 R2 시약을 얻는 방법.
더 바람직하게는, 상기 예비-여기 용액은 1% (w/v) 과산화수소 용액인 것이다.
또한, 여기 용액은 1 mol/L 수산화 나트륨 용액이다.
다른 양태에서, 본 발명은 하기 성분을 포함하는 C-반응성 단백질의 전 범위 검출용 키트(효소 화학 발광, 즉 호스래디시 퍼옥시다제 또는 알칼리성 포스파타제 플레이트형 화학 발광)를 제공한다:
플레이트형 발광 플레이트(선택적으로 96 웰, 384 웰 또는 다른 플레이트형 발광 플레이트)를 포함하는 제 1 항체로 코팅된 평평한-바닥 화학 발광 플레이트, 상기 제 1 항체의 코팅 양은 100~500 ng/웰이고(선택적으로 500 ng/웰), 코팅 버퍼는 pH = 7.0 ~ 8.0의 인산염 버퍼이고, 블로킹 용액은 5-8% (w/v) 블로킹 혈청 또는 블로킹 단백질(블로킹 혈청은 선택적으로 송아지 혈청임) 및 0.02% (w/v) 아지드화 나트륨을 포함하는 pH 7.2-7.4인 50mM 인산염 버퍼이다;
pH=3~4이고, 0.1 ~ 1M 농도의 시트르산 용액인 시료 처리 용액;
호스래디시 퍼옥시다제(horseradish peroxidase) 또는 알칼리성 포스파타제(alkaline phosphatase)로 표지된 제 2 항체를 포함하고, 호스래디시 퍼옥시다제 또는 알칼리성 포스파타제가 동일한 비율로 표지된 제 2 항체가 1 mg/mL의 표지 양을 갖는 표지 효소 용액;
발색 용액: 표지 효소가 호스래디시 퍼옥시다제인 경우, 발색 용액은 발색 용액 A 및 발색 용액 B를 포함하고, 발색 용액 A는 과산화수소(선택적으로, 발색 용액 A의 조성: 13.6g 아세트산 나트륨, 1.6g 시트르산, 0.3ml의 30% 과산화수소, 증류수 500ml로 조성)이고, 발색 용액 B는 o-페닐렌다이아민 (발색 용액 B의 조성: 0.2 g 에틸렌디아민사아세트산이나트륨, 0.95g 시트르산, 50ml 글리세롤, 9.15g 테트라메틸벤지딘, 증류수 500ml로 조성)이다; 표지 효소가 알칼리성 포스파타제인 경우, 발색 용액은 시판되는 시약(제품 번호: 180309-01, 구입처: Xiamen Boson Biotechnology Co., Ltd)이다.
검출: 자동 화학 발광 분석기(구입처: Yantai Addcare Biotechnology Co., Ltd.)는 발광 값을 읽는데 사용된다.
상기 언급된 제 1 항체 및 제 2 항체는 모두 C-반응성 단백질과 특이적으로 반응할 수 있는 단일 클론 항체이다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 상기 시료 처리 용액은 pH 3 내지 3.5의 0.5M 시트르산 용액이다.
더 바람직하게는, 상기 시료 처리 용액의 pH는 인산수소이나트륨 12수화물에 의해 조절되는 것이다.
일 구체예에서, 상기 시트르산 용액의 pH는 인산수소이나트륨 12수화물에 의해 조절되는 것이다. 바람직하게는, 시트르산 용액의 pH는 3.0-3.5이고, 보다 바람직하게는, 시트르산 용액의 pH는 3.2, 3.3, 3.4 또는 3.5이다.
또 다른 구체예에서, 상기 시트르산의 농도는 0.5 mol/L이다.
더 바람직하게는, 상기 제 1 항체로 코팅되어 있는 평평한-바닥 화학 발광 플레이트는 5-8% 송아지 혈청 및 0.02% 아지드화 나트륨을 포함한다.
더 바람직하게는, 상기 제 1 항체로 코팅된 평평한-바닥 화학 발광 플레이트를 제조하는 방법은 다음을 포함한다: 코팅된 제 1 항체는 코팅 버퍼로서 pH = 7.0-8.0을 갖는 인산염 버퍼 5 μg/mL, 즉, 500 ng/웰로 희석하고, 웰당 100 μL로 발광 플레이트에 첨가하고, 37 ℃에서 2 시간 또는 4 ℃에서 밤새 배양하고, 코팅 버퍼를 쏟아 내고, 블로킹 용액(5-8% (w/v) 송아지 혈청과 0.02% (w/v) 아지드화 나트륨) 200μL를 사용하여 37 ℃에서 2 시간 동안 배양하고, 웰에 있는 액체를 붓고, 플레이트를 건조하고 알루미늄 필름으로 진공 상태에서 밀봉한 다음 4 ℃의 건조한 장소에 보관.
더 바람직하게는, 상기 표지 효소 용액의 제조 방법은 다음을 포함한다: 1:1 비율의 제 2 항체 및 호스래디시 퍼옥시다제 또는 알칼리성 포스파타제를 pH = 9.6의 탄산염 완충액에서 혼합하고 표지하고 투석하고, 투석 버퍼를 4 시간 마다 3회 교체하고, 효소로 표지된 제 2 항체를 수집하여 스톡 용액으로 한 후, 표지 효소 용액을 얻기 위해 스톡 용액을 시판되는 효소 희석제로 1:500으로 희석.
더 바람직하게는, 상기 표지 효소가 호스래디시 퍼옥시다제인 경우, 발색 용액 A는 과산화수소이고, 발색 용액 B는 o-페닐렌다이아민이고; 표지 효소가 알칼리성 포스파타제인 경우 발색 용액은 시판되는 시약이다.
또한, 상기 내용은 자동 화학 발광 분석기에 의해 직접결정된다.
본 발명의 우수한 효과는 시료 처리 용액(pH=3~4이고, 0.1~1M시트르산 용액)을 본 발명의 키트의 반응 과정에서 한 단계로 첨가한 후에, 본 발명의 키트의 검출 범위가 0.02 mg/L 내지 100 mg/L인 것이며, 상기 키트는 C-반응성 단백질의 전 범위 검출의 요구를 충족시킬 수 있는 키트이다.
도 1은 페어링 검출(pairing detection)을 위한 교정기(calibrator)의 곡선인, 페어링된 용량-반응 곡선(paired dose-response curve)을 나타낸다. 왼쪽 이미지는 10C11-7D9에 대한 페어링된 용량-반응 곡선을 나타내고 오른쪽 이미지는 10C11-14D9-2에 대한 페어링된 용량-반응 곡선을 나타낸다.
도 2는 시료와 바탕값(background value) 간의 상관관계를 평가하는 페어링된 검출 결과의 상관관계 분석을 나타낸다. 왼쪽 이미지는 10C11-7D9에 대한 페어링된 검출 결과의 상관관계 분석을 나타내고, 오른쪽 이미지는 10C11-14D9-2에 대한 페어링된 검출 결과의 상관관계 분석을 나타낸다.
도 2는 시료와 바탕값(background value) 간의 상관관계를 평가하는 페어링된 검출 결과의 상관관계 분석을 나타낸다. 왼쪽 이미지는 10C11-7D9에 대한 페어링된 검출 결과의 상관관계 분석을 나타내고, 오른쪽 이미지는 10C11-14D9-2에 대한 페어링된 검출 결과의 상관관계 분석을 나타낸다.
본 발명의 과제의 해결수단은 특정 실시예를 통해 아래에서 예시되고 설명된다.
시약은 분석 등급 이였으며, 달리 명시되지 않는 한 Xiamen Xilong Chemical Co., Ltd에서 구입하였다.
일 구체예에서, 본 발명의 C-반응성 단백질의 전 범위 검출용 키트(직접 화학 발광, 즉, 자성 입자 화학 발광 방법)는 다음과 같은 성분을 포함한다:
제 1 항체가 코팅된 자성 입자 0.8mg/mL, 0.05% Tween-20 및 10% 수크로스를 포함하는 M 시약, 용매는 pH=7.5인 인산염 버퍼이며, 상기 제 1 항체의 코팅 양은 12 μg/μg 자성 입자 이고, 상기 자성 입자는 Thermo Fisher Scientific에서 구입하였으며, 자성입자는 Fe3O4 코어가 있는 나노 크기의 초상자성 입자(superparamagnetic particles)이다. 상기 M 시약을 제조하는 방법은 다음을 포함한다: 제 1 항체 및 자성 입자를 pH=5.5의 2-모르폴린에탄술폰산 버퍼에 혼합하고, 32 ℃에서 1~3 시간 동안 코팅하고, 2 시간동안 반응을 중단하기 위해 pH=8.5이고 0.3% 소 혈청 알부민을 포함하는 인산염 버퍼 용액을 첨가하고, 상기 코팅된 자성 입자를 분리하여 pH=7.5인 인산염 버퍼에 분산 시킨 후, Tween-20 및 수크로스를 첨가하여 M 시약을 얻는다;
R1 시약, 0.5M 농도의 pH=3.2인 시트르산 용액, 인산수소이나트륨 12수화물로 조절된다;
제 2 항체가 코팅된 아크리디늄 에스테르, 0.8% 카제인 및 0.8% 소 혈청 알부민을 포함하는 R2 시약, 용매는 pH=7.5인 인산염 버퍼이고, 상기 제 2 항체의 코팅 양은 12 μg/μg 아크리디늄 에스테르이다. 상기 R2 시약을 제조하는 방법은 다음을 포함한다: 제 2 항체 및 아크리디늄 에스테르를 pH=8.5인 인산염 버퍼에서 혼합하고, 32 ℃에서 1~3 시간 동안 코팅한 후, 2시간 동안 코팅을 중단하기 위해 0.3% 소 혈청 알부민을 포함하고 pH=8.5을 갖는 트리스 버퍼를 첨가하여 스톡 용액을 얻고; 상기 스톡 용액은 pH=7.5인 인산염 버퍼로 1:300으로 희석하여 R2 시약을 얻는다;
예비-여기 용액, 1% (w/v) 과산화수소 용액;
여기 용액, 1 mol/L 수산화 나트륨 용액;
상술한 제 1 항체 및 제 2 항체는 C-반응성 단백질과 특이적으로 반응할 수 있는 단일 클론 항체이다. 제 1 항체는 10C11이고 제 2 항체는 14D9-2이며, 양 항체 모두 Xiamen Innovax Biotech CO., Ltd.에서 구입하였다.
상술한 C-반응성 단백질의 전 범위 검출을 위한 키트를 사용한 검출 방법은 다음 단계를 포함한다:
(1) 시료 20 μL를 채취하고(시료는 항원 표준 곡선을 위한 혈청 또는 표준 C-반응성 단백질이다), 시료를 처리하기 위해 R1 시약 100 μL을 첨가하는 단계;
(2) M 시약 50 μL를 첨가한 후 15분 동안 배양하는 단계;
(3) 단계 (2) 이후, 0.05% Tween-20을 포함하는 인산염 버퍼로 세척한 후, R2 시약 50 μL을 첨가하고 10 분 동안 배양하는 단계;
(4) 단계 (3) 이후, 0.05 ~ 0.08% (w/v) Tween-20을 포함하는 인산 버퍼로 세척하고, 예비 여기를 수행하기 위해 예비 여기 용액 100 μL를 첨가하는 단계;
(5) 예비 여기 용액을 제거하고, 여기 용액 100 μL을 추가하여 여기 및 검출하는 단계.
다른 구체예에서, 본 발명의 C-반응성 단백질의 전 범위 검출용 키트(효소 화학 발광, 즉, 호스래디시 퍼옥시다제 플레이트형 화학 발광)는 다음 성분을 포함한다:
96-웰 발광 플레이트를 포함하는 발광 플레이트 코팅 소스, 제 1 항체의 코팅양은 500 ng/웰이고, 코팅 버퍼는 pH=7.5인 인산염 버퍼이고, 블로킹 용액은 6% 송아지 혈청 및 0.02% 아지드화 나트륨을 포함하는 pH 7.3인 50 mM 인산염 버퍼이다. 상기 발광 플레이트 코팅 소스의 제조 방법은 다음을 포함한다: 코팅된 제 1 항체는 코팅 버퍼로서 pH = 7.5를 갖는 인산염 버퍼로 5 μg/mL(즉, 500 ng/웰)로 희석하고, 웰당 100 μL로 발광 플레이트에 첨가하고, 37 ℃에서 2 시간 또는 4 ℃에서 밤새 배양하고, 코팅 버퍼를 쏟아 내고, 6% 송아지 혈청과 0.02% 아지드화 나트륨을 포함하는 블로킹 용액 200μL를 사용하여 37 ℃에서 2 시간 동안 배양하고, 웰에 있는 액체를 붓고, 플레이트를 건조하고 알루미늄 필름으로 진공 상태에서 밀봉한 다음 4 ℃의 건조한 장소에 보관하였다;
인산수소이나트륨 12수화물로 조절된 0.5M 농도, pH = 3.2의 시트르산 용액인, 시료 처리 용액;
호스래디시 퍼옥시다제 또는 알칼리성 포스파타제로 표지된 제 2 항체를 포함하고, 호스래디시 퍼옥시다제 또는 알칼리성 포스파타제가 동일한 비율로 표지된 제 2 항체가 1 mg/mL의 표지 양을 갖는 표지 효소 용액. 표지 효소 용액의 제조 방법은 다음을 포함한다: 1:1 비율의 제 2 항체 및 호스래디시 퍼옥시다제 또는 알칼리성 포스파타제를 pH = 9.6의 탄산염 완충액에서 혼합하고 표지하고 투석하고, 투석 버퍼를 4 시간 마다 3회 교체하고, 효소로 표지된 제 2 항체를 수집하여 스톡 용액을 획득한 후, 스톡 용액을 시판되는 효소 희석제(카탈로그 번호. ED-11, Beijing Wantai Biopharmaceutical Co., Ltd.에서 구입)로 1:500으로 희석하여 표지 효소 용액을 얻는다;
발색 용액: 표지 효소가 호스래디시 퍼옥시다제인 경우, 발색 용액 A는 과산화수소이고, 발색 용액 B는 o-페닐렌다이아민이고; 표지 효소가 알칼리성 포스파타제인 경우, 발색 용액은 구입한 시약(구입처: Xiamen Boson Biotechnology Co., Ltd.)이다.
검출: 발광 값을 판독하기 위한 자동 화학 분석기(구입처: Yantai Addcare Biotechnology Co., Ltd.)를 사용하였다.
상술한 제 1 항체 및 제 2 항체는 C-반응성 단백질과 특이적으로 반응할 수 있는 단일 클론 항체이다. 제 1 항체는 10C11이고, 제 2 항체는 14D9-2이며, 양 항체는 모두 Xiamen Innovax Biotech CO., Ltd.에서 구입하였다.
상술한 C-반응성 단백질의 전 범위 검출을 위한 키트를 사용한 검출 방법은 다음의 단계를 포함한다:
(1) 시료 20 μL를 채취하고, 시료를 처리하기 위해 시료 처리 용액 100 μL을 첨가하는 단계;
(2) 그 후 발광 플레이트 코팅 소스에 첨가하고 40 분 동안 37 ℃에서 함께 배양하는 단계;
(3) 단계 (2) 이후, 0.05% Tween-20을 포함하는 인산염 버퍼로 5 회 세척하고, 발광 플레이트를 건조될 때까지 뒤집은 후, 표지 효소 용액 100 μL를 첨가하여 37 ℃에서 40 분 동안 배양하는 단계;
(4) 단계 (3) 이후, 0.05% Tween-20을 포함하는 인산염 버퍼로 5 회 세척하고, 발광 플레이트를 건조 될 때까지 뒤집었다; 표지 효소가 호스래디시 퍼옥시다제인 경우, 50 μL의 발색 용액 A 와 50 μL의 발색 용액 B를 가하여 상온에서 5 분간 반응시켰다; 표지 효소가 알칼리성 포스파타제이면 100 μL의 발색 용액 (구입처: Xiamen Boson Biotechnology Co., Ltd.)을 첨가하고 실온에서 5 분 동안 반응시켰다; 마지막으로 자동 화학 발광 분석기를 사용하여 검출을 수행하고 발광 값을 읽었다.
실시예
실시예 1
pH 값이 상이한 0.1M 시트르산 및 0.1M 글리신을 각각 처리 용액으로 선택하고, 효소 면역 분석 시스템(pH 범위 2-6)에 첨가하여 점진적으로 희석된 C-반응성 단백질 항원을 평가하였다. 상대적인 OD 값은 하기 표 1 및 2에 나타내었다.
농도 (mg/L) | pH=2 | pH=3 | pH=4 | pH=5 | pH=6 |
100.00 | 0.4090 | 1.4410 | 3.7590 | 0.7350 | 1.0130 |
25.00 | 0.5760 | 1.3740 | 3.7620 | 1.0160 | 1.2900 |
6.25 | 0.1510 | 0.8930 | 3.7590 | 1.3460 | 1.5250 |
1.56 | 0.0430 | 0.3720 | 3.7760 | 2.4110 | 2.8010 |
0.39 | 0.0120 | 0.0960 | 3.0050 | 1.5960 | 3.2060 |
0.10 | 0.0060 | 0.0240 | 0.9480 | 0.8620 | 2.2130 |
0.02 | 0.0100 | 0.0110 | 0.2560 | 0.0640 | 0.2760 |
농도 (mg/L) | pH=2 | pH=3 | pH=4 | pH=5 | pH=6 |
100 | 3.7910 | 3.7500 | 2.6820 | 3.2820 | 1.7660 |
25 | 2.6980 | 3.5760 | 2.3680 | 2.9670 | 2.1690 |
6.25 | 0.5270 | 3.0060 | 2.5510 | 3.2550 | 2.3350 |
1.56 | 0.1100 | 0.6840 | 2.6910 | 3.3620 | 2.8260 |
0.39 | 0.0330 | 0.1780 | 1.1610 | 1.7100 | 1.8980 |
0.1 | 0.0190 | 0.0440 | 0.5440 | 0.7650 | 0.6870 |
0.02 | 0.0140 | 0.0150 | 0.1090 | 0.1850 | 0.0880 |
표 1 및 표 2는 처리 용액이 pH 값이 상이한 0.1M 시트르산 (인산수소이나트륨 12수화물로 pH가 조절 됨)인 경우 및 처리 용액이 pH 값이 상이한 0.1M 글리신인 경우 효소 면역 분석 시스템에서 C-반응성 단백질의 전 범위 검출에 대한 추적 항원의 검출 결과를 나타낸다. 상기 결과는 pH 3-4 사이의 검출에서는 명백한 경향성이 있지만, 다른 pH 범위는 이상적이지 않음을 나타내었다. 이는 처리 용액의 처리 pH로 pH 3 ~4 범위를 선택했을 때 시료 검출이 다른 pH 범위에 비해 높음에서 낮음으로의 경향을 보인 표 1 및 표 2의 결과로 나타났다. 그러나, 효소 면역 분석 시스템의 선폭은 전 범위 검출에 충분하지 않아, 화학 발광 플랫폼 검출을 위한 최적 pH 범위를 3~4인 것으로 판단하고 후속 실험에서 시트르산을 사용하였다.
실시예 2
실시예 1에 기초하여, 시트르산 농도(0.1M, 0.5M, 1M의 시트르산 농도) 및 pH 범위 (pH3 및 pH3.5, pH4)의 개선 및 조절을 수행하였으며, 효소 면역 분석 시스템의 선형 폭은 상대적으로 좁았으며, 선호되는 용액은 화학 발광 플랫폼에서 조절되었다. 상이한 몰 농도 및 pH 3-4인 시트르산 용액을 처리 용액으로 선택하여 화학 발광 검출 시스템 (즉.,자기 입자 화학 발광 플랫폼) 에 첨가하여 점진적으로 희석된 C-반응성 단백질 항원을 평가하였다. 상이한 pH 및 상이한 농도의 시트르산을 사용함으로써, 점진적으로 희석된 C-반응성 단백질 항원을 처리하고, 검출 결과를 얻기 위해 자성 입자 화학 발광 플랫폼 또는 효소적 호스래디시 퍼옥시다제 화학 발광 플랫폼을 사용하였으며, 얻은 결과를 표준 곡선으로 만들었다. 그 후, 수집된 18개의 임상적 시료 (Xiamen Zhongshan Affiliated Hospital 및 Xijing Hospital에서 수집) 의 상대적인 발광 강도를 아래 표 3과 표 4에 별도로 나타내었다.
시트르산 농도(mol/L) | 0.1 | 0.5 | 1 | |||||||
pH 값 | 3 | 3.5 | 4 | 3 | 3.5 | 4 | 3 | 3.5 | 4 | |
Zhongshan Hospital의 혈청 일련 번호 | 바탕값(mg/L) | 검출 값(mg/L) | ||||||||
1257 | 46.70 | 58.17 | 50.68 | 19.67 | 38.70 | 49.77 | 96.64 | 65.72 | 73.63 | 163.59 |
1203 | 54.30 | 67.65 | 62.15 | 25.76 | 37.36 | 57.59 | 98.96 | 95.94 | 44.42 | 319.43 |
1444 | 170.00 | 106.50 | 120.46 | 37.40 | 87.46 | 137.30 | 189.87 | 273.05 | 209.85 | 79.81 |
1315 | 183.00 | 144.27 | 146.56 | 44.94 | 140.15 | 181.43 | 257.77 | 373.53 | 470.72 | 342.03 |
1432 | 136.00 | 78.22 | 89.66 | 22.38 | 76.33 | 102.71 | 132.89 | 182.84 | 200.50 | 88.86 |
1333 | 110.00 | 99.11 | 100.68 | 45.29 | 62.90 | 109.99 | 186.08 | 165.51 | 65.75 | 186.25 |
1478 | 70.30 | 46.69 | 56.99 | 10.28 | 41.24 | 47.21 | 83.52 | 65.98 | 132.74 | 152.31 |
1233 | 62.30 | 53.84 | 60.32 | 16.85 | 44.19 | 54.97 | 102.16 | 88.10 | 104.26 | 154.66 |
1207 | 84.80 | 97.89 | 75.66 | 17.15 | 79.43 | 69.73 | 113.89 | 107.25 | 120.61 | 91.72 |
1210 | 40.10 | 43.45 | 43.21 | 10.23 | 29.06 | 36.09 | 71.60 | 46.09 | 63.54 | 67.85 |
1231 | 36.90 | 60.52 | 59.45 | 45.53 | 37.01 | 49.67 | 99.61 | 77.69 | 17.84 | 193.95 |
1338 | 33.70 | 39.83 | 39.97 | 6.90 | 30.62 | 35.97 | 69.69 | 47.56 | 5.99 | 124.40 |
1223 | 24.20 | 30.60 | 32.36 | 3.34 | 23.25 | 31.46 | 82.90 | 40.27 | 6.61 | 72.51 |
1230 | 29.00 | 28.35 | 32.70 | 12.25 | 22.82 | 26.86 | 60.01 | 38.28 | 27.95 | 106.24 |
1349 | 16.80 | 19.46 | 24.65 | 8.17 | 15.58 | 19.75 | 56.57 | 29.44 | 12.92 | 88.97 |
1317 | 12.10 | 16.12 | 20.92 | 12.24 | 12.03 | 16.52 | 37.35 | 20.29 | 16.66 | 40.57 |
1316 | 5.40 | 9.94 | 6.74 | 12.49 | 6.26 | 7.82 | 19.74 | 18.29 | 23.27 | 2.77 |
1324 | 9.10 | 10.52 | 11.43 | 17.12 | 8.79 | 7.84 | 24.26 | 13.17 | 19.98 | 39.97 |
Zhongshan Hospital의 혈청 일련 번호 | 바탕값 (Log10) | 검출 값(Log10) | ||||||||
1257 | 1.67 | 1.76 | 1.70 | 1.29 | 1.59 | 1.70 | 1.99 | 1.82 | 1.87 | 2.21 |
1203 | 1.73 | 1.83 | 1.79 | 1.41 | 1.57 | 1.76 | 2.00 | 1.98 | 1.65 | 2.50 |
1444 | 2.23 | 2.03 | 2.08 | 1.57 | 1.94 | 2.14 | 2.28 | 2.44 | 2.32 | 1.90 |
1315 | 2.26 | 2.16 | 2.17 | 1.65 | 2.15 | 2.26 | 2.41 | 2.57 | 2.67 | 2.53 |
1432 | 2.13 | 1.89 | 1.95 | 1.35 | 1.88 | 2.01 | 2.12 | 2.26 | 2.30 | 1.95 |
1333 | 2.04 | 2.00 | 2.00 | 1.66 | 1.80 | 2.04 | 2.27 | 2.22 | 1.82 | 2.27 |
1478 | 1.85 | 1.67 | 1.76 | 1.01 | 1.62 | 1.67 | 1.92 | 1.82 | 2.12 | 2.18 |
1233 | 1.79 | 1.73 | 1.78 | 1.23 | 1.65 | 1.74 | 2.01 | 1.94 | 2.02 | 2.19 |
1207 | 1.93 | 1.99 | 1.88 | 1.23 | 1.90 | 1.84 | 2.06 | 2.03 | 2.08 | 1.96 |
1210 | 1.60 | 1.64 | 1.64 | 1.01 | 1.46 | 1.56 | 1.85 | 1.66 | 1.80 | 1.83 |
1231 | 1.57 | 1.78 | 1.77 | 1.66 | 1.57 | 1.70 | 2.00 | 1.89 | 1.25 | 2.29 |
1338 | 1.53 | 1.60 | 1.60 | 0.84 | 1.49 | 1.56 | 1.84 | 1.68 | 0.78 | 2.09 |
1223 | 1.38 | 1.49 | 1.51 | 0.52 | 1.37 | 1.50 | 1.92 | 1.61 | 0.82 | 1.86 |
1230 | 1.46 | 1.45 | 1.51 | 1.09 | 1.36 | 1.43 | 1.78 | 1.58 | 1.45 | 2.03 |
1349 | 1.23 | 1.29 | 1.39 | 0.91 | 1.19 | 1.30 | 1.75 | 1.47 | 1.11 | 1.95 |
1317 | 1.08 | 1.21 | 1.32 | 1.09 | 1.08 | 1.22 | 1.57 | 1.31 | 1.22 | 1.61 |
1316 | 0.73 | 1.00 | 0.83 | 1.10 | 0.80 | 0.89 | 1.30 | 1.26 | 1.37 | 0.44 |
1324 | 0.96 | 1.02 | 1.06 | 1.23 | 0.94 | 0.89 | 1.38 | 1.12 | 1.30 | 1.60 |
r 2 | 0.9304 | 0.9586 | 0.2907 | 0.9692 | 0.9615 | 0.9179 | 0.9251 | 0.5942 | 0.4972 |
시트르산 농도(mol/L) | 0.1 | 0.5 | 1 | |||||||
pH 값 | 3 | 3.5 | 4 | 3 | 3.5 | 4 | 3 | 3.5 | 4 | |
Zhongshan Hospital의 혈청 일련 번호 | 바탕값(mg/L) | 검출 값(mg/L) | ||||||||
1242 | 20 | 27.77 | 139.53 | 37.45 | 37.13 | 17.22 | 140.83 | 82.22 | 92.16 | 9.14 |
1351 | 5 | 34.19 | 163.47 | 20.06 | 13.03 | 3.15 | 53.52 | 25.86 | 34.85 | 5.10 |
1402 | 3.8 | 15.56 | 89.20 | 21.63 | 9.55 | 3.51 | 37.49 | 24.61 | 31.38 | 1.56 |
1417 | 25.8 | 59.31 | 289.25 | 30.77 | 54.35 | 15.76 | 221.95 | 73.38 | 110.76 | 7.75 |
1408 | 33.2 | 59.31 | 348.65 | 43.69 | 66.34 | 24.84 | 136.92 | 133.23 | 151.15 | 10.03 |
1341 | 38.1 | 76.55 | 501.37 | 37.72 | 71.94 | 34.57 | 68.66 | 159.38 | 352.94 | 10.32 |
1255 | 45.7 | 64.17 | 234.53 | 42.15 | 83.93 | 39.37 | 137.79 | 195.34 | 231.96 | 11.19 |
1247 | 55.6 | 51.16 | 142.44 | 23.93 | 91.89 | 27.36 | 121.47 | 97.02 | 82.81 | 11.30 |
1276 | 62.3 | 82.81 | 302.86 | 22.94 | 94.97 | 55.71 | 92.95 | 206.66 | 386.77 | 12.87 |
1365 | 65.4 | 64.67 | 406.95 | 34.06 | 113.07 | 47.36 | 129.91 | 303.71 | 240.53 | 12.23 |
1404 | 140 | 104.87 | 405.49 | 87.16 | 209.22 | 73.61 | 132.60 | 239.11 | 264.62 | 15.46 |
1246 | 13.2 | 27.49 | 125.45 | 27.00 | 19.99 | 5.67 | 125.97 | 54.08 | 60.48 | 9.04 |
1239 | 14.6 | 42.23 | 125.20 | 21.44 | 20.84 | 8.52 | 130.21 | 52.57 | 123.92 | 6.15 |
1382 | 133 | 85.53 | 592.49 | 70.10 | 155.30 | 90.13 | 100.33 | 424.02 | 506.85 | 19.91 |
1393 | 136 | 83.84 | 444.01 | 32.82 | 211.47 | 69.50 | 92.66 | 163.08 | 187.86 | 18.68 |
1484 | 70.3 | 59.54 | 970.42 | 102.66 | 105.58 | 43.79 | 85.37 | 421.22 | 383.87 | 21.00 |
1277 | 18.4 | 32.57 | 91.97 | 56.87 | 29.44 | 12.78 | 168.98 | 110.16 | 115.56 | 8.94 |
1493 | 67.7 | 72.98 | 336.93 | 307.01 | 104.80 | 59.61 | 74.96 | 393.77 | 340.69 | 17.50 |
Zhongshan Hospital의 혈청 일련 번호 | 바탕값(Log10) | 검출값(Log10) | ||||||||
1242 | 1.30 | 1.44 | 2.14 | 1.57 | 1.57 | 1.24 | 2.15 | 1.91 | 1.96 | 0.96 |
1351 | 0.70 | 1.53 | 2.21 | 1.30 | 1.11 | 0.50 | 1.73 | 1.41 | 1.54 | 0.71 |
1402 | 0.58 | 1.19 | 1.95 | 1.34 | 0.98 | 0.54 | 1.57 | 1.39 | 1.50 | 0.19 |
1417 | 1.41 | 1.77 | 2.46 | 1.49 | 1.74 | 1.20 | 2.35 | 1.87 | 2.04 | 0.89 |
1408 | 1.52 | 1.77 | 2.54 | 1.64 | 1.82 | 1.40 | 2.14 | 2.12 | 2.18 | 1.00 |
1341 | 1.58 | 1.88 | 2.70 | 1.58 | 1.86 | 1.54 | 1.84 | 2.20 | 2.55 | 1.01 |
1255 | 1.66 | 1.81 | 2.37 | 1.62 | 1.92 | 1.60 | 2.14 | 2.29 | 2.37 | 1.05 |
1247 | 1.75 | 1.71 | 2.15 | 1.38 | 1.96 | 1.44 | 2.08 | 1.99 | 1.92 | 1.05 |
1276 | 1.79 | 1.92 | 2.48 | 1.36 | 1.98 | 1.75 | 1.97 | 2.32 | 2.59 | 1.11 |
1365 | 1.82 | 1.81 | 2.61 | 1.53 | 2.05 | 1.68 | 2.11 | 2.48 | 2.38 | 1.09 |
1404 | 2.15 | 2.02 | 2.61 | 1.94 | 2.32 | 1.87 | 2.12 | 2.38 | 2.42 | 1.19 |
1246 | 1.12 | 1.44 | 2.10 | 1.43 | 1.30 | 0.75 | 2.10 | 1.73 | 1.78 | 0.96 |
1239 | 1.16 | 1.63 | 2.10 | 1.33 | 1.32 | 0.93 | 2.11 | 1.72 | 2.09 | 0.79 |
1382 | 2.12 | 1.93 | 2.77 | 1.85 | 2.19 | 1.95 | 2.00 | 2.63 | 2.70 | 1.30 |
1393 | 2.13 | 1.92 | 2.65 | 1.52 | 2.33 | 1.84 | 1.97 | 2.21 | 2.27 | 1.27 |
1484 | 1.85 | 1.77 | 2.99 | 2.01 | 2.02 | 1.64 | 1.93 | 2.62 | 2.58 | 1.32 |
1277 | 1.26 | 1.51 | 1.96 | 1.75 | 1.47 | 1.11 | 2.23 | 2.04 | 2.06 | 0.95 |
1493 | 1.83 | 1.86 | 2.53 | 2.49 | 2.02 | 1.78 | 1.87 | 2.60 | 2.53 | 1.24 |
r 2 | 0.7954 | 0.4898 | 0.2703 | 0.9759 | 0.9495 | 0.1002 | 0.8034 | 0.7264 | 0.8121 |
표 3 및 4는 3, 3.5, 4의 세 가지 pH 범위를 고정하고 상이한 시트르산 농도 (0.1M, 0.5M 및 1M)를 사용하는 경우 전 범위 C-반응성 단백질의 추적 항원을 검출하고 18개의 시료를 평가하기 위해 발광 플랫폼을 사용하는 것을 나타낸다. 상기 결과는 농도가 0.5M이고 pH가 3-3.5인 시트르산이 더 나은 결과를 나타냄을 보여준다. 상기 농도 및 pH 하에서 혈청 사이의 상관관계는 pH 3 내지 3.5 사이에서 더 좋았으며; 0.5M 시트르산이 선호되고, 0.5M 시트르산의 경우 pH 3 내지 3.5 사이에서 상대적으로 변동이 작으므로, 상대적으로 안정되는 것으로 간주됨을 표 3에서 볼 수 있었다.
실시예 3
pH 농도 (pH 2.8-4)를 더욱 최적화하고 정제하기 위해 0.5M 시트르산을 선택하였다. pH가 상이한 0.5M 시트르산을 처리 용액으로 사용하여 점진적으로 희석된 C-반응성 단백질 항원을 처리하고, 검출 결과를 얻기 위해 자성 입자 화학 발광 플랫폼 또는 효소적 호스래디시 퍼옥시다제 화학 발광 플랫폼을 사용하였으며; 그 후 상기 결과를 표준 곡선으로 만들었다. 수집된 18 개의 임상 시료를 검출하고 검출 결과를 표 5 및 표 6에 나타냈다.
시트르산 농도(mol/L) | 0.5 | ||||||||
pH 값 | 2.8 | 3.0 | 3.2 | 3.4 | 3.5 | 3.6 | 3.8 | 4 | |
Zhongshan Hospital의 혈청 일련 번호 | 바탕값(mg/L) | 검출값(mg/L) | |||||||
1257 | 46.70 | 41.51 | 38.70 | 34.66 | 34.23 | 49.77 | 39.04 | 39.02 | 96.64 |
1203 | 54.30 | 52.57 | 37.36 | 42.20 | 37.53 | 57.59 | 51.86 | 47.60 | 98.96 |
1444 | 170.00 | 98.97 | 87.46 | 86.84 | 72.81 | 137.30 | 78.51 | 64.71 | 189.87 |
1315 | 183.00 | 180.00 | 140.15 | 136.04 | 110.94 | 181.43 | 113.01 | 81.42 | 257.77 |
1432 | 136.00 | 75.33 | 76.33 | 72.26 | 66.97 | 102.71 | 74.05 | 58.84 | 132.89 |
1333 | 110.00 | 78.86 | 62.90 | 63.58 | 58.17 | 109.99 | 69.18 | 62.38 | 186.08 |
1478 | 70.30 | 51.60 | 41.24 | 39.64 | 39.12 | 47.21 | 40.94 | 44.16 | 83.52 |
1233 | 62.30 | 44.84 | 44.19 | 41.87 | 43.44 | 54.97 | 45.01 | 39.10 | 102.16 |
1207 | 84.80 | 101.81 | 79.43 | 71.45 | 55.36 | 69.73 | 54.71 | 46.83 | 113.89 |
1210 | 40.10 | 29.66 | 29.06 | 27.17 | 26.77 | 36.09 | 37.45 | 36.37 | 71.60 |
1231 | 36.90 | 45.18 | 37.01 | 38.04 | 33.17 | 49.67 | 39.54 | 42.19 | 99.61 |
1338 | 33.70 | 32.44 | 30.62 | 27.45 | 26.63 | 35.97 | 38.25 | 34.35 | 69.69 |
1223 | 24.20 | 23.28 | 23.25 | 21.48 | 22.13 | 31.46 | 20.15 | 37.00 | 82.90 |
1230 | 29.00 | 25.81 | 22.82 | 20.91 | 26.46 | 26.86 | 29.64 | 34.47 | 60.01 |
1349 | 16.80 | 15.64 | 15.58 | 16.75 | 17.43 | 19.75 | 23.79 | 30.96 | 56.57 |
1317 | 12.10 | 10.63 | 12.03 | 13.21 | 15.00 | 16.52 | 21.95 | 23.37 | 37.35 |
1316 | 5.40 | 5.91 | 6.26 | 7.11 | 8.13 | 7.82 | 11.94 | 13.43 | 19.74 |
1324 | 9.10 | 8.11 | 8.79 | 9.96 | 10.39 | 7.84 | 14.53 | 17.05 | 24.26 |
Zhongshan Hospital의 혈청 일련 번호 | 바탕값 (Log10) | 검출값(Log10) | |||||||
1257 | 1.67 | 1.62 | 1.59 | 1.54 | 1.53 | 1.70 | 1.59 | 1.59 | 1.99 |
1203 | 1.73 | 1.72 | 1.57 | 1.63 | 1.57 | 1.76 | 1.71 | 1.68 | 2.00 |
1444 | 2.23 | 2.00 | 1.94 | 1.94 | 1.86 | 2.14 | 1.89 | 1.81 | 2.28 |
1315 | 2.26 | 2.26 | 2.15 | 2.13 | 2.05 | 2.26 | 2.05 | 1.91 | 2.41 |
1432 | 2.13 | 1.88 | 1.88 | 1.86 | 1.83 | 2.01 | 1.87 | 1.77 | 2.12 |
1333 | 2.04 | 1.90 | 1.80 | 1.80 | 1.76 | 2.04 | 1.84 | 1.80 | 2.27 |
1478 | 1.85 | 1.71 | 1.62 | 1.60 | 1.59 | 1.67 | 1.61 | 1.65 | 1.92 |
1233 | 1.79 | 1.65 | 1.65 | 1.62 | 1.64 | 1.74 | 1.65 | 1.59 | 2.01 |
1207 | 1.93 | 2.01 | 1.90 | 1.85 | 1.74 | 1.84 | 1.74 | 1.67 | 2.06 |
1210 | 1.60 | 1.47 | 1.46 | 1.43 | 1.43 | 1.56 | 1.57 | 1.56 | 1.85 |
1231 | 1.57 | 1.65 | 1.57 | 1.58 | 1.52 | 1.70 | 1.60 | 1.63 | 2.00 |
1338 | 1.53 | 1.51 | 1.49 | 1.44 | 1.43 | 1.56 | 1.58 | 1.54 | 1.84 |
1223 | 1.38 | 1.37 | 1.37 | 1.33 | 1.35 | 1.50 | 1.30 | 1.57 | 1.92 |
1230 | 1.46 | 1.41 | 1.36 | 1.32 | 1.42 | 1.43 | 1.47 | 1.54 | 1.78 |
1349 | 1.23 | 1.19 | 1.19 | 1.22 | 1.24 | 1.30 | 1.38 | 1.49 | 1.75 |
1317 | 1.08 | 1.03 | 1.08 | 1.12 | 1.18 | 1.22 | 1.34 | 1.37 | 1.57 |
1316 | 0.73 | 0.77 | 0.80 | 0.85 | 0.91 | 0.89 | 1.08 | 1.13 | 1.30 |
1324 | 0.96 | 0.91 | 0.94 | 1.00 | 1.02 | 0.89 | 1.16 | 1.23 | 1.38 |
r 2 | 0.9547 | 0.9692 | 0.9672 | 0.9786 | 0.9615 | 0.9471 | 0.9319 | 0.9179 |
시트르산 농도(mol/L) | 0.5 | ||||||||
pH 값 | 2.8 | 3.0 | 3.2 | 3.4 | 3.5 | 3.6 | 3.8 | 4 | |
Zhongshan Hospital의 혈청 일련 번호 | 바탕값(mg/L) | 검출값 (mg/L) | |||||||
1445 | 170 | 17.65 | 65.14 | 122.17 | 118.01 | 101.83 | 133.13 | 87.17 | 28.26 |
1449 | 140 | 18.45 | 58.83 | 120.32 | 138.13 | 139.69 | 137.80 | 113.82 | 22.61 |
1283 | 114 | 13.50 | 33.13 | 74.65 | 125.50 | 87.12 | 111.72 | 150.29 | 29.15 |
1238 | 114 | 18.20 | 53.46 | 94.57 | 157.07 | 130.74 | 136.98 | 174.20 | 28.40 |
1465 | 73.1 | 15.85 | 31.78 | 59.66 | 115.18 | 104.39 | 119.16 | 136.63 | 23.71 |
1366 | 65.4 | 8.13 | 23.87 | 45.86 | 83.41 | 54.86 | 58.97 | 86.38 | 22.05 |
1303 | 58.8 | 9.23 | 24.63 | 55.07 | 88.79 | 57.88 | 79.32 | 52.87 | 12.73 |
1487 | 52.2 | 5.90 | 15.02 | 33.21 | 73.56 | 58.32 | 83.29 | 105.08 | 30.43 |
1345 | 42.3 | 3.41 | 10.48 | 18.21 | 33.29 | 38.14 | 37.83 | 65.16 | 28.49 |
1454 | 33.2 | 3.67 | 13.92 | 25.27 | 54.27 | 38.88 | 43.03 | 57.80 | 36.47 |
1461 | 25.8 | 2.74 | 9.24 | 20.37 | 37.56 | 28.74 | 50.86 | 69.94 | 32.99 |
1394 | 18.8 | 3.07 | 11.64 | 20.62 | 42.19 | 26.63 | 33.52 | 82.36 | 33.42 |
1470 | 9.2 | 1.70 | 4.39 | 8.60 | 14.50 | 15.27 | 17.11 | 32.14 | 41.04 |
1407 | 8.1 | 0.39 | 1.94 | 7.01 | 8.82 | 6.54 | 7.64 | 10.36 | 37.76 |
1370 | 5.9 | 0.36 | 1.89 | 4.58 | 11.98 | 6.72 | 6.71 | 6.75 | 27.83 |
Zhongshan Hospital의 혈청 일련 번호 | 바탕값(Log10) | 검출값 (Log10) | |||||||
1445 | 2.23 | 1.25 | 1.81 | 2.09 | 2.07 | 2.01 | 2.12 | 1.94 | 1.45 |
1449 | 2.15 | 1.27 | 1.77 | 2.08 | 2.14 | 2.15 | 2.14 | 2.06 | 1.35 |
1283 | 2.06 | 1.13 | 1.52 | 1.87 | 2.10 | 1.94 | 2.05 | 2.18 | 1.46 |
1238 | 2.06 | 1.26 | 1.73 | 1.98 | 2.20 | 2.12 | 2.14 | 2.24 | 1.45 |
1465 | 1.86 | 1.20 | 1.50 | 1.78 | 2.06 | 2.02 | 2.08 | 2.14 | 1.37 |
1366 | 1.82 | 0.91 | 1.38 | 1.66 | 1.92 | 1.74 | 1.77 | 1.94 | 1.34 |
1303 | 1.77 | 0.97 | 1.39 | 1.74 | 1.95 | 1.76 | 1.90 | 1.72 | 1.10 |
1487 | 1.72 | 0.77 | 1.18 | 1.52 | 1.87 | 1.77 | 1.92 | 2.02 | 1.48 |
1345 | 1.63 | 0.53 | 1.02 | 1.26 | 1.52 | 1.58 | 1.58 | 1.81 | 1.45 |
1454 | 1.52 | 0.56 | 1.14 | 1.40 | 1.73 | 1.59 | 1.63 | 1.76 | 1.56 |
1461 | 1.41 | 0.44 | 0.97 | 1.31 | 1.57 | 1.46 | 1.71 | 1.84 | 1.52 |
1394 | 1.27 | 0.49 | 1.07 | 1.31 | 1.63 | 1.43 | 1.53 | 1.92 | 1.52 |
1470 | 0.96 | 0.23 | 0.64 | 0.93 | 1.16 | 1.18 | 1.23 | 1.51 | 1.61 |
1407 | 0.91 | -0.41 | 0.29 | 0.85 | 0.95 | 0.82 | 0.88 | 1.02 | 1.58 |
1370 | 0.77 | -0.44 | 0.28 | 0.66 | 1.08 | 0.83 | 0.83 | 0.83 | 1.44 |
r 2 | 0.9206 | 0.9468 | 0.9591 | 0.9154 | 0.9401 | 0.9204 | 0.7299 | 0.2197 |
표 5 및 표 6은 이전에 탐색된 최적화된 시트르산 농도를 보여준 후 pH 농도를 신중하게 탐색하고, 상이한 pH 값(pH 2.8 ~ 4 포함)을 조절하기 위해 인산수소이나트륨 12수화물을 선택했으며, 전 범위 C-반응성 단백질의 추적 항원을 검출하기 위해 발광 플랫폼을 사용하였다. 상기 결과는 pH(3.0-3.5) 테스트 샘플이 더 나은 상관 관계를 보여주는 것을 나타냈으며, 그중 자성 입자 화학 발광 플랫폼은 pH 3.4가 가장 좋고, pH(3.0-3.5) 테스트 샘플이 가장 좋은 선형 검출 결과를 보여주는 것으로 나타냈다.
상기 pH 범위 및 표5의 결과를 조합하여, 상기 pH는 3.0 내지 3.5 범위였고, C-반응성 단백질 단일 혈청은 0.96 이상의 선형 상관관계 r2를 보였으며, 최종 선호 조건은 pH 3.4의 0.5M 시트르산이였고, 18개의 혈청 시료 검출의 상관관계는 0.97 이상이였다. 표 6의 결과로부터, 효소적 호스래디시 퍼옥시다제 발광 플랫폼은 pH 3.2에서 최적의 선형 검출을 보여주었다. 15개의 혈청 시료의 상관관계는 0.959 이상이였다.
실시예 4
최적화된 검출 시스템은 표준 곡선을 만들기 위한 점진적으로 희석된 C-반응성 단백질 항원을 검출하기 위해 사용되었으며, 그 후 수집된 47개의 임상적 시료는 검출되었으며, 이들 농도값은 표준 곡선을 통해 계산하고 임상 바탕값과의 상관 관계 평가를 실시하였으며, 그 결과를 하기 표 7에 나타내었다(자성 입자 화학 발광 플랫폼):
Zhongshan Hospital 혈청 일련 번호 | 바탕값(mg/L) | Log10 | 검출값(mg/L) | Log10 |
1 | 10.59 | 1.02 | 10.99 | 1.04 |
2 | 16.95 | 1.23 | 14.88 | 1.17 |
3 | 107.75 | 2.03 | 112.29 | 2.05 |
4 | 23.77 | 1.38 | 16.99 | 1.23 |
5 | 11.88 | 1.07 | 12.97 | 1.11 |
6 | 37.34 | 1.57 | 27.23 | 1.44 |
7 | 14.8 | 1.17 | 15.41 | 1.19 |
8 | 65.23 | 1.81 | 71.81 | 1.86 |
9 | 64.93 | 1.81 | 49.28 | 1.69 |
10 | 135.45 | 2.13 | 225.39 | 2.35 |
11 | 38.85 | 1.59 | 25.73 | 1.41 |
12 | 81.04 | 1.91 | 102.13 | 2.01 |
13 | 37.34 | 1.57 | 21.58 | 1.33 |
14 | 15.4 | 1.19 | 11.87 | 1.07 |
15 | 10.88 | 1.04 | 12.81 | 1.11 |
16 | 15.09 | 1.18 | 16.10 | 1.21 |
17 | 6.65 | 0.82 | 6.85 | 0.84 |
18 | 9 | 0.95 | 8.20 | 0.91 |
19 | 69.29 | 1.84 | 40.24 | 1.60 |
20 | 85.55 | 1.93 | 90.29 | 1.96 |
21 | 9.42 | 0.97 | 10.08 | 1.00 |
22 | 14.11 | 1.15 | 15.54 | 1.19 |
23 | 33 | 1.52 | 23.67 | 1.37 |
24 | 50.97 | 1.71 | 35.66 | 1.55 |
25 | 28.42 | 1.45 | 28.40 | 1.45 |
Xijing Hospital의 혈청 일련 번호 | - | - | - | - |
1 | 1.5 | 0.18 | 2.11 | 0.32 |
2 | 1.32 | 0.12 | 2.29 | 0.36 |
3 | 4.24 | 0.63 | 5.57 | 0.75 |
4 | 0.285 | -0.55 | 0.66 | -0.18 |
5 | 0.737 | -0.13 | 1.18 | 0.07 |
6 | 5.62 | 0.75 | 6.60 | 0.82 |
7 | 3.63 | 0.56 | 4.65 | 0.67 |
8 | 1.37 | 0.14 | 2.44 | 0.39 |
9 | 1.39 | 0.14 | 2.03 | 0.31 |
10 | 37 | 1.57 | 21.02 | 1.32 |
11 | 1.4 | 0.15 | 2.49 | 0.40 |
12 | 0.159 | -0.80 | 0.34 | -0.46 |
13 | 2.87 | 0.46 | 3.94 | 0.60 |
14 | 44.3 | 1.65 | 31.67 | 1.50 |
15 | 45 | 1.65 | 26.10 | 1.42 |
16 | 17.4 | 1.24 | 16.19 | 1.21 |
17 | 60.1 | 1.78 | 30.51 | 1.48 |
18 | 3.02 | 0.48 | 5.27 | 0.72 |
19 | 0.665 | -0.18 | 1.33 | 0.12 |
20 | 15.4 | 1.19 | 12.34 | 1.09 |
21 | 0.381 | -0.42 | 0.93 | -0.03 |
22 | 1.81 | 0.26 | 2.87 | 0.46 |
상관 관계 평가를 통해, 상기 2개의 상관관계 식은 y = 0.8151x + 0.2179이고, 상관 계수 r2 = 0.9692로 우수한 상관관계를 나타내었다.
최적화된 검출 시스템은 표준 곡선을 만들기 위한 점진적으로 희석된 C-반응성 단백질 항원을 검출하기 위해 사용하였으며, 그 후 73 개의 임상 시료를 검출하였으며, 이들의 농도값은 표준 곡선을 통해 계산되었고 임상 바탕값과의 상관관계 평가를 실시하였으며, 상기 결과는 하기 표 8에 나타내었다(효소적 호스래디시 퍼옥시다제 화학발광 플랫폼):
Zhongshan Hospital의 혈청 일련 번호 | 바탕값(mg/L) | Log10 | 검출값(mg/L) | Log10 |
1 | 20 | 1.30 | 32.42 | 1.51 |
2 | 5 | 0.70 | 5.37 | 0.73 |
3 | 3.8 | 0.58 | 5.90 | 0.77 |
4 | 22.8 | 1.36 | 46.23 | 1.66 |
5 | 25.8 | 1.41 | 40.60 | 1.61 |
6 | 33.2 | 1.52 | 53.73 | 1.73 |
7 | 38.1 | 1.58 | 67.42 | 1.83 |
8 | 45.7 | 1.66 | 73.19 | 1.86 |
9 | 62.3 | 1.79 | 89.68 | 1.95 |
10 | 65.4 | 1.82 | 74.84 | 1.87 |
11 | 140 | 2.15 | 155.47 | 2.19 |
12 | 110 | 2.04 | 140.33 | 2.15 |
13 | 13.2 | 1.12 | 12.42 | 1.09 |
14 | 14.6 | 1.16 | 22.56 | 1.35 |
15 | 133 | 2.12 | 176.93 | 2.25 |
16 | 45 | 1.65 | 93.78 | 1.97 |
17 | 65.4 | 1.82 | 111.15 | 2.05 |
18 | 70.3 | 1.85 | 92.69 | 1.97 |
19 | 18.4 | 1.26 | 27.67 | 1.44 |
20 | 67.7 | 1.83 | 82.16 | 1.91 |
21 | 170 | 2.23 | 203.55 | 2.31 |
22 | 170 | 2.23 | 228.36 | 2.36 |
23 | 140 | 2.15 | 216.73 | 2.34 |
24 | 182 | 2.26 | 555.17 | 2.74 |
25 | 41.7 | 1.62 | 60.82 | 1.78 |
26 | 43.1 | 1.63 | 57.47 | 1.76 |
27 | 33.2 | 1.52 | 44.20 | 1.65 |
28 | 42.3 | 1.63 | 48.68 | 1.69 |
29 | 31.3 | 1.50 | 42.16 | 1.62 |
30 | 86.1 | 1.94 | 179.86 | 2.25 |
31 | 58.8 | 1.77 | 100.40 | 2.00 |
32 | 39.6 | 1.60 | 59.01 | 1.77 |
33 | 21.8 | 1.34 | 46.29 | 1.67 |
34 | 41.7 | 1.62 | 59.99 | 1.78 |
35 | 33.3 | 1.52 | 73.34 | 1.87 |
36 | 58.6 | 1.77 | 104.54 | 2.02 |
37 | 57.8 | 1.76 | 76.28 | 1.88 |
38 | 29 | 1.46 | 43.97 | 1.64 |
39 | 39.6 | 1.60 | 32.97 | 1.52 |
40 | 30.2 | 1.48 | 38.47 | 1.59 |
Xijing Hospital의 혈청 일련 번호 | - | - | - | - |
1 | 58.6 | 1.77 | 110.22 | 2.04 |
2 | 26.3 | 1.42 | 28.64 | 1.46 |
3 | 24.2 | 1.38 | 22.55 | 1.35 |
4 | 5.6 | 0.75 | 7.98 | 0.90 |
5 | 7 | 0.85 | 9.95 | 1.00 |
6 | 9.1 | 0.96 | 10.88 | 1.04 |
7 | 7.8 | 0.89 | 10.32 | 1.01 |
8 | 6.9 | 0.84 | 7.85 | 0.89 |
9 | 6.5 | 0.81 | 10.58 | 1.02 |
10 | 12.1 | 1.08 | 19.77 | 1.30 |
11 | 16.8 | 1.23 | 25.96 | 1.41 |
12 | 42.3 | 1.63 | 50.42 | 1.70 |
13 | 114 | 2.06 | 179.29 | 2.25 |
14 | 6.9 | 0.84 | 5.40 | 0.73 |
15 | 17.1 | 1.23 | 21.13 | 1.32 |
16 | 58.6 | 1.77 | 102.90 | 2.01 |
17 | 213 | 2.33 | 418.66 | 2.62 |
18 | 20.3 | 1.31 | 35.05 | 1.54 |
19 | 170 | 2.23 | 196.84 | 2.29 |
20 | 140 | 2.15 | 187.56 | 2.27 |
21 | 114 | 2.06 | 152.75 | 2.18 |
22 | 114 | 2.06 | 144.88 | 2.16 |
23 | 77.9 | 1.89 | 185.85 | 2.27 |
24 | 73.1 | 1.86 | 97.58 | 1.99 |
25 | 65.4 | 1.82 | 71.60 | 1.85 |
26 | 58.8 | 1.77 | 81.52 | 1.91 |
27 | 52.2 | 1.72 | 48.59 | 1.69 |
28 | 33.2 | 1.52 | 34.49 | 1.54 |
29 | 25.8 | 1.41 | 37.18 | 1.57 |
30 | 18.8 | 1.27 | 30.58 | 1.49 |
31 | 9.2 | 0.96 | 12.20 | 1.09 |
32 | 8.1 | 0.91 | 7.77 | 0.89 |
33 | 5.9 | 0.77 | 5.73 | 0.76 |
상관관계 평가를 통해 상기 2 개의 상관 관계식은 y = 1.056x + 0.0619이고, 상관 계수 r2 = 0.9506으로 우수한 상관관계가 있었다.
실시예 5
최적화된 검출 시스템 및 중국 공개 특허 CN105988003A의 출원 명세서에서 언급된 산 처리 및 알칼리 중화용 시약은 표준 곡선을 만들기 위해 점진적으로 희석된 C-반응성 단백질 항원을 검출하기 위해 사용하였으며, 그 후 수집된 48 개의 임상 시료는 검출되었고 그들의 농도 값은 표준 곡선을 통해 계산되었고 임상 바탕값과의 상관관계 평가를 수행하고, 상기 결과는 도 1 및 도 2에 나타내었다(자성 입자 화학 발광 플랫폼).
추적된 항원의 선폭과 비교하여, 상기 두 시약은 시장의 수요(0.02-100 mg/L)를 충족할 수 있었고, 상기 두 시약은 시료 상관관계 평가에서 동등한 성능을 나타내었다.
본 발명의 키트의 검출 범위는 시료 처리 용액(0.1 ~ 1M 농도의 시트르산 용액, pH = 3 ~ 4)을 본 발명의 키트 검출과정에서의 한 단계에서 첨가 한 후 0.02 mg/L 내지 100 mg/L에 이를 수 있었으며, 상기 키트는 C-반응성 단백질의 전 범위 검출 요구를 충족하였다.
상기 내용은 본 발명의 바람직한 실시예에 불과하므로 본 발명의 실시범위를 제한 할 수는 없다. 즉, 본 발명의 범위 및 명세서의 내용에 따라 등가의 변경 및 수정을 가하는 것은 본 발명의 적용 범위에 속한다.
Claims (10)
- 다음을 포함하는 C-반응성 단백질의 전 범위 검출용 키트:
(a) 제 1 항체가 코팅된 자성 입자 0.5~1 mg/mL, 0.04~0.06% (w/v) 계면활성제, 및 8~12% (w/v) 수크로스(sucrose)를 포함하는 M 시약(M reagent),
상기 M 시약의 용매는 pH가 7.0 ~ 8.0 인 인산염 버퍼(phosphate buffer)이고; 상기 제 1 항체의 코팅 양은 자성입자 1 mg 당 5~20 ㎍ 임;
(b) pH 3.0~4.0이고, 0.1~1 M 농도의 시트르산 용액인 시료 처리 용액인 R1 시약;
(c) 제 2 항체가 코팅된 아크리디늄 에스테르(acridinium ester), 0.5-1% 카제인(casein) 및 0.5-1% 소 혈청 알부민을 포함하는 R2 시약,
상기 R2 시약의 용매는 pH가 7.0-8.0인 인산염 버퍼이고, 상기 제 2 항체의 코팅 양은 아크리디늄 에스테르 1 ㎍ 당 0.3-0.9 ㎍ 임; 및
(d) 예비-여기 용액(pre-excitation solution) 및 여기 용액;
상기 제 1 항체 및 제 2 항체는 모두 C-반응성 단백질과 특이적으로 반응할 수 있는 단일 클론 항체이고, 상기 제 1 항체 및 제 2 항체는 상이한 에피토프에 대한 항체임.
- 다음을 포함하는 C-반응성 단백질의 전 범위 검출용 키트:
(a) 플레이트형 발광 플레이트를 포함하는 제 1 항체로 코팅된 평평한-바닥 플레이트형 화학 발광 플레이트(flat-bottomed plate-type chemiluminescence plate),
상기 제 1 항체의 코팅 양은 100~500 ng/웰이고, 코팅 버퍼는 pH 7.0~8.0의 인산염 버퍼이고, 블로킹 용액은 5-8% (w/v) 블로킹 혈청 또는 블로킹 단백질 및 0.02% (w/v) 아지드화 나트륨(sodium azide)을 포함하는 pH 7.2-7.4인 50 mM 인산염 버퍼임;
(b) pH 3.0~4.0이고, 0.1 ~ 1 M 농도의 시트르산 용액인 시료 처리 용액;
(c) 호스래디시 퍼옥시다제 또는 알칼리성 포스파타제로 표지된 제 2 항체를 포함하고, 호스래디시 퍼옥시다제 또는 알칼리성 포스파타제가 동일한 비율로 표지된 제 2 항체가 1 mg/mL의 표지 양을 갖는 표지 효소 용액; 및
(d) 발색 용액: 표지 효소가 호스래디시 퍼옥시다제인 경우, 발색 용액은 발색 용액 A 및 발색 용액 B를 포함하고, 발색 용액 A는 과산화수소이고, 발색 용액 B는 o-페닐렌다이아민(o-phenylenediamine)임; 표지 효소가 알칼리성 포스파타제인 경우, 발색 용액은 시판되는 시약임;
상기 제 1 항체 및 제 2 항체는 모두 C-반응성 단백질과 특이적으로 반응할 수 있는 단일 클론 항체이고, 상기 제 1 항체 및 제 2 항체는 상이한 에피토프에 대한 항체임.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 시트르산 용액의 pH는 인산수소이나트륨 12수화물(disodium hydrogen phosphate dodecahydrate)에 의해 조절되는 것인, 키트.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 시트르산 용액의 pH는 3.0-3.5인 것인, 키트.
- 제4항에 있어서, 상기 시트르산 용액의 pH는 3.2, 3.3, 3.4 또는 3.5인 것인, 키트.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 시트르산의 농도는 0.5 mol/L인 것인, 키트.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 예비-여기 용액은 1% (w/v) 과산화수소 용액이고, 상기 여기 용액은 1 mol/L 수산화 나트륨 용액인 것인, 키트.
- 제1항에 있어서, 상기 키트의 M 시약 및 R2 시약은 다음의 방법으로 제조되는 것인, 키트:
상기 M 시약은 제 1 항체 및 자성 입자를 pH 5.0 ~ 6.0의 2-모르폴린에탄술폰산 버퍼(2-morpholineethanesulfonic acid buffer)에 혼합하고, 25-37℃에서 1-3 시간 동안 코팅하고, 1~3 시간 동안 반응을 중단하기 위해 pH 8.0 ~ 9.0인 0.1% ~ 0.5% (w/v)의 소 혈청 알부민 인산염 버퍼를 첨가하고, 상기 코팅된 자성 입자를 분리하여 pH 7.0 ~ 8.0인 인산염 버퍼에 분산시킨 후, 0.04~0.06% (w/v) 계면활성제 및 8~12% (w/v) 수크로스를 첨가하여 얻을 수 있고; 및
상기 R2 시약은 제 2 항체 및 아크리디늄 에스테르를 pH 8.0~9.0의 인산염 버퍼에서 혼합하고, 25-37℃에서 1-3 시간 동안 코팅한 후, 1~3 시간동안 반응을 중단하기 위해 0.1%~0.5% (w/v) 소혈청 알부민을 포함하고 pH 8.0~9.0을 가지는 트리스 버퍼를 첨가하여 스톡 용액을 얻고, 상기 스톡 용액은 pH 7.0~8.0인 인산염 버퍼로 1:100~500로 희석하여 얻을 수 있음.
- 제2항에 있어서, 상기 키트의 평평한-바닥 플레이트형 화학 발광 플레이트(flat-bottomed plate-type chemiluminescence plate) 및 표지 효소 용액은 다음의 방법으로 제조되는 것인, 키트:
상기 평평한-바닥 플레이트형 화학 발광 플레이트는 코팅된 제 1 항체를 코팅 버퍼로서 pH 7.0-8.0을 갖는 인산염 버퍼로 100-500 ng/웰로 희석하여, 웰당 100 μL로 상기 발광 플레이트에 첨가하고, 37℃에서 2 시간 또는 4℃에서 밤새 배양하고, 코팅 버퍼를 쏟아 내고, 5-8% (w/v) 송아지 혈청과 0.02% (w/v) 아지드화 나트륨을 포함하는 블로킹 용액 200μL를 사용하여 37℃에서 2 시간 동안 배양하고, 웰에 있는 액체를 버리고, 플레이트를 건조하고 알루미늄 필름으로 진공 상태에서 밀봉한 다음 4℃의 건조한 장소에 보관하여 얻을 수 있고; 및
상기 표지 효소 용액은 1:1 비율의 제 2 항체 및 호스래디시 퍼옥시다제 또는 알칼리성 포스파타제를 pH 9.6의 탄산염 완충액에서 혼합하고 표지하고 투석하고, 투석 버퍼를 4 시간 마다 3회 교체하고, 효소로 표지된 제 2 항체를 수집하여 스톡 용액으로 한 후, 스톡 용액을 시판되는 효소 희석제로 1:500으로 희석하여 얻어짐.
- 제1항 또는 제2항에 따른 키트를 사용하여 수행되는 다음을 포함하는 C-반응성 단백질의 전 범위 검출 방법:
(1) 시료 20 μL를 채취하고, 시료를 처리하기 위해 R1 시약 100 μL을 첨가하는 단계;
(2) M 시약 50 μL를 첨가한 후 15분 동안 배양하는 단계;
(3) 단계 (2) 이후, 0.05 ~ 0.08% (w/v) Tween-20을 포함하는 인산염 버퍼로 세척한 후, R2 시약 50 μL을 첨가하고 10 분 동안 배양하는 단계;
(4) 단계 (3) 이후, 0.05 ~ 0.08% (w/v) Tween-20을 포함하는 인산 버퍼로 세척하고, 예비 여기를 수행하기 위해 예비 여기 용액 100 μL를 첨가하는 단계; 및
(5) 예비 여기 용액을 제거하고, 여기 용액 100 μL을 추가하여 여기 및 검출하는 단계.
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CN114216897A (zh) * | 2021-12-22 | 2022-03-22 | 武汉生之源生物科技股份有限公司 | 一种sST2化学发光检测试剂盒及其检测方法 |
CN114544978A (zh) * | 2022-03-04 | 2022-05-27 | 美康生物科技股份有限公司 | 一种igf-1检测试剂盒及其制备方法和检测方法 |
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CN115975025B (zh) * | 2022-11-01 | 2023-06-23 | 北京中楷健康科技有限公司 | C反应蛋白(crp)检测试剂盒 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2003066047A (ja) * | 2001-06-14 | 2003-03-05 | Matsushita Electric Ind Co Ltd | 免疫反応測定方法及びそれに用いる免疫反応測定用試薬 |
US20030108858A1 (en) * | 2001-06-26 | 2003-06-12 | Shah Dinesh O. | Methods for the simultaneous detection of HCV antigens and HCV antibodies |
CN103941017A (zh) * | 2014-03-18 | 2014-07-23 | 北京普恩光德生物科技开发有限公司 | C反应蛋白检测试剂盒 |
CN105988003A (zh) * | 2015-01-28 | 2016-10-05 | 厦门万泰凯瑞生物技术有限公司 | 一种全程c反应蛋白测定试剂盒及其应用 |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5358852A (en) * | 1992-12-21 | 1994-10-25 | Eastman Kodak Company | Use of calcium in immunoassay for measurement of C-reactive protein |
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CN107402308A (zh) * | 2017-06-21 | 2017-11-28 | 北京科跃中楷生物技术有限公司 | Il‑6定量检测试剂盒及其制备方法 |
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---|---|---|---|---|
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US20030108858A1 (en) * | 2001-06-26 | 2003-06-12 | Shah Dinesh O. | Methods for the simultaneous detection of HCV antigens and HCV antibodies |
CN103941017A (zh) * | 2014-03-18 | 2014-07-23 | 北京普恩光德生物科技开发有限公司 | C反应蛋白检测试剂盒 |
CN105988003A (zh) * | 2015-01-28 | 2016-10-05 | 厦门万泰凯瑞生物技术有限公司 | 一种全程c反应蛋白测定试剂盒及其应用 |
Non-Patent Citations (2)
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---|
PINGGUO LIU et al., ‘Chemiluminescent immunoassay for high-sensitivity C-reactive protein’, Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao., 2010, Vol. 26, pp 1150-6. 1부.* |
SHUZHEN ZOU et al., ‘Development of ic-ELISA and an immunochromatographic strip assay for the detection of methylmercury’, Food and Agricultural Immunology, 2017, Vol. 28, pp 699-710. 1부.* |
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