JP6559781B2 - 免疫蛍光を使用する酵素イムノアッセイのための組成物及びその使用 - Google Patents
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Description
E+S→ES→E+S* (1)
式中、「E」は、酵素であり、「S」は、蛍光発生酵素基質であり、「ES」は、酵素−基質複合体に相当し、「S*」は、蛍光発生酵素基質から結果として生じる蛍光性反応生成物に相当する。
− 一方では、酵素加水分解後に、蛍光性生成物、及び優先的にはアニオンである第2の反応生成物の形成を可能にする、蛍光発生酵素基質、及び
− 他方では、蛍光発生酵素基質の酵素加水分解後に、かつ第2の反応生成物が遊離されることによって、消光型蛍光発生化合物に起因する蛍光性化合物の形成を可能にする、消光型蛍光発生化合物。
E+S→ES→E+S*+B (2)
式中、「E」は、酵素であり、「S」は、蛍光発生酵素基質であり、「ES」は、酵素−基質複合体に相当し、「S*」は、蛍光性反応生成物に相当し、「B」は、第2の反応生成物であり、2つの化合物「S*」及び「B」は、反応媒体中に存在する。
− 以下の式(3.i)に従い、生成物「B」が、消光型蛍光発生化合物「A」と反応して、一方では蛍光性化合物「A*」を、他方では反応生成物「B’」を遊離するか、
A+B→A*+B’ (3.i)
− 又は、以下の式(3.ii)に従い、生成物「B」が、消光型蛍光発生化合物「A」に特異的に結合して、消光型蛍光発生化合物「A」を生成物「B」と.してなる蛍光性化合物「A*−B」を形成するか
A+B→A*−B (3.ii)
のどちらかを意味することを意図する。
B+A−cat→cat−B+A* (4)
上式で、「B」は、上記の一般式(2)に詳述された第2の反応生成物に相当し、「A−cat」は、カチオン「cat」を遊離後、蛍光を放出することができるようになる部分「A*」を含む、消光型蛍光発生化合物であり、そのカチオン「cat」は、生成物「B」と会合して、生成物「cat−B」を形成することになる。
− 例えばシグナルの増幅に使用されるデンドリマーなど、合成が複雑で再現が困難な追加の薬剤の添加を制限し、それによって、感度、原料の調製、及び試験の迅速性を増加させることを可能にする。
− 反応時間を変えることなく、得られる感度の増加を実現する。
− 非蛍光性反応生成物と消光型蛍光発生化合物との間の追加の反応が、特に反応生成物「B」と前記消光型蛍光発生化合物との間の直接的な反応である場合に、単純かつ迅速であり、多数の工程を必要としない。
− シグナルを検出する機器の改良を何も必要とせず、ゆえに概して比較的高価ではない。
− 被験試料中に低濃度で存在する被分析物を検出することを可能にする。
− 弱いシグナルの蛍光のみを増加させるために、消光型蛍光発生化合物(「A−cat」)の濃度を調整することを可能にする。
− 蛍光性反応生成物(「S*」)の蛍光シグナルと、生成物「B」によって蛍光性(「A*」又は「A*−B」)を生じる消光型蛍光発生化合物「A」又は「A−cat」の蛍光シグナルとが、同じ間隔内に位置する波長範囲内に検出される。
− 被分析物を捕捉パートナーに結合させるために、予め固体表面に付着させた又は付着させていない捕捉パートナーと、前記液体試料とを一緒にする工程、
− 捕捉パートナー−被分析物複合体に結合させるために、検出パートナーを添加する工程であって、検出パートナーは、本発明の組成物の蛍光発生酵素基質を分解することが可能な酵素に、直接的又は間接的にカップリングされている、工程、
− 本発明の組成物と、捕捉パートナー−被分析物−検出パートナー複合体とを一緒にして、反応媒体を形成する工程、及び
−反応媒体中で放出される蛍光を測定することによって、被分析物の存在及び/又は量を免疫蛍光により検出する工程
を含むか又はそれらにある方法である。
− 予め固体表面に付着させた又は付着させていない捕捉パートナー、本発明の組成物の蛍光発生酵素基質を分解することが可能な酵素にカップリングされた、被分析物のアナログ、及び捕捉パートナーとの結合を競合する前記液体試料を一緒にする工程、
− 本発明の組成物、捕捉パートナー−被分析物、及び捕捉パートナー−被分析物アナログ複合体を一緒にして、反応媒体を形成する工程、並びに
− 反応媒体中で放出される蛍光を測定することによって、被分析物の存在及び/又は量を、免疫蛍光により検出する工程
を含むか又はそれらにある方法である。
− 一方の(i)では、酵素加水分解後に、蛍光性生成物(第1の蛍光性生成物と称される)、及び優先的にはアニオンである第2の反応生成物の形成を可能にする、蛍光発生酵素基質;並びに
− 他方の(ii)では、特に第2の反応生成物の遊離、優先的には基質(i)の酵素加水分解の結果生じるアニオンの遊離によって、蛍光性化合物(第2の蛍光性生成物と称される)の形成を可能にする、消光型蛍光発生化合物
を含む。
− 一方では、反応生成物をカチオンと会合してなる複合体(図2の「Pi−cat」)の形成、及び
− 第2の蛍光性シグナルの産生を可能にする蛍光性化合物(「A*」)の形成。第2の蛍光性シグナルは、蛍光性化合物の従来の誘導体の場合のように、蛍光性形態の化合物を形成するのに必要な一連の反応を実行するための追加の化合物の添加を必要とせず、本発明の特定の実施態様を構成する。
(i)Jung H. S.ら、2009、Thomas F.及びSerratrice G.、1999、並びにYao J.ら、2009により記載されているような親水性クマリンであって、例えば:
− 7−(ジエチルアミノ)−2−オキソ−N−[(ピリジン−2−イル)−メチル]−2H−クロメン−3−カルボキサミド:
− N−(1,3−ジヒドロキシ−2−(ヒドロキシメチル)プロパン−2−イル)−2−オキソ−2H−クロメン−3−カルボキサミド:
− カルセイン:
及び
− カルセインブルー:
(ii)Zhang G.ら、2012に記載されているようなポリ(9−アミノフルオレン);
(iii)Alvaro M.ら、2001、Henary M. M.ら、2004及びSaluja P.ら、2012によって記載されているようなベンズイミダゾール誘導体であって、例えば:
− 以下の式(I)のN−[2−(1H−ベンゾ[d]イミダゾール−2−イル)−フェニル]−N−[(E)−1−(1H−ピロール−2−イル)メチリデン]アミン:
− ビス−ベンズイミダゾール誘導体のN,S,−マクロ環;
− {4−[2−(1H−ベンズイミダゾール−2−イル)フェニル−スルファモイル]−フェノキシ}酢酸:
− {4−{2−{4−[(ジエチルアミノ)メチル]−1H−ベンゾイミダゾール−2−イル}フェニル−スルファモイル}フェノキシ}酢酸:
− {4−{2−{4−[(メチルピリジン−2−イルメチルアミノ)−メチル]−1H−ベンゾイミダゾール−2−イル}フェニルスルファモイル}フェノキシ}酢酸:
及び
− {4−{2−{4−[(ビスピリジン−2−イルメチルアミノ)メチル]−1H−ベンゾイミダゾール−2−イル}フェニルスルファモイル}フェノキシ}酢酸:
(i)例えば以下の複合体など、金属イオンによって消光されている親水性クマリン:
− 7−(ジエチルアミノ)−2−オキソ−N−((ピリジン−2−イル)−メチル)−2H−クロメン−3−カルボキサミド−銅イオン(Cu2+);
− N−(1,3−ジヒドロキシ−2−(ヒドロキシメチル)プロパン−2−イル)−2−オキソ−2H−クロメン−3−カルボキサミド−鉄イオン(Fe3+);
− カルセイン−鉄イオン(Fe3+);
− カルセインブルー−コバルトイオン(Co2+);
(ii)例えば以下の複合体などの、金属イオンによって消光されている水溶性ベンズイミダゾール誘導体:
− 以下の式(II)のN−[2−(1H−ベンゾ[d]イミダゾール−2−イル)−フェニル]−N−[(E)−1−(1H−ピロール−2−イル)メチリデン]アミン−銅イオン(Cu2+):
− Cu2+、Fe2+、Ni2+、Co2+及びMn2+から選ばれるイオンによって消光されているビス−ベンズイミダゾール誘導体のN,S,−マクロ環;
− Cu2+、Fe2+、Ni2+、Co2+及びMn2+から選ばれるイオンによって消光されている{4−[2−(1H−ベンゾイミダゾール−2−イル)−フェニル−スルファモイル]フェノキシ}酢酸;
− Cu2+、Fe2+、Ni2+、Co2+及びMn2+から選ばれるイオンによって消光されている{4−{2−{4−[(ジエチルアミノ)メチル]−1H−ベンゾイミダゾール−2−イル}フェニルスルファモイル}フェノキシ}酢酸;
− Cu2+、Fe2+、Ni2+、Co2+及びMn2+から選ばれるイオンによって消光されている{4−{2−{4−[(メチルピリジン−2−イルメチルアミノ)メチル]−1H−ベンゾイミダゾール−2−イル}フェニルスルファモイル}フェノキシ}酢酸;及び
− Cu2+、Fe2+、Ni2+、Co2+及びMn2+から選ばれるイオンによって消光されている{4−{2−{4−[(ビスピリジン−2−イルメチルアミノ)メチル]−1H−ベンゾイミダゾール−2−イル}フェニルスルファモイル}フェノキシ}酢酸。
− カルセインブルー−コバルトイオン(Co2+)及び
− N−[2−(1H−ベンゾ[d]イミダゾール−2−イル)−フェニル]−N−[(E)−1−(1H−ピロール−2−イル)メチリデン]アミン−銅イオン(Cu2+)。
・ Beckman Coulterが販売するAccess(登録商標)2、UniCel(商標)DxI600及びUniCel(商標)DxI800;
・ Siemensが販売するAdvia Centaur(商標)及びImmulite(商標);
・ Ortho−Clinical−Diagnosticsが販売するVitros(商標);
・ 出願人が販売するVIDAS(登録商標);
・ Abbott Diagnosticsが販売するArchitect(商標);及び
・ Roche Diagnosticsが販売するElecsys(商標)
− 被分析物を捕捉パートナーに結合させるために、予め固体表面に付着させた又は付着させていない捕捉パートナーと、前記液体試料とを一緒にする工程、
− 捕捉パートナー−被分析物複合体に結合させるために、検出パートナーを添加する工程であって、検出パートナーは、本発明の組成物の蛍光発生酵素基質を分解することが可能な酵素に、直接的又は間接的にカップリングされている、工程、
− 本発明の組成物と、捕捉パートナー−被分析物−検出パートナー複合体とを一緒にして、反応媒体を形成する工程、及び
− 反応媒体、すなわち、上に記載の第1及び第2の蛍光生成物を含有する媒体中で放出される蛍光を測定することによって、被分析物の存在及び/又は量を、免疫蛍光により検出する工程
を含む方法に関する。
「捕捉パートナー/被分析物/酵素にカップリングされた検出パートナー」
からなることになる。
「捕捉パートナー/被分析物/検出パートナー/酵素にカップリングされた結合パートナー」からなることになる。後者の実施態様のコンテクストでは、結合パートナーは、当業者に周知であり、例えば、検出パートナーが、目的の被分析物を認識するIgGであるとき、抗IgG(免疫グロブリン)抗体であってもよい。
− 予め固体表面に付着させた又は付着させていない捕捉パートナーと、本発明の組成物の蛍光発生酵素基質を分解することが可能な酵素にカップリングされた被分析物のアナログと、前記液体試料とを一緒にして、アナログと前記液体試料とが捕捉パートナーとの結合を競合する、工程、
− 本発明の組成物と、捕捉パートナー−被分析物複合体と、捕捉パートナー−被分析物アナログ複合体とを一緒にして、反応媒体を形成する工程、及び
− 反応媒体、すなわち、上に記載されたような第1及び第2の蛍光生成物を含有する媒体中で放出される蛍光を測定することによって、被分析物の存在及び/又は量を、免疫蛍光により検出する工程
を含む方法に関する。
− 検出パートナーを添加する工程の前に、捕捉パートナー−被分析物複合体に結合していない被分析物を除去するようにリンスする工程、及び
− 検出パートナーを添加する工程の後に、非結合の検出パートナーを除去するようにリンスする工程
を含むこともでき、これは、本発明の別の実施態様を構成する。
無機リン酸Piの選択的な検出とカップリングしている蛍光発生酵素基質4−メチルウンベリフェリルホスフェート(4−MUP)の活性化による蛍光の増加
1.一般原理:
1.1.標準反応:
図1に概略的に表されるように、VIDAS(登録商標)(bioMerieux)機器で実行されるイムノアッセイにおいて、被分析物の存在を免疫蛍光によって検出する現行の工程は、VIDAS(登録商標)ストリップの最後の容器(ウェル10又はXA)が含有する蛍光発生酵素基質4−メチルウンベリフェリルホスフェート(4−MUP)の活性化に基づく。
− VIDAS(登録商標)機器の光学スキャナーによってその蛍光が測定される、高蛍光性分子の4−メチルウンベリフェロン(4−MU)、及び
− 特別な役割を持たずに溶液中に残る、リン酸水素イオンHPO4 2−(又は全ての形態の無機リン酸を表すPi)
の2つの生成物を生成する。
図1は、この公知の反応を概略的に表す。
図2は、本発明による免疫蛍光による検出の反応の向上を概略的に表す。この反応は、一方では、蛍光発生酵素基質、この場合では4−メチルウンベリフェリルホスフェート(4−MUP)の従来の活性化からなる。この反応は、さらに消光型化学センサー−カチオン複合体(図2に概略的に表される菱形「A−cat」)があるために最適化されている。
図3に説明されるように、出願人は、コバルトカチオン(Co2+)によって消光された化学センサー「カルセインブルー」(CB)に会合してなる複合体を二次基質として使用し、上記の1.2章に詳述された反応の向上を実行した。
− 無機リン酸Piに対する選択性がある。
− 図4に示すように、漸増濃度の無機リン酸Piによって良好に活性化される。実際、図4では、カルセインブルー及びコバルトイオン(「CB−Co」)が会合してなる消光型化学センサー−カチオン複合体が、漸増濃度の無機リン酸Piによって活性化され、前記濃度の無機リン酸Piの関数として蛍光性カルセインブルーの遊離を可能にすることを示す。
− 水溶性である。
− 370±5nmの波長で励起され、450±20nmの波長で放出する。
− 図5に示すように、4−メチルウンベリフェロン(4−MU)に匹敵する蛍光強度を有する。図5では、以下の2つの溶液の放出スペクトルを比較しており、溶液は、第1の場合にカルセインブルー(CB)を、第2の場合に4−メチルウンベリフェロン(4−MU)を含む。
・ 6410nMのカルセインブルー、0.6mMのジエタノールアミン(DEA);0.3mMのエチレンジアミン四酢酸(EDTA−Na2)及び0.5mMのMgCl2を含む、pH9.4の溶液、及び
・ 6410nM(6.4μM)の蛍光発生酵素基質リン酸4−メチル−ウンベリフェリル(4−MUP)を含む、VIDAS(登録商標)OPT溶液
− カルセインブルーとコバルトイオン(Co2+)との間の結合は、VIDAS XAのpHに相当するpH9.2を含めて、各種のpHで安定である。
− 図6に示すように、カルセインブルー及びコバルトイオン(「CB−Co」)を会合してなる化学センサー−カチオン複合体は、消光されている、すなわち、コバルトイオン(Co2+)が分離する前は蛍光性ではない。
本発明による組成物を使用した蛍光放出の向上
1.試験対象の溶液の調製
以下の化合物を用いてpH8.2バッファーを調製した。
・ トリス塩基+HCl(最終pH8.2)
・ 0.7mM [Mg2+]
・ 0.03mM [EDTA−Na2]
・ 0.03mM [Co2+]
溶液A: 0.64μMの4−MUP(遊離酸形態)
溶液B: 6.4μMのCB−Co
溶液C: 0.64μMの4−MUP+6.4μMのCB−Co
蛍光発生酵素基質4−MUPの自然発生的な加水分解及びカルセインブルーCBからのコバルトイオン(Co2+)の移動が防止されていることを立証するために、溶液A及びBの安定性を、蛍光を経時的にモニタリングすることによって試験した。
この安定性試験の後、以下の試験を3回実行した。
工程1: 3つのストリップ(XAウェル)を300μLの溶液Aで満たし、3つのストリップを溶液Cで満たした。ストリップをVIDAS(登録商標)3機器内に装填した。
工程2: 各ストリップについて、時間t0で、バックグラウンド値(BKG)をVIDAS(登録商標)機器のスキャナヘッドによって測定する。
工程3: 酵素アルカリホスファターゼ(ALP)を各キュベット内に添加する(500μg/mLで10μL)。
工程4: 各キュベットの蛍光を所与の時点で15分間測定する。
工程5: 蛍光の増加を算出する。t=15分での最終読み取り値からバックグラウンド値(BKG)を差し引くことによって、相対蛍光値(RFV)を決定した。
本発明による組成物中の各種濃度の一次基質の使用
カルセインブルーとコバルトイオンとを会合してなる消光型化学センサー−カチオン複合体(「CB−Co」)を用いた予備試験:
上の実施例2に記載されたように、pH8.2バッファーを調製した。
(1)0.64μM
(2)0.43μM
(3)0.32μM
(1)0.64μM濃度:
− 溶液A1: 0.64μMの4−MUP(遊離酸形態)
− 溶液B1: 6.4μMのCB−Co
− 溶液C1: 0.64μMの4−MUP+6.4μMのCB−Co
(2)0.43μM濃度:
− 溶液A2: 0.43μMの4−MUP(遊離酸形態)
− 溶液B2: 6.4μMのCB−Co
− 溶液C2: 0.43μMの4−MUP+6.4μMのCB−Co
(3)0.32μM濃度:
− 溶液A3: 0.32μMの4−MUP(遊離酸形態)
− 溶液B3: 6.4μMのCB−Co
− 溶液C3: 0.32μMの4−MUP+6.4μMのCB−Co
(i)VIDAS(登録商標)3機器のスキャナヘッドを使用して、それぞれの空のストリップのプラスチックを測定する。
(ii)以下のようにストリップを満たす(XAウェル)。
a.区画A→1つのストリップを300μLの溶液B(B1、B2、又はB3)で満たし、
b.区画B→3つのストリップを300μLの溶液A(A1、A2、又はA3)で満たし、
c.区画C→3つのストリップを300μLの溶液C(C1、C2、又はC3)で満たす。
(iii)ストリップをVIDAS(登録商標)3EP VN 1015内に装填する。
(iv)同じスキャナヘッドによって、各ストリップについてバックグラウンド読み取り(BKG)をT0で取得する。
(v)酵素アルカリホスファターゼ(ALP)を、各キュベット内に過剰に添加する(500μg/mLで10μL)。
(vi)各キュベットの蛍光を、5分毎に15分間測定する。
(vii)t=15分での最終読み取り値からバックグラウンド値(T0)を差し引くことによって、相対蛍光値(RFV)を決定する。
I.0.64μMの4−MUP濃度についてのセッション1、2、及び3の間の試験:
予備的な安定性試験:
複合体CB−Co、蛍光発生酵素基質4−MUP、及びそれらの混合物の安定性を、それらの蛍光を経時でモニタリングすることによって評価した。これは、蛍光発生酵素基質4−MUPの自然発生的な加水分解、並びにカルセインブルー(CB)からのカチオンCo2+の移動が回避されることを立証するために行った。
消光型化学センサー−カチオン複合体としてのN−[2−(1H−ベンゾ[d]イミダゾール−2−イル)フェニル]−N−[(E)−1−(1H−ピロール−2−イル)メチリデン]アミン−銅イオン(Cu2+)複合体の使用
以下の式(II)のN−[2−(1H−ベンゾ[d]イミダゾール−2−イル)−フェニル]−N−[(E)−1−(1H−ピロール−2−イル)メチリデン]アミン−銅イオン(Cu2+)複合体:
は、無機リン酸Piと特異的に反応し、二次基質として使用することができる、化学センサー−カチオン複合体の別の例である。
以下の反応に従って、化合物N−[2−(1H−ベンゾ[d]イミダゾール−2−イル)−フェニル]−N−[(E)−1−(1H−ピロール−2−イル)メチリデン]アミンを得る。
2−(2−アミノフェニル)−1H−ベンズイミダゾール(209mg、1.0mmol)の溶液を、50mLの無水メタノール中のピロール−2−カルボクスアルデヒド溶液(142mg、1.5mmol)と反応させて、10時間加熱還流する。反応後、溶媒を25mLにエバポレートし、エバポレーションを遅くするために50℃に保つ。得られる白色沈殿物を、次いで濾過して、冷メタノールで3回洗浄する。
以下の式(II)のN−[2−(1H−ベンゾ[d]イミダゾール−2−イル)−フェニル]−N−[(E)−1−(1H−ピロール−2−イル)メチリデン]アミン−銅イオン(Cu2+)複合体:
は、N−[2−(1H−ベンゾ[d]イミダゾール−2−イル)フェニル]−N−[(E)−1−(1H−ピロール−2−イル)−メチリデン]アミン(286mg、1.0mmol)を、Cu(NO3)2・6H2O(295mg、1.0mmol)のTHF/H2O(30mL、1/1、v/v)中液に反応させることによって得る。混合物を8時間加熱還流する。反応終了時に、反応混合物中でジエチルエーテルをゆっくり拡散させることで、生成物を分離する。得られる固体を冷メタノール中で洗浄し、濃緑色の生成物を得る。
図7に示すように、この消光型化学センサー−カチオン複合体は、無機リン酸Piによって活性化され、一方では、カチオンCu2+をリン酸水素イオンに会合してなる非蛍光性生成物(Pi−Cu)を生成し、他方では蛍光性化合物である[2−(1H−ベンゾ[d]イミダゾール−2−イル)フェニル]−N−[(E)−1−(1H−ピロール−2−イル)メチリデン]アミンを遊離することを可能にする。図11では、消光型化学センサー−カチオン複合体[N−[2−(1H−ベンゾ[d]イミダゾール−2−イル)フェニル]−N−[(E)−1−(1H−ピロール−2−イル)メチリデン]アミン−銅イオン(Cu2+)]を含む、無機リン酸不含の組成物の放出スペクトラムを、消光型化学センサー−カチオン複合体[N−[2−(1H−ベンゾ[d]イミダゾール−2−イル)フェニル]−N−[(E)−1−(1H−ピロール−2−イル)メチリデン]アミン−銅イオン(Cu2+)]及び無機リン酸Piの両方を含む組成物からの放出スペクトラムと比較している。図11から明らかであるように、有機リン酸の存在によって、一方では、カチオンCu2+をリン酸水素イオンに会合してなる非蛍光性生成物(Pi−Cu)の形成が、他方では、蛍光性化合物である[2−(1H−ベンゾ[d]イミダゾール−2−イル)フェニル]−N−[(E)−1−(1H−ピロール−2−イル)メチリデン]アミンを遊離することが、可能になる。
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Claims (15)
- (i)蛍光発生酵素基質と、(ii)蛍光発生酵素基質(i)の加水分解後に蛍光性化合物を形成する消光型蛍光発生化合物とを含む、免疫蛍光を使用する酵素イムノアッセイのための組成物。
- 蛍光発生酵素基質が、4−メチルウンベリフェリルホスフェート(4−MUP)、4−メチルウンベリフェリルガラクトシド(4−MUG)、4−メチルウンベリフェリルサルフェート(4−MUS)、フルオレセインジホスフェート(FDP)、6,8−ジフルオロ−4−メチルウンベリフェリルホスフェート(DiFMUP)、9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン−7−イル)ホスフェート(DDAOホスフェート)、2’−[2−ベンゾチアゾール]−6’−ヒドロキシベンゾチアゾールホスフェート、2−ナフチルホスフェート、及び2−ウンベリフェリルホスフェートから選ばれることを特徴とする、請求項1に記載の組成物。
- 蛍光発生酵素基質が、4−メチルウンベリフェリルホスフェート(4−MUP)であることを特徴とする、請求項2に記載の組成物。
- 消光型蛍光発生化合物が、消光型化学センサー−カチオン複合体であることを特徴とする、請求項1から3の何れか一項に記載の組成物。
- 消光型化学センサー−カチオン複合体の化学センサーが、親水性クマリン及びベンズイミダゾール誘導体から選ばれること、並びに消光型化学センサー−カチオン複合体のカチオンが、Co2+、Cr3+、Cu2+、Fe2+、Fe3+、Mn2+、Ni2+、Hg2+、及びPb2+から選ばれることを特徴とする、請求項4に記載の組成物。
- 消光型化学センサー−カチオン複合体が、
− カルセインブルー−コバルトイオン(Co2+)複合体及び
− N−[2−(1H−ベンゾ[d]イミダゾール−2−イル)−フェニル]−N−[(E)−1−(1H−ピロール−2−イル)メチリデン]アミン−銅イオン(Cu2+)複合体
から選ばれることを特徴とする、請求項5に記載の組成物。 - 蛍光発生酵素基質が、4−メチルウンベリフェリルホスフェート(4−MUP)であること、及び消光型化学センサー−イオン複合体が、カルセインブルー−コバルトイオン(Co2+)複合体であることを特徴とする、請求項4に記載の組成物。
- 請求項1から7の何れか一項に記載の組成物を含む、免疫蛍光を使用する酵素イムノアッセイのためのキット。
- 請求項1から7の何れか一項に記載の組成物、又は請求項8に記載のキットを含む、イムノアナリシスのための自動化デバイス。
- 被分析物の免疫蛍光を使用する酵素イムノアッセイのための、請求項1から9の何れか一項に記載の組成物、キット、又は自動化デバイスの使用。
- 被分析物を含有している可能性のある液体被験試料中の免疫蛍光を使用する酵素イムノアッセイによる、被分析物をインビトロで検出及び/又は定量するための方法であって、
− 被分析物を捕捉パートナーに結合させるために、予め固体表面に付着させた又は付着させていない捕捉パートナーと、前記液体試料とを一緒にする工程
− 捕捉パートナー−被分析物複合体に結合させるために、検出パートナーを添加する工程であって、検出パートナーは、請求項1から7の何れか一項に記載の組成物の蛍光発生酵素基質を分解することが可能な酵素に、直接的又は間接的にカップリングされている、工程、
− 請求項1から7の何れか一項に記載の組成物と、捕捉パートナー−被分析物−検出パートナー複合体とを一緒にして、反応媒体を形成する工程、及び
− 反応媒体中に放出される蛍光を測定することによって、被分析物の存在及び/又は量を、免疫蛍光により検出する工程
を含む方法。 - 検出パートナーを添加する工程の前に、捕捉パートナー−被分析物複合体に結合していない被分析物を除去するようにリンスする工程、及び
検出パートナーを添加する工程の後に、非結合の検出パートナーを除去するようにリンスする工程
のうち少なくとも1つを含む、請求項11に記載の被分析物をインビトロで検出及び/又は定量するための方法。 - 被分析物を含有している可能性のある液体被験試料の免疫蛍光を使用する酵素イムノアッセイにより、インビトロで被分析物を検出及び/又は定量するための方法であって、
− 予め固体表面に付着させた又は付着させていない捕捉パートナーと、請求項1から7の何れか一項に記載の組成物の蛍光発生酵素基質を分解することが可能な酵素にカップリングされた被分析物のアナログと、前記液体試料とを一緒にする工程であって、前記アナログと前記液体試料とが捕捉パートナーとの結合について競合する、工程、
− 請求項1から7の何れか一項に記載の組成物と、捕捉パートナー−被分析物複合体と、捕捉パートナー−被分析物アナログ複合体とを一緒にして、反応媒体を形成する工程、及び
− 反応媒体中で放出される蛍光を測定することによって、被分析物の存在及び/又は量を免疫蛍光により検出する工程
を含む方法。 - 試料を添加する前に、捕捉パートナー−被分析物複合体に結合していない被分析物を除去するようにリンスする工程、及び
試料を添加した後に、非結合の被分析物及び被分析物アナログを除去するようにリンスする工程
のうち少なくとも1つを含む、請求項13に記載の被分析物をインビトロで検出及び/又は定量するための方法。 - 被験試料中の検出対象の被分析物を、免疫蛍光を使用する酵素イムノアッセイによってインビトロで検出及び/又は定量する方法の感度を向上させるための方法において、アッセイを実行する間の請求項1から7の何れか一項に記載の組成物又は請求項8に記載のキットの使用を含むことを特徴とする、方法。
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