KR20210022692A - C-반응성 단백질의 전 범위 검출 방법 및 해당 키트 - Google Patents

C-반응성 단백질의 전 범위 검출 방법 및 해당 키트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 화학 발광 면역 분석에 기초한 C-반응성 단백질의 전 범위 검출용 키트 및 C-반응성 단백질의 전 범위 검출방법을 제공한다. 키트는 R1 시약, M 시약, R2 시약, 예비 여기 용액 및 여기 용액을 포함한다. 시료 처리 용액인 R1 시약은 0.5M 시트르산 용액(pH 3.0-3.5, 인산수소이나트륨 12수화물로 조절됨)이다. 또한, 본 발명은 제 1 항체가 코팅된 평평한 바닥 플레이트형 화학 발광 플레이트, 샘플 처리 용액, 호스래디시 퍼옥시다제(HRP) 또는 알칼리성 포스파타제(AP)로 표지된 제 2 항체, 발색 용액을 포함하는 C-반응성 단백질의 전 범위 검출용 키트를 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 키트를 사용하는 C-반응성 단백질의 전 범위 검출 방법을 제공한다. 제 1 항체 및 제 2 항체 모두 C-반응성 단백질과 특이적으로 반응할 수 있는 단일 클론 항체이다.

Description

C-반응성 단백질의 전 범위 검출 방법 및 해당 키트
본 발명은 화학 발광 면역 분석 기술 분야에 속하는 것이고, 특히 C-반응성 단백질의 전 범위 검출 방법 및 해당 키트에 관한 것이다.
C-반응성 단백질 (C-Reactive protein, CRP)은 1930 년에 Tillet과 Francis가 발견한 급성 반응 단백질로, Ca2+의 존재하에 폐렴 구균 C(Streptococcus pneumoniae C) 다당류와 반응하여 복합체를 형성 할 수 있다; 혈청 CRP는 IL-6, IL-2 및 TNF의 자극하에 간세포에 의해 합성되고, 염증성 국소 대식세포도 소량 생산된다. CRP는 분자량이 약 115KD이고 5 개의 동일한 비당화 폴리펩티드 서브 유닛으로 구성되며, 각 서브 유닛은 204개의 아미노산을 포함하고, 이러한 서브 유닛은 비공유 결합으로 연결되어 고리형 오량체를 형성하며, 사슬간 이황화 결합을 통해 오량체 단백질은 뛰어난 내열성 및 단백질 분해 저항성을 갖는다.
CRP는 신체에 널리 분포되어 있다. 혈액 외에도 흉막액, 복수, 심낭액 및 관절액에서 발견될 수 있다.
CRP는 중요한 급성 반응 단백질이다. CRP는 세균 감염 발생 후 6-8 시간에 증가하기 시작하여 24-48 시간에 최고점에 도달한다. 감염이 소멸되면 CRP는 급격히 감소하고 일주일 이내에 정상으로 돌아온다.
CRP의 임상 적용은 주로 박테리아 또는 바이러스 감염을 식별하기 위한 1차 적인 지표로 사용될 뿐 아니라, 질병 변화 및 수술 후 감염을 모니터링하고, 항생제의 효능을 동적으로 관찰하고, 치료를 가이드하고 모니터링하기위한 우선 지표로 사용된다. 또한, CRP는 심혈관 질환, 관상 동맥 심장 질환 및 급성 관상 동맥 증후군과 관련이 있으며, 환자의 CRP 수준은 종종 현저하게 상승하며, CRP의 상승 수준은 관상 동맥 폐쇄 정도, 관상 동맥 심장병의 말기 단계의 발생 및 예후, 울혈성 심부전과 유의하게 상관 관계가 있다. 또한, CRP는 심방 세동의 독립적인 예측 인자이며, 혈청 CRP 농도와 고혈압 사이에는 일정한 상관 관계가 있다. 고혈압 환자의 수축기 및 확장기 혈압 수준은 혈청 CRP 농도가 증가함에 따라 증가한다.
현재, 시장에 나와있는 CRP 검출 방법은 주로 과민성 CRP(hsCRP) 검출, 전통적인 CRP 검출 및 전-범위 CRP 검출이 포함된다. 과민성 CRP 검출은 주로 심혈관 질환의 발생 및 진행을 진단하고 예측하는 데 사용되는 반면, 전통적인 CRP 검출은 주로 세균 감염, 다양한 염증 과정, 조직 괴사 및 조직 손상 (예: 수술 후 손상)뿐만 아니라 회복 기간 동안 선별, 모니터링, 질병 평가 및 유효성 판단에 사용된다. 초기의 전통적인 CRP 검출 방법은 주로 면역-산란 혼탁도(immuno-scattering turbidity) 또는 면역-투과 혼탁도(immuno-transmitting turbidity) 방법을 기반으로 하며, 검출 능력이 5 mg/L 이상이지만 민감도가 낮아 심혈관 질환의 위험을 예측하기 어렵다. 후속 연구 개발은 분석 감도가 크게 향상되고 검출 하한이 0.02 mg/L에 해당하는 면역 강화 혼탁도 측정 방법을 제공한다. 이들 저농도를 위한 과민성 CRP 검출은 과민성 CRP 검출이라고 한다. 기술의 지속적인 혁신과 개선을 통해 일부 검출 방법은 화학 발광 검출 방법 및 면역 형광 검출 방법과 같은 과민성 및 전-범위 CRP의 검출 선형성을 한 번에 포함한다. 검출선 폭(line width of detection)은 0.02-100 mg/L에 도달할 수 있다.
현재, 전 범위 CRP 검출 방법은 일반적으로 경쟁 유리 항체(competing free antibodies)를 첨가하는 단계를 사용한다. 예를 들어, 미국 공개 특허 2014-0017712 A1은 코팅하는 단계 또는 표지하는 단계와 경쟁할 수 있는 유리 단일 클론 항체 또는 항체를 첨가하는 단계의 사용을 언급한다. 그러나, 이러한 방법은 시약 안정성과 같은 작업의 어려움을 증가시킨다. 중국 공개 특허 CN105988003A은 산 분해(acid destruction) 후 알칼리 중화를 이용하여 전 범위 검출의 목적을 달성하는 방법을 개시하고 있으나, 여전히 안정적이지 않고 편리하지 않다. 따라서, 안정적이고 편리한 검출 모드에서 전 범위 CRP 검출 방법을 실현하기 위해 전 범위 CRP 검출 방법을 개선할 필요성이 당 업계에 존재한다.
본 발명의 목적은 종래 기술의 결함을 극복하고 안정적이고 편리한 C-반응성 단백질의 전 범위 검출을 위한 방법 및 이에 해당하는 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 기술적 해결방법은 다음과 같다:
일 양태에서, 본 발명은 다음을 포함하는 C-반응성 단백질의 전 범위 검출용 키트를 제공한다:
제 1 항체가 코팅된 자성 입자 0.5~1 mg/mL, 0.04~0.06% (w/v) 계면활성제(상기 계면활성제는 선택적으로 Tween-20 임), 및 8~12% (w/v) 수크로스(sucrose)를 포함하는 M 시약(M reagent), 용매는 pH가 7.0 ~ 8.0 인 인산염 버퍼이다; 상기 제 1 항체의 코팅 양은 5~20 μg/mg 자성입자이다;
pH=3.0~4.0이고, 0.1 ~ 1M 농도의 시트르산 용액인 시료 처리 용액인 R1 시약;
제 2 항체가 코팅된 아크리디늄 에스테르(acridinium ester), 0.5-1% 카제인 및 0.5-1% 소 혈청 알부민을 포함하는 R2 시약, 용매는 pH가 7.0-8.0인 인산염 버퍼고, 상기 제 2 항체의 코팅 양은 0.3-0.9 μg/μg 아크리디늄 에스테르이다;
예비-여기 용액(pre-excitation solution) 및 여기 용액;
상기 제 1 항체 및 제 2 항체는 모두 C-반응성 단백질과 특이적으로 반응할 수 있는 단일 클론 항체이고, 상기 제 1 항체 및 제 2 항체는 상이한 에피토프에 대한 항체이다.
다른 양태에서, 본 발명은 다음을 포함하는 C-반응성 단백질의 전 범위 검출용 키트를 제공한다:
플레이트형 발광 플레이트(선택적으로 96 웰, 384 웰 또는 다른 플레이트형 발광 플레이트)를 포함하는 제 1 항체로 코팅된 평평한-바닥 플레이트형 화학 발광 플레이트(flat-bottomed plate-type chemiluminescence plate), 상기 제 1 항체의 코팅 양은 100~500 ng/웰이고(선택적으로 500 ng/웰), 코팅 버퍼는 pH = 7.0~8.0의 인산염 버퍼이고, 블로킹 용액은 5-8% (w/v) 블로킹 혈청 또는 블로킹 단백질(블로킹 혈청은 선택적으로 송아지 혈청임) 및 0.02% (w/v) 아지드화 나트륨을 포함하는 pH 7.2-7.4인 50mM 인산염 버퍼이다;
pH=3~4이고, 0.1~1M 농도의 시트르산 용액인 시료 처리 용액;
호스래디시 퍼옥시다제(horseradish peroxidase) 또는 알칼리성 포스파타제(alkaline phosphatase)로 표지된 제 2 항체를 포함하고, 호스래디시 퍼옥시다제 또는 알칼리성 포스파타제가 동일한 비율로 표지된 제 2 항체가 1 mg/mL의 표지 양을 갖는 표지 효소 용액;
발색 용액: 표지 효소가 호스래디시 퍼옥시다제인 경우, 발색 용액은 발색 용액 A 및 발색 용액 B를 포함하고, 발색 용액 A는 과산화수소(선택적으로, 발색 용액 A의 조성: 13.6g 아세트산 나트륨, 1.6g 시트르산, 0.3ml의 30% 과산화수소, 증류수 500ml로 조성)이고, 발색 용액 B는 o-페닐렌다이아민(o-phenylenediamine) (선택적으로, 발색 용액 B의 조성: 0.2 g 에틸렌디아민사아세트산이나트륨(disodium ethylenediaminetetraacetate), 0.95g 시트르산, 50ml 글리세롤, 9.15g 테트라메틸벤지딘(tetramethylbenzidine), 증류수 500ml로 조성)이다; 표지 효소가 알칼리성 포스파타제인 경우, 발색 용액은 시판되는 시약이다;
상기 제 1 항체 및 제 2 항체는 모두 C-반응성 단백질과 특이적으로 반응할 수 있는 단일 클론 항체이고, 상기 제 1 항체 및 제 2 항체는 상이한 에피토프에 대한 항체이다.
일부 구체예에서, 상기 시트르산 용액의 pH는 인산수소이나트륨 12수화물(disodium hydrogen phosphate dodecahydrate)에 의해 조절되고; 바람직하게는, 시트르산 용액의 pH는 3.0-3.5이고; 및 보다 바람직하게는, 시트르산 용액의 pH는 3.2, 3.3, 3.4 또는 3.5인 것이다.
다른 구체예에서, 상기 시트르산의 농도는 0.5 mol/L이다.
일부 구체예에서, 상기 예비-여기 용액은 1% (w/v) 과산화수소 용액이고, 상기 여기 용액은 1 mol/L 수산화 나트륨 용액이고, 상기 제 1 항체가 10C11이고, 상기 제 2 항체는 14D9-2인 것이다.
또 다른 구체예에서, 상기 M 시약을 제조하는 방법은 다음을 포함하는 것이다: 제 1 항체 및 자성 입자를 pH = 5.0 ~ 6.0의 2-모르폴린에탄술폰산 버퍼(2-morpholineethanesulfonic acid buffer)에 혼합하고, 25-37 ℃에서 1-3 시간 동안 코팅하고, 1~3 시간동안 반응을 중단하기 위해 pH = 8.0 ~ 9.0인 0.1% ~ 0.5% (w/v)의 소 혈청 알부민 인산염 버퍼를 첨가하고, 상기 코팅된 자성 입자를 분리하여 pH = 7.0 ~ 8.0인 인산염 버퍼에 분산시킨 후, 0.04~0.06% (w/v) 계면활성제(계면 활성제는 선택적으로 Tween-20 임; 일 구체예에서 계면 활성제는 0.05% (w/v) Tween-20 임) 및 8~12% (w/v) 수크로스(선택적으로, 10% (w/v) 수크로스)를 첨가하여 M 시약을 얻는 방법;
상기 R2 시약을 제조하는 방법은 다음을 포함하는 것이다: 제 2 항체 및 아크리디늄 에스테르를 pH=8.0~9.0의 인산염 버퍼에서 혼합하고, 25-37 ℃에서 1-3 시간 동안 코팅한 후, 1~3 시간 동안 반응을 중단하기 위해 0.1%~0.5% (w/v) 소혈청 알부민을 포함하고 pH=8.0~9.0을 가지는 트리스 버퍼를 첨가하여 스톡 용액을 얻고, 상기 스톡 용액은 pH=7.0~8.0인 인산염 버퍼로 1:100~500로 희석하여 R2 시약을 얻는 방법.
다른 구체예에서, 상기 발광 플레이트 코팅 소스를 제조하는 방법은 다음을 포함하는 것이다: 코팅된 제 1 항체는 코팅 버퍼로서 pH = 7.0-8.0을 갖는 인산염 버퍼로 100-500 ng/웰 (선택적으로, 500 ng/웰)로 희석하고, 웰당 100 μL로 발광 플레이트에 첨가하고, 37 ℃에서 2 시간 또는 4 ℃에서 밤새 배양하고, 코팅 버퍼를 쏟아 내고, 5-8% (w/v) 송아지 혈청과 0.02% (w/v) 아지드화 나트륨을 포함하는 블로킹 용액 200μL를 사용하여 37 ℃에서 2 시간 동안 배양하고, 웰에 있는 액체를 붓고, 플레이트를 건조하고 알루미늄 필름으로 진공 상태에서 밀봉한 다음 4 ℃의 건조한 장소에 보관하는 방법;
표지 효소 용액의 제조 방법은 다음을 포함하는 것이다: 1:1 비율의 제 2 항체 및 호스래디시 퍼옥시다제 또는 알칼리성 포스파타제를 pH = 9.6의 탄산염 완충액에서 혼합하고 표지하고 투석하고, 투석 버퍼를 4 시간 마다 3회 교체하고, 효소로 표지된 제 2 항체를 수집하여 스톡 용액으로 한 후, 스톡 용액을 시판되는 효소 희석제로 1:500으로 희석하여 표지 효소 용액을 얻는 방법.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 키트를 사용하여 수행되는 다음을 포함하는 C-반응성 단백질의 전 범위 검출 방법을 제공한다:
(1) 시료 20 μL를 채취하고, 시료를 처리하기 위해 R1 시약 100 μL을 첨가하는 단계;
(2) M 시약 50 μL를 첨가한 후 15분 동안 배양하는 단계;
(3) 단계 (2) 이후, 0.05 ~ 0.08% (w/v) Tween-20을 포함하는 인산염 버퍼로 세척한 후, R2 시약 50 μL을 첨가하고 10 분 동안 배양하는 단계;
(4) 단계 (3) 이후, 0.05 ~ 0.08% (w/v) Tween-20을 포함하는 인산 버퍼로 세척하고, 예비 여기를 수행하기 위해 예비 여기 용액 100 μL를 첨가하는 단계;
(5) 예비 여기 용액을 제거하고, 여기 용액 100 μL을 추가하여 여기 및 검출하는 단계.
다른 양태에서, 본 발명은 C-반응성 단백질의 전 범위 검출을 위한 키트 제조 시 시료 처리 용액으로써 시트르산 용액의 용도를 제공한다.
일부 구체예에서, 상기 시트르산 용액은 pH = 3 ~ 4이고, 0.1 ~ 1M의 농도를 갖는 시트르산 용액이고; 바람직하게는 시트르산 용액의 pH는 인산수소이나트륨 12수화물에 의해 조절되고, 보다 바람직하게는 시트르산 용액의 pH는 3.0-3.5이고, 보다 바람직하게는 시트르산 용액의 pH는 3.2, 3.3, 3.4 또는 3.5인 것이다.
일 양태에서, 본 발명은 하기 성분을 포함하는 C-반응성 단백질의 전 범위 검출용 키트(직접 화학 발광, 즉 자기 입자-화학 발광법)를 제공한다.
제 1 항체가 코팅된 자성 입자 0.5~1 mg/mL, 0.04~0.06% (w/v) 계면활성제(상기 계면활성제는 선택적으로 Tween-20 임), 및 8~12% (w/v) 수크로스(sucrose)를 포함하는 M 시약(M reagent), 용매는 pH가 7.0 ~ 8.0 인 인산염 버퍼이다; 상기 제 1 항체의 코팅 양은 5~20 μg/mg 자성입자이다;
pH=3.0~4.0이고, 0.1 ~ 1M 농도의 시트르산 용액인 시료 처리 용액인 R1 시약;
제 2 항체가 코팅된 아크리디늄 에스테르, 0.5-1% 카제인 및 0.5-1% 소 혈청 알부민을 포함하는 R2 시약, 용매는 pH가 7.0-8.0인 인산염 버퍼고, 상기 제 2 항체의 코팅 양은 0.3-0.9 μg/μg 아크리디늄 에스테르이다;
예비-여기 용액 및 여기 용액;
상기 제 1 항체 및 제 2 항체는 모두 C-반응성 단백질과 특이적으로 반응할 수 있는 단일 클론 항체이고, 상기 제 1 항체 및 제 2 항체는 상이한 에피토프에 대한 항체이다.
아크리딘 화합물의 발광 메커니즘은 다음과 같다: 알칼리 과산화수소 용액에서, 아크리딘 화합물의 분자는 과산화수소 이온에 의해 불안정한 퍼옥시 화합물을 형성하며, 이는 CO2로 분해되고 전기적으로 여기된 N-메틸-아크리돈이 바닥 상태로 돌아오면 최대 방출 파장이 430 nm인 광자를 방출한다. Triton X-100, Tween-20, CTAC(헥사데실트리메틸암모늄 클로라이드, hexadecyltrimethylammonium chloride, 양이온성 계면 활성제)와 같은 계면 활성제는 발광을 향상시킬 수 있다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 상기 R1 시약은 0.5M 시트르산 용액, pH = 3 ~ 3.5이다.
더 바람직하게는, 상기 R1 시약은 인산수소이나트륨 12수화물로 조절된다.
일 구체예에서, 상기 시트르산 용액의 pH는 인산수소이나트륨 12수화물로 조절된다. 바람직하게는, 시트르산 용액의 pH는 3.0-3.5 이고, 보다 바람직하게는, 시트르산 용액의 pH는 3.2, 3.3, 3.4 또는 3.5이다.
또 다른 구체예에서, 상기 시트르산의 농도는 0.5 mol/L이다.
더 바람직하게는, 상기 M 시약은 0.05% Tween-20 및 10% 수크로스를 포함한다.
더 바람직하게는, 상기 M 시약을 제조하는 방법은 다음을 포함하는 것이다: 제 1 항체 및 자성 입자를 pH = 5.0 ~ 6.0의 2-모르폴린에탄술폰산 버퍼에 혼합하고, 25-37 ℃에서 1-3 시간 동안 코팅하고, 1~3 시간동안 코팅을 중단하기 위해 pH = 8.0 ~ 9.0인 0.1% ~ 0.5% (w/v)의 소 혈청 알부민 인산염 버퍼를 첨가하고, 상기 코팅된 자성 입자를 분리하여 pH = 7.0 ~ 8.0인 인산염 버퍼에 분산시킨 후, 계면활성제 및 수크로스를 첨가하여 M 시약을 얻는 방법.
더 바람직하게는, 상기 R2 시약을 제조하는 방법은 다음을 포함하는 것이다: 제 2 항체 및 아크리디늄 에스테르를 pH=8.0~9.0의 인산염 버퍼에서 혼합하고, 25-37 ℃에서 1-3 시간 동안 코팅한 후, 1~3 시간동안 코팅을 중단하기 위해 0.1%~0.5% (w/v) 소혈청 알부민을 포함하고 pH=8.0~9.0을 가지는 트리스 버퍼를 첨가하여 스톡 용액을 얻고, 상기 스톡 용액은 pH=7.0~8.0인 인산염 버퍼로 1:100~500로 희석하여 R2 시약을 얻는 방법.
더 바람직하게는, 상기 예비-여기 용액은 1% (w/v) 과산화수소 용액인 것이다.
또한, 여기 용액은 1 mol/L 수산화 나트륨 용액이다.
다른 양태에서, 본 발명은 하기 성분을 포함하는 C-반응성 단백질의 전 범위 검출용 키트(효소 화학 발광, 즉 호스래디시 퍼옥시다제 또는 알칼리성 포스파타제 플레이트형 화학 발광)를 제공한다:
플레이트형 발광 플레이트(선택적으로 96 웰, 384 웰 또는 다른 플레이트형 발광 플레이트)를 포함하는 제 1 항체로 코팅된 평평한-바닥 화학 발광 플레이트, 상기 제 1 항체의 코팅 양은 100~500 ng/웰이고(선택적으로 500 ng/웰), 코팅 버퍼는 pH = 7.0 ~ 8.0의 인산염 버퍼이고, 블로킹 용액은 5-8% (w/v) 블로킹 혈청 또는 블로킹 단백질(블로킹 혈청은 선택적으로 송아지 혈청임) 및 0.02% (w/v) 아지드화 나트륨을 포함하는 pH 7.2-7.4인 50mM 인산염 버퍼이다;
pH=3~4이고, 0.1 ~ 1M 농도의 시트르산 용액인 시료 처리 용액;
호스래디시 퍼옥시다제(horseradish peroxidase) 또는 알칼리성 포스파타제(alkaline phosphatase)로 표지된 제 2 항체를 포함하고, 호스래디시 퍼옥시다제 또는 알칼리성 포스파타제가 동일한 비율로 표지된 제 2 항체가 1 mg/mL의 표지 양을 갖는 표지 효소 용액;
발색 용액: 표지 효소가 호스래디시 퍼옥시다제인 경우, 발색 용액은 발색 용액 A 및 발색 용액 B를 포함하고, 발색 용액 A는 과산화수소(선택적으로, 발색 용액 A의 조성: 13.6g 아세트산 나트륨, 1.6g 시트르산, 0.3ml의 30% 과산화수소, 증류수 500ml로 조성)이고, 발색 용액 B는 o-페닐렌다이아민 (발색 용액 B의 조성: 0.2 g 에틸렌디아민사아세트산이나트륨, 0.95g 시트르산, 50ml 글리세롤, 9.15g 테트라메틸벤지딘, 증류수 500ml로 조성)이다; 표지 효소가 알칼리성 포스파타제인 경우, 발색 용액은 시판되는 시약(제품 번호: 180309-01, 구입처: Xiamen Boson Biotechnology Co., Ltd)이다.
검출: 자동 화학 발광 분석기(구입처: Yantai Addcare Biotechnology Co., Ltd.)는 발광 값을 읽는데 사용된다.
상기 언급된 제 1 항체 및 제 2 항체는 모두 C-반응성 단백질과 특이적으로 반응할 수 있는 단일 클론 항체이다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 상기 시료 처리 용액은 pH 3 내지 3.5의 0.5M 시트르산 용액이다.
더 바람직하게는, 상기 시료 처리 용액의 pH는 인산수소이나트륨 12수화물에 의해 조절되는 것이다.
일 구체예에서, 상기 시트르산 용액의 pH는 인산수소이나트륨 12수화물에 의해 조절되는 것이다. 바람직하게는, 시트르산 용액의 pH는 3.0-3.5이고, 보다 바람직하게는, 시트르산 용액의 pH는 3.2, 3.3, 3.4 또는 3.5이다.
또 다른 구체예에서, 상기 시트르산의 농도는 0.5 mol/L이다.
더 바람직하게는, 상기 제 1 항체로 코팅되어 있는 평평한-바닥 화학 발광 플레이트는 5-8% 송아지 혈청 및 0.02% 아지드화 나트륨을 포함한다.
더 바람직하게는, 상기 제 1 항체로 코팅된 평평한-바닥 화학 발광 플레이트를 제조하는 방법은 다음을 포함한다: 코팅된 제 1 항체는 코팅 버퍼로서 pH = 7.0-8.0을 갖는 인산염 버퍼 5 μg/mL, 즉, 500 ng/웰로 희석하고, 웰당 100 μL로 발광 플레이트에 첨가하고, 37 ℃에서 2 시간 또는 4 ℃에서 밤새 배양하고, 코팅 버퍼를 쏟아 내고, 블로킹 용액(5-8% (w/v) 송아지 혈청과 0.02% (w/v) 아지드화 나트륨) 200μL를 사용하여 37 ℃에서 2 시간 동안 배양하고, 웰에 있는 액체를 붓고, 플레이트를 건조하고 알루미늄 필름으로 진공 상태에서 밀봉한 다음 4 ℃의 건조한 장소에 보관.
더 바람직하게는, 상기 표지 효소 용액의 제조 방법은 다음을 포함한다: 1:1 비율의 제 2 항체 및 호스래디시 퍼옥시다제 또는 알칼리성 포스파타제를 pH = 9.6의 탄산염 완충액에서 혼합하고 표지하고 투석하고, 투석 버퍼를 4 시간 마다 3회 교체하고, 효소로 표지된 제 2 항체를 수집하여 스톡 용액으로 한 후, 표지 효소 용액을 얻기 위해 스톡 용액을 시판되는 효소 희석제로 1:500으로 희석.
더 바람직하게는, 상기 표지 효소가 호스래디시 퍼옥시다제인 경우, 발색 용액 A는 과산화수소이고, 발색 용액 B는 o-페닐렌다이아민이고; 표지 효소가 알칼리성 포스파타제인 경우 발색 용액은 시판되는 시약이다.
또한, 상기 내용은 자동 화학 발광 분석기에 의해 직접결정된다.
본 발명의 우수한 효과는 시료 처리 용액(pH=3~4이고, 0.1~1M시트르산 용액)을 본 발명의 키트의 반응 과정에서 한 단계로 첨가한 후에, 본 발명의 키트의 검출 범위가 0.02 mg/L 내지 100 mg/L인 것이며, 상기 키트는 C-반응성 단백질의 전 범위 검출의 요구를 충족시킬 수 있는 키트이다.
도 1은 페어링 검출(pairing detection)을 위한 교정기(calibrator)의 곡선인, 페어링된 용량-반응 곡선(paired dose-response curve)을 나타낸다. 왼쪽 이미지는 10C11-7D9에 대한 페어링된 용량-반응 곡선을 나타내고 오른쪽 이미지는 10C11-14D9-2에 대한 페어링된 용량-반응 곡선을 나타낸다.
도 2는 시료와 바탕값(background value) 간의 상관관계를 평가하는 페어링된 검출 결과의 상관관계 분석을 나타낸다. 왼쪽 이미지는 10C11-7D9에 대한 페어링된 검출 결과의 상관관계 분석을 나타내고, 오른쪽 이미지는 10C11-14D9-2에 대한 페어링된 검출 결과의 상관관계 분석을 나타낸다.
본 발명의 과제의 해결수단은 특정 실시예를 통해 아래에서 예시되고 설명된다.
시약은 분석 등급 이였으며, 달리 명시되지 않는 한 Xiamen Xilong Chemical Co., Ltd에서 구입하였다.
일 구체예에서, 본 발명의 C-반응성 단백질의 전 범위 검출용 키트(직접 화학 발광, 즉, 자성 입자 화학 발광 방법)는 다음과 같은 성분을 포함한다:
제 1 항체가 코팅된 자성 입자 0.8mg/mL, 0.05% Tween-20 및 10% 수크로스를 포함하는 M 시약, 용매는 pH=7.5인 인산염 버퍼이며, 상기 제 1 항체의 코팅 양은 12 μg/μg 자성 입자 이고, 상기 자성 입자는 Thermo Fisher Scientific에서 구입하였으며, 자성입자는 Fe3O4 코어가 있는 나노 크기의 초상자성 입자(superparamagnetic particles)이다. 상기 M 시약을 제조하는 방법은 다음을 포함한다: 제 1 항체 및 자성 입자를 pH=5.5의 2-모르폴린에탄술폰산 버퍼에 혼합하고, 32 ℃에서 1~3 시간 동안 코팅하고, 2 시간동안 반응을 중단하기 위해 pH=8.5이고 0.3% 소 혈청 알부민을 포함하는 인산염 버퍼 용액을 첨가하고, 상기 코팅된 자성 입자를 분리하여 pH=7.5인 인산염 버퍼에 분산 시킨 후, Tween-20 및 수크로스를 첨가하여 M 시약을 얻는다;
R1 시약, 0.5M 농도의 pH=3.2인 시트르산 용액, 인산수소이나트륨 12수화물로 조절된다;
제 2 항체가 코팅된 아크리디늄 에스테르, 0.8% 카제인 및 0.8% 소 혈청 알부민을 포함하는 R2 시약, 용매는 pH=7.5인 인산염 버퍼이고, 상기 제 2 항체의 코팅 양은 12 μg/μg 아크리디늄 에스테르이다. 상기 R2 시약을 제조하는 방법은 다음을 포함한다: 제 2 항체 및 아크리디늄 에스테르를 pH=8.5인 인산염 버퍼에서 혼합하고, 32 ℃에서 1~3 시간 동안 코팅한 후, 2시간 동안 코팅을 중단하기 위해 0.3% 소 혈청 알부민을 포함하고 pH=8.5을 갖는 트리스 버퍼를 첨가하여 스톡 용액을 얻고; 상기 스톡 용액은 pH=7.5인 인산염 버퍼로 1:300으로 희석하여 R2 시약을 얻는다;
예비-여기 용액, 1% (w/v) 과산화수소 용액;
여기 용액, 1 mol/L 수산화 나트륨 용액;
상술한 제 1 항체 및 제 2 항체는 C-반응성 단백질과 특이적으로 반응할 수 있는 단일 클론 항체이다. 제 1 항체는 10C11이고 제 2 항체는 14D9-2이며, 양 항체 모두 Xiamen Innovax Biotech CO., Ltd.에서 구입하였다.
상술한 C-반응성 단백질의 전 범위 검출을 위한 키트를 사용한 검출 방법은 다음 단계를 포함한다:
(1) 시료 20 μL를 채취하고(시료는 항원 표준 곡선을 위한 혈청 또는 표준 C-반응성 단백질이다), 시료를 처리하기 위해 R1 시약 100 μL을 첨가하는 단계;
(2) M 시약 50 μL를 첨가한 후 15분 동안 배양하는 단계;
(3) 단계 (2) 이후, 0.05% Tween-20을 포함하는 인산염 버퍼로 세척한 후, R2 시약 50 μL을 첨가하고 10 분 동안 배양하는 단계;
(4) 단계 (3) 이후, 0.05 ~ 0.08% (w/v) Tween-20을 포함하는 인산 버퍼로 세척하고, 예비 여기를 수행하기 위해 예비 여기 용액 100 μL를 첨가하는 단계;
(5) 예비 여기 용액을 제거하고, 여기 용액 100 μL을 추가하여 여기 및 검출하는 단계.
다른 구체예에서, 본 발명의 C-반응성 단백질의 전 범위 검출용 키트(효소 화학 발광, 즉, 호스래디시 퍼옥시다제 플레이트형 화학 발광)는 다음 성분을 포함한다:
96-웰 발광 플레이트를 포함하는 발광 플레이트 코팅 소스, 제 1 항체의 코팅양은 500 ng/웰이고, 코팅 버퍼는 pH=7.5인 인산염 버퍼이고, 블로킹 용액은 6% 송아지 혈청 및 0.02% 아지드화 나트륨을 포함하는 pH 7.3인 50 mM 인산염 버퍼이다. 상기 발광 플레이트 코팅 소스의 제조 방법은 다음을 포함한다: 코팅된 제 1 항체는 코팅 버퍼로서 pH = 7.5를 갖는 인산염 버퍼로 5 μg/mL(즉, 500 ng/웰)로 희석하고, 웰당 100 μL로 발광 플레이트에 첨가하고, 37 ℃에서 2 시간 또는 4 ℃에서 밤새 배양하고, 코팅 버퍼를 쏟아 내고, 6% 송아지 혈청과 0.02% 아지드화 나트륨을 포함하는 블로킹 용액 200μL를 사용하여 37 ℃에서 2 시간 동안 배양하고, 웰에 있는 액체를 붓고, 플레이트를 건조하고 알루미늄 필름으로 진공 상태에서 밀봉한 다음 4 ℃의 건조한 장소에 보관하였다;
인산수소이나트륨 12수화물로 조절된 0.5M 농도, pH = 3.2의 시트르산 용액인, 시료 처리 용액;
호스래디시 퍼옥시다제 또는 알칼리성 포스파타제로 표지된 제 2 항체를 포함하고, 호스래디시 퍼옥시다제 또는 알칼리성 포스파타제가 동일한 비율로 표지된 제 2 항체가 1 mg/mL의 표지 양을 갖는 표지 효소 용액. 표지 효소 용액의 제조 방법은 다음을 포함한다: 1:1 비율의 제 2 항체 및 호스래디시 퍼옥시다제 또는 알칼리성 포스파타제를 pH = 9.6의 탄산염 완충액에서 혼합하고 표지하고 투석하고, 투석 버퍼를 4 시간 마다 3회 교체하고, 효소로 표지된 제 2 항체를 수집하여 스톡 용액을 획득한 후, 스톡 용액을 시판되는 효소 희석제(카탈로그 번호. ED-11, Beijing Wantai Biopharmaceutical Co., Ltd.에서 구입)로 1:500으로 희석하여 표지 효소 용액을 얻는다;
발색 용액: 표지 효소가 호스래디시 퍼옥시다제인 경우, 발색 용액 A는 과산화수소이고, 발색 용액 B는 o-페닐렌다이아민이고; 표지 효소가 알칼리성 포스파타제인 경우, 발색 용액은 구입한 시약(구입처: Xiamen Boson Biotechnology Co., Ltd.)이다.
검출: 발광 값을 판독하기 위한 자동 화학 분석기(구입처: Yantai Addcare Biotechnology Co., Ltd.)를 사용하였다.
상술한 제 1 항체 및 제 2 항체는 C-반응성 단백질과 특이적으로 반응할 수 있는 단일 클론 항체이다. 제 1 항체는 10C11이고, 제 2 항체는 14D9-2이며, 양 항체는 모두 Xiamen Innovax Biotech CO., Ltd.에서 구입하였다.
상술한 C-반응성 단백질의 전 범위 검출을 위한 키트를 사용한 검출 방법은 다음의 단계를 포함한다:
(1) 시료 20 μL를 채취하고, 시료를 처리하기 위해 시료 처리 용액 100 μL을 첨가하는 단계;
(2) 그 후 발광 플레이트 코팅 소스에 첨가하고 40 분 동안 37 ℃에서 함께 배양하는 단계;
(3) 단계 (2) 이후, 0.05% Tween-20을 포함하는 인산염 버퍼로 5 회 세척하고, 발광 플레이트를 건조될 때까지 뒤집은 후, 표지 효소 용액 100 μL를 첨가하여 37 ℃에서 40 분 동안 배양하는 단계;
(4) 단계 (3) 이후, 0.05% Tween-20을 포함하는 인산염 버퍼로 5 회 세척하고, 발광 플레이트를 건조 될 때까지 뒤집었다; 표지 효소가 호스래디시 퍼옥시다제인 경우, 50 μL의 발색 용액 A 와 50 μL의 발색 용액 B를 가하여 상온에서 5 분간 반응시켰다; 표지 효소가 알칼리성 포스파타제이면 100 μL의 발색 용액 (구입처: Xiamen Boson Biotechnology Co., Ltd.)을 첨가하고 실온에서 5 분 동안 반응시켰다; 마지막으로 자동 화학 발광 분석기를 사용하여 검출을 수행하고 발광 값을 읽었다.
실시예
실시예 1
pH 값이 상이한 0.1M 시트르산 및 0.1M 글리신을 각각 처리 용액으로 선택하고, 효소 면역 분석 시스템(pH 범위 2-6)에 첨가하여 점진적으로 희석된 C-반응성 단백질 항원을 평가하였다. 상대적인 OD 값은 하기 표 1 및 2에 나타내었다.
pH 값이 상이한 0.1M 시트르산 처리 용액이 C-반응성 단백질 검출에 미치는 영향
농도 (mg/L) pH=2 pH=3 pH=4 pH=5 pH=6
100.00 0.4090 1.4410 3.7590 0.7350 1.0130
25.00 0.5760 1.3740 3.7620 1.0160 1.2900
6.25 0.1510 0.8930 3.7590 1.3460 1.5250
1.56 0.0430 0.3720 3.7760 2.4110 2.8010
0.39 0.0120 0.0960 3.0050 1.5960 3.2060
0.10 0.0060 0.0240 0.9480 0.8620 2.2130
0.02 0.0100 0.0110 0.2560 0.0640 0.2760
pH 값이 상이한 0.1M 글리신 처리 용액이 C-반응성 단백질 검출에 미치는 영향
농도 (mg/L) pH=2 pH=3 pH=4 pH=5 pH=6
100 3.7910 3.7500 2.6820 3.2820 1.7660
25 2.6980 3.5760 2.3680 2.9670 2.1690
6.25 0.5270 3.0060 2.5510 3.2550 2.3350
1.56 0.1100 0.6840 2.6910 3.3620 2.8260
0.39 0.0330 0.1780 1.1610 1.7100 1.8980
0.1 0.0190 0.0440 0.5440 0.7650 0.6870
0.02 0.0140 0.0150 0.1090 0.1850 0.0880
표 1 및 표 2는 처리 용액이 pH 값이 상이한 0.1M 시트르산 (인산수소이나트륨 12수화물로 pH가 조절 됨)인 경우 및 처리 용액이 pH 값이 상이한 0.1M 글리신인 경우 효소 면역 분석 시스템에서 C-반응성 단백질의 전 범위 검출에 대한 추적 항원의 검출 결과를 나타낸다. 상기 결과는 pH 3-4 사이의 검출에서는 명백한 경향성이 있지만, 다른 pH 범위는 이상적이지 않음을 나타내었다. 이는 처리 용액의 처리 pH로 pH 3 ~4 범위를 선택했을 때 시료 검출이 다른 pH 범위에 비해 높음에서 낮음으로의 경향을 보인 표 1 및 표 2의 결과로 나타났다. 그러나, 효소 면역 분석 시스템의 선폭은 전 범위 검출에 충분하지 않아, 화학 발광 플랫폼 검출을 위한 최적 pH 범위를 3~4인 것으로 판단하고 후속 실험에서 시트르산을 사용하였다.
실시예 2
실시예 1에 기초하여, 시트르산 농도(0.1M, 0.5M, 1M의 시트르산 농도) 및 pH 범위 (pH3 및 pH3.5, pH4)의 개선 및 조절을 수행하였으며, 효소 면역 분석 시스템의 선형 폭은 상대적으로 좁았으며, 선호되는 용액은 화학 발광 플랫폼에서 조절되었다. 상이한 몰 농도 및 pH 3-4인 시트르산 용액을 처리 용액으로 선택하여 화학 발광 검출 시스템 (즉.,자기 입자 화학 발광 플랫폼) 에 첨가하여 점진적으로 희석된 C-반응성 단백질 항원을 평가하였다. 상이한 pH 및 상이한 농도의 시트르산을 사용함으로써, 점진적으로 희석된 C-반응성 단백질 항원을 처리하고, 검출 결과를 얻기 위해 자성 입자 화학 발광 플랫폼 또는 효소적 호스래디시 퍼옥시다제 화학 발광 플랫폼을 사용하였으며, 얻은 결과를 표준 곡선으로 만들었다. 그 후, 수집된 18개의 임상적 시료 (Xiamen Zhongshan Affiliated Hospital 및 Xijing Hospital에서 수집) 의 상대적인 발광 강도를 아래 표 3과 표 4에 별도로 나타내었다.
상이한 pH 및 상이한 농도의 시트르산 처리 용액이 C-반응성 단백질 검출에 미치는 영향의 상관 관계(자성 입자 화학 발광 시스템)
시트르산 농도(mol/L) 0.1 0.5 1
pH 값 3 3.5 4 3 3.5 4 3 3.5 4
Zhongshan Hospital의 혈청 일련 번호 바탕값(mg/L) 검출 값(mg/L)
1257 46.70 58.17 50.68 19.67 38.70 49.77 96.64 65.72 73.63 163.59
1203 54.30 67.65 62.15 25.76 37.36 57.59 98.96 95.94 44.42 319.43
1444 170.00 106.50 120.46 37.40 87.46 137.30 189.87 273.05 209.85 79.81
1315 183.00 144.27 146.56 44.94 140.15 181.43 257.77 373.53 470.72 342.03
1432 136.00 78.22 89.66 22.38 76.33 102.71 132.89 182.84 200.50 88.86
1333 110.00 99.11 100.68 45.29 62.90 109.99 186.08 165.51 65.75 186.25
1478 70.30 46.69 56.99 10.28 41.24 47.21 83.52 65.98 132.74 152.31
1233 62.30 53.84 60.32 16.85 44.19 54.97 102.16 88.10 104.26 154.66
1207 84.80 97.89 75.66 17.15 79.43 69.73 113.89 107.25 120.61 91.72
1210 40.10 43.45 43.21 10.23 29.06 36.09 71.60 46.09 63.54 67.85
1231 36.90 60.52 59.45 45.53 37.01 49.67 99.61 77.69 17.84 193.95
1338 33.70 39.83 39.97 6.90 30.62 35.97 69.69 47.56 5.99 124.40
1223 24.20 30.60 32.36 3.34 23.25 31.46 82.90 40.27 6.61 72.51
1230 29.00 28.35 32.70 12.25 22.82 26.86 60.01 38.28 27.95 106.24
1349 16.80 19.46 24.65 8.17 15.58 19.75 56.57 29.44 12.92 88.97
1317 12.10 16.12 20.92 12.24 12.03 16.52 37.35 20.29 16.66 40.57
1316 5.40 9.94 6.74 12.49 6.26 7.82 19.74 18.29 23.27 2.77
1324 9.10 10.52 11.43 17.12 8.79 7.84 24.26 13.17 19.98 39.97
Zhongshan Hospital의 혈청 일련 번호 바탕값 (Log10) 검출 값(Log10)
1257 1.67 1.76 1.70 1.29 1.59 1.70 1.99 1.82 1.87 2.21
1203 1.73 1.83 1.79 1.41 1.57 1.76 2.00 1.98 1.65 2.50
1444 2.23 2.03 2.08 1.57 1.94 2.14 2.28 2.44 2.32 1.90
1315 2.26 2.16 2.17 1.65 2.15 2.26 2.41 2.57 2.67 2.53
1432 2.13 1.89 1.95 1.35 1.88 2.01 2.12 2.26 2.30 1.95
1333 2.04 2.00 2.00 1.66 1.80 2.04 2.27 2.22 1.82 2.27
1478 1.85 1.67 1.76 1.01 1.62 1.67 1.92 1.82 2.12 2.18
1233 1.79 1.73 1.78 1.23 1.65 1.74 2.01 1.94 2.02 2.19
1207 1.93 1.99 1.88 1.23 1.90 1.84 2.06 2.03 2.08 1.96
1210 1.60 1.64 1.64 1.01 1.46 1.56 1.85 1.66 1.80 1.83
1231 1.57 1.78 1.77 1.66 1.57 1.70 2.00 1.89 1.25 2.29
1338 1.53 1.60 1.60 0.84 1.49 1.56 1.84 1.68 0.78 2.09
1223 1.38 1.49 1.51 0.52 1.37 1.50 1.92 1.61 0.82 1.86
1230 1.46 1.45 1.51 1.09 1.36 1.43 1.78 1.58 1.45 2.03
1349 1.23 1.29 1.39 0.91 1.19 1.30 1.75 1.47 1.11 1.95
1317 1.08 1.21 1.32 1.09 1.08 1.22 1.57 1.31 1.22 1.61
1316 0.73 1.00 0.83 1.10 0.80 0.89 1.30 1.26 1.37 0.44
1324 0.96 1.02 1.06 1.23 0.94 0.89 1.38 1.12 1.30 1.60
r 2 0.9304 0.9586 0.2907 0.9692 0.9615 0.9179 0.9251 0.5942 0.4972
상이한 pH 및 상이한 농도의 시트르산 처리 용액이 C-반응성 단백질 검출에 미치는 영향의 상관 관계(효소적 호스래디시 퍼옥시다제 화학발광 시스템)
시트르산 농도(mol/L) 0.1 0.5 1
pH 값 3 3.5 4 3 3.5 4 3 3.5 4
Zhongshan Hospital의 혈청 일련 번호 바탕값(mg/L) 검출 값(mg/L)
1242 20 27.77 139.53 37.45 37.13 17.22 140.83 82.22 92.16 9.14
1351 5 34.19 163.47 20.06 13.03 3.15 53.52 25.86 34.85 5.10
1402 3.8 15.56 89.20 21.63 9.55 3.51 37.49 24.61 31.38 1.56
1417 25.8 59.31 289.25 30.77 54.35 15.76 221.95 73.38 110.76 7.75
1408 33.2 59.31 348.65 43.69 66.34 24.84 136.92 133.23 151.15 10.03
1341 38.1 76.55 501.37 37.72 71.94 34.57 68.66 159.38 352.94 10.32
1255 45.7 64.17 234.53 42.15 83.93 39.37 137.79 195.34 231.96 11.19
1247 55.6 51.16 142.44 23.93 91.89 27.36 121.47 97.02 82.81 11.30
1276 62.3 82.81 302.86 22.94 94.97 55.71 92.95 206.66 386.77 12.87
1365 65.4 64.67 406.95 34.06 113.07 47.36 129.91 303.71 240.53 12.23
1404 140 104.87 405.49 87.16 209.22 73.61 132.60 239.11 264.62 15.46
1246 13.2 27.49 125.45 27.00 19.99 5.67 125.97 54.08 60.48 9.04
1239 14.6 42.23 125.20 21.44 20.84 8.52 130.21 52.57 123.92 6.15
1382 133 85.53 592.49 70.10 155.30 90.13 100.33 424.02 506.85 19.91
1393 136 83.84 444.01 32.82 211.47 69.50 92.66 163.08 187.86 18.68
1484 70.3 59.54 970.42 102.66 105.58 43.79 85.37 421.22 383.87 21.00
1277 18.4 32.57 91.97 56.87 29.44 12.78 168.98 110.16 115.56 8.94
1493 67.7 72.98 336.93 307.01 104.80 59.61 74.96 393.77 340.69 17.50
Zhongshan Hospital의 혈청 일련 번호 바탕값(Log10) 검출값(Log10)
1242 1.30 1.44 2.14 1.57 1.57 1.24 2.15 1.91 1.96 0.96
1351 0.70 1.53 2.21 1.30 1.11 0.50 1.73 1.41 1.54 0.71
1402 0.58 1.19 1.95 1.34 0.98 0.54 1.57 1.39 1.50 0.19
1417 1.41 1.77 2.46 1.49 1.74 1.20 2.35 1.87 2.04 0.89
1408 1.52 1.77 2.54 1.64 1.82 1.40 2.14 2.12 2.18 1.00
1341 1.58 1.88 2.70 1.58 1.86 1.54 1.84 2.20 2.55 1.01
1255 1.66 1.81 2.37 1.62 1.92 1.60 2.14 2.29 2.37 1.05
1247 1.75 1.71 2.15 1.38 1.96 1.44 2.08 1.99 1.92 1.05
1276 1.79 1.92 2.48 1.36 1.98 1.75 1.97 2.32 2.59 1.11
1365 1.82 1.81 2.61 1.53 2.05 1.68 2.11 2.48 2.38 1.09
1404 2.15 2.02 2.61 1.94 2.32 1.87 2.12 2.38 2.42 1.19
1246 1.12 1.44 2.10 1.43 1.30 0.75 2.10 1.73 1.78 0.96
1239 1.16 1.63 2.10 1.33 1.32 0.93 2.11 1.72 2.09 0.79
1382 2.12 1.93 2.77 1.85 2.19 1.95 2.00 2.63 2.70 1.30
1393 2.13 1.92 2.65 1.52 2.33 1.84 1.97 2.21 2.27 1.27
1484 1.85 1.77 2.99 2.01 2.02 1.64 1.93 2.62 2.58 1.32
1277 1.26 1.51 1.96 1.75 1.47 1.11 2.23 2.04 2.06 0.95
1493 1.83 1.86 2.53 2.49 2.02 1.78 1.87 2.60 2.53 1.24
r 2 0.7954 0.4898 0.2703 0.9759 0.9495 0.1002 0.8034 0.7264 0.8121
표 3 및 4는 3, 3.5, 4의 세 가지 pH 범위를 고정하고 상이한 시트르산 농도 (0.1M, 0.5M 및 1M)를 사용하는 경우 전 범위 C-반응성 단백질의 추적 항원을 검출하고 18개의 시료를 평가하기 위해 발광 플랫폼을 사용하는 것을 나타낸다. 상기 결과는 농도가 0.5M이고 pH가 3-3.5인 시트르산이 더 나은 결과를 나타냄을 보여준다. 상기 농도 및 pH 하에서 혈청 사이의 상관관계는 pH 3 내지 3.5 사이에서 더 좋았으며; 0.5M 시트르산이 선호되고, 0.5M 시트르산의 경우 pH 3 내지 3.5 사이에서 상대적으로 변동이 작으므로, 상대적으로 안정되는 것으로 간주됨을 표 3에서 볼 수 있었다.
실시예 3
pH 농도 (pH 2.8-4)를 더욱 최적화하고 정제하기 위해 0.5M 시트르산을 선택하였다. pH가 상이한 0.5M 시트르산을 처리 용액으로 사용하여 점진적으로 희석된 C-반응성 단백질 항원을 처리하고, 검출 결과를 얻기 위해 자성 입자 화학 발광 플랫폼 또는 효소적 호스래디시 퍼옥시다제 화학 발광 플랫폼을 사용하였으며; 그 후 상기 결과를 표준 곡선으로 만들었다. 수집된 18 개의 임상 시료를 검출하고 검출 결과를 표 5 및 표 6에 나타냈다.
pH가 상이한 0.5M 시트르산 처리 용액이 C-반응성 단백질 검출에 미치는 영향의 상관 관계 (자성 입자 화학 발광 시스템)
시트르산 농도(mol/L) 0.5
pH 값 2.8 3.0 3.2 3.4 3.5 3.6 3.8 4
Zhongshan Hospital의 혈청 일련 번호 바탕값(mg/L) 검출값(mg/L)
1257 46.70 41.51 38.70 34.66 34.23 49.77 39.04 39.02 96.64
1203 54.30 52.57 37.36 42.20 37.53 57.59 51.86 47.60 98.96
1444 170.00 98.97 87.46 86.84 72.81 137.30 78.51 64.71 189.87
1315 183.00 180.00 140.15 136.04 110.94 181.43 113.01 81.42 257.77
1432 136.00 75.33 76.33 72.26 66.97 102.71 74.05 58.84 132.89
1333 110.00 78.86 62.90 63.58 58.17 109.99 69.18 62.38 186.08
1478 70.30 51.60 41.24 39.64 39.12 47.21 40.94 44.16 83.52
1233 62.30 44.84 44.19 41.87 43.44 54.97 45.01 39.10 102.16
1207 84.80 101.81 79.43 71.45 55.36 69.73 54.71 46.83 113.89
1210 40.10 29.66 29.06 27.17 26.77 36.09 37.45 36.37 71.60
1231 36.90 45.18 37.01 38.04 33.17 49.67 39.54 42.19 99.61
1338 33.70 32.44 30.62 27.45 26.63 35.97 38.25 34.35 69.69
1223 24.20 23.28 23.25 21.48 22.13 31.46 20.15 37.00 82.90
1230 29.00 25.81 22.82 20.91 26.46 26.86 29.64 34.47 60.01
1349 16.80 15.64 15.58 16.75 17.43 19.75 23.79 30.96 56.57
1317 12.10 10.63 12.03 13.21 15.00 16.52 21.95 23.37 37.35
1316 5.40 5.91 6.26 7.11 8.13 7.82 11.94 13.43 19.74
1324 9.10 8.11 8.79 9.96 10.39 7.84 14.53 17.05 24.26
Zhongshan Hospital의 혈청 일련 번호 바탕값 (Log10) 검출값(Log10)
1257 1.67 1.62 1.59 1.54 1.53 1.70 1.59 1.59 1.99
1203 1.73 1.72 1.57 1.63 1.57 1.76 1.71 1.68 2.00
1444 2.23 2.00 1.94 1.94 1.86 2.14 1.89 1.81 2.28
1315 2.26 2.26 2.15 2.13 2.05 2.26 2.05 1.91 2.41
1432 2.13 1.88 1.88 1.86 1.83 2.01 1.87 1.77 2.12
1333 2.04 1.90 1.80 1.80 1.76 2.04 1.84 1.80 2.27
1478 1.85 1.71 1.62 1.60 1.59 1.67 1.61 1.65 1.92
1233 1.79 1.65 1.65 1.62 1.64 1.74 1.65 1.59 2.01
1207 1.93 2.01 1.90 1.85 1.74 1.84 1.74 1.67 2.06
1210 1.60 1.47 1.46 1.43 1.43 1.56 1.57 1.56 1.85
1231 1.57 1.65 1.57 1.58 1.52 1.70 1.60 1.63 2.00
1338 1.53 1.51 1.49 1.44 1.43 1.56 1.58 1.54 1.84
1223 1.38 1.37 1.37 1.33 1.35 1.50 1.30 1.57 1.92
1230 1.46 1.41 1.36 1.32 1.42 1.43 1.47 1.54 1.78
1349 1.23 1.19 1.19 1.22 1.24 1.30 1.38 1.49 1.75
1317 1.08 1.03 1.08 1.12 1.18 1.22 1.34 1.37 1.57
1316 0.73 0.77 0.80 0.85 0.91 0.89 1.08 1.13 1.30
1324 0.96 0.91 0.94 1.00 1.02 0.89 1.16 1.23 1.38
r 2 0.9547 0.9692 0.9672 0.9786 0.9615 0.9471 0.9319 0.9179
pH가 상이한 0.5M 시트르산 처리 용액이 C-반응성 단백질 검출에 미치는 영향의 상관 관계 (효소적 호스래디시 퍼옥시다제 화학 발광 시스템)
시트르산 농도(mol/L) 0.5
pH 값 2.8 3.0 3.2 3.4 3.5 3.6 3.8 4
Zhongshan Hospital의 혈청 일련 번호 바탕값(mg/L) 검출값 (mg/L)
1445 170 17.65 65.14 122.17 118.01 101.83 133.13 87.17 28.26
1449 140 18.45 58.83 120.32 138.13 139.69 137.80 113.82 22.61
1283 114 13.50 33.13 74.65 125.50 87.12 111.72 150.29 29.15
1238 114 18.20 53.46 94.57 157.07 130.74 136.98 174.20 28.40
1465 73.1 15.85 31.78 59.66 115.18 104.39 119.16 136.63 23.71
1366 65.4 8.13 23.87 45.86 83.41 54.86 58.97 86.38 22.05
1303 58.8 9.23 24.63 55.07 88.79 57.88 79.32 52.87 12.73
1487 52.2 5.90 15.02 33.21 73.56 58.32 83.29 105.08 30.43
1345 42.3 3.41 10.48 18.21 33.29 38.14 37.83 65.16 28.49
1454 33.2 3.67 13.92 25.27 54.27 38.88 43.03 57.80 36.47
1461 25.8 2.74 9.24 20.37 37.56 28.74 50.86 69.94 32.99
1394 18.8 3.07 11.64 20.62 42.19 26.63 33.52 82.36 33.42
1470 9.2 1.70 4.39 8.60 14.50 15.27 17.11 32.14 41.04
1407 8.1 0.39 1.94 7.01 8.82 6.54 7.64 10.36 37.76
1370 5.9 0.36 1.89 4.58 11.98 6.72 6.71 6.75 27.83
Zhongshan Hospital의 혈청 일련 번호 바탕값(Log10) 검출값 (Log10)
1445 2.23 1.25 1.81 2.09 2.07 2.01 2.12 1.94 1.45
1449 2.15 1.27 1.77 2.08 2.14 2.15 2.14 2.06 1.35
1283 2.06 1.13 1.52 1.87 2.10 1.94 2.05 2.18 1.46
1238 2.06 1.26 1.73 1.98 2.20 2.12 2.14 2.24 1.45
1465 1.86 1.20 1.50 1.78 2.06 2.02 2.08 2.14 1.37
1366 1.82 0.91 1.38 1.66 1.92 1.74 1.77 1.94 1.34
1303 1.77 0.97 1.39 1.74 1.95 1.76 1.90 1.72 1.10
1487 1.72 0.77 1.18 1.52 1.87 1.77 1.92 2.02 1.48
1345 1.63 0.53 1.02 1.26 1.52 1.58 1.58 1.81 1.45
1454 1.52 0.56 1.14 1.40 1.73 1.59 1.63 1.76 1.56
1461 1.41 0.44 0.97 1.31 1.57 1.46 1.71 1.84 1.52
1394 1.27 0.49 1.07 1.31 1.63 1.43 1.53 1.92 1.52
1470 0.96 0.23 0.64 0.93 1.16 1.18 1.23 1.51 1.61
1407 0.91 -0.41 0.29 0.85 0.95 0.82 0.88 1.02 1.58
1370 0.77 -0.44 0.28 0.66 1.08 0.83 0.83 0.83 1.44
r 2 0.9206 0.9468 0.9591 0.9154 0.9401 0.9204 0.7299 0.2197
표 5 및 표 6은 이전에 탐색된 최적화된 시트르산 농도를 보여준 후 pH 농도를 신중하게 탐색하고, 상이한 pH 값(pH 2.8 ~ 4 포함)을 조절하기 위해 인산수소이나트륨 12수화물을 선택했으며, 전 범위 C-반응성 단백질의 추적 항원을 검출하기 위해 발광 플랫폼을 사용하였다. 상기 결과는 pH(3.0-3.5) 테스트 샘플이 더 나은 상관 관계를 보여주는 것을 나타냈으며, 그중 자성 입자 화학 발광 플랫폼은 pH 3.4가 가장 좋고, pH(3.0-3.5) 테스트 샘플이 가장 좋은 선형 검출 결과를 보여주는 것으로 나타냈다.
상기 pH 범위 및 표5의 결과를 조합하여, 상기 pH는 3.0 내지 3.5 범위였고, C-반응성 단백질 단일 혈청은 0.96 이상의 선형 상관관계 r2를 보였으며, 최종 선호 조건은 pH 3.4의 0.5M 시트르산이였고, 18개의 혈청 시료 검출의 상관관계는 0.97 이상이였다. 표 6의 결과로부터, 효소적 호스래디시 퍼옥시다제 발광 플랫폼은 pH 3.2에서 최적의 선형 검출을 보여주었다. 15개의 혈청 시료의 상관관계는 0.959 이상이였다.
실시예 4
최적화된 검출 시스템은 표준 곡선을 만들기 위한 점진적으로 희석된 C-반응성 단백질 항원을 검출하기 위해 사용되었으며, 그 후 수집된 47개의 임상적 시료는 검출되었으며, 이들 농도값은 표준 곡선을 통해 계산하고 임상 바탕값과의 상관 관계 평가를 실시하였으며, 그 결과를 하기 표 7에 나타내었다(자성 입자 화학 발광 플랫폼):
Zhongshan Hospital 혈청 일련 번호 바탕값(mg/L) Log10 검출값(mg/L) Log10
1 10.59 1.02 10.99 1.04
2 16.95 1.23 14.88 1.17
3 107.75 2.03 112.29 2.05
4 23.77 1.38 16.99 1.23
5 11.88 1.07 12.97 1.11
6 37.34 1.57 27.23 1.44
7 14.8 1.17 15.41 1.19
8 65.23 1.81 71.81 1.86
9 64.93 1.81 49.28 1.69
10 135.45 2.13 225.39 2.35
11 38.85 1.59 25.73 1.41
12 81.04 1.91 102.13 2.01
13 37.34 1.57 21.58 1.33
14 15.4 1.19 11.87 1.07
15 10.88 1.04 12.81 1.11
16 15.09 1.18 16.10 1.21
17 6.65 0.82 6.85 0.84
18 9 0.95 8.20 0.91
19 69.29 1.84 40.24 1.60
20 85.55 1.93 90.29 1.96
21 9.42 0.97 10.08 1.00
22 14.11 1.15 15.54 1.19
23 33 1.52 23.67 1.37
24 50.97 1.71 35.66 1.55
25 28.42 1.45 28.40 1.45
Xijing Hospital의 혈청 일련 번호 - - - -
1 1.5 0.18 2.11 0.32
2 1.32 0.12 2.29 0.36
3 4.24 0.63 5.57 0.75
4 0.285 -0.55 0.66 -0.18
5 0.737 -0.13 1.18 0.07
6 5.62 0.75 6.60 0.82
7 3.63 0.56 4.65 0.67
8 1.37 0.14 2.44 0.39
9 1.39 0.14 2.03 0.31
10 37 1.57 21.02 1.32
11 1.4 0.15 2.49 0.40
12 0.159 -0.80 0.34 -0.46
13 2.87 0.46 3.94 0.60
14 44.3 1.65 31.67 1.50
15 45 1.65 26.10 1.42
16 17.4 1.24 16.19 1.21
17 60.1 1.78 30.51 1.48
18 3.02 0.48 5.27 0.72
19 0.665 -0.18 1.33 0.12
20 15.4 1.19 12.34 1.09
21 0.381 -0.42 0.93 -0.03
22 1.81 0.26 2.87 0.46
상관 관계 평가를 통해, 상기 2개의 상관관계 식은 y = 0.8151x + 0.2179이고, 상관 계수 r2 = 0.9692로 우수한 상관관계를 나타내었다.
최적화된 검출 시스템은 표준 곡선을 만들기 위한 점진적으로 희석된 C-반응성 단백질 항원을 검출하기 위해 사용하였으며, 그 후 73 개의 임상 시료를 검출하였으며, 이들의 농도값은 표준 곡선을 통해 계산되었고 임상 바탕값과의 상관관계 평가를 실시하였으며, 상기 결과는 하기 표 8에 나타내었다(효소적 호스래디시 퍼옥시다제 화학발광 플랫폼):
Zhongshan Hospital의 혈청 일련 번호 바탕값(mg/L) Log10 검출값(mg/L) Log10
1 20 1.30 32.42 1.51
2 5 0.70 5.37 0.73
3 3.8 0.58 5.90 0.77
4 22.8 1.36 46.23 1.66
5 25.8 1.41 40.60 1.61
6 33.2 1.52 53.73 1.73
7 38.1 1.58 67.42 1.83
8 45.7 1.66 73.19 1.86
9 62.3 1.79 89.68 1.95
10 65.4 1.82 74.84 1.87
11 140 2.15 155.47 2.19
12 110 2.04 140.33 2.15
13 13.2 1.12 12.42 1.09
14 14.6 1.16 22.56 1.35
15 133 2.12 176.93 2.25
16 45 1.65 93.78 1.97
17 65.4 1.82 111.15 2.05
18 70.3 1.85 92.69 1.97
19 18.4 1.26 27.67 1.44
20 67.7 1.83 82.16 1.91
21 170 2.23 203.55 2.31
22 170 2.23 228.36 2.36
23 140 2.15 216.73 2.34
24 182 2.26 555.17 2.74
25 41.7 1.62 60.82 1.78
26 43.1 1.63 57.47 1.76
27 33.2 1.52 44.20 1.65
28 42.3 1.63 48.68 1.69
29 31.3 1.50 42.16 1.62
30 86.1 1.94 179.86 2.25
31 58.8 1.77 100.40 2.00
32 39.6 1.60 59.01 1.77
33 21.8 1.34 46.29 1.67
34 41.7 1.62 59.99 1.78
35 33.3 1.52 73.34 1.87
36 58.6 1.77 104.54 2.02
37 57.8 1.76 76.28 1.88
38 29 1.46 43.97 1.64
39 39.6 1.60 32.97 1.52
40 30.2 1.48 38.47 1.59
Xijing Hospital의 혈청 일련 번호 - - - -
1 58.6 1.77 110.22 2.04
2 26.3 1.42 28.64 1.46
3 24.2 1.38 22.55 1.35
4 5.6 0.75 7.98 0.90
5 7 0.85 9.95 1.00
6 9.1 0.96 10.88 1.04
7 7.8 0.89 10.32 1.01
8 6.9 0.84 7.85 0.89
9 6.5 0.81 10.58 1.02
10 12.1 1.08 19.77 1.30
11 16.8 1.23 25.96 1.41
12 42.3 1.63 50.42 1.70
13 114 2.06 179.29 2.25
14 6.9 0.84 5.40 0.73
15 17.1 1.23 21.13 1.32
16 58.6 1.77 102.90 2.01
17 213 2.33 418.66 2.62
18 20.3 1.31 35.05 1.54
19 170 2.23 196.84 2.29
20 140 2.15 187.56 2.27
21 114 2.06 152.75 2.18
22 114 2.06 144.88 2.16
23 77.9 1.89 185.85 2.27
24 73.1 1.86 97.58 1.99
25 65.4 1.82 71.60 1.85
26 58.8 1.77 81.52 1.91
27 52.2 1.72 48.59 1.69
28 33.2 1.52 34.49 1.54
29 25.8 1.41 37.18 1.57
30 18.8 1.27 30.58 1.49
31 9.2 0.96 12.20 1.09
32 8.1 0.91 7.77 0.89
33 5.9 0.77 5.73 0.76
상관관계 평가를 통해 상기 2 개의 상관 관계식은 y = 1.056x + 0.0619이고, 상관 계수 r2 = 0.9506으로 우수한 상관관계가 있었다.
실시예 5
최적화된 검출 시스템 및 중국 공개 특허 CN105988003A의 출원 명세서에서 언급된 산 처리 및 알칼리 중화용 시약은 표준 곡선을 만들기 위해 점진적으로 희석된 C-반응성 단백질 항원을 검출하기 위해 사용하였으며, 그 후 수집된 48 개의 임상 시료는 검출되었고 그들의 농도 값은 표준 곡선을 통해 계산되었고 임상 바탕값과의 상관관계 평가를 수행하고, 상기 결과는 도 1 및 도 2에 나타내었다(자성 입자 화학 발광 플랫폼).
추적된 항원의 선폭과 비교하여, 상기 두 시약은 시장의 수요(0.02-100 mg/L)를 충족할 수 있었고, 상기 두 시약은 시료 상관관계 평가에서 동등한 성능을 나타내었다.
본 발명의 키트의 검출 범위는 시료 처리 용액(0.1 ~ 1M 농도의 시트르산 용액, pH = 3 ~ 4)을 본 발명의 키트 검출과정에서의 한 단계에서 첨가 한 후 0.02 mg/L 내지 100 mg/L에 이를 수 있었으며, 상기 키트는 C-반응성 단백질의 전 범위 검출 요구를 충족하였다.
상기 내용은 본 발명의 바람직한 실시예에 불과하므로 본 발명의 실시범위를 제한 할 수는 없다. 즉, 본 발명의 범위 및 명세서의 내용에 따라 등가의 변경 및 수정을 가하는 것은 본 발명의 적용 범위에 속한다.

Claims (10)

  1. 다음을 포함하는 C-반응성 단백질의 전 범위 검출용 키트:
    제 1 항체가 코팅된 자성 입자 0.5~1 mg/mL, 0.04~0.06% (w/v) 계면활성제(상기 계면활성제는 선택적으로 Tween-20임), 및 8~12% (w/v) 수크로스(sucrose)를 포함하는 M 시약(M reagent), 용매는 pH가 7.0 ~ 8.0 인 인산염 버퍼(phosphate buffer)이다; 상기 제 1 항체의 코팅 양은 5~20 μg/mg 자성입자이다;
    pH=3.0~4.0이고, 0.1~1M 농도의 시트르산 용액인 시료 처리 용액인 R1 시약;
    제 2 항체가 코팅된 아크리디늄 에스테르(acridinium ester), 0.5-1% 카제인(casein) 및 0.5-1% 소 혈청 알부민을 포함하는 R2 시약, 용매는 pH가 7.0-8.0인 인산염 버퍼이고, 상기 제 2 항체의 코팅 양은 0.3-0.9 μg/μg 아크리디늄 에스테르이다;
    예비-여기 용액(pre-excitation solution) 및 여기 용액;
    상기 제 1 항체 및 제 2 항체는 모두 C-반응성 단백질과 특이적으로 반응할 수 있는 단일 클론 항체이고, 상기 제 1 항체 및 제 2 항체는 상이한 에피토프에 대한 항체이다.
  2. 다음을 포함하는 C-반응성 단백질의 전 범위 검출용 키트:
    플레이트형 발광 플레이트(선택적으로 96 웰, 384 웰 또는 다른 플레이트형 발광 플레이트)를 포함하는 제 1 항체로 코팅된 평평한-바닥 플레이트형 화학 발광 플레이트(flat-bottomed plate-type chemiluminescence plate), 상기 제 1 항체의 코팅 양은 100~500 ng/웰이고(선택적으로 500 ng/웰), 코팅 버퍼는 pH = 7.0 ~ 8.0의 인산염 버퍼이고, 블로킹 용액은 5-8% (w/v) 블로킹 혈청 또는 블로킹 단백질(블로킹 혈청은 선택적으로 송아지 혈청임) 및 0.02% (w/v) 아지드화 나트륨(sodium azide)을 포함하는 pH 7.2-7.4인 50mM 인산염 버퍼이다;
    pH=3~4이고, 0.1 ~ 1M 농도의 시트르산 용액인 시료 처리 용액;
    호스래디시 퍼옥시다제 또는 알칼리성 포스파타제로 표지된 제 2 항체를 포함하고, 호스래디시 퍼옥시다제 또는 알칼리성 포스파타제가 동일한 비율로 표지된 제 2 항체가 1 mg/mL의 표지 양을 갖는 표지 효소 용액;
    발색 용액: 표지 효소가 호스래디시 퍼옥시다제인 경우, 발색 용액은 발색 용액 A 및 발색 용액 B를 포함하고, 발색 용액 A는 과산화수소(선택적으로, 발색 용액 A의 조성: 13.6g 아세트산 나트륨, 1.6g 시트르산, 0.3ml의 30% 과산화수소, 증류수 500ml로 조성)이고, 발색 용액 B는 o-페닐렌다이아민(o-phenylenediamine) (선택적으로, 발색 용액 B의 조성: 0.2 g 에틸렌디아민사아세트산이나트륨(disodium ethylenediaminetetraacetate), 0.95g 시트르산, 50ml 글리세롤, 9.15g 테트라메틸벤지딘(tetramethylbenzidine), 증류수 500ml로 조성)이다; 표지 효소가 알칼리성 포스파타제인 경우, 발색 용액은 시판되는 시약이다;
    상기 제 1 항체 및 제 2 항체는 모두 C-반응성 단백질과 특이적으로 반응할 수 있는 단일 클론 항체이고, 상기 제 1 항체 및 제 2 항체는 상이한 에피토프에 대한 항체이다.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 시트르산 용액의 pH는 인산수소이나트륨 12수화물(disodium hydrogen phosphate dodecahydrate)에 의해 조절되고, 바람직하게는 시트르산 용액의 pH는 3.0-3.5, 보다 바람직하게는, 시트르산 용액의 pH는 3.2, 3.3, 3.4 또는 3.5인 것인, 키트.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시트르산의 농도는 0.5 mol/L인 것인, 키트.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 예비-여기 용액은 1% (w/v) 과산화수소 용액이고, 상기 여기 용액은 1 mol/L 수산화 나트륨 용액이고, 선택적으로 상기 제 1 항체가 10C11이고, 상기 제 2 항체는 14D9-2인 것인, 키트.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 M 시약을 제조하는 방법은 다음을 포함하는 것: 제 1 항체 및 자성 입자를 pH = 5.0 ~ 6.0의 2-모르폴린에탄술폰산 버퍼(2-morpholineethanesulfonic acid buffer)에 혼합하고, 25-37 ℃에서 1-3 시간 동안 코팅하고, 1~3 시간 동안 반응을 중단하기 위해 pH = 8.0 ~ 9.0인 0.1% ~ 0.5% (w/v)의 소 혈청 알부민 인산염 버퍼를 첨가하고, 상기 코팅된 자성 입자를 분리하여 pH = 7.0 ~ 8.0인 인산염 버퍼에 분산시킨 후, 0.04~0.06% (w/v) 계면활성제(계면 활성제는 선택적으로 Tween-20 임; 일 구체예에서 계면 활성제는 0.05% (w/v) Tween-20 임) 및 8~12% (w/v) 수크로스(선택적으로, 10% (w/v) 수크로스)를 첨가하여 M 시약을 얻는 방법;
    상기 R2 시약을 제조하는 방법은 다음을 포함하는 것인, 키트: 제 2 항체 및 아크리디늄 에스테르를 pH=8.0~9.0의 인산염 버퍼에서 혼합하고, 25-37 ℃에서 1-3 시간 동안 코팅한 후, 1~3 시간동안 반응을 중단하기 위해 0.1%~0.5% (w/v) 소혈청 알부민을 포함하고 pH=8.0~9.0을 가지는 트리스 버퍼를 첨가하여 스톡 용액을 얻고, 상기 스톡 용액은 pH=7.0~8.0인 인산염 버퍼로 1:100~500로 희석하여 R2 시약을 얻는 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발광 플레이트 코팅 소스를 제조하는 방법은 다음을 포함하는 것: 코팅된 제 1 항체는 코팅 버퍼로서 pH = 7.0-8.0을 갖는 인산염 버퍼로 100-500 ng/웰 (선택적으로, 500 ng/웰)로 희석하고, 웰당 100 μL로 발광 플레이트에 첨가하고, 37 ℃에서 2 시간 또는 4 ℃에서 밤새 배양하고, 코팅 버퍼를 쏟아 내고, 5-8% (w/v) 송아지 혈청과 0.02% (w/v) 아지드화 나트륨을 포함하는 블로킹 용액 200μL를 사용하여 37 ℃에서 2 시간 동안 배양하고, 웰에 있는 액체를 붓고, 플레이트를 건조하고 알루미늄 필름으로 진공 상태에서 밀봉한 다음 4 ℃의 건조한 장소에 보관하는 방법;
    표지 효소 용액의 제조 방법은 다음을 포함하는 것인, 키트: 1:1 비율의 제 2 항체 및 호스래디시 퍼옥시다제 또는 알칼리성 포스파타제를 pH = 9.6의 탄산염 완충액에서 혼합하고 표지하고 투석하고, 투석 버퍼를 4 시간 마다 3회 교체하고, 효소로 표지된 제 2 항체를 수집하여 스톡 용액으로 한 후, 스톡 용액을 시판되는 효소 희석제로 1:500으로 희석하여 표지 효소 용액을 얻는 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 키트를 사용하여 수행되는 다음을 포함하는 C-반응성 단백질의 전 범위 검출 방법:
    (1) 시료 20 μL를 채취하고, 시료를 처리하기 위해 R1 시약 100 μL을 첨가하는 단계;
    (2) M 시약 50 μL를 첨가한 후 15분 동안 배양하는 단계;
    (3) 단계 (2) 이후, 0.05 ~ 0.08% (w/v) Tween-20을 포함하는 인산염 버퍼로 세척한 후, R2 시약 50 μL을 첨가하고 10 분 동안 배양하는 단계;
    (4) 단계 (3) 이후, 0.05 ~ 0.08% (w/v) Tween-20을 포함하는 인산 버퍼로 세척하고, 예비 여기를 수행하기 위해 예비 여기 용액 100 μL를 첨가하는 단계;
    (5) 예비 여기 용액을 제거하고, 여기 용액 100 μL을 추가하여 여기 및 검출하는 단계.
  9. C-반응성 단백질의 전 범위 검출을 위한 키트 제조 시 시료 처리 용액으로써 시트르산 용액의 용도.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 시트르산 용액은 pH = 3 ~ 4이고, 0.1 ~ 1M의 농도를 갖는 시트르산 용액이고; 바람직하게는 시트르산 용액의 pH는 인산수소이나트륨 12수화물에 의해 조절되고, 보다 바람직하게는 시트르산 용액의 pH는 3.0-3.5이고, 보다 바람직하게는 시트르산 용액의 pH는 3.2, 3.3, 3.4 또는 3.5인 것인, 용도.
KR1020217001837A 2018-06-20 2019-05-29 C-반응성 단백질의 전 범위 검출 방법 및 해당 키트 KR102459248B1 (ko)

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