CN112147337B - 一种富含半胱氨酸蛋白61高敏化学发光检测试剂盒及其制备和应用 - Google Patents

一种富含半胱氨酸蛋白61高敏化学发光检测试剂盒及其制备和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种富含半胱氨酸蛋白61高敏化学发光检测试剂盒及其制备方法和应用，所述试剂盒包括R1试剂、R3试剂；或所述试剂盒包括R1试剂、R2试剂、R3试剂，其中，所述R1试剂为含有偶联单克隆抗体的磁微粒缓冲液；所述R2试剂为含蛋白保护剂的缓冲液；所述R3试剂为一种含有吖啶酯标记单克隆抗体的结合物的缓冲液；所述试剂盒还包括校准品及激发液A和激发液B。本发明所述的检测试剂盒具有灵敏度高、操作简单、特异性强、无污染且适用于临床，可快速高效进行高通量检测等的优点，为临床人血清Cyr61蛋白的检测提供了有效工具，对冠心病患者支架植入的风险预测具有指导意义，便于临床辅助诊断应用；也为相关的临床研究提供技术手段。

Description

一种富含半胱氨酸蛋白61高敏化学发光检测试剂盒及其制备 和应用
技术领域
本发明属于生物检测领域，具体利用双单克隆抗体夹心法的原理开发了一种检测人血清中Cyr61蛋白的含量的检测试剂盒，以预测心脏支架植入术后的潜在风险，对心脑血管疾病患者的临床辅助诊断提供一定的帮助。
背景技术
富含半胱氨酸蛋白61(CCN1)也称为CCN1，是由即刻早期基因(IEG)编码的肝素结合蛋白。CCN1是CCN家族第一个被认定为CCN1到CCN6的成员。作为分泌的细胞外基质(ECM)蛋白，CCN1参与胚胎发育，伤口愈合和组织重塑，血管生成和成骨细胞分化等。此外，体内CCN1含量的增加与人类许多疾病有关。在恶性肿瘤(例如乳腺癌，食管鳞状细胞癌，肺癌等)中，CCN1表达有所改变。
CCN1作为已知的主要促血管生成因子，近来又被定义为一种新型的促炎因子，它与动脉粥样硬化斑块破裂导致的血栓形成进而发生急性心肌梗塞(acute myocardialinfarction，AMI)之间有一定的关联。经皮冠状动脉介入(percutaneous coronaryintervention，PCI)及支架治疗已成为心血管疾病患者血供重建的最常用且有效的方法，可以使狭窄及闭塞血管再通，达到血运重建，快速有效缓解缺血症状，但PCI同样带来一定的风险，包括支架内血栓形成(ST)和支架内再狭窄(ISR)。早期支架内血栓发生在支架植入30天内，迟发支架内血栓发生在支架植入30天后，且早期支架内血栓形成较迟发支架内血栓形成更为常见。另外，PCI术后血管壁损伤可引起相关炎症反应，促使成纤维母细胞和平滑肌细胞增生，从而发生支架内再狭窄。然而支架内再狭窄的发生对PCI术后长期预后影响极大。目前研究发现，支架内血栓形成的发生率1年内<1％，随后每年的发生率约为0.2％～0.4％。支架内再狭窄的发生率约为5％。因此，支架植入的术后风险预测对病人术后治疗和疾病转归具有重要意义，但目前仍无有效的支架植入风险预测标志物。研究显示，支架植入前后血清中富含半胱氨酸蛋白61(Cyr61)的水平与术后恢复状态显著相关，故Cyr61可能是支架植入风险预测的有效生物标志物。鉴于此，临床上对于应用CCN1检测需求越来越高。
目前尚无可供临床使用的商品化Cyr61蛋白检测试剂盒，仅有供科研使用的ELISA检测试剂盒，且样本需要前处理，操作繁琐，耗时耗力，灵敏度有限，在诊断的特异性和敏感性方面均存在不足，不合适进行高通量的临床检测。
发明内容
为了解决现有技术中存在的上述问题，本发明旨在开发一种自动化程度高，样本无需处理，需时短且灵敏度高，适用于临床应用的化学发光检测试剂盒，旨在实现对血清中Cyr61准确、可靠、高灵敏的检测。
本发明提供了一种富含半胱氨酸蛋白61高敏化学发光检测试剂盒，包括R1试剂、R3试剂；或，所述试剂盒包括R1试剂、R2试剂、R3试剂。
其中，所述R1试剂为含有偶联单克隆抗体的磁微粒缓冲液。
“偶联单克隆抗体”具体指一种利用单克隆抗体的属性将抗体偶联到磁微粒上羧基的技术。
所述R1试剂的工作浓度为：0.3-1.0mg/mL；优选地，为0.5mg/mL。
所述R1试剂中的缓冲液的组成为：0.1-1.0％(w/v)BSA，0.01-0.3％(v/v)RPE1740的磷酸盐缓冲液，浓度为0.05-0.2％的叠氮钠，其余为去离子水，pH值为7.2～7.4，所述磷酸盐的浓度为20-100mM；优选地，为1％(w/v)BSA，0.1％(v/v)RPE1740的磷酸盐缓冲液，浓度为0.1％的叠氮钠，其余为去离子水，pH值为7.3，所述磷酸盐的浓度为50mM。
其中，所述R2试剂为含蛋白保护剂的缓冲液。
所述R2试剂中的缓冲液的组成为：0.1-1.0％(w/v)BSA，0.01-0.3％(v/v)Tween-20或TritonX-100，浓度为20-100mM的磷酸盐(或Tris)，浓度为0.05-0.2％的叠氮钠，其余为去离子水，pH值为7.2～7.4；优选地，为1％(w/v)BSA，0.1％(v/v)Tween-20，浓度为50mM的磷酸盐(或Tris)，浓度为0.1％的叠氮钠，其余为去离子水，pH值为7.3。
所述蛋白保护剂是指缓冲液中含有的蛋白及表面活性剂。
其中，所述R3试剂为含有吖啶酯标记单克隆抗体的结合物的缓冲液。
“单克隆抗体”具体指Cyr61单克隆抗体。
所述吖啶酯作为标记物。
所述R3试剂的工作浓度为：0.05-0.5ug/mL；优选地，为0.1ug/mL。
所述R3试剂中缓冲液的组成为：0.1-1.0％(w/v)BSA，0.01-0.3％(v/v)Tween-20或TritonX-100，浓度为20-100mM的磷酸盐(或Tris)，浓度为0.05-0.2％的叠氮钠，其余为去离子水，pH值为7.2～7.4；优选地，为含有1％(w/v)BSA，0.1％(v/v)Tween-20，浓度为50mM的磷酸盐，浓度为0.1％的叠氮钠，其余为去离子水，pH值为7.3。
进一步地，所述试剂盒的制备开发过程中还包括激发液A和激发液B，即，所述激发液A和激发液B可以是所述试剂盒中的组成部分，也可以与试剂盒配套使用。
其中，所述激发液A含有0.05-0.15M硝酸和1-1.5g/100mL过氧化氢；优选地，为含有0.1M硝酸和1.5g/100mL过氧化氢。
其中，所述激发液B含有0.5-2.5g/100mL氢氧化钠和0.1-0.3g/100mL TritonX-100；优选地，为含有1.5g/100mL氢氧化钠和0.2g/100mL TritonX-100。
进一步地，所述试剂盒的制备开发过程中还包括校准品，即，所述校准品可以是所述试剂盒中的组成部分，也可以与试剂盒配套使用。
所述校准品为含有Cyr61蛋白的缓冲液。
(1)所述缓冲液组成为：0.1-1.0％(w/v)BSA，浓度为20-100mM的磷酸盐(或Tris)缓冲液，其余为去离子水，pH值范围为7.2～7.4；优选地，为1％(w/v)BSA，浓度为50mM的磷酸盐(或Tris)缓冲液，其余为去离子水，pH值范围为7.3。
(2)所述校准品的浓度为0-3000pg/ml；优选地，为0.00，31.25，62.50，125，500，1000，3000pg/ml。
本发明所述试剂盒中包含R1试剂、R3试剂的反应为一步法反应，R1、R3试剂和样品加一起先进行孵育，然后进行清洗，最后加入激发液A、B发光，读数。
本发明所述试剂盒中包含R1试剂、R2试剂、R3试剂的反应为两步法反应，即，R1、R2试剂和样品加一起先进行孵育，然后进行清洗，然后加入R3试剂进行孵育，再次清洗，之后加入激发液A、B发光，读数。
本发明还提供了一种富含半胱氨酸蛋白61高敏化学发光检测试剂盒的制备方法：
(1)配制R1试剂：
a.按照上述R1试剂中缓冲液的组分配制缓冲液，调节pH；
b.制备有包被Cyr61单克隆抗体的磁微粒：
(b-1)将目的单克隆抗体(Cyr61)进行透析；
(b-2)向磁微粒中加入EDC和NHS，进行第一次滚轴，然后加入步骤(b-1)透析后的单克隆抗体和MES，进行第二次滚轴，得到磁微粒；
c.将包被有Cyr61单克隆抗体的磁微粒用步骤a制备的缓冲液进行1:10-1:20稀释，所得溶液即为R1试剂。
步骤a中，所述pH为7.2-7.4；优选地，为7.3。
步骤b-1中，所述磁微粒和单克隆抗体的质量比为：每毫克磁微粒包被10-40ug抗体；优选地，为每毫克磁微粒包被20ug抗体。
步骤b-1中，所述EDC、NHS的终浓度为0.5-4.0mg/mL；优选地，为2mg/mL。
步骤b-1中还包括对磁微粒进行洗涤的步骤。
其中，所述洗涤液为10-50mM MES pH 5.0-6.0；优选地，所述洗涤液为20mM MESpH6.0。
所述洗涤的次数为2-3次；优选地，为3次。
步骤b-2中，所述第一次滚轴的温度为室温。
步骤b-2中，所述第一次滚轴的时间为10-35min；优选地，为30min。
步骤b-2中，所述第二次滚轴的温度为室温。
步骤b-2中，所述第二次滚轴的时间为12-16h；优选地，为15h。
本发明在第二次滚轴之前还包括洗涤的步骤。
步骤c中，所述稀释的倍数优选为20倍。
本发明所述有包被Cyr61单克隆抗体的磁微粒的制备方法，具体为：将目的单克隆抗体进行透析；取一定量的磁微粒，加入20mM MES pH5.0-6.0，洗涤2-3次，然后加入EDC(终浓度1.5mg/mL)和NHS(终浓度1.5mg/mL)，室温滚轴混匀30min，洗涤，磁吸去掉上清，加入悬浮液20mM MES pH5.0-6.0和单克隆抗体，室温滚轴混匀15h，最后保存磁微粒备用。
(2)配制试剂R2：
按照上述R2试剂中缓冲液组分配制缓冲液，调节pH，所得溶液即为R2试剂。
所述pH为7.2-7.4；优选地，为7.3。
(3)配制R3试剂：
a.按照上述R3试剂中缓冲液的组分配制缓冲液，调节pH；
b.制备有标记吖啶酯的Cyr61单克隆抗体：
(b-1)将目的单克隆抗体透析，加入吖啶酯，反应；
(b-2)然后加入赖氨酸盐缓冲液，反应，得到有标记吖啶酯的Cyr61单克隆抗体；
c.将标记有吖啶酯的单克隆抗体的结合物用步骤a制备的缓冲液进行1:500-1:1000稀释，所得溶液即为R3试剂。
步骤a中，所述pH为7.2-7.4；优选地，为7.3。
步骤b-1中，透析后的单克隆抗体的浓度为1mg/mL。
步骤b-1中，所述单克隆抗体和吖啶酯的摩尔比为1:5-1:40；优选地，为1:15。
步骤b-1中，所述反应的温度为室温。
步骤b-1中，所述反应的时间为0.5-1h；优选地，为1h。
步骤b-2中，所述反应的温度为室温。
步骤b-2中，所述反应的时间为10-30min；优选地，为20min。
步骤b-2中，所述加入赖氨酸盐缓冲液的体积为10uL，浓度为50mg/mL，pH为8.0。
所述制备有标记吖啶酯的Cyr61单克隆抗体的具体步骤为：将目的单克隆抗体预先在0.1M CB pH8.5缓冲液中过夜透析，调整单克隆抗体浓度为1mg/mL。按照一定的单克隆抗体：吖啶酯摩尔比加入吖啶酯，混合，室温反应1h。接着加入赖氨酸盐缓冲液，室温反应20min，然后进行纯化收集。
进一步地，所述方法还包括配制激发液A、激发液B和配制校准品的步骤：
(4)配制激发液A：
所述配制激发液A的步骤具体为：
将0.1M硝酸和1.5g/100mL过氧化氢混合，配制激发液A。
(5)配制激发液B：
所述配制激发液B的步骤具体为：
将1.5g/100mL氢氧化钠和0.2g/100mLTritonX-100混合，配制激发液B。
所述富含半胱氨酸蛋白61高敏化学发光检测试剂盒的制备方法还包括配制R2试剂和配制校准品：
(6)配制校准品：
a.按照所述校准品中的缓冲液组分配制缓冲液；
b.将Cyr61蛋白溶解于校准品缓冲液中，按一定比例配制成不同浓度的校准品液(0-3000pg/ml)。
本发明还提供了由上述方法制备得到的所述富含半胱氨酸蛋白61高敏化学发光检测试剂盒。
本发明还提供了一种激化液A、激发液B，所述激发液A含有0.05-0.15M硝酸和1-1.5g/100mL过氧化氢；所述激发液B含有0.5-2.5g/100mL氢氧化钠和0.1-0.3g/100mLTritonX-100。
本发明还提供了所述激化液A、激发液B的筛选方法，所述方法包括以下步骤：
(1)配制激发液A和激发液B；
将硝酸和过氧化氢混合，配制激发液A；
将氢氧化钠和TritonX-100混合，配制激发液B；
(2)在反应杯中加入吖啶酯发光物质，然后迅速往其中加入配制好的激发液A和激发液B，室温条件下充分反应；
(3)在激发液的作用下吖啶酯(Acridinium ester,AE)结合物释放光子数(RLU)，根据收集的光子的数量及反应时间，筛选出最优的激发液组合。
步骤(1)中，所述激发液A中硝酸的浓度为0.05-0.15M，过氧化氢的浓度为1-1.5g/100mL；所述激发液B中氢氧化钠的浓度为0.5-2.5g/100mL，TritonX-100的浓度为0.1-0.3g/100mL。
步骤(2)中温度条件为室温。
本发明还提供了所述富含半胱氨酸蛋白61高敏化学发光检测试剂盒或激发液A、激发液B在制备诊断/辅助诊断心脑血管疾病、肿瘤、类风湿因子的产品中的应用。
所述心脑血管疾病包括动脉粥样硬化、心肌梗塞、支架介入等。
所述肿瘤包括乳腺癌、食管鳞状细胞癌等。
本发明还提供了所述富含半胱氨酸蛋白61高敏化学发光检测试剂盒的使用方法，具体包括以下步骤：
(1)取待测样本(或校准品)、试剂R1和试剂R2加入到反应杯中，37℃温育15min，此时已包被单克隆抗体的磁微粒与待测样本中的抗原结合形成抗原—单克隆抗体免疫复合物；
(2)洗涤，去除未结合的单克隆抗体和杂质，然后加入试剂R3，37℃混合温育15min，此时免疫复合物会与标记有吖啶酯的单克隆抗体结合，形成单克隆抗体-抗原-单克隆抗体夹心复合物；
(3)洗涤，去除未结合的单克隆抗体和杂质，然后依次加入激发液A和激发液B，并在2s内收集光子数；
(4)在一定范围内RLU与Cyr61蛋白浓度呈正比，通过4-PL拟合方法就可以从标准曲线上读取待测样本中Cyr61蛋白的含量。
目前尚无可供临床使用的商品化Cyr61蛋白检测试剂盒，仅有供科研使用的ELISA检测试剂盒，且样本需要前处理，操作繁琐，耗时耗力，灵敏度有限，在诊断的特异性和敏感性方面均存在不足，不适合进行高通量的临床检测。相对于现有技术，本发明的试剂盒在测试通量，简易程度，自动化等方面有显著地改进。
本发明检测试剂盒可达到的试剂基本性能：
1.最低检测限：不高于5.0pg/ml；
2.线性范围：10～2500pg/ml，线性相关系数r≥0.99；
在小于等于30pg/mL的浓度范围内，其线性绝对偏差不超过±15pg/mL，在大于30pg/mL的浓度范围内，其线性相对偏差不超过±15％。
3.精密度：
(1)分析内精密度：对高低两点的校准品分别测试10次，变异系数CV≤8％；
(2)分析间精密度：使用三个批号的试剂盒对高低两点的校准品分别测试10次，变异系数CV≤15％。
4.准确度：回收率在85％～115％之间。
5.校准品稳定性：校准品放入37℃温箱7天，校准品的RLU降幅小于10％。
6.临床样本测值相关性：与ELISA试剂盒测值符合性整体良好，相关性r>0.85。
本发明的有益效果在于：
本发明的试剂盒采用夹心法的反应模式，利用化学发光检测技术与磁分离技术相结合的原理，定量检测人血样品中Cyr61蛋白含量，目前尚无同类检测试剂。相比ELISA方法，本发明所述的化学发光法Cyr61检测试剂盒具有灵敏度高、操作简单、特异性强、无污染且适用于临床，可快速高效进行高通量检测等的优点，为临床人血清Cyr61蛋白的检测提供了有效工具，对冠心病患者支架植入的风险预测具有指导意义，便于临床辅助诊断应用，也为相关的临床研究提供了技术手段。
附图说明
图1为本发明实施案例6的Cyr61剂量-RLU反应曲线。
图2为本发明实施案例7的考核试剂与参比试剂样本测值相关性曲线。
具体实施方式
结合以下具体实施例对本发明作进一步详细说明，实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
实施例1：本发明一种富含半胱氨酸蛋白61高敏化学发光检测试剂盒，包括R1试剂，R2试剂，R3试剂以及校准品和激发液。
其中，(1)R1试剂是一种含偶联有单克隆抗体的磁微粒缓冲液。R1工作浓度为0.5mg/mL；缓冲液组成：含有1％(w/v)BSA，0.1％(v/v)RPE1740的磷酸盐缓冲液，磷酸盐浓度为50mM，叠氮钠浓度为0.1％，其余为去离子水。pH值为7.3。
(2)R2试剂为用于稀释样本的缓冲液。缓冲液组成：含有1％BSA(w/v)，0.1％Tween-20(v/v)的磷酸盐缓冲液，磷酸盐浓度为50mM，叠氮钠浓度为0.1％，其余为去离子水。pH值为7.3。
(3)R3试剂是一种含有吖啶酯标记单克隆抗体结合物的缓冲液。R3试剂的工作浓度为0.05ug/mL；缓冲液组成：含有1％(w/v)BSA的磷酸盐缓冲液，磷酸盐浓度为50mM。试剂的缓冲液pH值为7.3。
(4)校准品是含有不同Cyr61蛋白浓度的缓冲液。校准品的浓度为0.00，31.25，62.50，125，500，1000，3000pg/ml；缓冲液组成：含有1％(w/v)BSA的磷酸盐缓冲液，磷酸盐浓度为50mM。试剂的缓冲液pH值为7.3。
(5)化学发光激发液包括激发液A和激发液B。其中，激发液A含有0.1M硝酸和1.5g/100mL过氧化氢；激发液B含有1.5g/100mL氢氧化钠和0.2g/100mL TritonX-100。
实施例2：本发明一种富含半胱氨酸蛋白61高敏化学发光检测试剂盒，与实施例1的试剂盒基本相同，不同之处在于：
(1)R1试剂是一种含偶联有单克隆抗体的磁微粒缓冲液。R1工作浓度为1mg/mL；缓冲液组成：含有1％(w/v)BSA，0.1％(v/v)RPE1740的磷酸盐缓冲液，磷酸盐浓度为50mM，叠氮钠浓度为0.1％，其余为去离子水。pH值为7.3。
(2)校准品是含有不同Cyr61蛋白浓度的缓冲液。校准品的浓度为0.00，31.25，62.50，125，500，1000，3000pg/ml；缓冲液组成：含有1％(w/v)BSA的磷酸盐缓冲液，磷酸盐浓度为50mM。试剂的缓冲液pH值为7.3。
实施例3：本发明一种富含半胱氨酸蛋白61高敏化学发光检测试剂盒，与实施例1的试剂盒基本相同，不同之处在于：
(1)R1试剂是一种含偶联有单克隆抗体的磁微粒缓冲液。R1工作浓度为1mg/mL；缓冲液组成：含有1％(w/v)BSA，0.1％(v/v)RPE1740的磷酸盐缓冲液，磷酸盐浓度为50mM，叠氮钠浓度为0.1％，其余为去离子水。pH值为7.3。
(2)R3试剂是一种含有吖啶酯标记单克隆抗体结合物的缓冲液。R3试剂的工作浓度为0.1ug/mL；缓冲液组成：含有1％(w/v)BSA的磷酸盐缓冲液，磷酸盐浓度为50mM。试剂的缓冲液pH值为7.3。
(3)校准品是含有不同Cyr61蛋白浓度的缓冲液。校准品的浓度为0.00，31.25，62.50，125，500，1000，3000pg/ml；缓冲液组成：含有1％(w/v)BSA的磷酸盐缓冲液，磷酸盐浓度为50mM。试剂的缓冲液pH值为7.3。
实施例4：本发明一种富含半胱氨酸蛋白61高敏化学发光检测试剂盒，与实施案例1的试剂盒基本相同，不同之处在于：
(1)R1试剂是一种含偶联有单克隆抗体的磁微粒缓冲液。R1工作浓度为1mg/mL；缓冲液组成：含有1％(w/v)BSA，0.1％(v/v)RPE1740的磷酸盐缓冲液，磷酸盐浓度为50mM，叠氮钠浓度为0.1％，其余为去离子水。pH值为7.3。
(2)R3试剂是一种含有吖啶酯标记单克隆抗体结合物的缓冲液。R3试剂的工作浓度为0.1ug/mL；缓冲液组成：含有1％(w/v)BSA的磷酸盐缓冲液，磷酸盐浓度为50mM。试剂的缓冲液pH值为7.3。
(3)校准品是含有不同Cyr61蛋白浓度的缓冲液。校准品的浓度为0.00，31.25，62.50，125，500，1000，3000pg/ml；缓冲液组成：含有1％(w/v)BSA的磷酸盐缓冲液，磷酸盐浓度为50mM。试剂的缓冲液pH值为7.3。
实施例5：本发明一种富含半胱氨酸蛋白61高敏化学发光检测试剂盒，与实施例3的试剂盒基本相同，不同之处在于：
(1)化学发光激发液包括激发液A和激发液B。其中，激发液A含有0.1M硝酸和1g/100mL过氧化氢；激发液B含有1.5g/100mL氢氧化钠和0.1g/100mL TritonX-100。
实施例6：本发明一种富含半胱氨酸蛋白61高敏化学发光检测试剂盒的各项性能评价
1.最低检测限
(1)方法：将零浓度校准品作为样本进行检测，重复测定20次，得出20次测定结果的相对发光强度(RLU)，然后计算出其平均值M和标准差SD，根据公式M+2SD，计算得到最低检测限的RLU值。根据零浓度校准品S0和相邻校准品S1的浓度-RLU(各测定至少2次)进行两点回归拟合得出线性方程，将M+2SD(正反应)或M-2SD(负反应)的RLU值带入上述线性方程中，求出对应的浓度值，即为最低检测限。
(2)合格标准判定：最低检测限≤5.0pg/mL
(3)数据如表1所示：
表1
(4)结论：经测定校准品S0平均发光值M为296，SD为17，得出M+2SD为330，带入剂量-反应曲线，得出最低检测限为0.863pg/mL。
2.线性范围
(1)方法：将覆盖线性范围上限的高值样本用样本稀释液稀释倍比稀释到接近该项目的分析灵敏度，形成若干系列浓度梯度的样本。按试剂盒说明书进行操作，将高值样本连同稀释样本每个重复测定3次，计算平均值。再以稀释浓度为自变量，以检测结果均值为因变量将结果平均值和稀释比例用最小二乘法进行直线拟合，并计算线性相关系数r。将稀释浓度带入线性方程，计算测定值的估计值及测定值与估计值的相对偏差或绝对偏差。
(2)合格标准判定：线性范围10～2500pg/ml，线性相关系数r≥0.98；并且在小于等于30pg/mL的浓度范围内，其线性绝对偏差不超过±15pg/mL，在大于30pg/mL的浓度范围内，其线性相对偏差不超过±15％。
(3)数据如表2所示：
表2
(4)结论：经计算，在10～2500pg/ml范围内线性较好，相关系数为1.000，达到了检测要求，且在小于等于30pg/mL的浓度范围内，其线性绝对偏差小于1pg/mL，在大于30pg/mL的浓度范围内，其线性相对偏差小于2％，均达到相应检测要求。
3.准确度(回收率)
(1)方法：将一个较高浓度的样本A(浓度约200pg/mL)加入到浓度较低的血清或其他基质的样本B中(浓度约10pg/mL)，所加入样本A与B之间的体积比例为1:9，根据公式计算结果。
式中：
R：回收率；
VS：样本A的体积；
V0：样本B的体积；
C：样本B加入样本A后的测定浓度；
CS：样本A的测定浓度；
C0：样本B的测定浓度。
(2)合格标准判定：回收率在85％-115％之间
(3)数据如表3所示：
表3
(4)结论：经计算，准确度(回收率)为99.2％，符合要求。
4.精密度
4.1分析内精密度
(1)方法：将一个浓度较低和一个浓度较高的样本(质控品或新鲜人血清样本)各重复测定10次，计算10次测定结果的平均值M和标准差SD，根据公式计算变异系数(CV)。
式中：
CV：变异系数；
SD：测定结果的标准差；
X：测定结果的平均值。
(2)合格标准判定：CV≤8％
(3)数据如表4所示：
表4
(4)结论：经计算，分析内精密度分别为4.1％和1.4％，符合要求。
4.2分析间精密度
(1)方法：使用三个批号的试剂盒将一个浓度较低和一个浓度较高的样本(质控品或新鲜人血清样本)各重复测定10次，每个样本总共30个测试结果，计算其测定结果的平均值M和标准差SD，根据公式计算变异系数(CV)。
式中：
CV：变异系数；
SD：测定结果的标准差；
X：测定结果的平均值。
(2)合格标准判定：CV≤15％
(3)数据如表5所示：
表5
(4)结论：经计算，分析间精密度分别为3.9％和3.1％，符合要求。
5.校准品稳定性
(1)方法：将新配制的校准品放入37℃保温箱7天，待时间到后，取出置于室温30分钟，然后检测其放置前后RLU的变化。
(2)合格标准判定：放置前后RLU的变化幅度不高于10％。
(3)数据如表6所示：
表6
(4)结论：经考察，校准品的加速稳定性37℃7天降幅小于10％，符合要求。
实施例7：本发明一种富含半胱氨酸蛋白61高敏化学发光检测试剂盒的临床评价
1.用本发明实施例3中制备的化学发光法试剂盒与R&D公司ELISA试剂盒同时检测7例临床血清。其检测结果见图2。以本发明的考核试剂盒测得的结果作为横坐标X，浓度为pg/mL，以R&D公司ELISA试剂盒测定的结果作为纵坐标y，浓度单位为pg/mL，作回归方程，相关系数r＝0.9407。经统计学处理结果表明，本发明的试剂盒与国外试剂盒临床相关性良好。
2.R&D公司ELISA试剂盒使用方法：
(1)实验准备(包被96孔板)
a.往96孔板中每孔加入100ul捕获抗体，密封，室温过夜孵育；
b.移除液体，然后用400ul的洗涤液清洗3次，并将液体吸干；
c.每孔加入300ul封闭液，室温孵育1h；
d.按照步骤b的要求对96孔板进行处理。
(2)实验方法
a.加入100ul血清样品或标准品，密封，室温孵育2h；
b.按照实验准备中步骤b的要求对96孔板进行处理；
c.加入100ul Cyr61检测抗体进行孵育，密封，室温孵育2h；
d.按照实验准备中步骤b的要求对96孔板进行处理；。
e.加入辣根过氧化物酶标记的亲和素试剂进行孵育，密封，室温孵育20min；
f.加入100ul底物液进行孵育，密封，室温孵育20min；
g.加入50ul终止液混匀；
h.检测OD值，根据OD值的大小计算Cyr61的蛋白含量。
3.本发明一种富含半胱氨酸蛋白61高敏化学发光检测试剂盒的使用方法
(1)取待测样本(或校准品)、试剂R1和试剂R2加入到反应杯中，37℃温育15min，此时已包被单克隆抗体的磁微粒与样本中的抗原结合形成抗原—单克隆抗体免疫复合物；
(2)洗涤，去除未结合的单克隆抗体和杂质，然后加入试剂R3，37℃混合温育15min，此时免疫复合物会与标记有吖啶酯的单克隆抗体结合，形成单克隆抗体-抗原-单克隆抗体夹心复合物；
(3)洗涤，去除未结合的单克隆抗体和杂质，然后依次加入激发液A和激发液B，并在2s内收集光子数；
(4)在一定范围内RLU与Cyr61蛋白浓度呈正比，通过4-PL拟合方法就可以从标准曲线上读取待测样本中Cyr61蛋白的含量。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，基于本发明思想的其他实施方式也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (5)

1.一种富含半胱氨酸蛋白61高敏化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括R1试剂、R3试剂；或，所述试剂盒包括R1试剂、R2试剂、R3试剂；其中，所述R1试剂为含有偶联单克隆抗体的磁微粒缓冲液；所述R2试剂为含蛋白保护剂的缓冲液；所述R3试剂为一种含有吖啶酯标记单克隆抗体的结合物的缓冲液；
所述R1试剂的工作浓度为：0.3-1.0mg/mL；所述R1试剂中的缓冲液的组成为：0.1-1.0％w/v BSA，0.01-0.3％v/v RPE1740的磷酸盐缓冲液，浓度为0.05-0.2％的叠氮钠，其余为去离子水，pH值为7.2～7.4，所述磷酸盐的浓度为20-100mM；
所述R2试剂中的缓冲液的组成为：0.1-1.0％w/v BSA，0.01-0.3％v/vTween-20，浓度为20-100mM的磷酸盐，浓度为0.05-0.2％的叠氮钠，其余为去离子水，pH值为7.2～7.4；所述R3试剂的工作浓度为：0.05-0.5ug/mL；所述R3试剂中的缓冲液的组成为：0.1-1.0％w/vBSA，0.01-0.3％v/v Tween-20或TritonX-100，浓度为20-100mM的磷酸盐，浓度为0.05-0.2％的叠氮钠，其余为去离子水，pH值为7.2～7.4；
所述试剂盒最低检测限：不高于5.0pg/ml；所述试剂盒线性范围：10～2500pg/ml；
所述试剂盒还包括激发液A和激发液B；其中，所述激发液A含有0.05-0.15M硝酸和1-1.5g/100mL过氧化氢；所述激发液B含有0.5-2.5g/100mL氢氧化钠和0.1-0.3g/100mLTritonX-100；
所述试剂盒还包括含有Cyr61蛋白的缓冲液校准品；其中，所述校准品中的缓冲液组成为：0.1-1.0％(w/v)BSA，浓度为20-100mM的磷酸盐或Tris缓冲液，其余为去离子水，pH值范围为7.2～7.4；和/或，所述校准品的浓度为0-3000pg/ml。
2.如权利要求1所述富含半胱氨酸蛋白61高敏化学发光检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)配制R1试剂：
a.按照如权利要求1所述的R1试剂中缓冲液组分配制缓冲液，调节pH；
b.制备有包被Cyr61单克隆抗体的磁微粒：
(b-1)将Cyr61单克隆抗体进行透析；
(b-2)向磁微粒中加入EDC和NHS，进行第一次滚轴，然后加入所述步骤(b-1)透析后的单克隆抗体和MES，进行第二次滚轴，得到包被有Cyr61单克隆抗体的磁微粒；
c.将所述包被有Cyr61单克隆抗体的磁微粒用步骤a配制的缓冲液进行1:10-1:20稀释，所得溶液即为R1试剂；
步骤(1)中，步骤a中，所述pH为7.2-7.4；步骤b-1中，所述磁微粒和单克隆抗体的质量比为：每毫克磁微粒包被10-40ug抗体；步骤b-1中，所述EDC、NHS的终浓度为0.5-4.0mg/mL；步骤b-2中，所述第一次滚轴的温度为室温；步骤b-2中，所述第二次滚轴的温度为室温；
(2)配制R2试剂：
按照如权利要求1所述R2试剂中缓冲液的组分配制缓冲液，调节pH，所得溶液即为R2试剂；
步骤(2)中，所述pH为7.2-7.4；
(3)配制R3试剂：
a.按照如权利要求1所述R3试剂中缓冲液组分配制缓冲液，调节pH；
b.制备有标记吖啶酯的Cyr61单克隆抗体：
(b-1)将Cyr61单克隆抗体透析，加入吖啶酯，反应；
(b-2)然后加入赖氨酸盐缓冲液，反应，得到有标记吖啶酯的Cyr61单克隆抗体；
c.将所述标记有吖啶酯的单克隆抗体结合物用步骤a制备的缓冲液进1:500-1:1000稀释，所得溶液即为R3试剂；
步骤(3)中，步骤a中，所述pH为7.2-7.4；步骤b-1中，所述单克隆抗体和吖啶酯的摩尔比为1:5-1:40；步骤b-1中，所述反应的温度为室温；步骤b-2中，所述反应的温度为室温；步骤b-2中，所述加入赖氨酸盐缓冲液的体积为10uL，浓度为50mg/mL，pH为8.0。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，还包括配制激发液A、激发液B和配制校准品的步骤；
(4)配制激发液A：
将0.1M硝酸和1.5g/100mL过氧化氢混合，配制激发液A；
(5)配制激发液B：
将1.5g/100mL氢氧化钠和0.2g/100mL TritonX-100混合，配制激发液B；
(6)配制校准品：
a.按照如权利要求1所述的校准品中缓冲液的组分配制缓冲液；
b.将Cyr61蛋白溶解于步骤a制备的校准品缓冲液中，按一定比例配制成不同浓度的校准品液。
4.如权利要求2或3所述方法制备得到的所述富含半胱氨酸蛋白61高敏化学发光检测试剂盒。
5.如权利要求1或4所述富含半胱氨酸蛋白61高敏化学发光检测试剂盒在制备诊断心脑血管疾病、肿瘤、类风湿因子的产品中的应用。
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