JP6082767B2 - 化学発光タンパク質チップ測定方法及びそれに用いられる試薬キット - Google Patents
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Description
ビオチン標記のAFPマルチクローン抗体は、ウサギ源抗体であり、前記測定斑の上に固定されたAFP特異性抗体と比べて、異なる種を源とする。
ステップ(1)は、
サンプル測定ステップであり、
測定待ち血清試料を希釈した後、前記化学発光タンパク質チップの測定サブ領域上に滴加してから、孵化した後、PBSTで測定サブ領域を洗って非特異結合物を除去するステップ、
PBSで希釈されたビオチン標識AFP抗体を入れて孵化した後、PBSTで洗って非特異結合物を除去するステップ、
PBSで希釈されたアビジンHRPを入れて孵化した後、PBSTで洗って非特異結合物を除去するステップ、および、
HRP基質発光液を入れ、化学発光スキャナーでタンパク質チップに対して走査を行い、それぞれ希釈後測定待ち血清試料でのαフェトプロテインの発光画素値及びフコース化タンパク質の発光画素値を得るステップを有する。
ステップ(2)は、
αフェトプロテインの標準曲線方程及びフコース化タンパク質の標準曲線方程式を得るステップであり、
αフェトプロテイン標準曲線方程式において、AFP標準品の勾配濃度値を横座標xとし、勾配濃度のAFP標準品をシリーズ測定待ちサンプルとし、ステップ(1)の方法で測定されたαフェトプロテインの発光画素値を縦座標yとし、
フコース化タンパク質標準曲線方程式において、AFP−L3標準品でのAFP−L3の勾配濃度値を横座標xとし、勾配濃度のAFP−L3標準品をシリーズ測定待ちサンプルとし、ステップ(1)の方法で測定されたフコース化タンパク質の発光画素値を縦座標yとし、前記AFP−L3標準品がフコース基タンパク質(AFP)を含む血清である。
ステップ(3)は、ステップ(1)での測定待ち血清サンプルのαフェトプロテインの発光画素値を前記αフェトプロテイン標準曲線方程式に代入して算出した希釈後血清のαフェトプロテイン濃に希釈倍数を度掛けることで、測定待ち血清αフェトプロテイン濃度を算出し、ステップ(1)での測定待ち血清サンプルのフコース化タンパク質の発光画素値を前記フコース化タンパク質標準曲線方程式に代入して計算した希釈後の血清フコース化タンパク質濃度に希釈倍数を掛けることで測定待ち血清フコース化タンパク質的濃度を算出し、測定待ち血清フコース化タンパク質の濃度と前記測定待ち血清αフェトプロテイン濃度との比をフコース化指数とする。
主な計測機器
化学発光スキャナー(軍事医学科学院研究開発された)
ネズミ源単クローン抗体AFP(深セン菲鵬(Fapon(登録商標)))、レンズ豆レクチン(Sigma(登録商標))、アルデヒド基チップ(上海百傲(登録商標))、ビオチン標記的ウサギ源抗体(米国abcam(登録商標))、アビジン−HRP(米国abcam)、HRP化学発光基質A液及びB液、1:1の比例で混合し、新鮮に調製する。(米国Millipore(登録商標))。
実験で使用する試薬及び測定機器:ネズミ源単クローン抗体AFP(深セン菲鵬)。レンズ豆レクチン(Sigma)。アルデヒド基チップ(上海百傲)。ビオチン標識ウサギ源一次抗体(米国abcam)。アビジンHRP(米国abcam)、化学発光スキャナー(軍事医学科学院王啓昇教授実験室で研究開発された)。
PBS配合成分:塩化ナトリウム(NaCl)8g、塩素化カリウム(KCl)0.2g、リン酸水素二ナトリウム(Na2HPO4)1.44g、
リン酸二水素カリウム(KH2PO4)0.24g、pH7.4に調節し、1Lに定容する。
PBST配合成分:PBS、1L+Tween−20、1ml
タンパク質チップの操作フロー:
製作された蛋白質チップで健康対照組及び肝癌実験組での動態的な血清標本での腫瘍バイオマーカーを測定する。
(1).標準曲線及び回帰方程式A。
購入されたAFP抗原(米国abcam)を採用して異なる濃度勾配に設置し、(1−5)80ng/ml、40ng/ml、20ng/ml、10ng/ml、5ng/ml、6.肝癌血清、7.肝癌血清、8ブランク対照、9健康血清、10肝癌血清(図3、チップ抗体サンプル付け抗体がAFP2mg/ml、1mg/ml、0.5mg/mlと0.25mg/ml)とする。
(2).標準曲線及び回帰方程式B。
血清サンプル:
39部の肝癌血清:首都医科大学附属佑安医院標本プールを源とする。
32部の正常な健康人血清。
9部のブランク対照(ブランク対照が1×PBSである)。
測定フローが実施形態1と同じである。
サンプル測定結果と走査結果は、図8A〜図8Hを参照して下さい。図8A〜図8Hに示すように、8枚のチップで、39部の肝癌血清サンプル、32部の正常な健康血清サンプル、および9部のブランク対照サンプルを測定した。
表1〜16は、臨床サンプルの測定結果統括表である。
本チップの測定結果:
ブランク対照:9部にAFP及びAFP−L3が測定されていないので、本実験で採用されたチップが有効であることを説明する。
健康血清32部に、AFP及びAFP−L3が測定されていないので、本発明で提供されたチップ及び方法の測定仮陽性が0であることを説明する。
上記データによると、本発明のチップ及び方法が良い安定性、正確性及び信頼性を有することを説明する。
Claims (11)
- 血清糖タンパク質のフコース指数を測定するのに用いられる化学発光タンパク質チップであって、
基質スライドガラスに少なくとも一つの測定サブ領域を有し、前記一つの測定サブ領域は、一部血清サンプルを測定し、
前記一つの測定サブ領域内に、二つの測定斑区域及び一列の対照斑区域が設置されており、その中で一つの測定斑区域に固定αフェトプロテインの特異性抗体により形成された測定斑を有し、その他の測定斑区域に、固定レンズ豆レクチンにより形成された測定斑を有し、前記αフェトプロテインの特異性抗体のスポッティング濃度は0.5mg/mlであり、前記レンズ豆レクチンのスポッティング濃度は4mg/mlであり、前記対照斑区域に固定ウシ血清アルブミンにより形成された対照斑を有し、
同じ測定斑区域内のすべての測定斑が同じ物質濃度を有し、
前記基質スライドガラスは、アルデヒド基チップであることを特徴とする化学発光タンパク質チップ。 - 一つの前記測定斑区域が少なくとも二つの前記測定斑を含むことを特徴とする請求項1記載の化学発光タンパク質チップ。
- 前記αフェトプロテインの特異性抗体がネズミの抗ヒトαフェトプロテイン抗体であることを特徴とする請求項1記載の化学発光タンパク質チップ。
- 前記基質スライドガラスに複数の前記測定サブ領域を有し、前記各測定斑区域が1列に配列する四つの測定斑を有し、前記対照斑区域が1列に配列されている四つの対照斑を有し、前記測定斑及び対照斑が平行である三列に配列されていることを特徴とする請求項1記載の化学発光タンパク質チップ。
- 前記測定サブ領域の間に物理遮断とする突起が設置されていることを特徴とする請求項4記載の化学発光タンパク質チップ。
- 血清糖タンパク質のフコース指数を測定するのに用いられる化学発光試薬キットであって、
請求項1〜5のいずれかに記載の化学発光タンパク質チップを含むことを特徴とする化学発光試薬キット。 - AFP標準品、ビオチン標記のAFPマルチクローン抗体、アビジンHRP及びHRP化学発光基質液を含み、
前記ビオチン標記のAFPマルチクローン抗体は、ウサギ源抗体であり、前記測定斑の上に固定されたAFP特異性抗体と比べて、異なる種を源とすることを特徴とする請求項6記載の化学発光試薬キット。 - 洗濯及び希釈用一般検査試薬PBST及びPBSを含むことを特徴とする請求項6記載の化学発光試薬キット。
- αフェトプロテイン及び/又はフコース化αフェトプロテイン及び/又は血清糖タンパク質フコース指数測定面に応用可能である請求項6−8のいずれかに記載の化学発光試薬キット。
- 請求項1〜5のいずれか一項に記載の化学発光タンパク質チップを使用するフコース化蛋白の定量測定方法であって、
測定待ち血清試料を希釈した後、前記化学発光タンパク質チップの測定サブ領域上に滴加してから、孵化した後、PBSTで測定サブ領域を洗って非特異結合物を除去するステップ、
PBSで希釈されたビオチン標識AFP抗体を入れて孵化した後、PBSTで洗って非特異結合物を除去するステップ、
PBSで希釈されたアビジンHRPを入れて孵化した後、PBSTで洗って非特異結合物を除去するステップ、および、
HRP基質発光液を入れ、化学発光スキャナーでタンパク質チップに対して走査を行い、それぞれ希釈後測定待ち血清試料でのαフェトプロテインの発光画素値及びフコース化タンパク質の発光画素値を得るステップを有するサンプル測定ステップ(1)と、
αフェトプロテイン標準曲線方程式において、AFP標準品の勾配濃度値を横座標xとし、勾配濃度のAFP標準品をシリーズ測定待ちサンプルとし、ステップ(1)の方法で測定されたαフェトプロテインの発光画素値を縦座標yとし、
フコース化タンパク質標準曲線方程式において、AFP−L3標準品でのAFP−L3の勾配濃度値を横座標xとし、勾配濃度のAFP−L3標準品をシリーズ測定待ちサンプルとし、ステップ(1)の方法で測定されたフコース化タンパク質の発光画素値を縦座標yとし、前記AFP−L3標準品がフコース基タンパク質(AFP)を含む血清であるαフェトプロテインの標準曲線方程及びフコース化タンパク質の標準曲線方程式を得るステップ(2)と、
ステップ(1)での測定待ち血清サンプルのαフェトプロテインの発光画素値を前記αフェトプロテイン標準曲線方程式に代入して算出した希釈後血清のαフェトプロテイン濃に希釈倍数を度掛けることで、測定待ち血清αフェトプロテイン濃度を算出し、ステップ(1)での測定待ち血清サンプルのフコース化タンパク質の発光画素値を前記フコース化タンパク質標準曲線方程式に代入して計算した希釈後の血清フコース化タンパク質濃度に希釈倍数を掛けることで測定待ち血清フコース化タンパク質的濃度を算出し、測定待ち血清フコース化タンパク質の濃度と前記測定待ち血清αフェトプロテイン濃度との比をフコース化指数とするステップ(3)と、を含むことを特徴とするフコース化蛋白の定量測定方法。 - 前記孵化は37℃の条件の下での30分間インキュベートすることであることを特徴とする請求項10記載のフコース化蛋白の定量測定方法。
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