CN105785043B

CN105785043B - 用于定量检测afp‑l3%的试剂盒

Info

Publication number: CN105785043B
Application number: CN201610210876.8A
Authority: CN
Inventors: 马灵芝; 王惟; 何林富; 王�义
Original assignee: SHANGHAI LIANGRUN BIOLOGICAL PHARMACEUTICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: SHANGHAI LIANGRUN BIOLOGICAL PHARMACEUTICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2016-04-06
Filing date: 2016-04-06
Publication date: 2018-02-02
Anticipated expiration: 2036-04-06
Also published as: CN105785043A

Abstract

本发明提供了一种用于测定AFP‑L3％的试剂盒，其包括AFP检测体系和AFP‑L3检测体系，所述AFP检测体系包括连接有AFP第一单克隆抗体的磁性微粒A和辣根过氧化物酶标记的AFP第二单克隆抗体；所述AFP‑L3检测体系包括经过氧化处理的连接有AFP第三单克隆抗体的磁性微粒B和辣根过氧化物酶标记的凝集素。该试剂盒可用于精确测定AFP‑L3％。

Description

用于定量检测AFP-L3%的试剂盒

技术领域

本发明属于生物检测领域，具体地说，涉及一种用于定量检测AFP-L3％的试剂盒。

背景技术

甲胎蛋白AFP是原发性肝癌的特异性和灵敏度较高的肿瘤标志物，但是一些良性肝病、转移性肝癌、其他恶性肿瘤如睾丸癌、畸胎癌、胃癌、胰腺癌等也促使AFP升高，因此单纯通过AFP难以鉴别肝病是否良性或者恶性。

良性肝炎患者所产生的AFP与肝癌患者所产生的AFP在糖链结构上有所差别，根据与小扁豆凝集素(LCA)作为外源性凝集素的亲合力，AFP被分为三种类型： AFP-L1、AFP-L2和AFP-L3。其中，AFP-L3只能由肿瘤细胞(hepatocellular carcinoma， HCC)产生。AFP-L3在肝癌的早期诊断中非常有效，具有相当高的准确率。而肝癌的早期发现可以为患者提供更多的治疗机会，例如外科手术切除或介入治疗等等。因此，AFP-L3可作为肝癌的诊断及疗效随访观察指标。2005年FDA批准AFP-L3为原发性肝癌肿瘤标志物；2011年中国肝癌诊疗规范将AFP-L3列为肝癌诊断特异性指标。多年来，AFP-L3被公认为是比单纯的AFP甲胎蛋白更为特异的原发性肝癌指标。目前用于AFP异质体的检测方法有植物凝集素亲和层析法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法、亲和印迹法、亲和交叉免疫电泳法，这些方法均可以直接分离出AFP-L3蛋白并且进行定量估算。

在加拿大和美国的一项多中心、前瞻性、双盲、长期临床试验中，对AFP-L3检测方法进行了研究。结果显示AFP-L3％升高(15％以上)的患者，在接下来的21个月中，发生肝细胞癌的危险增加7倍之多。根据已有的肝细胞癌肿瘤学实践指南，这些患者肝细胞癌发生率极端增高。目前的研究结果把AFP-L3含量大于15％作为肝癌的阳性指标。

AFP-L3％是指甲胎蛋白异质体占比，即甲胎蛋白异质体AFP-L3在总甲胎蛋白 AFP中的百分占比，是临床上通过血清检测来确定肝癌阳性或阴性的重要指标。

国内外研究结果都一致表明：慢性肝病血清AFP-L3％很低，而原发性肝癌很高，表明AFP-L3％测定非常有助于良、恶性肝病的鉴别诊断。另外，大量研究表明部分肝癌患者血清AFP为20～50ng/mL，而AFP-L3％呈阳性。AFP-L3％也非常适用于AFP低浓度阳性良、恶性肝病的鉴别诊断。因此，AFP-L3％对于肝病的鉴别及肝癌的早期预警诊断具有重要意义。

对于AFP-L3％的测定，目前国内主要采用离心管分离方法，该方法采用琼脂糖偶联LCA，采用离心方法分离AFP-L3，然后再用AFP试剂进行检测。参见专利 CN200610112962，离心管分离方法是目前国内唯一获得药监局批准适用于AFP-L3％检测的方法。

专利申请CN104714026A公开了一种甲胎蛋白异质体的分离检测组合物、系统、方法及试剂盒，通过检测血液样本中甲胎蛋白异质体含量与甲胎蛋白含量，得到甲胎蛋白异质体占比AFP-L3％。该组合物和试剂盒包括分离试剂和检测试剂，其中分离试剂包括偶联凝集素的磁性颗粒和洗脱液，偶联凝集素的磁性颗粒用于与待检测样品中的AFP-L3特异性结合；检测试剂包括包被甲胎蛋白抗体的磁性颗粒、标记酶的抗甲胎蛋白抗体。

但是，发明人研究发现，上述AFP-L3％检测方法的弊端是会有非特异吸附，因此对于AFP-L3％测定的准确性需进一步提高；而且该系统操作程序相对较多，需要较多设备配套，存在体系本底高等问题，最终会引起检测结果的偏差。

发明内容

为了克服现有AFP-L3％检测技术的上述缺陷，本发明基于磁微粒化学发光法，设计了一种全新的试剂盒，能够同时对生物样品中的AFP-L3和总AFP的含量分别进行精确测量，从而准确测定出AFP-L3％。

因此，本发明提供了一种用于测定AFP-L3％的试剂盒，包括甲胎蛋白AFP检测体系和甲胎蛋白异质体AFP-L3检测体系，其中，所述AFP检测体系包括连接有AFP 第一单克隆抗体的磁性微粒A和酶标记的AFP第二单克隆抗体；所述AFP-L3检测体系包括连接有AFP第三单克隆抗体的磁性微粒B和酶标记的凝集素。

在一种实施方式中，上述试剂盒的AFP-L3检测体系中的磁性微粒B与AFP检测体系中的磁性微粒A可以相同。

在一种实施方式中，上述试剂盒中的磁性微粒B与磁性微粒A原料可以相同，但AFP-L3检测体系中的免疫磁性微粒B经过了氧化处理，从而与AFP检测体系中的免疫磁性微粒A不同。

在一种优选的实施方式中，上述磁性微粒A和磁性微粒B的粒径分别是0.1-10 微米、优选0.2-5微米、优选0.2-3微米、更优选0.3-2微米、更优选0.3-1微米，以便在试剂盒使用时AFP检测体系和AFP-L3检测体系分别形成接近均相的反应体系。

优选地，上述试剂盒中的所述AFP第一单克隆抗体与所述AFP第二单克隆抗体不同。

优选地，上述试剂盒中的所述AFP第一单克隆抗体与AFP第三单克隆抗体可以相同，也可以不相同。

在一种优选的实施方式中，上述AFP第一单克隆抗体、AFP第二单克隆抗体和AFP第三单克隆抗体是鼠抗人AFP单克隆抗体，以使得这些抗体对于来源于人的 AFP具有高度的特异性。

在一种实施方式中，上述试剂盒中的所述凝集素是可以特异性识别并结合 AFP-L3的凝集素，包括植物凝集素。优选小扁豆凝集素(LCA)、橙黄网胞盘菌凝集素(AAL)或者刀豆凝集素(Con A)，比如是小扁豆凝集素(LCA)。

本发明的试剂盒中的AFP检测体系和AFP-L3检测体系分别采用酶催化的底物化学发光法，从而通过进行光电信号检测而确定样品中的AFP和/或AFP-L3含量。

在一种实施方式中，上述试剂盒中的酶优选是过氧化物酶、碱性磷酸酶、磷酸酯酶或荧光素酶，更优选辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase，简称HRP)或者碱性磷酸酶，更优选辣根过氧化物酶。

作为辣根过氧化物酶的作用底物，可以选自下组：氨基苯二酰一肼(鲁米诺)、异氨基苯二酰一肼、氨基丁基乙基异氨基苯二酰一肼(ABEI)、氨基己基乙基异氨基苯二酰一肼(AHEI)、7-二甲基氨基萘-l,2-二羧酸酰肼、环取代的氨基邻苯二甲酰肼、蒽-2,3-二羧酸酰肼、菲-1,2-二羧酸酰肼、芘二羧酸酰肼、5-羟基-邻苯二甲酰肼、6-羟基邻苯二甲酰肼、2,3-二氮杂萘二酮类似物、9,10-二氢化吖啶类化合物比如9,10-二氢化吖啶酯、9,10-二氢化吖啶酯、9,10-二氢化吖啶硫酯、9,10-二氢化吖啶磺酰胺、9,10-二氢化吖啶二硫缩烯酮化合物。优选是鲁米诺。

酶的作用底物可以单独作为试剂盒的组成部分，即，底物溶液。该底物溶液可同时用于AFP检测体系和AFP-L3检测体系的酶催化反应。优选地，所述底物溶液含有鲁米诺。

相对应地，上述试剂盒进一步包含引发剂溶液，该引发剂溶液包含过氧化氢，比如是双氧水溶液。

上述底物溶液和引发剂溶液可共用于AFP-L3检测体系和AFP检测体系

本发明将化学发光和磁性微粒结合起来，提供了一种接近均相的反应体系；而且将检测甲胎蛋白(AFP)和甲胎蛋白异质体(AFP-L3)联合起来，从而可以定量检测出甲胎蛋白异质体占总甲胎蛋白的百分含量。与现有技术相比，本发明的试剂盒具有更高的灵敏度和特异性，同时具有快速简便等诸多优点，并且大大降低了产品的成本，在临床检验中可应用于肝癌等恶性肿瘤的鉴别诊断、疗效评估等方面。

附图说明

图1是AFP检测标准曲线。

图2是AFP-L3检测标准曲线。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

本文中涉及到多种物质的添加量、含量及浓度，其中所述的百分含量，除特别说明外，皆指质量百分含量。

本发明的试剂盒可用于检测生物样本中的甲胎蛋白(AFP)和甲胎蛋白异质体(AFP-L3)，从而可以定量检测出甲胎蛋白异质体占总甲胎蛋白的百分含量 AFP-L3％。

所述生物样本来源于受测对象、尤其是有肝癌嫌疑的患者。样本可以包含多种形式，比如全血、血浆、血清、尿液、脑脊液、唾液、精液、或眼泪。其中优选血清。

本发明的试剂盒的作用原理是：基于磁微粒化学发光免疫检测机制，采用两套检测体系，分别定量测定总AFP和AFP-L3，进而计算出AFP-L3％。AFP检测体系中，酶标记的AFP第二单克隆抗体和抗原AFP结合形成抗原抗体复合物，随后加入连接有AFP第一单克隆抗体的磁性微粒A，使抗原抗体复合物连接到磁珠(磁性微粒A) 上，形成免疫磁珠-抗原-HRP标记抗体的双抗夹心免疫复合物，然后利用磁场分离出该免疫复合物，加入酶促反应的化学发光底物液并借助化学发光信号来测定总AFP 含量，其中的酶用于催化或激活化学发光反应；AFP-L3检测体系中，酶标记的凝集素和部分抗原(AFP中的亚型AFP-L3)结合形成复合物，随后加入经过处理的连接有AFP第三单克隆抗体的磁性微粒B，使凝集素和抗原的复合物连接到磁珠(磁性微粒B)上，形成免疫磁珠-抗原-凝集素的免疫复合物，最后利用磁场分离出免疫复合物，加入酶促反应的化学发光底物液并借助化学发光信号来测定AFP-L3含量，其中的酶用于催化或激活化学发光反应。

在本发明中，术语“磁性微粒”、“磁微粒”、“磁珠”和“磁性颗粒”表示相同的意义，都是指用于将抗原/抗体、酶、核酸/寡核苷酸、小分子药物等固定在其表面的具有超顺磁性的胶态复合材料，可均匀分散于一定基液中，在磁场中富集。

在本发明中，AFP第一单克隆抗体与磁性微粒A的连接、AFP第三单克隆抗体与磁性微粒B的连接的方式可以独立地选自吸附、偶联或包埋，从而形成抗体修饰的免疫磁珠。考虑到抗体与磁珠结合的牢固性，优选连接的方式是偶联。

至于磁性微粒，可以使用生物检测领域中常用的磁性微粒。作为一种选择方式，可以根据需要在磁性微粒表面覆盖高分子成分，包括硅化物、多聚糖、蛋白、纤维素或树脂等。

本发明所提供试剂盒中所使用的磁珠具有超顺磁和相应的磁场响应性，根据磁珠表面基团类型，所述磁珠包括羧基磁珠、氨基磁珠、硅基磁珠、巯基磁珠、醛基磁珠以及链霉素亲和素磁珠等，优选羧基磁珠。

在本发明的一种实施方式中，上述磁性微粒A和磁性微粒B的粒径范围是0.1-10微米。磁性微粒的平均粒径的下限为0.1微米，优选为0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、 0.4、0.45、0.5、0.55、0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、0.95或1微米；其上限为10微米，优选为9.5、9、8.5、8、7.5、7、6.5、6、5.5、5、4.5、4、3.5或3微米。更优选0.2-5微米、优选0.2-3微米、更优选0.3-2微米、更优选0.3-1微米。比如磁性微粒的平均粒径可以为0.2-5微米，优选0.2-3微米、更优选0.3-2微米、更优选0.3-1微米。如果平均粒径小于0.1微米，则价格过高，并可能造成上述免疫复合物的分离困难，可能影响AFP含量和/或AFP-L3含量的测定精确性；另一方面，如果平均粒径大于10微米，则不利于AFP检测体系和AFP-L3检测体系分别形成接近均相的反应体系，进而可能影响到AFP含量和/或AFP-L3含量的测定精确性。

上述磁性微粒A和磁性微粒B与AFP单克隆抗体的重量百分比为200-4:1，优选为40-4:1。

AFP单克隆抗体修饰的磁珠可稳定地在贮存液(20mg/mL BSA+20mg/mL甘氨酸+偶联液+0.05％Proclin 300)中或者在水与乙醇的混合溶液(乙醇含量为1-40 wt％)中存在和保存。

在一种实施方式中，作为原料的磁性微粒A与磁性微粒B相同。

在一种实施方式中，AFP第一单克隆抗体与AFP第三单克隆抗体相同，都作为 AFP的捕获抗体；AFP第二单克隆抗体则作为AFP检测抗体。此时，为简要期间，三种AFP单克隆抗体可统称为“AFP单克隆抗体”或者“AFP抗体”。

在另一种实施方式中，AFP第一单克隆抗体与AFP第二单克隆抗体不同。但AFP 第一单克隆抗体与AFP第三单克隆抗体可以相同，也可以不同。比如AFP第三单克隆抗体经过了氧化处理，但AFP第一单克隆抗体未经氧化处理。上述氧化处理比如是岩藻糖氧化和烷基化。

在一种优选的实施方式中，磁性微粒B与AFP第三单克隆抗体形成的免疫磁珠 B即AFP-L3检测体系中的连接有AFP第三单克隆抗体的磁性微粒B经过了氧化处理，比如岩藻糖氧化和烷基化。所述氧化处理比如是应用高碘酸钠(NaIO₄)和乙醇胺(C₂H₇NO)进行岩藻糖氧化和烷基化。其中高碘酸钠(NaIO₄)对AFP第三单克隆抗体上的核心岩藻糖进行氧化，乙醇胺(C₂H₇NO)对氧化后的岩藻糖进行烷基化修饰，可以起到稳定产物的作用。

由于AFP抗体的Fc片段上有两个和AFP-L3上一样的核心岩藻糖链，会对 AFP-L3检测体系造成干扰，因此本发明中优选进行岩藻糖氧化和烷基化修饰，从而消除岩藻糖链对于凝集素与AFP-L3特异性结合时的竞争性干扰，进而提高AFP-L3 检测的准确性。上述对AFP第三单克隆抗体的氧化处理，可以直接使用化学试剂比如高碘酸钠(NaIO₄)、乙醇胺(C₂H₇NO)等处理AFP第三单克隆抗体，也可以在 AFP第三单克隆抗体连接于磁性微粒B之上后再使用化学试剂来处理该免疫磁性微粒B。

作为AFP的抗体，AFP第一单克隆抗体、AFP第二单克隆抗体和AFP第三单克隆抗体是可以是鼠抗人AFP单克隆抗体、也可以是羊抗人AFP单克隆抗体或者兔抗人AFP单克隆抗体，以使得这些抗体对于来源于人的AFP具有高度的特异性。优选是鼠抗人AFP单克隆抗体。

在本发明中，当AFP第一单克隆抗体和AFP第三单克隆抗体相同、且磁性微粒 A与磁性微粒B相同时，连接了AFP第一单克隆抗体的免疫磁性微粒A与连接了 AFP第三单克隆抗体的免疫磁性微粒B相同，可以共用于AFP检测体系和AFP-L3 检测体系。这种情况下，可以将免疫磁性微粒A和免疫磁性微粒B统称为“免疫磁珠”或“免疫磁性微粒”。

为了实现化学发光检测，本发明的试剂盒中采用酶作为催化剂来催化底物的化学发光反应，所使用的酶能够催化或者激活化学发光化合物或者荧光染料，从而快速地将无色的底物转变成有色的产物、或者引起光变化，或者将非荧光的荧光染料转变成强烈的荧光产物。

在一种实施方式中，AFP检测体系和AFP-L3检测体系中的酶分别独立地选自含有过渡金属的过氧化物酶、碱性磷酸酶、磷酸酯酶和荧光素酶，更尤其优选是过氧化物酶。其中过氧化物酶可以包括：乳过氧化物酶、微小过氧化物酶、髓过氧化物酶、卤素过氧化物酶例如钒溴过氧化物酶、辣根过氧化物酶、真菌的过氧化物酶比如木质素过氧化物酶和在白腐真菌中产生的依赖Mn的过氧化物酶、以及大豆过氧化物酶。其他氧化物酶的模拟化合物并不是酶，而是具有类似过氧化物酶的活性，其包括铁络合物比如亚铁原卟啉和Mn-TPPS4(Y.X.Ci等，Mikrochem.J.，52，257-62(1995))，已知该化合物可以催化底物的化学发光氧化，这种化合物也被包含在本发明所使用的过氧化物酶含义的范围内。考虑到ELISA在蛋白质检测中的普遍适用性，优选酶是过氧化物酶、碱性磷酸酶、磷酸酯酶或荧光素酶，更优选辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase，简称HRP)。

作为酶催化的底物，这些底物是适用于化学发光检测、显色检测或者荧光检测的化合物。因此，在本发明的一个实施方式中，优选酶能够催化或者激活化学发光化合物或者荧光染料，从而快速地将无色的底物转变成有色的产物、或者引起光变化，或者将非荧光的荧光染料转变成强烈的荧光产物。比如，当酶是辣根过氧化物酶时，相应的显色化合物例如是常用的邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)比如3,3′,5,5′- 四甲基联苯胺、或2,2′-联氨-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺盐(ABTS)；当酶是磷酸酯酶(AP)时，相应的显色化合物例如是常用的对硝基苯磷酸酯(p-NPP)或者相应的荧光底物例如是(磷酸4-甲基伞酮)。优选的化学发光化合物是能够被氧化从而当存在酶和引发剂溶液时产生化学发光，其示例性化合物种类包括氨基苯二酰一肼 (鲁米诺)、异氨基苯二酰一肼、氨基丁基乙基异氨基苯二酰一肼(ABEI)、氨基己基乙基异氨基苯二酰一肼(AHEI)、7-二甲基氨基萘-l,2-二羧酸酰肼、环取代的氨基邻苯二甲酰肼、蒽-2,3-二羧酸酰肼、菲-1,2-二羧酸酰肼、芘二羧酸酰肼、5- 羟基-邻苯二甲酰肼、6-羟基邻苯二甲酰肼、2,3-二氮杂萘二酮类似物、9,10-二氢化吖啶类化合物比如9,10-二氢化吖啶酯、9,10-二氢化吖啶酯、9,10-二氢化吖啶硫酯、 9,10-二氢化吖啶磺酰胺、9,10-二氢化吖啶二硫缩烯酮化合物。一般来讲，任何已知可以在过氧化氢和过氧化物酶的作用下产生化学发光的化合物都可在本发明中被用做化学发光化合物来产生化学发光，这样的化合物包括占辛染料、芳香胺和杂环胺。可在本发明中使用的荧光染料包括可用于蛋白质的荧光免疫测定的化合物，其可共轭于蛋白质比如抗体。优选的荧光染料包括萤火虫荧光素化合物。荧光素是荧光素酶的底物，其在荧光素酶存在的条件下被氧化从而产生氧化荧光素并发光。

在一种实施方式中，AFP检测体系的酶与AFP-L3检测体系中的酶都是辣根过氧化物酶，并且作用底物都是鲁米诺。

上述试剂盒进一步包含引发剂溶液比如双氧水，用于实现酶催化反应。引发剂溶液提供了为产生对于化学发光所需激发态化合物所需要的反应物。该反应物可以是一种对于通过直接与化学发光化合物反应而进行化学发光反应所必需的反应物。例如，当催化剂是过氧化物酶时，将会发生这种情况。在一种优选实施方式中，引发剂溶液包含过氧化物化合物。该过氧化物成分是任何能够与过氧化物酶反应的过氧化物或者烷基氢过氧化物。优选的过氧化物包括过氧化氢(双氧水)、过氧化脲和过硼酸盐。该过氧化物与过氧化物酶反应，估计可能是在酶的活性部位将铁的氧化态变成了不同的氧化态。所述引发剂溶液还可以包含选自下组的过氧化物酶增强子：苯酚化合物、芳香胺、芳基硼酸化合物、芳基硼酸酯化合物、芳基硼酸酸酐化合物。

在优选的实施方式中，上述试剂盒中可进一步包括辅助试剂，比如，显色剂(底物溶液和引发剂溶液)、酶抑制剂、缓冲液、稳定剂、稀释剂、洗涤试剂、以及AFP 标准品和AFP-L3标准品。比如，所述缓冲液用于增加检测试剂的稳定性、提高检测灵敏度以及检测特异性。所述稀释剂用于稀释样本，是含有BSA的溶液。所述洗涤试剂用于洗涤磁珠，除去没有偶联到磁珠上的物质。洗涤试剂可以是含有磷酸盐、氯化钠以及表面活性剂的缓冲液。大部分辅助试剂比如显色剂、酶抑制剂、缓冲液、稳定剂、稀释剂、洗涤试剂等可共用于AFP检测体系和AFP-L3检测体系。

在优选的实施方式中，上述试剂盒还可分别包括下述物品中的至少之一：携带工具，其空间划分为可以收容一种或多种容器、96孔板或板条的限定空间，该容器例如是药瓶、试管、和类似物，每样容器都含有一个单独的用于本发明方法的组分；说明书，其可以写在瓶子、试管和类似物上，或者写在一张单独的纸上，或者在容器的外部或内部；也可以是多媒体的形式，比如CD、电脑光盘、录像等等。

本发明的试剂盒在医学领域的具体应用，主要体现在肝癌的鉴别诊断、预后评估、治疗效果监测或病程监测方面。以下以个体的血清为样本进行肝癌鉴别诊断为例，对本发明作进一步详细说明。

实施例

材料和方法

磁性微粒A和磁性微粒B相同，购自河南惠尔纳米科技(生物)有限公司，为羧基磁珠，粒径1000纳米(1微米)，型号：HRCZ-04N200。

鼠抗人AFP单克隆抗体(捕获抗体)，购自北京久峰润达生物技术有限公司，型号：JFZL0001。

鼠抗人AFP单克隆抗体(检测抗体)，购自北京久峰润达生物技术有限公司，型号：JFZL0002。

活化辣根过氧化物酶(HRP)标记试剂盒，购自北京泰天河生物科技有限公司，型号：MD010A。

辣根过氧化物酶标记的小扁豆凝集素(LCA-HRP)，购自USBiological lifeScience 公司，型号：L1665-25。

AFP标准品，购自Biovendor公司，货号：RAL-104。

AFP-L3标准品，购自Elabscience公司，货号：AF002。

吗啉乙磺酸一水合物(MES)：购自上海芃硕生物科技有限公司，货号： PM105074-500g。

N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)：购自上海子起生物科技有限公司，货号：ZQ-094746。

EDC(EDAC)：购自北京华迈科生物技术有限责任公司，货号：E046101。

吐温-20：购自生工生物工程(上海)股份有限公司，货号：T0777-500ml。

Proclin 300：购自闪晶生物公司，型号：ZB116。

包被缓冲液：碳酸盐缓冲液(pH9.5，0.05mol/L)。

封闭缓冲液：0.02M PBS，0.1％proclin-300。

洗涤缓冲液：0.15％PBST，pH7.4。

稀释液：0.05％PBST，2％BSA，0.02％Proclin 300；

化学发光底物液：购自Thermo Scientific，货号：34080，分为A液(作为HRP 底物的鲁米诺溶液)和B液(作为引发剂的双氧水)。

其他化学试剂均为分析纯，均购自中国医药(集团)上海化学试剂公司。

为简要起见，实施例中，有时将鼠抗人AFP单克隆抗体称为“AFP抗体”或者“抗体”；有时将辣根过氧化物酶称为“酶”或者“HRP”；有时将辣根过氧化物酶标记的AFP单克隆抗体称为“酶标抗体”；有时将“包被缓冲液”称为“包被液”；有时将“封闭缓冲液”称为“封闭液”；有时将“洗涤缓冲液”称为“洗涤液”。

化学发光型免疫分析仪，安图生物，型号：LUMO。

全自动磁微粒化学发光仪，江苏泽成生物技术有限公司，型号：CIA600。

实施例1免疫磁珠制备

1.1试剂的配制：

反应缓冲液：0.05M MES，0.5M NaCl，pH＝5.5；

偶联液：0.15M磷酸钠，0.15M NaCl，pH＝7.5；

封闭液：20mg/mL BSA+20mg/mL甘氨酸+偶联液；

贮存液：20mg/mL BSA+20mg/mL甘氨酸+偶联液+0.05％Proclin 300。

1.2偶联步骤：

洗涤：取300μL(1mg/mL)磁珠，加入1mL反应缓冲液震荡洗涤三次，每次1min。

活化：磁珠洗涤完毕后，吸去反应缓冲液，然后加入活化剂200μL EDC (1mg/mL)和200μL NHS(1mg/mL)，现配现用，震荡反应60min。

包被(蛋白偶联)：活化完成后，吸取1mL偶联液震荡洗涤，洗涤三次，每次1min。洗涤完成后，加入200μL偶联液，并加入包被抗体(鼠抗人AFP单克隆抗体)30μg，室温震荡反应2h。

封闭：吸去包被液，加入1mL封闭液，室温震荡反应1h。

保存：封闭完成后，用100μL封闭液洗涤3次，每次震荡洗涤5min。洗涤完成后，用贮存液定容至300μL(15人份)，于4℃冰箱保存。

实施例2用辣根过氧化物酶标记AFP单克隆抗体

用辣根过氧化物酶(HRP)对AFP单克隆抗体进行标记的实验通过试剂盒(北京泰天和公司，活化辣根过氧化物酶(A型)试剂盒)完成，具体步骤为：

准备待标记物：用超纯水将抗AFP单克隆抗体溶解至浓度约为1mg/mL；

取100μL抗体溶液，加至1.5毫升EP管中，随后加入0.2毫克REAGENT I活化的辣根过氧化物酶；

用REAGENT II将反应体系的pH调至9.5左右(大约10μL，准确记录REAGENT II用量，以备下一步使用)，37℃反应0.5-1个小时；

加入微量硼氢化钠(适合酶标抗体长期保存，用枪头粘取少量硼氢化钠转移到反应体系吹匀即可)；

加入用REAGENT III(加入体积是所加REAGENT II体积的3倍)，混匀后终止反应，得到氧化处理后的免疫磁珠；

加入甘油至50％，于-20℃保存。

得到的辣根过氧化物酶标记的AFP单克隆抗体与实施例1中得到的免疫磁珠及辅助试剂可组成甲胎蛋白AFP检测体系。

实施例3免疫磁珠氧化处理

3.1对实施例1中得到的免疫磁珠进行氧化处理，包括下述步骤：

(1)溶液配制

磷酸盐缓冲液(1xPBS)：称取8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na₂HPO₄和0.24g KH₂PO₄，溶于800mL蒸馏水中，用HCl调节溶液至pH7.4，最后加蒸馏水定容至1L；

PBST:在配置好的PBS中加入0.05％的吐温-20；

氧化缓冲液(NaIO₄溶液)：称取0.213g NaIO₄溶于100毫升上述PBS中，震荡混匀，现配现用；

乙醇胺溶液：取0.122毫升乙醇胺，加到9.878毫升水中，混匀，得到0.2M乙醇胺溶液；

(2)取1毫克免疫磁珠，加到小玻璃瓶中，并置于磁力架上，静置1分钟，移去上清液；震荡洗涤3次，每次震荡一分钟；最后移去上清液；

(3)加入0.5毫升NaIO₄溶液，混匀，置于4℃震荡处理30分钟；

(4)将玻璃瓶置于磁力架上，静置1分钟，移去上清液；震荡洗涤3次，每次震荡一分钟；最后移去上清液，加入1毫升0.2M乙醇胺溶液，室温震荡40分钟；

(5)将玻璃瓶置于磁力架上，静置1分钟，移去上清液；震荡洗涤3次，每次震荡一分钟；最后移去上清液，加入1毫升磁珠保存液，即得经氧化处理的免疫磁珠 (为简要起见，下文中有时简称为“氧化免疫磁珠”)。

3.2氧化免疫磁珠与未经氧化处理的免疫磁珠的对比试验

实验组使用氧化免疫磁珠，对照组使用未经氧化处理的免疫磁珠。

一、实验材料：

96孔板：厂家：Corning，货号：CON-43923；

辣根过氧化物酶标记的小扁豆凝集素(LCA-HRP)，购自USBiological lifeScience 公司，型号：L1665-25；

化学发光板封闭液：3％BSA、0.05％PBST；

稀释液：0.05％PBST，1％BSA，0.02％Proclin 300。

洗涤液：PBST；

二、步骤：

1.取化学发光板两条，每孔加入200μL化学发光板封闭液，于37℃温箱孵育1 小时后除掉化学发光板封闭液，并在37℃温箱干燥半小时后待用；

2.用稀释液将辣根过氧化物酶标记的小扁豆凝集素(LCA-HRP)稀释为浓度为10000、5000、2500、1250、625、312.5、156.25、0ng/mL的工作液；将标准品工作液按顺序加入到化学发光板中，待用。

3.实验组：在上述处理的其中一条酶标板中加入氧化处理后的免疫磁珠 (1mg/mL)，30μL/孔；置于磁力架上并吸除磁珠保存液，随后将步骤2中所述工作液按顺序加入到化学发光板中(100μL/孔)。对照组：所加磁珠为未经处理的免疫磁珠，其余步骤与实验组一致；37℃，震荡孵育15分钟。

4.清洗：此步骤目的是洗涤板内磁珠，需将微孔板置于磁力架上操作。吸净板中液体，加入洗涤液200μL/孔，将磁珠吹打均匀，吸净孔里的洗涤液，如此反复进行3次。

5.加入化学发光底物液：在洁净容器中预先将发光底物A液和B液以1：1的比例混合均匀，然后每孔加入100μL发光底物混合液即可。

6.读取发光强度值(RLU)：加完化学发光底物液后，须在5分钟内通过化学发光仪测量各孔的发光强度(RLU)，每孔的测量间隔时间须设定为最短。

表1.免疫磁珠氧化处理前后的对比试验

由表1可以看出，经过氧化处理，AFP单克隆抗体上的核心岩藻糖被氧化掉95％以上。

实施例4甲胎蛋白异质体AFP-L3检测体系

辣根过氧化物酶标记的小扁豆凝集素(LCA-HRP)、实施例3中得到的氧化免疫磁珠或者实施例1中得到的免疫磁珠及辅助试剂可组成甲胎蛋白异质体AFP-L3检测体系。优选包含辣根过氧化物酶标记的小扁豆凝集素(LCA-HRP)和实施例3中得到的氧化免疫磁珠的AFP-L3检测体系。

AFP-L3检测体系测定AFP-L3为两步法：先用辣根过氧化物酶标记的小扁豆凝集素(LCA-HRP)和样本(或AFP-L3标准品)一起37℃孵育15分钟，再加入磁珠 37℃孵育10分钟，之后除去上清，并清洗3-5次；然后加入HRP底物液A(比如作为HRP底物的鲁米诺溶液)和底物液B(比如作为引发剂的双氧水)的混合物，最后在全自动磁微粒化学发光仪上读取化学发光数值。

实施例5试剂盒

以实施例1中所述的甲胎蛋白AFP检测体系、实施例4中所述的甲胎蛋白异质体AFP-L3检测体系、必要的辅助试剂为基础，可组合成试剂盒。其中辅助试剂比如化学发光底物液、缓冲液、稳定剂、稀释剂、洗涤试剂可共用于AFP检测体系和AFP-L3检测体系。

本发明试剂盒的性能指标主要包括：

1.外观和性状：试剂盒各组分应齐全、完整、液体无渗漏；中文包装标签应清晰，准确、牢固。

2.准确度：采用回收实验作为准确度的评价指标。回收率均在80％～120％范围内。

3.最低检测限：AFP最低检测限不大于1.5ng/mL。AFP-L3最低检测限不大于0.8ng/mL

4.线性：AFP试剂盒2ng/mL-500ng/mL区间内，其线性相关系数(r)应不低于0.990。AFP-L3试剂盒1ng/mL-250ng/mL区间内，其线性相关系数(r)应不低于0.990。

5.重复性：变异系数(CV)不大于10％。

6.批间差：变异系数(CV)不大于15％。用3个批号试剂盒检测同一批间差参考品，则3个批号试剂盒的批间变异系数≤15.0％。

7.热稳定性：取有效期内试剂盒在37℃放置3天，检测其准确度、最低检测限、线性、重复性，应符合上述2、3、4、5项的要求。

实施例6测定AFP和AFP-L3

6.1样品预处理

对于临床血清，采血后室温下放置1-2小时，待血液凝固、血块收缩后，于3000rpm离心10分钟，取上清液以备检测分析；待测样本2-8℃存放不得超过48小时，若48 小时未检测，应存放于-20℃冰箱，但存放时间不超过30天。

6.2实验前准备

实验前需将所有试剂平衡至室温；打开化学发光型免疫分析仪，并准备好一次性反应管以及枪头，调剂仪器的反应槽温度为37℃；

1.洗涤液：用纯水将洗涤液稀释至工作浓度(稀释比例为1:25)。

2.酶标抗体：用稀释液将酶标AFP抗体稀释至工作浓度(稀释比例为1:500)，稀释的抗体当天有效。

3.酶标凝集素(辣根过氧化物酶标记的小扁豆凝集素(LCA-HRP)，购自USBiological life Science公司，型号：L1665-25)：用稀释液将酶标凝集素稀释至工作浓度(稀释比例为1:1000)，当天使用。

6.3检测总AFP的浓度

1.磁珠、标准品及样本加样

用稀释液将标准品(1mg/mL)稀释为500ng/mL，然后依次3倍稀释为166.7、 55.6、18.5、6.2、2.1、0ng/mL标准品工作液，按顺序加入到反应管中。为了保证实验的稳定性，建议标准品的每个浓度均加两个管，每管加入50μL。标准品加样完成后，将待检血清样本按顺序依次加入到反应管中，每管加入50μL。同时每管加入50μL 配制好的酶标抗体，置于37℃温箱中振荡孵育15分钟。之后加入实施例1中得到的免疫磁珠，按30μL/管加到反应管中，反应10分钟。

2.洗涤

将反应管在磁分离器上静止两分钟，然后吸出上清液，加入300μL洗涤液，混匀后在磁分离器上静止2分钟，吸出；重复两次。

3.加底物液：每个反应管加入50μL化学发光底物液A以及50μL化学发光底物液B并吹打均匀；

4.读取发光强度值(RLU)，在化学发光型免疫分析仪上读取每管的发光值；

5.如遇到高值样本，建议临床医师根据其余指标选择合适的稀释倍数对样本进行稀释。

得到了AFP标准品的检测结果，如表2所示。

表2.AFP标准品的检测结果

AFP浓度(ng/mL)	发光值	发光值(复孔)
			0.0	283.53	234.35
2.1	1569.27	1668.36
			6.2	4672.14	4827.41
18.5	12758.79	12243.29
			55.6	36278.03	35134.32
166.7	96252.42	93715.15
			500.0	190375.34	188591.44

基于检测值(需将每个非0浓度的发光值扣除0浓度的发光平均值)进行计算，绘制了AFP标准品的检测标准曲线，如图1所示，该曲线呈现理想的线性。

6.4检测AFP-L3的浓度

1.磁珠、标准品及样本加样

用稀释液将标准品(1mg/mL)稀释为250ng/mL，然后依次3倍稀释为83.3、27.8、9.3、3.1、1.0、0ng/mL标准品工作液，按顺序加入到反应管中，为了保证实验的稳定性，建议标准品的每个浓度均加两个管，每管加入50μL。标准品加样完毕后，将待检血清样本按顺序依次加入到反应管中，每管加入50μL。同时每管加入50μL配制好的酶标凝集素，置于37℃温箱中振荡孵育15分钟。之后加入实施例3中得到的氧化免疫磁珠，按30μL/管加到反应管中，反应10分钟；

2.洗涤

将反应管在磁分离器上静止两分钟，然后吸出上清液，加入300μL洗涤液，混匀，在磁分离器上静止2分钟，吸出；重复两次。

3.加底物液：每个反应管加入50μL化学发光底物液A以及50μL化学发光底物液B；

得到了AFP-L3标准品的检测结果，如表3所示。

表3.AFP-L3标准品的检测结果

AFP-L3浓度(ng/mL)	发光值	发光值(复孔)
			0.0	1256.47	1325.14
1.0	2435.18	2549.24
			3.1	3825.45	3946.64
9.3	6691.71	7026.41
			27.8	15336.57	16873.58
83.3	45128.38	43586.21
			250.0	76559.95	82355.25

基于检测值(需将每个非0浓度的发光值扣除0浓度的发光平均值)进行计算，绘制了AFP-L3标准品的检测标准曲线，如图2所示，该曲线呈现理想的线性。

6.5计算AFP、AFP-L3和AFP-L3％

1.AFP含量的计算

以AFP标准品浓度(C)的对数值lgC作为自变量(X轴)，以AFP标准品对应发光强度(RLU)的对数值lg(RLU)作为因变量(Y轴)，求出AFP标准品的线性回归方程，然后将待测样本测得的发光强度(RLU)取对数代入回归方程，求出该待测样本浓度的对数值，再取反对数即可求得样本中AFP的含量。

2.AFP-L3含量的计算

以AFP-L3标准品浓度(C)的对数值lgC作为自变量(X轴)，以AFP-L3标准品对应发光强度(RLU)的对数值lg(RLU)作为因变量(Y轴)，求出AFP-L3 的线性回归方程，然后将待测样本测得的发光强度(RLU)取对数代入回归方程，求出该待测样本浓度的对数值，再取反对数即可求得样本中AFP-L3的含量。

3.AFP-L3％的计算：

将所得AFP以及AFP-L3浓度代入到以下公式，算出AFP-L3％：

AFP-L3％＝AFP-L3/AFP×100％。

实施例7临床试验

对洛阳医院原发性肝癌145例、良性肝病(肝炎100例、肝硬化51例)151样本进行检验，所得结果如表3所示，统计学指标如表4所示。

表3.试剂盒测定AFP-L3％的统计结果

表4.试剂盒测定AFP-L3％的统计学指标

检测指标	检测切值	敏感性	特异性	诊断正确率
					AFP	>200ng/mL	73.79％	63.6％	68.58％
AFP-L3	>34.25ng/mL	60.69％	93.38％	77.36％
					AFP-L3％	>10	84.14％	87.42％	85.81％

由表3和表4可见，AFP-L3％在敏感性、特异性等方面明显优于AFP、AFP-L3 单独检测。

检测切值(cut-off)的确定：

通过对原发性肝癌145例、良性肝病151例以及健康人300例的样本(健康人样本体检结果均无传染性疾病，女性不在妊娠以及哺乳期，半年内无大手术史)进行检测，再对检测数值进行统计学分析，得出肝癌与非肝癌样本的切值为10％。

综上所述，本发明的试剂盒可用于精确测定AFP-L3％，为肝癌等恶性肿瘤的鉴别诊断、疗效评估提供有效的参考。

Claims

1.一种用于测定AFP-L3％的试剂盒，包括甲胎蛋白AFP检测体系和甲胎蛋白异质体AFP-L3检测体系，其中，所述AFP检测体系包括连接有AFP第一单克隆抗体的磁性微粒A和酶标记的AFP第二单克隆抗体；所述AFP-L3检测体系包括连接有AFP第三单克隆抗体的磁性微粒B和酶标记的凝集素，其中所述AFP-L3检测体系中的连接有AFP第三单克隆抗体的磁性微粒B经过了氧化处理，所述氧化处理是岩藻糖氧化和烷基化。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述AFP-L3检测体系中的磁性微粒B与AFP检测体系中的磁性微粒A相同。

3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述AFP第一单克隆抗体与所述AFP第二单克隆抗体不同。

4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述AFP第一单克隆抗体与所述AFP第三单克隆抗体相同。

5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述磁性微粒B和所述磁性微粒A的粒径各自是0.1-10微米。

6.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述凝集素是小扁豆凝集素或者刀豆凝集素。

7.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述酶选自过氧化物酶、碱性磷酸酶、磷酸酯酶或荧光素酶。

8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述酶是辣根过氧化物酶。

9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，还包括作为辣根过氧化物酶底物的鲁米诺溶液和双氧水，共用于AFP-L3检测体系和AFP检测体系。

10.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，AFP第三单克隆抗体与AFP第一单克隆抗体不相同，AFP第三单克隆抗体经过了氧化处理，但AFP第一单克隆抗体未经氧化处理。