CN106680482A - 尿液fxyd检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种尿液FXYD检测试剂盒,其包括:偶联有抗FXYD抗体的磁性微粒;酶标记抗FXYD多克隆抗体;FXYD标准品;化学发光底物液。该试剂盒能够定量检测尿液中的纤维蛋白原降解产物组分FXYD,具有检测时间短、灵敏度高、稳定性好、变异小的特点,能够用于肠癌的早期诊断、治疗过程中的疗效评估、以及治疗后的转移复发监控。
Description
技术领域
本发明属于生物检测领域,具体地说,涉及一种用于定量检测纤维蛋白原降解产物组分FXYD的试剂盒、尤其是用于检测尿液中纤维蛋白原降解产物组分FXYD的试剂盒。
背景技术
结肠癌、直肠癌是常见的恶性肿瘤,进展期占大多数,其发病率已居恶性肿瘤的第4位。随着经济发展,人们的生活方式、生活环境及膳食结构逐渐发生改变,导致结直肠癌的发病率呈不断上升趋势。虽然近年来结、直肠癌的诊断水平有了提高,但早期结直肠癌的检出率仍然较低,死亡率较高。据统计显示,早期结肠癌根治后5年生存率约为80%,而进展期结肠癌术后5年生存率仅为50%。因此,早期诊断是提高结肠癌治愈率的关键因素,寻找敏感性、特异性高的肿瘤标志物成为临床科学研究的重点目标。
血清肿瘤标志物CEA、CA19-9、CA242等是结肠癌诊断常用检测对象,其中以CEA为主,有40%~70%结肠癌患者中CEA增高。但这些标记物单独作为诊断指标尚不精确,敏感性较低,并且在其他消化道肿瘤及良性疾病中也有升高,因此对结肠癌早期诊断的价值有限。
纤维蛋白(原)降解产物达10余种之多,我们的研究发现,仅纤维蛋白(原)F、中间体X和Y,D和D-dimer(D二聚体)等主要大分子(缩写FXYD)与癌症进展的关系更为紧密。目前在临床上使用的纤维蛋白(原)降解产物检测仅检测其中一个组分或几个组分,而且检测方法为乳胶比浊法或酶联免疫吸附法(ELISA),这些方法检测的灵敏度还存在不够灵敏的问题。
临床上使用的FXYD测定通常是针对从受试者身上采集的血清进行FXYD测定。由于血清中包含的蛋白质种类过于庞大,氨基酸序列和高级结构相近的蛋白有很多,在含量测定时这些相似蛋白彼此之间很容易产生干扰,这在一定程度上导致血清FXYD中的精确测定存在局限性。
我们惊讶地发现,肠癌(包括结肠癌和直肠癌)患者的尿液中也存在FXYD、而健康人群的尿液中几乎检测不到FXYD或者FXYD含量很低。这一发现提示尿液中FXYD是一种肠癌标志物,其含量检测有可能成为肠癌诊断的辅助手段。尿液中FXYD反映着肿瘤的存在和生长,通过分析尿液中FXYD含量的变化,能够帮助鉴别肠癌的发生和发展的不同时期,有助于肿瘤的辅助诊断及病程监控。
尿液具有无创、可以大量获得的优点,是理想的临床研究样本。尿液与血清相比,有很多独特的优势。从尿液中寻找疾病标记物或进行生理学研究能够极大地方便疾病的诊断,并减轻受测者的心理和生理负担。检测尿液中的肠癌标志物,具有简便、快捷、易复查等优点,容易被接受,对肠癌的临床诊断具有重要意义。
发明内容
为了实现尿液中FXYD的定量检测,增加肠癌辅助诊断的准确性,从而为肠癌的辅助诊断和疗效评估提供一种新的途径,本发明基于磁微粒化学发光法,设计了一种全新的FXYD检测试剂盒,使FXYD抗体与特定的磁性微粒偶联,采用化学发光法对尿液中FXYD的含量进行精确测量。
本发明是通过以下技术方案实现的:
一种用于定量检测纤维蛋白原降解产物组分FXYD的试剂盒,其包括:偶联有抗FXYD抗体的磁性微粒;酶标记抗FXYD多克隆抗体;FXYD标准品;化学发光底物液。
在一种实施方式中,上述试剂盒中,所述抗FXYD抗体选自纤维蛋白原降解产物组分F单克隆抗体或多克隆抗体、纤维蛋白原降解产物组分X单克隆抗体或多克隆抗体、纤维蛋白原降解产物组分Y单克隆抗体或多克隆抗体、纤维蛋白原降解产物组分D单克隆抗体或多克隆抗体、纤维蛋白原降解产物组分D-dimer单克隆抗体或多克隆抗体、或它们的混合物。优选抗FXYD抗体是上述各单克隆抗体或多克隆抗体的混合物。更优选抗FXYD抗体是上述各多克隆抗体的混合物。
优选地,当所述抗FXYD抗体是混合物时,两种以上单克隆抗体或者多克隆抗体之间的摩尔比为1:1。
在一种实施方式中,上述试剂盒中,酶标记抗FXYD多克隆抗体中的抗FXYD多克隆抗体优选是纤维蛋白原降解产物组分F多克隆抗体、纤维蛋白原降解产物组分X多克隆抗体、纤维蛋白原降解产物组分Y多克隆抗体、纤维蛋白原降解产物组分D多克隆抗体和纤维蛋白原降解产物组分D-dimer多克隆抗体的混合物。优选地,各多克隆抗体之间的摩尔比为1:1。酶标记抗FXYD多克隆抗体中的抗FXYD多克隆抗体对纤维蛋白(原)降解产物中F、X、Y、D片段均有反应活性。
在一种优选的实施方式中,上述试剂盒还包括FXYD质控品。
在一种优选的实施方式中,上述试剂盒还包括稀释液和洗液。优选地,所述稀释液比如是含0.1wt%BSA的PBS缓冲液;所述洗液比如为25倍的PBST。
本发明设计的洗液主要由缓冲体系和表面活性剂组成,其中缓冲体系可以选择PBS、Tris-HCl等;表面活性剂通常选自Tween-20、Tween-80、TritonX-100等,洗液有助于清除磁珠表面附着的游离标记物,降低读数本底,提高信噪比。比如,洗液由0.01M的pH7.4磷酸盐缓冲液和0.15%Tween20配制而成,使用时可以用25倍超纯水稀释。
在一种实施方式中,上述试剂盒中的所述磁性微粒的粒径是0.1-10微米、优选0.2-5微米、优选0.2-3微米、更优选0.2-2微米、更优选0.3-1微米,以便在试剂盒使用时的检测体系形成接近均相的反应体系。
在一种优选的实施方式中,磁性微粒是超顺磁亲水高分子磁微粒。优选所述磁性微粒是表面带有氨基或羧基活性基团、以四氧化三铁为内核的聚合物。所述活性基团可以是氨基、羧基、IDA(亚氨基二乙酸)、环氧基等,优选氨基或羧基。更优选磁性微粒的表面含有羧基活性基团。
在一种优选的实施方式中,上述试剂盒中的偶联有抗FXYD抗体的磁性微粒呈磁珠悬液形式。
本发明的试剂盒中的FXYD检测体系采用酶催化的底物化学发光法,从而通过进行光电信号检测而确定样品中的FXYD含量。
在一种实施方式中,上述试剂盒中的酶优选是过氧化物酶、碱性磷酸酶、磷酸酯酶或荧光素酶,更优选辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase,简称HRP)或者碱性磷酸酶,更优选辣根过氧化物酶。
作为辣根过氧化物酶的作用底物,可以选自下组:氨基苯二酰一肼(鲁米诺)、异氨基苯二酰一肼、氨基丁基乙基异氨基苯二酰一肼(ABEI)、氨基己基乙基异氨基苯二酰一肼(AHEI)、7-二甲基氨基萘-l,2-二羧酸酰肼、环取代的氨基邻苯二甲酰肼、蒽-2,3-二羧酸酰肼、菲-1,2-二羧酸酰肼、芘二羧酸酰肼、5-羟基-邻苯二甲酰肼、6-羟基邻苯二甲酰肼、2,3-二氮杂萘二酮类似物、9,10-二氢化吖啶类化合物比如9,10-二氢化吖啶酯、9,10-二氢化吖啶酯、9,10-二氢化吖啶硫酯、9,10-二氢化吖啶磺酰胺、9,10-二氢化吖啶二硫缩烯酮化合物。优选是鲁米诺。
酶的作用底物可以单独作为试剂盒的组成部分,即,底物溶液。优选地,所述底物溶液含有鲁米诺(luminol),比如由鲁米诺和Tris-HCl缓冲液组成。通常称作化学发光底物A。
相对应地,上述试剂盒进一步包含引发剂溶液,该引发剂溶液包含过氧化氢,比如是双氧水溶液。通常称作化学发光底物B。
在一种实施方式中,上述试剂盒除了用于测定尿液中的纤维蛋白原降解产物组分FXYD外,还可以用于测定其他生物样品中的FXYD含量,所述其他生物样品来源于受测对象、尤其是有肠癌嫌疑的患者,比如是全血、血浆、血清、唾液、眼泪、体液、胃液、粪便等。
与现有的乳胶比浊法、酶联免疫吸附法(ELISA)相比,本发明的FXYD测定技术的有益效果在于:
(1)采用磁性微粒作为固相载体,增加抗体与待测物FXYD的接触机会,缩短反应时间,提高检测敏感度,线性范围宽,实现了操作的简便性和自动化性。
(2)采用尿液作为测定对象,样品来源方便,可以对患者进行无创及实时监控,可减轻受测者的心理和生理负担。并且具有稳定性好、结果准确、变异性小的特点。该试剂盒线性范围宽,为6.25~800ng/ml;特异性好,达到75%以上;发光信号强度与FXYD含量线性相关、便于精确定量,从而为肠癌临床诊断和预后提供了方便。
附图说明
图1是本发明的FXYD检测试剂盒采用不同浓度FXYD标准品绘制的标准曲线。其中,Y轴代表发光信号(强度)对数值,X轴代表FXYD标准品的浓度对数值。
图2是本发明实施例中肠癌患者与健康人血清的ROC曲线。其中,Y轴代表敏感度,X轴代表1-特异性。
具体实施方式
本文中涉及到多种物质的添加量、含量及浓度,其中所述的百分含量,除特别说明外,皆指质量百分含量。
本发明中,抗FXYD抗体既可以是纤维蛋白原降解产物组分F、X、Y、D或D-dimer的单克隆抗体,也可以是纤维蛋白原降解产物组分F、X、Y、D或D-dimer的多克隆抗体。抗FXYD抗体既可以是纤维蛋白原降解产物组分F、X、Y、D和D-dimer中之一的单克隆抗体,也可以是纤维蛋白原降解产物组分F、X、Y、D和D-dimer的单克隆抗体中两种以上的混合物。抗FXYD抗体既可以是纤维蛋白原降解产物组分F、X、Y、D和D-dimer中之一的多克隆抗体,也可以是纤维蛋白原降解产物组分F、X、Y、D和D-dimer的多克隆抗体中两种以上的混合物。
优选抗FXYD抗体是纤维蛋白原降解产物组分F、X、Y、D和D-dimer的多克隆抗体中两种以上的混合物。
优选地,当所述抗FXYD抗体是混合物时,两种以上单克隆抗体或者或多克隆抗体之间保持一定的比例,优选摩尔比为1:1。
本发明中,当与磁性微粒偶联的抗FXYD抗体是多克隆抗体时,其与被酶标记的抗FXYD多克隆抗体可以相同也可以不相同,从而可以在检测体系中形成磁珠偶联抗FXYD抗体-抗原FXYD-酶标记抗FXYD多克隆抗体的双抗夹心免疫复合物。为方便起见,本文中有时将偶联有抗FXYD抗体的磁性微粒简称为磁珠偶联抗FXYD抗体。
磁微粒免疫检测技术是利用高分子材料合成一定粒度大小的磁性固相微粒,作为载体,以物理吸附、化学偶联等方法包被具有特异性亲和力的抗体或抗原等各种免疫活性物质。磁微粒具有顺磁性,在磁场下具有磁场响应性,将磁微粒应用于免疫检测固相,增加包被表面积,从而增加抗原或抗体吸附量及接触面积,提高反应灵敏度,同时使得抗原-抗体结合物与游离抗体的分离更容易,即清洗更方便;而且磁微粒反应体系更接近于均相反应体系,加快了反应的速度,缩短了反应时间。
本发明的试剂盒的作用原理是基于磁微粒化学发光免疫检测机制。FXYD检测体系中,酶标记抗FXYD多克隆抗体、抗原FXYD和磁珠偶联抗FXYD抗体三者相结合形成双抗夹心免疫复合物,得到磁珠免疫复合物,然后利用磁场分离出该磁珠免疫复合物,加入酶促反应的化学发光底物液并借助化学发光信号来测定FXYD含量,其中的酶用于催化或激活化学发光反应。
在本发明中,术语“磁性微粒”、“磁微粒”、“磁珠”和“磁性颗粒”表示相同的意义,都是指用于将抗FXYD抗体固定在其表面的具有超顺磁性的胶态复合材料,可均匀分散于一定基液中,在磁场中富集。
在本发明中,术语“偶联有抗FXYD抗体的磁性微粒”、“磁性微粒偶联抗FXYD抗体”、“抗FXYD抗体偶联磁微粒”、“抗FXYD抗体磁性微粒”、“抗FXYD抗体磁珠”和“磁珠偶联抗FXYD抗体”表示相同的意义。
至于磁性微粒,可以使用生物检测领域中常用的磁性微粒。作为一种选择方式,可以根据需要在磁性微粒表面覆盖高分子成分比如PEI(聚醚酰亚胺Polyetherimide)、PVA(聚乙烯醇)、PS(聚苯乙烯)等聚合物,包括硅化物、多聚糖、蛋白、纤维素或树脂等。
磁微粒化学发光免疫检测所使用的磁珠具有超顺磁和相应的磁场响应性,超顺磁性在后期洗涤分离过程中更利于全自动仪器应用。根据磁珠表面基团类型,所述磁珠包括羧基磁珠、氨基磁珠、硅基磁珠、巯基磁珠、IDA(亚氨基二乙酸)磁珠、环氧基磁珠、醛基磁珠、链霉素亲和素磁珠等,本发明所提供的试剂盒中优选羧基磁珠。
在本发明的一种实施方式中,上述磁性微粒的粒径范围是0.1-10微米。磁性微粒的平均粒径的下限为0.1微米,优选为0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.55、0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、0.95或1微米;其上限为10微米,优选为9.5、9、8.5、8、7.5、7、6.5、6、5.5、5、4.5、4、3.5或3微米。更优选0.2-5微米、优选0.2-3微米、更优选0.3-2微米、更优选0.3-1微米。比如磁性微粒的平均粒径可以为0.2-5微米,优选0.2-3微米、更优选0.3-2微米、更优选0.5-1微米。如果平均粒径小于0.1微米,则不容易在反应或洗涤后从液体中分离,并可能影响FXYD含量的测定精确性;另一方面,如果平均粒径大于10微米,则在反应过程中容易发生沉降,难以形成稳定的混悬液,不利于FXYD检测体系形成接近均相的反应体系,进而可能影响到FXYD含量的测定精确性。
在反应和洗涤过程中,通过振荡等机械作用或变化的磁场等方式使磁性微粒保持悬浮状态。而在固液分离时则利用磁场吸附或离心等方式使磁性微粒沉降。
试剂盒中的偶联有抗FXYD抗体的磁性微粒优选呈磁珠悬液形式。混悬液可采用氨基戊二醛法制备,通过化学键联结磁性微粒和FXYD抗体,以0.01M的PBS和1%BSA作为缓冲体系和保护体系。
为了实现化学发光检测,本发明的试剂盒中采用酶作为催化剂来催化底物的化学发光反应,所使用的酶能够催化或者激活化学发光化合物或者荧光染料,从而快速地将无色的底物转变成有色的产物、或者引起光变化,或者将非荧光的荧光染料转变成强烈的荧光产物。
在一种实施方式中,酶选自含有过渡金属的过氧化物酶、碱性磷酸酶、磷酸酯酶和荧光素酶,更尤其优选是过氧化物酶。其中过氧化物酶可以包括:乳过氧化物酶、微小过氧化物酶、髓过氧化物酶、卤素过氧化物酶例如钒溴过氧化物酶、辣根过氧化物酶、真菌的过氧化物酶比如木质素过氧化物酶和在白腐真菌中产生的依赖Mn的过氧化物酶、以及大豆过氧化物酶。其他氧化物酶的模拟化合物并不是酶,而是具有类似过氧化物酶的活性,其包括铁络合物比如亚铁原卟啉,已知该化合物可以催化底物的化学发光氧化,这种化合物也被包含在本发明所使用的过氧化物酶含义的范围内。考虑到ELISA在蛋白质检测中的普遍适用性,优选酶是过氧化物酶、碱性磷酸酶、磷酸酯酶或荧光素酶,更优选辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase,简称HRP)。
作为酶催化的底物,这些底物是适用于化学发光检测、显色检测或者荧光检测的化合物。因此,在本发明的一个实施方式中,优选酶能够催化或者激活化学发光化合物或者荧光染料,从而快速地将无色的底物转变成有色的产物、或者引起光变化,或者将非荧光的荧光染料转变成强烈的荧光产物。比如,当酶是辣根过氧化物酶时,相应的显色化合物例如是常用的邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)比如3,3′,5,5′-四甲基联苯胺、或2,2′-联氨-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺盐(ABTS);当酶是磷酸酯酶(AP)时,相应的显色化合物例如是常用的对硝基苯磷酸酯(p-NPP)或者相应的荧光底物例如是(磷酸4-甲基伞酮)。优选的化学发光化合物是能够被氧化从而当存在酶和引发剂溶液时产生化学发光,其示例性化合物种类包括氨基苯二酰一肼(鲁米诺)、异氨基苯二酰一肼、氨基丁基乙基异氨基苯二酰一肼(ABEI)、氨基己基乙基异氨基苯二酰一肼(AHEI)、7-二甲基氨基萘-l,2-二羧酸酰肼、环取代的氨基邻苯二甲酰肼、蒽-2,3-二羧酸酰肼、菲-1,2-二羧酸酰肼、芘二羧酸酰肼、5-羟基-邻苯二甲酰肼、6-羟基邻苯二甲酰肼、2,3-二氮杂萘二酮类似物、9,10-二氢化吖啶类化合物比如9,10-二氢化吖啶酯、9,10-二氢化吖啶酯、9,10-二氢化吖啶硫酯、9,10-二氢化吖啶磺酰胺、9,10-二氢化吖啶二硫缩烯酮化合物。一般来讲,任何已知可以在过氧化氢和过氧化物酶的作用下产生化学发光的化合物都可在本发明中被用做化学发光化合物来产生化学发光,这样的化合物包括占辛染料、芳香胺和杂环胺。可在本发明中使用的荧光染料包括可用于蛋白质的荧光免疫测定的化合物,其可共轭于蛋白质比如抗体。优选的荧光染料包括萤火虫荧光素化合物。荧光素是荧光素酶的底物,其在荧光素酶存在的条件下被氧化从而产生氧化荧光素并发光。
在一种实施方式中,酶是辣根过氧化物酶,并且作用底物都是鲁米诺。
上述试剂盒进一步包含引发剂溶液比如双氧水,用于实现酶催化反应。引发剂溶液提供了为产生对于化学发光所需激发态化合物所需要的反应物。该反应物可以是一种对于通过直接与化学发光化合物反应而进行化学发光反应所必需的反应物。例如,当催化剂是过氧化物酶时,将会发生这种情况。在一种优选实施方式中,引发剂溶液包含过氧化物化合物。该过氧化物成分是任何能够与过氧化物酶反应的过氧化物或者烷基氢过氧化物。优选的过氧化物包括过氧化氢(双氧水)、过氧化脲和过硼酸盐。该过氧化物与过氧化物酶反应,估计可能是在酶的活性部位将铁的氧化态变成了不同的氧化态。所述引发剂溶液还可以包含选自下组的过氧化物酶增强子:苯酚化合物、芳香胺、芳基硼酸化合物、芳基硼酸酯化合物、芳基硼酸酸酐化合物。
在优选的实施方式中,上述试剂盒中可进一步包括辅助试剂,比如,显色剂(底物溶液和引发剂溶液)、酶抑制剂、缓冲液、稳定剂、稀释剂、洗涤试剂、以及FXYD校准品和/或FXYD质控品。比如,所述缓冲液用于增加检测试剂的稳定性、提高检测灵敏度以及检测特异性。所述稀释剂用于稀释样本,是含有BSA的溶液。所述洗涤试剂用于洗涤磁珠,除去没有偶联到磁珠上的物质。洗涤试剂可以是含有磷酸盐、氯化钠以及表面活性剂的缓冲液。
在优选的实施方式中,上述试剂盒还可分别包括下述物品中的至少之一:携带工具,其空间划分为可以收容一种或多种容器、96孔板或板条的限定空间,该容器例如是药瓶、试管、和类似物,每样容器都含有一个单独的用于本发明方法的组分;说明书,其可以写在瓶子、试管和类似物上,或者写在一张单独的纸上,或者在容器的外部或内部;也可以是多媒体的形式比如录像等。
本发明试剂盒进行FXYD的测试具有操作简单、线性范围宽、准确度高、重复性好、灵敏度高、检测时间短等优点。
本发明的试剂盒在医学领域的具体应用,主要体现在肠癌的鉴别诊断、预后评估、治疗效果监测或病程监测方面。以下以个体的尿液为样本进行肠癌癌鉴别诊断为例,对本发明作进一步详细说明。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于举例说明目的,而不是对本发明的限制。此外应理解,在阅读了本发明的构思之后,本领域技术人员对其作出的各种改变或调整,均应落入本发明的保护范围内,这些等价形式同样属于本申请所附权利要求书限定的范围。
实施例
材料和仪器
磁性微粒,粒径为300nm,为磁微粒悬液,浓度为1mg/mL,磁微粒含羧基活性基团,每毫克(mg)磁微粒羧基含量不低于0.05毫摩尔(mmol)。购自无锡百迈格生物科技有限公司。
作为标准品的FXYD蛋白冻干粉,上海良润生物医药科技有限公司。
抗FXYD多克隆抗体,可以识别降解产物F多克隆抗体、抗X多克隆抗体、抗Y多克隆抗体、D以及D-dimer的任意一种组分,上海良润生物医药科技有限公司提供。
活化辣根过氧化物酶(HRP)标记试剂盒,购自济南泰天和生物科技有限公司。
洗液:洗液含0.01M磷酸盐缓冲液PBS,0.15%Tween20,pH7.4。使用前以纯化水25倍稀释。
化学发光底物液:购自Thermo Scientific,货号:34080,分为A液(作为HRP底物的鲁米诺溶液)和B液(作为引发剂的双氧水)。
其他化学试剂均为分析纯,均购自中国医药(集团)上海化学试剂公司。
为简要起见,实施例中,有时将辣根过氧化物酶称为“酶”或者“HRP”。
磁力架,购自Corning公司。
化学发光型免疫分析仪,安图生物,型号:LUMO。
实施例1酶标抗FXYD多克隆抗体制备
酶标抗FXYD多克隆抗体为HRP标记抗体,采用活化HRP标记试剂盒(济南泰天和生物科技有限公司)制备,方法如下:
取100μL 0.01M的PBS缓冲液(pH7.4)中稀释的1mg/mL的抗FXYD多克隆抗体,加入等体积100μL的浓度为10mg/mL的活化HRP,混合均匀,用REAGENT II调节pH为9.5(大约10μL),在37℃恒温培养箱孵育0.5-1h。
用100μL枪头粘取硼氢化钠少量粉末,加入上述反应液中,37℃恒温培养箱孵育0.5-1h。
用REAGENT III终止反应,取大约三倍REAGENT II的体积(约30μL)到上述反应液中,检测pH为7.2左右,37℃恒温培养箱孵育0.5-1h,即得酶标抗FXYD多克隆抗体。
将得到的酶标抗FXYD多克隆抗体于含1-5%的BSA缓冲液中4℃保存。
实施例2抗FXYD抗体偶联磁性微粒
1、试剂的配制:
反应缓冲液:0.05M MES,0.5M NaCl,pH5.5;
偶联液:0.15M磷酸钠,0.15M NaCl,pH7.5;
封闭液:20mg/mL BSA+20mg/mL甘氨酸+偶联液;
贮存液:20mg/mL BSA+20mg/mL甘氨酸+偶联液+0.05%Proclin 300。
2、磁珠偶联抗体
洗涤:取300μL(1mg/mL)磁珠,加入1mL反应缓冲液震荡洗涤三次,每次1min。
活化:磁珠洗涤完毕后,吸去反应缓冲液,然后加入活化剂200μL EDC(1mg/mL)和200μL NHS(1mg/mL),现配现用,震荡反应60min。
包被(蛋白偶联):活化完成后,吸取1mL偶联液震荡洗涤,洗涤三次,每次1min。洗涤完成后,加入200μL偶联液,并加入抗FXYD多克隆抗体30μg,室温震荡反应2h。
封闭:吸去包被液,加入1mL封闭液,室温震荡反应1h。
保存:封闭完成后,用100μL封闭液洗涤3次,每次震荡洗涤5min。洗涤完成后,用贮存液定容至300μL(15人份),于4℃冰箱保存。
实施例3试剂盒组成
试剂盒包括:偶联有抗FXYD抗体的磁性微粒混悬液、FXYD质控品、FXYD标准品、酶标抗FXYD多克隆抗体、化学发光底物A、化学发光底物B以及洗液。
一、试剂盒组分
1、FXYD标准品浓度分别为0、6.25ng/mL、18.75ng/mL、37ng/mL、111ng/mL、333ng/mL、1000ng/mL,各0.6mL。
2、FXYD质控品200ng/mL,0.6mL。
3、偶联有抗FXYD抗体的磁性微粒混悬液3mL。
4、酶标抗FXYD多克隆抗体20mL。
5、25倍洗液25mL
6、发光底物液A、B各8mL。
二、试剂盒试剂制备
所述标准品以pH7.35-7.45的Tris缓冲液作为校准品的基质,标定高浓度的FXYD蛋白,倍比稀释后配制成系列浓度,配制的系列浓度为0、6.25ng/mL、18.75ng/mL、37ng/mL、111ng/mL、333ng/mL、1000ng/mL。
抗FXYD抗体的磁性微粒混悬液是以四氧化三铁作为固相载体,将抗体偶联于磁性微粒表面。
洗液是含0.15%Tween20的0.01M磷酸盐缓冲液pH7.4。
化学发光底物液包括A液和B液,A液为鲁米诺,B液为H2O2。
实施例4试剂盒检测体系
一、检测体系
尿液FXYD检测为磁微粒夹心一步法化学发光检测。
1、向反应孔/管分别加入FXYD标准品、FXYD质控品和待测样本100uL;
2、每管各加入酶标抗FXYD多克隆抗体100μL,充分混匀后37℃温育30分钟;
3、每管各加入30μL抗FXYD抗体的磁性微粒混悬液,充分混匀后37℃温育15分钟;
4、反应液在磁力分离器上静置5分钟,弃上清,沉淀物用洗液洗两遍;
5、每管各加入发光底物液100μL,半自动/全自动化学发光仪上测量发光强度RLU,依据校准曲线,计算样本对应的FXYD蛋白浓度。
二、试剂盒性能
本发明试剂盒的性能指标主要包括:
1.外观和性状:试剂盒各组分应齐全、完整、液体无渗漏;中文包装标签应清晰,准确、牢固。
2.准确度:回收试验,回收率(实测浓度与理论浓度的比值)为在85%~115%范围内,见下表。准确度参考品A 700ng/ml按1:10比例取10μL加到准确度参考品B中,检测回收率。准确度回收率大为93.5%。
3.最低检测限:FXYD最低检测限不大于5ng/mL。
对检测限参考品进行重复测定20次,得出20次测量结果的RLU值(相对发光值),计算其平均值(M)和标准差(SD),将M+2SD所对应的RLU的对数值带入标曲方程中,经过计算求出对应的最低检测限浓度值。
4.线性:在6.25ng/mL-1000ng/mL区间内,其线性相关系数(r)大于0.990。图1显示了用FXYD标准品绘制的标准曲线。
5.重复性:检测200ng/mL的变异系数CV为3.4%。
6.批间差:3个批次试剂盒批间变异系数(CV)为6.9%。
实施例5试剂盒在诊断肠癌中的应用
用试剂盒检测尿液中的FXYD,考察作为肠癌辅助诊断手段的可行性。
一、尿液FXYD检测试剂盒在肠癌辅助诊断上的应用
收集120例肠癌患者的术前尿液样本,同时收集160例正常人尿液样本,每例2mL。使用试剂盒检测尿液中FXYD蛋白浓度,然后根据检测结果绘制ROC曲线(图2)。
结果显示,区分肠癌患者于正常人的cutoff值为65.8ng/ml,曲线下面积为0.856,诊断灵敏度为75.8%,特异性为92.7%,准确度为83.6%。
二、尿液FXYD检测试剂盒在肠癌疗效评估上的应用
选取10例肠癌患者,手术一月后,收集尿液样本,与术前样本进行对比,检测结果如表1所示。
表1、FXYD酶联免疫检测试剂盒监控胃肠道间质瘤转移复发结果
患者编号 | 术前(ng/mL) | 术后(ng/mL) |
1 | 98.6 | 54.3 |
2 | 198.7 | 45.5 |
3 | 128.3 | 79.3 |
4 | 375.1 | 120.5 |
5 | 267.2 | 98.5 |
6 | 154.7 | 76.4 |
7 | 356.2 | 52.7 |
8 | 459.6 | 38.5 |
9 | 246.8 | 55.6 |
10 | 542.3 | 168.7 |
通过肠癌患者术前术后检测结果分析发现,术后尿液中FXYD蛋白检测值均下降,且变化差异显著(p<0.05)。因此,尿液中FXYD蛋白的检测对肠癌症患者的疗效评估有预示作用。
综上所述,本发明的试剂盒可用于精确测定尿液中的FXYD含量,为肠癌的早期鉴别诊断、疗效评估提供有效的参考。
Claims (10)
1.一种用于定量检测纤维蛋白原降解产物组分FXYD的试剂盒,其包括:偶联有抗FXYD抗体的磁性微粒;酶标记抗FXYD多克隆抗体;FXYD标准品;化学发光底物液。
2.如权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述抗FXYD抗体选自纤维蛋白原降解产物组分F单克隆抗体或多克隆抗体、纤维蛋白原降解产物组分X单克隆抗体或多克隆抗体、纤维蛋白原降解产物组分Y单克隆抗体或多克隆抗体、纤维蛋白原降解产物组分D单克隆抗体或多克隆抗体、纤维蛋白原降解产物组分D-dimer单克隆抗体或多克隆抗体、或它们的混合物。
3.如权利要求2所述的试剂盒,其特征在于,当抗FXYD抗体是混合物时,两种以上单克隆抗体或者或多克隆抗体之间的摩尔比为1:1。
4.如权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述酶标记抗FXYD多克隆抗体中的抗FXYD多克隆抗体是纤维蛋白原降解产物组分F多克隆抗体、纤维蛋白原降解产物组分X多克隆抗体、纤维蛋白原降解产物组分Y多克隆抗体、纤维蛋白原降解产物组分D多克隆抗体和纤维蛋白原降解产物组分D-dimer多克隆抗体的混合物。
5.如权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,还包括FXYD质控品。
6.如权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述磁性微粒的粒径是0.1-10微米。
7.如权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述酶选自过氧化物酶、碱性磷酸酶、磷酸酯酶或荧光素酶。
8.如权利要求7所述的试剂盒,其特征在于,所述酶是辣根过氧化物酶。
9.如权利要求8所述的试剂盒,其特征在于,所述化学发光底物液包括作为辣根过氧化物酶底物的鲁米诺溶液和双氧水。
10.如权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,用于测定尿液中的纤维蛋白原降解产物组分FXYD。
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