WO2004048975A1 - 黄色ブドウ球菌の検査方法 - Google Patents
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Definitions
- the present invention relates to a method for testing a Staphylococcus aureus in a sample with high sensitivity without culturing.
- Staphylococcus aureus is a bacterium belonging to the genus Staphyl ococcus, which has a positive Gram stain and has an irregular grape cluster under a microscope, and various toxins and enzymes. Is a major pathogenic bacterium that produces suppurative diseases in mammals and is a representative bacterial species that causes food poisoning in humans.
- M R S A methicillin-resistant Staphylococcus aureus
- a type of Staphylococcus aureus has received special attention as a causative agent of hospital infection.
- protein A is known to have a binding site to the Fc portion of immunoglobulin G (IgG) derived from mammals.
- IgG immunoglobulin G
- a gene amplification method (Ikunoyuki Kato, Proteins, Nucleic Acids, Enzymes, Vol. 35, p. 2957 (1990)) has been attempted as a rapid and highly sensitive method for detecting bacterial infections.
- staphylococcus is one of the indigenous bacteria, a small amount of bacterial genes contaminated from the outside can often result in a positive test even in non-infected individuals, and infectious diseases caused by indigenous bacteria such as Staphylococcus aureus There is a problem in the determination of.
- MRSA a method was developed using gene amplification to detect MRSA without waiting for the results of susceptibility tests by detecting the mecA gene involved in drug resistance. (Oigata et al., I. Clin. Microbiol., 30, P. 1728-1733 (1992)), which has already been put into practical use, but the me c A gene is not only used for S. aureus but also for other staphylococci ( CNS), which has the problem that MR SA and CNS cannot be clearly distinguished in the detection of mecA gene. Disclosure of the invention
- the present invention provides a method for testing Staphylococcus aureus in a sample in a short time and with high sensitivity.
- the aim is to provide a method.
- the present inventors have conducted intensive studies on an immunoassay using an antibody against protein A, and found that a highly sensitive immunoassay using at least one kind of mouse IgG1 monoclonal antibody was performed. Sensitivity to protein A antigens in body fluids such as blood, urine, sputum, cerebrospinal fluid, pleural effusion, ascites, and pus of patients infected with Staphylococcus aureus The present inventors have found that they can be detected or quantified well, and that S. aureus in a sample can be quickly tested, and thus completed the present invention.
- the present invention provides a method for examining Staphylococcus aureus in a sample by an immunoassay using an antibody against protein A, wherein at least one kind of mouse IgG1 monoclonal antibody is used. It provides a test method for Staphylococcus aureus.
- the present invention also provides a kit for testing Staphylococcus aureus in a sample, which comprises at least a mouse IgG1 anti-protein A monoclonal antibody and a reagent for detecting a label. It is.
- protein A can be measured with high sensitivity without being affected by IgG or the like in a sample, and the presence or absence of Staphylococcus aureus infection can be easily and quickly examined. Even if the Staphylococcus aureus is MRSA, it can be tested for the presence of infection.
- FIG. 1 is a view showing a standard curve of purified port Tin A measured by San Deutsch enzyme immunoassay 1.
- FIG. 2 is a diagram showing a standard curve of purified protein A measured by sandwich enzyme immunoassay 2.
- FIG. 3 is a diagram showing the amount of protein A in the culture supernatant measured over time.
- FIG. 3 is a view showing measurement of protein A in blood (4 persons) and urine (2 persons).
- test method for Staphylococcus aureus of the present invention directly detects protein A produced by Staphylococcus aureus in a sample by an immunoassay.
- Staphylococcus aureus means Staphylococcus aureus, and includes methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA).
- MRSA methicillin-resistant Staphylococcus aureus
- the sample used in the present invention may be any biological sample in which Staphylococcus aureus can be present, and examples thereof include body fluid components such as blood, urine, sputum, cerebrospinal fluid, pleural effusion, ascites, and pus. That is, not only those having a high concentration of bacteria such as sputum and urine, but also those having a low concentration of bacteria such as blood fluid, pleural effusion and ascites (for example, 10 to 10 3 cfu / mL)
- Pre-culture It is possible to directly detect or quantify protein A without performing the operation of concentrating protein A in the test sample.
- the sample may be used not only as it is, but also diluted with a buffer such as a phosphate buffer.
- the buffer for dilution of such a sample may be a suitable buffer for stabilizing the antigen.
- Proteins such as BSA, HSA, and gelatin can coexist.
- any highly sensitive method capable of measuring protein A produced by Staphylococcus aureus up to 100 pg ZmL or less, more preferably up to 10 pg / mL or less.
- known immunological assays such as enzyme immunoassay, radiolabeled immunoassay (Radio Immunoassay), immunochromatography, and fluorescence immunoassay can be used, but in particular safety and sensitivity.
- an enzyme immunoassay is preferred.
- Enzyme-linked immunosorbent assays include peroxidase, alkaline phosphatase, The amount of a correlated antibody or antigen is measured by detecting the enzyme activity of an enzyme-labeled antibody using an enzyme such as tosidase, and the colorimetric method, The fluorescence method and the chemiluminescence method (chemiluminescence enzyme immunoassay (CLE IA)) are known.
- the colorimetric method is generated by the enzymatic decomposition reaction of enzyme substrates such as hydrogen peroxide / o-phenylenediamine, p-nitrophenyl phosphoric acid, o-ditrophenyl-2-u
- the enzyme activity is quantified by measuring the amount of coloring of the chromogenic substance, and the fluorescence method is based on the catalytic activity of the enzyme, and depends on the catalytic activity of the enzyme, 4_hydroxyphenylacetic acid, 4-methyl-mbelliferyl phosphate, 4-methyl- After decomposing a fluorescent substrate such as muveriferyl-0-galactoside to generate fluorescence, the fluorescence intensity is measured to quantify the enzyme activity.
- the chemiluminescence method (CLE IA) is a technique for quantifying enzyme activity by measuring the amount of light emitted when the chemiluminescent substance is excited by the enzyme's catalytic activity and returning from this state to the ground state. .
- a chemiluminescent enzyme immunoassay which does not require a light source because it emits a chemiluminescent substance, and enables highly sensitive detection exceeding colorimetric and fluorescent methods. preferable.
- Enzymes used in CLE IA include peroxidase, alkaline phosphatase, / 3-galactosidase, glucose oxidase, glucose-16-phosphate dehydrogenase, and the like; chemiluminescent substances include luminol derivatives , Luminols such as iso-luminol derivatives, lucigenin (N, N'-dimethyl-9,9'-bisacridinium nitrate), bis (2,4,6-trichlorophenol) oxalate, etc.
- a combination of a luminol / hydrogen peroxide substrate and peroxidase is preferable (Akio Tsuji, et al., Proteins, Nucleic Acids, Enzymes, Separate Volume Vo 1.31, p. 51-63 (1 987) ).
- D-(-) luciferin, 6-hydroxybenzothiazole, p-phenol and the like can coexist in a chemiluminescence reaction system to increase the luminescence.
- the means for measurement is not particularly limited, and any of a competitive method and a sandwich method may be used. However, a two-antibody sandwich method is preferable because highly sensitive measurement is possible. .
- At least one kind of mouse IgG1 monoclonal antibody is used as an antibody against protein A, which may be a primary antibody or a secondary antibody.
- the mouse IgG1 monoclonal antibody which is a mouse-derived monoclonal antibody whose antibody subclass is IgGl, has a low affinity for the Fc binding site of immunoglobulin in protein A. Therefore, by using this, a substance (a substance having an Fc binding site of immunoglobulin) that non-immunologically binds to a mammal-derived antibody, a microorganism that produces the substance, or IgG can be mixed. Even if the sample is present, protein A can be measured reliably, and Staphylococcus aureus can be tested specifically and with high sensitivity.
- At least one of the primary antibody and the secondary antibody is a mouse IgG1 monoclonal antibody that recognizes an Fc non-binding site of protein A, and the other is the mouse IgG.
- mouse IgG1 monoclonal antibody which has a different recognition site from monoclonal antibody
- polyclonal antibody IgG derived from mammals other than mouse eg, egrets, goats, etc.
- enzymes such as pepsin or reduction.
- a mouse IgG1 monoclonal antibody can be prepared, for example, by preparing a mouse monoclonal antibody that recognizes protein A according to a conventional method, and then selecting a monoclonal antibody having a subclass of IgG1 using a mouse IgG subcluster typing kit. Just fine.
- the above-mentioned anti-protein A polyclonal antibody and monoclonal antibody can also be obtained by preparing a purified antigen by a known method.
- the solid phase carrier used for immobilizing the primary antibody is not particularly limited, such as a glass or plastic tube, plate, jewel or bead, magnetic particles, latex, membrane, fiber, and the like.
- a chemical bonding method using various cross-linking agents such as dartal aldehyde and carbodiimide can be used. For example, after diluting the antibody with a phosphate buffer, this is brought into contact with the surface of the solid support, and You only need to incubate for a minute.
- the secondary antibody may be labeled directly with radioisotopes, enzymes, biotin, fluorescent substances, chemiluminescent substances, colloidal gold, latex, ferrite particles, etc., but as described above, it is highly safe and good. It is preferable to perform enzyme labeling because a high measurement result can be expected. Suitable labeling enzymes include peroxidase, alkaline phosphatase, and galactosidase, which are excellent in stability and whose enzyme activity is easily measured. Detection or quantification of the bound secondary antibody can be performed according to any known method. For example, it is possible to directly detect or measure a secondary antibody itself labeled with an enzyme, a luminescent substance, a fluorescent substance, or the like. The antibody can be labeled by various methods, and the label of the tertiary antibody can be detected or quantified.
- an enzyme-labeled secondary antibody is reacted with a substrate (a chromogenic substrate, a fluorescent substrate, or a chemiluminescent substrate) specific to the enzyme to generate color, fluorescence,
- a substrate a chromogenic substrate, a fluorescent substrate, or a chemiluminescent substrate
- a method of generating luminescence or the like and detecting the signal with a measuring instrument can be mentioned, and a method using a chemiluminescent substrate capable of highly sensitive detection is particularly preferable.
- the kit for testing for Staphylococcus aureus infection of the present invention is a kit for performing the method for detecting Staphylococcus aureus in the above-mentioned sample, and includes at least the above-mentioned mouse IgG1 anti-protein A monoclonal antibody. It contains a reagent for detecting a labeled substance such as an enzyme and the like, and contains a buffer for diluting a sample, a buffer for diluting various reagents, a washing solution, and the like as necessary.
- a reagent for detecting a labeled substance such as an enzyme and the like
- a microtiter plate on which the mouse IgG1 anti-protein A monoclonal antibody prepared in (1) of Example 1 was immobilized was diluted with purified water using a block base (diluted block ace) diluted 10-fold with purified water. 0.5, 1, 5, 10, 5 Add 50 g / well of purified protein A diluted with OngZmU. After the reaction at 4 ° C, wash each well with 1T PBS. Dilute the biotinylated secondary antibody of Example 1 to 2.9 xg / mL with Dilution Block Ace and add 50 L / well. After reacting for 1 hour at room temperature, wash each well with PBS-T.
- Protein A concentration was measurable in the range of 0.5 to 5 Ong / mL.
- Protein A concentration was measurable in the range of 0.01 to 1 OngZmL.
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Abstract
本発明は、プロテインＡに対する抗体を用いた免疫学的測定法により検体中の黄色ブドウ球菌を検査する方法であって、少なくとも１種のマウスＩｇＧ１モノクローナル抗体を用いることを特徴とする黄色ブドウ球菌の検査方法、少なくともマウスＩｇＧ１抗プロテインＡモノクローナル抗体と標識体を検出する試薬を含有する検体中の黄色ブドウ球菌を検査するための検査キットに関する。 これを用いることにより、検体中の黄色ブドウ球菌を、短時間で且つ感度よく検査することができる。
Description
明 細 書
黄色ブドウ球菌の検査方法 技術分野
本発明は、 検体中の黄色ブドウ球菌を培養することなく、 高感度で検査する方 法に関する。 背景技術
黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus, S. aureus)は、グラム染色で陽性を呈 し、 顕微鏡下で不規則なブドウの房状を呈するブドウ球菌 (Staphyl ococcus)属に 属する細菌で、 各種の毒素や酵素を産生し、 ヒ卜ゃ哺乳動物に化膿性疾患を惹起 する主要な病原性細菌であり、 またヒトの食中毒の原因となる代表的菌種でもあ る。 また、 黄色ブドウ球菌の一種である M R S A (メチシリン耐性黄色ブドウ球 菌） は、 病院感染の原因菌として特に注目されている。
黄色ブドウ球菌の検出は、 選択分離培地を用いて前培養を行い、 疑わしいコロ ニーを拾って、 菌鑑別のための同定試験を行う培養法が従来から多用され、 菌の 同定試験は、 コアダラーゼ産生能の有無を調べることや、 黄色ブドウ球菌が産生 するサーモヌクレア一ゼ、 ェンテロトキシン、 プロティン Aに対する抗体を免疫 学的に測定すること (Archivfur Lebensmi t te lhygi ene. 35, 97 (1984)、特開平 6— 6 8 8 2 4号公報、 特開平 9— 2 1 1 0 0 0号公報） 等、 により行われている。 斯かる従来法は、 いずれも菌の培養が必要であり、 細菌の同定には長時間を要 し、 同定結果がでた時点では、 既に患者の様態が悪化しており、 同定結果が意味 をなさないことが多く、 また多量の抗菌薬を投与している患者では微量の細菌が 血液中に存在していても検出されない可能性もあった。
これに対して、 近年、 プロテイン Aを標的とし、 試料の前培養が不要な高感度 測定法がいくつか報告されている (Journal of I匪 imological Methods, 83 (198
5) 169-177、 Journal of Immunological Methods, 117 (1989) 83-89、 Journal of I讓漏 logical Methods, 142 (1991) 53-59)。 これらの方法は、 いずれもサンドィ ツチ酵素免疫測定法が採用されており、 それぞれ固相化したゥサギ抗プロテイン A抗体とアルカリホスファターゼ標識されたゥサギ抗プロティン A抗体の組み合 わせ、 固相化したゥサギ抗プロテイン A抗体と HRP標識されたゥサギ抗プロテ イン A抗体の F (a b ' ) 2の組み合わせ、 そして固相化したニヮトリ抗プロテ イン A抗体 （I gY) とピオチン標識されたゥサギ抗プロテイン A抗体の組み合 わせの系から構成されている。
しかしながら、 プロテイン Aは、 哺乳類由来の免疫グロブリン G (I gG) の F c部分との結合部位をもつことが知られているため、 いずれの測定系において も固相化した抗体と標識した抗体の両方又はいずれか一方の抗体に使用している I gGとプロテイン Aの Fc結合部位とが相互作用を起こすという問題があった。 一方、 迅速かつ高感度に細菌感染を検出する方法として、 遺伝子増幅法 （加藤 郁之進、 蛋白質 ·核酸 ·酵素、 Vol.35， p.2957 (1990)) も試みられているが、 黄 色ブドウ球菌は常在菌の一つであるため、 外部から微量の細菌遺伝子が混入する ことによって、 非感染者においても陽性判定される恐れが多く、 黄色ブドウ球菌 のような常在菌による感染症の判定には問題がある。また、 MR S Aについては、 薬剤耐性に関与している me c A遺伝子を検出することによって、 感受性試験の 結果を待たずに、 MR S Aの判定を行える方法が遺伝子増幅法を応用して開発さ れ （生方ら、 I. Clin. Microbiol., 30, P.1728-1733(1992)) 、 すでに実用化さ れているが、 me c A遺伝子は黄色ブドウ球菌だけでなく他のブドウ球菌 （CN S) でも有していることがあり、 me c A遺伝子の検出では MR S Aと CNSが 明確に区別できないという問題があった。 発明の開示
本発明は、 検体中の黄色ブドウ球菌を、 短時間で且つ感度よく検査するための
方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、 プロテイン Aに対する抗体を用いた免疫学的測定法に関して、 鋭意検討したところ、 少なくとも 1種のマウス I g G 1モノクローナル抗体を用 いた高感度な免疫学的測定法を行うことによって、 黄色ブドウ球菌に感染した患 者の血液、 尿、 喀痰、 髄液、 胸水、 腹水、 膿等の体液成分中に存在するプロティ ン A抗原を、 I g Gの影響を受けることなく、 感度良く検出又は定量でき、 検体 中の黄色ブドウ球菌が迅速に検査できることを見出し、 本発明を完成した。 すなわち本発明は、 プロテイン Aに対する抗体を用いた免疫学的測定法により 検体中の黄色ブドウ球菌を検査する方法であって、 少なくとも 1種のマウス I g G 1モノクローナル抗体を用いることを特徴とする黄色ブドウ球菌の検査方法を 提供するものである。
また本発明は、 検体中の黄色ブドウ球菌を検査するためのキットであって、 少 なくともマウス I g G 1抗プロテイン Aモノクローナル抗体と標識体を検出する 試薬を含有する検査キットを提供するものである。
本発明によれば、 検体中の I g G等の影響を受けることなくプロテイン Aを高 感度で測定することができ、 簡易且つ迅速に黄色プドウ球菌感染症の有無を検査 することができる。 また、 黄色ブドウ球菌が M R S Aであっても、 感染症の有無 を検査することができる。 図面の簡単な説明
図 1は、 サンドイツチ酵素免疫測定法 1によつて測定した精製プ口ティン Aの 標準曲線を示した図である。
図 2は、 サンドィツチ酵素免疫測定法 2によって測定した精製プロティン Aの 標準曲線を示した図である。
図 3は、 培養上清中のプロティン A量を経時的に測定した図である。
図 4は、 健常人の血清 （3人） 及び尿中 （3人） 、 黄色ブドウ球菌感染患者の
血中 （4人） 及び尿中 （2人） のプロテイン Aを測定した図である。 発明を実施するための最良の形態
本発明の黄色プドウ球菌の検査方法は、 検体中における黄色ブドウ球菌が産生 するプロテイン Aを免疫学的測定法により直接検出するものである。
従って、 検体 （被検試料） の前培養や、 遠心法、 カラム分離法、 沈殿法等によ つて検体中のプロテイン Aを濃縮する操作は特に必要としない。
尚、 黄色ブドウ球菌とは、 Staphylococcus aureusを意味し、 メチシリン耐性黄 色ブドウ球菌 （M R S A) も包含される。
本発明に用いる検体としては、 黄色ブドウ球菌が存在しうる生体試料であれば いずれのものでもよく、 例えば血液、 尿、 喀痰、 髄液、 胸水、 腹水、 膿等の体液 成分等が挙げられる。 すなわち、 喀痰、 尿等の菌濃度が高いものだけでなく、 血 液、 胸水、 腹水等の菌濃度が低い （例えば、 1 0〜 1 0 3cfu/mL) ものであっても 、被検試料の前培養ゃ被検試料中のプロテイン Aを濃縮する操作をすることなく、 直接検出又は定量することが可能である。
尚、 検体はそのまま用いるだけでなく、 リン酸緩衝液等の緩衝液で希釈したも のを用いてもよく、 斯かる検体の希釈用緩衝液には、 抗原を安定化するために、 適当な蛋白、 例えば B S A、 H S A、 ゼラチン等の蛋白を共存させることができ る。
本発明における免疫学的測定法としては、 黄色ブドウ球菌が産生するプロティ ン Aが 1 0 0 p g ZmL以下まで、 より好ましくは 1 0 p g /m L以下まで測定 できる高感度な方法であれば特に限定されず、 酵素免疫測定法、 放射標識免疫測 定法 (ラジオィムノアツセィ) 、 ィムノクロマト法、 蛍光免疫測定法等の公知の 免疫学的測定法が使用できるが、 特に安全性及び感度の点から酵素免疫測定法が 好ましい。
酵素免疫測定法は、 ペルォキシダ一ゼ、 アルカリホスファターゼ、 ；3—ガラク
トシダーゼ等の酵素を用いた酵素標識抗体の酵素活性を検出することにより、 相 関性を有する抗体又は抗原の量を測定するものであるが、 当該酵素活性を検出す る方法により比色法、 蛍光法、 化学発光法 （化学発光酵素免疫測定法 （CLE I A) ) が知られている。 比色法は、 過酸化水素 /o—フエ二レンジァミン、 p— ニトロフエ二ルリン酸、 o—二トロフエ二ルー |3—D—ガラクトピラノシド等の 酵素基質の酵素による分解反応に伴い生成する発色性物質の発色量を測定して酵 素活性を定量するものであり、 蛍光法は、 酵素の触媒活性により、 4_ヒドロキ シフエニル酢酸、 4ーメチルゥムベリフェリルリン酸、 4—メチルゥムベリフエ リル— 0—ガラクトシド等の蛍光基質を分解して蛍光を発生させた後、 この蛍光 強度を測定して酵素活性を定量するものである。 そして、 化学発光法 （CLE I A) は、 酵素の触媒活性によって化学発光物質が励起状態となり、 この状態から 基底状態に戻る際に放出される発光量を測定して酵素活性を定量するものである。 本発明においては、 このうち、 化学発光性物質を発光させるため光源が不要であ り、 比色法及び蛍光法を上回る高感度な検出が可能である化学発光酵素免疫測定 法を用いるのが特に好ましい。
CLE I Aに用いられる酵素としては、 ペルォキシダーゼ、 アルカリホスファ ターゼ、 /3—ガラクトシダ一ゼ、 グルコースォキシダーゼ、 グルコース一 6—リ ン酸脱水素酵素等が挙げられ、 化学発光物質としては、 ルミノール誘導体、 イソ ルミノール誘導体等のルミノール類、 ルシゲニン (N, N' 一ジメチルー 9, 9 ' 一ビスァクリジニゥムナイトレート） 、 ビス （2, 4， 6—トリクロ口フエ二 ル） ォキザレ一ト等が挙げられ、 このうち、 ルミノール/過酸化水素の基質とぺ ルォキシダーゼとの組み合わせが好ましい （辻章夫ら、 蛋白質 ·核酸 ·酵素、 別 冊 Vo 1. 3 1、 p. 51 - 63 (1 987) ) 。 そして、 必要があれば D— ( ―) ールシフェリン、 6—ヒドロキシベンゾチアゾール、 p—ョ一ドフエノール 等を化学発光反応系に共存させることによって、 その発光を増発光させることが できる。
本発明の免疫学的測定法は、 測定手段は特に限定されるものでなく、 競合法又 はサンドイッチ法の何れでもよいが、 高感度な測定が可能なことから、 二抗体サ ンドィツチ法が好ましい。
本発明の免疫学的測定法においては、 プロテイン Aに対する抗体として、 少な くとも 1種のマウス I gG 1モノクローナル抗体が用いられ、 これは一次抗体で あっても、 二次抗体であってもよい。
マウス由来のモノクローナル抗体であって、 抗体のサブクラスが I gG lであ るマウス I g G 1モノクローナル抗体は、 プロティン Aにおける免疫グロプリン の F c結合部位との親和性が低い。 従って、 これを用いることにより、 哺乳動物 由来の抗体と非免疫学的に結合する物質 （免疫グロプリンの F c結合部位を有す る物質） やそれを生産する微生物、 或いは I gGが混在している検体であっても プロテイン Aを確実に測定でき、 黄色ブドウ球菌を特異的に且つ高感度で検査す ることが可能となる。
二抗体法を用いる場合、 一次抗体又は二次抗体の少なくとも一方にマウス I g G 1モノクローナル抗体であって、 プロティン Aの F c非結合部位を認識する抗 体を用い、 他方は前記マウス I gG lモノクローナル抗体とは認識部位の異なる マウス I gG 1モノクローナル抗体の他、 マウス以外の哺乳動物 （例えば、 ゥサ ギ、 ャギ等） 由来のポリクローナル抗体 I g Gをペプシン等の酵素処理や還元処 理によって F c部位を切断して得られる抗体断片 （F (ab' ) 2、 F ab' 、 F a b断片等） 、 I gG l以外のモノクローナル抗体の F c部位を切断して得ら れる抗体断片 （F (a b ' ) 2、 F a b' 、 F a b断片等） であって、 プロティ ン Aの F c非結合部位を認識する抗体、 ラッ卜由来 I gG抗体、 哺乳動物由来 I gM抗体、 ニヮトリ由来 I gY抗体等のプロティン Aの F c結合部位とは反応し ない抗体を用いるのが好ましく、 特に哺乳動物由来のポリクローナル抗体 I g G をペプシン処理して得られる F (ab' ) 2断片を用いるのが好ましい。
斯かる抗体を選択することにより、 I gGとプロテイン Aの F c結合部位との
相互作用を完全に排除することができる。
マウス I g G 1モノクローナル抗体は、 例えば、 常法に従って、 プロテイン A を認識するマウスモノクローナル抗体を作製後、 マウス I g Gのサブクラスタイ ピングキットによって、 サブクラスが I g G 1のモノクローナル抗体を選択すれ ばよい。
また、 上記、 抗プロテイン Aポリクローナル抗体、 モノクローナル抗体につい ても、 精製抗原を用いて、 公知の方法により調製することにより得ることができ る。
以下に、 マウス I g G 1モノクローナル抗体を一次抗体として用いたサンドィ ツチ法の一例を具体的に説明する。
1 ) 適当な固相担体の表面にマウス I g G 1抗プロテイン Aモノクローナル抗 体を吸着固定する。
2 ) 該抗体と黄色プドウ球菌を含有する検体とを接触せしめ、 検体中の黄色ブ ドウ球菌が産生するプロテイン Aを固相担体に固定された抗体と特異的に結合さ せ、 検体中のプロテイン Aを固相担体に固定する。
3 ) プロテイン Aが固定された担体を、 標識されたプロテイン Aに対する抗体 (二次抗体） を含有する溶液と接触せしめ、 当該二次抗体を、 固定化抗プロティ ン A抗体及びプロティン Aを介して、 固相担体に結合させる。
4 ) 固定された二次抗体を二次抗体の標識体に応じて測定することにより、 検 体中のプロティン Aを検出又は定量する。
一次抗体の固相化に用いられる固相担体としては、 ガラス製やプラスチック製 のチューブ、 プレート、 ゥエル又はビーズ、 磁性粒子、 ラテックス、 膜、 繊維等、 特に限定されるものではない。
固相化の方法としては、 物理吸着法のほか、 ダルタールアルデヒド、 カルポジ イミド等の各種架橋剤による化学結合法を用いることができる。 例えば、 抗体を リン酸緩衝液で希釈した後、 これを固相担体の表面に接触させ、 3 7 にて 6 0
分間ィンキューペートすればよい。
二次抗体の標識は、 放射性同位元素、 酵素、 ピオチン、 蛍光物質、 化学発光物 質、 金コロイド、 ラテックス、 フェライト粒子等で直接標識すればよいが、 上述 したように、 安全性が高く、 良好な測定結果が期待できる点から酵素標識するの が好ましい。 好適な標識酵素としては、 安定性に優れ、 酵素活性が測定しやすい ペルォキシダーゼ、アルカリホスファタ一ゼ、ガラクトシダーゼ等が挙げられる。 結合された二次抗体の検出又は定量は、 任意の公知の方法に従って行うことが できる。 例えば、 酵素、 発光体、 蛍光体等で標識された二次抗体自体を、 直接検 出または測定することも可能であるし、 二次抗体に対して特異的な三次抗体を用 い、 この三次抗体を種々の方法により標識しておき、 三次抗体の標識を検出又は 定量することもできる。
好適な検出法としては、 上述のとおり、 酵素標識された二次抗体に対して、 当 該その酵素に特異的な基質 （発色基質、 蛍光基質、 化学発光基質） を反応させ、 発色、 蛍光、 発光等を生じさせてそのシグナルを測定機器で検出する方法が挙げ られ、 特に高感度検出が可能な化学発光基質を用いる方法が好ましい。
本発明の黄色ブドウ球菌感染症の検査用キットは、 上記の検体中の黄色ブドウ 球菌の検查方法を実施するためのキットであり、 少なくとも上記のマウス I g G 1抗プロティン Aモノクローナル抗体の他、 酵素等の標識体を検出する試薬を含 み、 必要に応じて検体の希釈緩衝液、 各種の試薬希釈用緩衝液、 洗浄液等を含む ものである。 実施例
以下、 実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、 本発明はこれらに限定 されるものではない。
実施例 1
( 1 ) 一次抗体固相化プレートの作製
マウス I g G 1抗プロティン Aモノクローナル抗体を 1 5 OmM N a C 1含有 25mMリン酸緩衝液 （P B S) で、 1 0 xg/mLに希釈したものを 50 L/ゥェ ルずつプレートへ入れ、 4°Cで一晩放置し抗体の固相化を行った。 翌日、 プレー 卜から内容物を除去後、 ブロックエース （大日本製薬社製） を精製水で 4倍希釈 したものを 280 /iL/ゥエルずつ加え、 4°Cで一晩以上放置した。 使用時には、 0. 05 %Tween20含有 P B S溶液（P B S— T) で 3回洗浄したものを反応に 供した。
(2) ピオチン化二次抗体の作製
ャギ抗プロティン Aポリクローナル抗体をペプシン消化して得たャギ抗プロテ イン A抗体 F (a b' ) 2の 500 L ( 1 mg/mL) を 0. 1M炭酸水素ナトリウ ムで透析した。抗体液を攪拌しながら、 Sulio- NHS- LC- Biotin(Pierce社製） 0. 0 5mgを 50 Lの同炭酸緩衝液に溶解したものを滴下した。 室温で 4時間攪拌後、 4°Cで P B S中一晩透析したものをピオチン化二次抗体として使用した。
実施例 2
( 1 ) サンドィツチ酵素免疫測定法によるプロティン Aの測定 1
実施例 1の （1 ) で調製したマウス I gG 1抗プロテイン Aモノクロ一ナル抗 体を固相化したマイクロタイ夕一プレートに精製水で 1 0倍希釈したブロックェ ース （希釈ブロックエース） で 0. 5、 1、 5、 10、 5 OngZmUこ希釈した精 製プロティン Aを 50 L/ゥエルずつ加える。 4°Cでー晚反応後、各ゥエルを P B S一 Tで洗浄する。実施例 1のピオチン化二次抗体を希釈プロックエースで 2. 9 xg/mLに希釈したものを 50 L/ゥエルずつ加える。 更に、 室温で 1時間反 応後、 各ゥエルを PBS— Tで洗浄する。 アビジン化 HRP (Zymed社製） を 0. 2%B SA—PBSで 4000倍希釈し、 50 iL/ゥエルずつ加え、室温で 1時 間反応させる。 洗浄後、 2mg/mLオルトフエ二レンジァミンと 5. 9mM過酸化水 素を含む 0. 1Mクェン酸緩衝液 pH5を 50 L/ゥエルずつ加え、室温で 30分 間反応を行った後、 1. 5 N硫酸 5 0 L/ゥエルずつ加え反応を停止し、 E L I
S Aプレートリーダ一の波長 49 2Mで測定を行った。 得られた標準曲線を図 1 に示す。
プロテイン A濃度 0. 5から 5 Ong/mLの範囲で測定可能であった。
(2) サンドイツチ酵素免疫測定法によるプロテイン Aの測定 2
マウス I gG 1抗プロティン Aモノクロ一ナル抗体を固相化した白色マイクロ 夕イタ一プレート（Dynex technologies社製）に希釈ブロックエースで 0. 0 1、 0. 1、 1. 0、 1 Ong/mUこ希釈した精製プロテイン Aを 5 O. Lノウエルずつ 加える。 4°Cで一晩反応後、 各ゥエルを P B S— Tで洗浄する。 実施例 1のピオ チン化二次抗体を希釈ブロックエースで 2. 9 zg/mUこ希釈したものを 5 0 nl /ゥエルずつ加える。 更に、 室温で 1時間反応後、 各ゥエルを P B S— Tで洗浄 する。 アビジン化 HRP (Zymed社製） を 0. 2 %B SA— PB Sで 4000倍希 釈し、 50 / L/ゥエルずつ加え、 室温で 1時間反応させる。 洗浄後、 Super Sig nal EL ISA Femto Substrate (Pierce社製）を 1 0 0 iLZゥエルずつ加え、 ルミノ メータ一で 1 0秒間の発光量を積算した。 得られた標準曲線を図 2に示す。
プロテイン A濃度 0. 0 1から 1 OngZmLの範囲で測定可能であった。
実施例 3 培養上清中のプロティン A量の経時的測定
黄色ブドウ球菌の臨床分離株 （MRS A 1 9 3 2) の一夜培養液 8 0 ^ Lを hea rt - infusion broth 10mLに加え培養する。 その後、 経時的に 1 mLずつ採取し、 2 分間遠心して上清を取り、 0. 2 μηιのフィル夕一ろ過したものをサンプルとして 測定するまで、 一 3 Ot:に保存した。 菌の増殖に応じたプロテイン A分泌量を測 定するため、前記サンプルを希釈ブロックエースで 25から 20 0倍に希釈して、 EL I S A法で測定した結果を図 3に示す。
その結果、 菌の増殖フェイズに応じて、 静止期よりも対数増殖期にプロテイン Aの産生量の増加が確認できた。
実施例 4 患者血清及び尿中のプロティン Aの測定
実施例 2の （2) の方法に従って黄色ブドウ球菌感染患者及び健常人の血清及
び尿中のプロティン Aを測定した結果を図 4に示す。
健常人の血清中にはプロティン Aがほとんど検出されないのに対し、 感染患者 の血清及び尿中にはプロテイン Aの存在が確認された。
Claims
1 . プロティン Aに対する抗体を用いた免疫学的測定法により検体中の黄色ブ ドウ球菌を検查する方法であって、 少なくとも 1種のマウス I g G 1モノクロ一 ナル抗体を用いることを特徴とする黄色ブドウ球菌の検査方法。
2 . 免疫学的測定法が二抗体サンドィツチ酵素免疫測定法である請求項 1記載 の検查方法。
3 . —次抗体又は二次抗体のいずれか一方にマウス I g G lモノクローナル抗 体を用い、 他方に哺乳動物由来のポリクローナル抗プロティン A抗体を酵素処理 によって該抗体の F c部位を切断して得られる抗体断片を用いるものである請求 項 2記載の検查方法。
4 . マウス I g G 1モノクローナル抗体が、 プロテイン Aの F c非結合部位を 認識する抗体である請求項 1〜 3のいずれか 1項記載の検査方法。
5 . 酵素免疫測定法が化学発光酵素免疫測定法である請求項 2〜4のいずれか 1項記載の検査方法。
6 . 化学発光酵素免疫測定法が、 標識酵素としてペルォキシダーゼ、 化学発光 物質としてルミノール類を用いるものである請求項 5記載の検査方法。
7 . 検体が体液成分である請求項 1 ~ 6のいずれか 1項記載の検査方法。
8 . 黄色ブドウ球菌がメチシリン耐性黄色ブドウ球菌である請求項 1〜 7のい ずれか 1項記載の検査方法。
9 . 検体中の黄色ブドウ球菌を検査するためのキットであって、 少なくともマ ウス I g G l抗プロテイン Aモノクローナル抗体と標識体を検出する試薬を含有 する検査キット。
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