JPS6212859A - 特定の細菌ポリペプチド及びそれに対する抗体の定量法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、（ｉ）＠乳動物１ｇ（即ち補乳動物からの免
疫グロブリン）のＦｃ部分に対して親和性を有する細菌
ポリペプチド、又は（ｉｉ）該ポリペプチドに対する抗
体を免疫学的に定量するための方法及び手段に係る。

該ポリペプチドは哺乳動物１ｇにより沈降可能であるこ
とが知られており、これは、該ポリペプチドがＦｃ結合
性に加えてＦａｂ結合性を有するためであると考えられ
ている。

ここで「細菌ポリペプチド」とは、細菌又は池の微生物
により天然に産生されるポリペプチド又は蛋白質の意で
ある。同語は更に、所謂組換えＤＮＡ技術を適用した場
合に非細菌細胞により発現される細菌ポリペプチドも包
含する。

ｒ　Ｆｃ結合性（即ち哺乳動物１ｇのＦｃ部分に対する
親和性）を有するポリペプチド」の概念は、Ｐｃ結合性
及び／又はＦａｂ結合性を有するポリペプチドとそのフ
ラグメント及びその誘導体を包含する。

この種のポリペプチド及びその使用については多数の研
究論文が発表されており、例えばＬａｎｇｏｎｅＪ　Ｊ
：　Ａｄｖ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　３２／１９ｇ２／　Ｉ）
、　１５７−２５２を参照されたい。

１９６６年、黄色ブドウ球菌（Ｓ、ａｕｒｅｕｓ）から
のプロティンＡはＦｃ結合性を示すことが発見された（
Ｆｏｒｓ　−ｇｒｅｎ　Ａ　　＆　　Ｓｊδｑｕｉｓｔ
　　Ｊ：　　Ｊ　　Ｉｍｍｕｎｏｌ　　１７／１９６６
／ｐ８２２〜２７）。数年後、同様の蛋白質（即ちプロ
ティンＧ）が肺炎双球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ
　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）中に発見された（Ｋｒｏｎｖ
ａｌｌ　Ｇ：　Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　１１１／１９７３
／　ｐ１４０１−０６．ａｎｄ　Ｍｙｈｒｅ　Ｅ　Ｂ　
＆　Ｄｒｏｎｖａｌｌ　Ｇ＋　Ｉｎｆｅｃｔ＆　　Ｉｍ
ｍｕｎｉｔｙ　１７／１９７７／　ｐ４７５−８２）。

その後、Ｆｃ結合性ポリペプチドは他の細菌種にも検出
された。プロティンＡ及びＧは各細菌属内の種に従って
構造変化を示すという結果ら報告されている。近年では
、これらの蛋白質がＦｃ結合性に加えて第二（ａｌｔｅ
ｒｎａｔ　１ｖｅ）の弱いＦａｂ結合性を有し得ること
が発表されている（Ｉｎｇａｎ’ａｓ　Ｍ　ｅｔ　ａｌ
：５ｃａｎｄ　Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　１４　／１９８１
／　ｐ　３７９−８８．　ａｎｄＥｒｎｔｅｌｌ　Ｍ　
ｅｔ　ａｔ：　５ｃａｎｄ　Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　１７
　／１９８３／ｐ　２０１−９）。「第二反応性」と称
されるこの特性は、免疫グロブリンの個々のクラスに無
関係であると考えられている。これらの２種の結合性は
１ｇ間即ち異種間及び異なる細胞クローンに由来する１
ｇ間で変化を生じ、Ｆａｂ結合性については最大の変化
が認められている。これらの反応性の正確な生物学的意
義はまだ解明されていないが、病原性に関係があると予
・想されている（Ｐｏｒｓｇｒｅｎ　Ａ：　Ｉｎｆｅｃ
ｔ＆　　Ｉｍｍｕｎｉｔｙ　２　／１９７９／　ｐ　６
７２−３．　ａｎｄ　Ｐｏｒｓｇｒｅｎ　Ａ・：　Ａｃ
ｔａ　Ｐａｔｈ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　５ｃａｎｄ　５
ｅｃｔ　Ｂ　８０　／１９７２／ｐ　５６４−７０）。

実際にプロティンＡは種々の方法で利用されており、Ｆ
ｃ結合性を有する池の細菌ポリペプチドも同様に利用で
きる可能性があると考えられている。

プロティン八については多くの研究が為されており、固
速相と結合したプロティンＡ上で腫瘍患者　（（Ｔｅｒ
ｍａｎ　Ｄ　Ｓ　ｅｔ　ａｌ：　Ｎ　Ｅｎｇ　Ｊ　Ｍｅ
ｄ　３０５　／１９８１／　ｐ１１９５−）又は実験動
物（Ｔｅｒｍａｎ　Ｄ　Ｓ　ｅｔ　ａｌ：　Ｊ　Ｉｍｍ
ｕ−ｎｏ＋　　１２４　／１９８０／　ｐ　７９５−、
　　ａｎｄ　５ｃｉｅｎｃｅ　２０９　／１９８０／　
ｐ１２５７−）からの血漿を潅流及び循環処理すること
により、腫瘍を著しく退行させ得ることが示されている
。プロティンＡ自体が強い生物学的反応を生じ得るので
、潅流中に生じ得るプロティンへの漏れを完全に制御す
ることが肝要である。従って、免疫グロブリンを含有す
る製剤中におけるプロティンへの汚染を高感度で特異的
に検定できることが特に重要である。

この目的にかなう一検定法が既に知られている（Ｌａｎ
ｇｏｎｅ　Ｊ　Ｊ　ｅｔ　ａｌ：　Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ
　Ｍｅｓｈ　６３　／１９８３／ｐ　１４５−５７）。

この方法は標識したプロティン人と標識しないプロティ
ンＡとをニワトリ抗プロティンＡ抗体に対して競合さけ
るコンペティティブ方式を使用するものであり、得られ
た免疫複合体を硫酸アンモニウムＰ（ａｂ’）ｚウザギ
ＩｇＧ抗ニワトリＩｇＧで沈降させる。しかしながらこ
の方法の使用は、プロティンＡと強く結合するＩｇＧ（
例えばヒトＩｇＧ及びイヌＩｇＧ）を有する動物からの
血清との干渉現象により制限される。従って、該方法は
これらの動物の免疫グロブリンを含む製剤の特性付けの
ためには不適当である。製剤を非経口で使用しようとす
る場合、該方法は特に高い品質を要求される。

前記干渉は、試料の１ｇＧが標識されたプロティン八と
結合するためである。この結合性は、試料が希釈される
か否かに関係なく生じる現象である。

優先期間中に、プロティンＡを定量するための別の方法
について記載した２件の論文が発表された（Ｄｅｒｔｚ
ｂａｕｇｈ　Ｍ　Ｔ　ｅｔ　ａｌ；　Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ　Ｍｅｔｈ　８３　／１９８５／　Ｉ）　１６９−Ｈ
ｔ　ａｎｄ　Ｋｉｎｅｔ　Ｊ　Ｐ　ｅｔ　ａｌ；　Ｅｕ
ｒ　ＪＣｌｉｎ　Ｉｎｖｅｓｔ　１６　／１９８６／　
ｐ　４３−４９）。

本発明の目的のひとつは、前記ポリペプチドに対する試
料血清１ｇＧの前記干渉を単純且つ実用的に最小化する
検定法を提供することにある。第二の目的は、改良され
た精度、感度及び選択性を有する検定法を提供すること
にある。第三の目的は、活性物質として前記ポリペプチ
ドを含む親和性吸着体中ボの漏れを分析する方法を提供
することにある。第四の目的は、血清免疫グロブリン（
特にヒトＩｇＧ）が前記ポリペプチドと結合しないよう
な条件下で当該型のポリペプチドに対して特異的な抗体
製剤を提供することにある。第五の目的は、Ｆａｂ部分
を介して当該型のポリペプチド、好ましくは第二反応性
に対応するエピトープと強い結合性を示すような免疫グ
ロブリンを検定する方法を提供することにある。ここで
「強い」結合性とは、３５未満のｌ）＋１で結合が生じ
ることを意味し、従ってこれらの免疫グロブリンは所謂
親和性の高い抗体である。

本発明は既知のプロティンＡ定量法の改良である。

第二反応性に対する抗プロティンＡ抗体については既に
研究されている（ｌｎｇａｎ’ｉｓ　Ｍ　ｅｔ　ａｌ；
５ｃａｎｄ　Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　１４／１９８１／　
ｐ　３７９−８８）。しかしながら、ここで使用された
製剤は４未満のＩ）Ｈで特に高い抗体活性を示していな
い。

本発明の免疫検定の新規特徴は、試料中の他の免疫グロ
ブリンに対するポリペプチドの反応性が抑制されるよう
な条件下でポリペプチドのエピトープとこれに対する抗
体との免疫反応を生じさせることにある。反応で使用さ
れる抗体は、該抗体が反応混合物中で主にそのＦａｂ部
分を介してポリペプチドと反応するように選択された。

一般的な型の免疫検定法として多くの方法か公知であり
、本発明中で潜在的に有用である。

免疫学的検定法（イムノアッセイ法）は免疫複合体を形
成するために免疫反応体を使用するものであり、この形
成により、添加された反応体の免疫学的対応部分が試料
中に存在していたことがわかる。定量及び検出を容易に
するために、反応体の１種はしばしば標識された形態で
添加され、即ち反応体は分析的に検出可能な基を備えて
いる。反応体の添加量は、複合体中に導入されるか又は
非複合状態で遊離している標識反応体の量が検定すべき
種の尺度となるように注意深く選択される。

−分類方式によると、検定法はホモジニアス又はヘテロ
ジニアス法のいずれかに分類され得る。

ホモジニアス法は、複合化された（複合物と結合された
）標識反応体を非複合反応体から物理的に分離すること
なしに標識反応体を検定する方法である。ホモジニアス
法は、複合化されるか否かに従って活性が変化するマー
カーを使用し、従って、複合化及び非複合化形態のマー
カーを含む反応混合物から信号を測定することが可能で
あり、分析すべき種の量に関して得られる値から結論を
導くことが可能である。ヘテロジニアス法は、複合化さ
れた標識反応体を非複合化反応体から物理的に分離する
工程を含むものである。ヘテロジニアス法の場合、マー
カーの活性を変化させる必要はない。標識反応体の２形
態の一方が反応混合物に不溶性であり且っ液相から容易
に分離可能な固相又は他の相と既に結合しているか又は
結合中であるという場合に分離可能になる。こうして、
分析的に検出可能な基は２相のいずれか一方又は両方で
定ｍされる。

第二の分類方式によると、検定法はコンペティティブ（
競合的）又は非コンペティティブ法のいずれかに分類さ
れ得る。コンペティティブ法では、免疫学的対応部分上
の不十分な数の対応結合部位に対して共通のエピトープ
を有する２種の反応体を競合させる。一般に該方式は、
分析すべき種と標識又は固相と結合された核種の変異体
との間に競合が生じるように選択される。免疫学的対応
部分と結合する量が、分析される種の尺度となる。

非コンペティティブ法では、競合が生じないように反応
体を選択する。非コンペティティブ法として特に所謂「
サンドイッチ」方式が注目できる。

第三の分類方式によると、検定法は沈降法又は非沈降法
のいずれかに分類され得る。沈降法の場合、まず均一液
相中で免疫反応を行い、その後、ポリエチレングリコー
ル、抗血清又は固相と結合された抗体のような沈降剤（
但し抗血清又は固相と結合した抗体は標識反応体と反応
しないように選択される）により、得られた免疫複合体
を沈降させる。

第四の分類方式によると、検定法は使用されるマーカー
によって分類され得、従って放射線、酵素、蛍光、化学
ルミネセンス、酵素−基質等の免疫法が挙げられる。

免疫検定法において、抗体及び抗原は場合によっては相
互に生物学的に特異的な親和性を有する他の反応体に置
換えられ得る。

現在知見されている限りでは、本発明は好ましくはヘテ
ロジニアス型のコンペティティブ方式で実施される。

本発明に関連して、好適なコンペティティブ法は、場合
によっては固相と結合された、分析物（ａｎａｌｙｔｅ
）の免疫学的対応部分の結合部位に対して標識及び非標
識分析物間の競合を使用すべきであることが特に注目で
きる。

本発明が適用可能な試料は血清試料又は血漿試料から構
成され得る。必要に応じて、例えば体外シャントのよう
な固相と結合した形態のプロティンＡ又はプロティンＧ
等の被分析種をこの試料に予め吸着させておいてもよい
。更に試料は、免疫グロブリン製剤又は例えばポリペプ
チドもしくは親和性の高いそれに対する抗体のような被
検出種を含有していると予想される他の製剤でもよい。

本発明によると、場合によっては好適な緩衝液で希釈さ
れた試料に、標識分析物及び／又はポリペプチドの対応
（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）抗体を添加する。次の段階で
、例えば既に添加された反応体に対する１種の抗体等、
更に別の免疫反応体を添加してもよい。本発明に関連し
て使用される抗体については、（ｉ）試験に干渉するよ
うに（標識されるか又はされていない）ポリペプチドと
反応することはないＦｃ部分を有するか又は（ｉｉ）Ｆ
ｃ部分が除去又は不活性化されていることが好ましい。

使用される抗体は、例えば周知の免疫グロブリンフラグ
メントＦａｂＳＦａｂ’又はＦ（ａｂ’　）、であり得
る。ポリペプチド−１ｇ干渉は、特定のクラスの免疫グ
ロブリン、細胞クローン及び動物種から抗体を選択する
ことにより回避することもできる。使用される抗体製剤
は、本発明による使用に必要な特異性、親和性、結合活
性及び力値を有している。該製剤は、所望の特異性が得
られるように吸着剤の形態であり得る。該製剤は例えば
抗体のＩｇＧ製剤であり得る。

該製剤は、例えば凍結乾燥又は噴霧乾燥による乾燥製剤
の形態であり得る。該製剤は、好適な緩衝液中で復元さ
れ、テストキットの一部を構成し得る密閉パツキン内に
収容された製剤であり得る。

使用される抗プロティンＡ抗体製剤は、当該ポリペプチ
ド好ましくは第二反応性に対応するエピトープに対して
特異性を有している。該製剤の抗体はそれ自体既知の方
法で免疫感作及び精製にょり産生され得、免疫感作は温
血を推動物にアジュバントと共にポリペプチドを注射す
ることにより実施される。一般に使用される動物は、例
えばニワトリのようなキジ目鳥類、及びラット、ウサギ
、ヒツジ、イヌ、ウマ等の哺乳動物である。免疫感作を
実施すると、動物の血液及び鳥類の場合には卵から抗体
が回収され得る。意図する特定の検定法で必要な純度を
生じるように、それ自体既知の方法で抗体をＩｓ精製（
免疫吸着精製）することもできる。本発明に関連して、
一般に当該細菌ポリペプチドに対して比較的低反応性（
Ｆａｂ反応性）の免疫グロブリンを有する動物の場合、
非常に良好な免疫応答が得られた。従って、ウサギ又は
ニワトリの免疫感作が有利であり、ヤギのような他の動
物も使用できる。発明者らは、ポリペプチドと強く結合
するＰｃ部分を有する非対応（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕ
ｓ）Ｉｇと複合したポリペプチド（例えばプロティンＡ
−イヌＩｇＧ複合体）を用いて免疫感作を実施した場合
に特に良好な結果を得た。

別の方法としては、（例えば上述のように）免疫感作さ
れた動物のリンパ球を所謂モノクローナル技術（Ｋ６ｈ
ｌｅｒ　＆　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ　Ｃ；　Ｎａｔｕｒｅ　
２５６　／１９７５／ｐ　４９５−７）に適用する。こ
うして好適な特異性及び親和性を有するモノクローナル
抗体が得られる。

該抗体は次に所謂単純なモノクローナル又は複合モノク
ローナルのいずれかとして使用され得る。

尚、該複合モノクローナルとは異なる決定基に対する特
異性を有するか及び／又は異なる親和性を有する２種以
上のモノクローナル製剤の混合物である。

本発明の「抗体製剤」は、当然のことながら抗体活性フ
ラグメント（例えばＦａｂ、　Ｆ（ａｂ’）２等）及び
誘導体（固相と結合され且つ標識された抗体）を含む製
剤を包含する。

使用すべき抗体製剤は、少なくともポリペプチドと試料
中の対応するＰｃ結合性免疫グロブリンとの関係の特徴
を表す親和メ定数よりも小さい親和定数（モル／２で表
す）を有する。親和定数を２７モルで表す場合にはこの
逆である。定数は当然該当条件、即ち本発明の各具体例
に属する条件下で比較すべきである。

本発明の抗体製剤は、ｐＨにほとんど依存しない抗体活
性を有している。因みにｐＨ３，２〜３．５の活性はｐ
Ｈ７，４の活性の３０％、例えば５０％よりも高い。

特に実施例Ｉで使用されているような抗プロティンＡ抗
体製剤の場合、即ち抗体活性成分がセファデックス（登
録商標５ｅｐｈａｄｅｘ、スウェーデン国ファルマシア
社）と結合されている場合、ｐＨ７，４及びｐＨ３，２
で一定量の抗プロティンＡセファデックスを一定量のプ
ロティン八と混合し、ｐＨ３，２の結合活性はｐＨ７，
４の結合活性の５０％であった。

本発明のある種の具体例又は変形例では所謂固相結合抗
体が使用され得る。抗体と固相との結合は従来技術の方
法に従って実施される（例えばＷｉｄｅＬ：　　Ｒａｄ
ｉｏｉｔｎｍｕｎｏａｓｓａｙ　　ａｎｄ　　Ｒｅ１ａ
ｔｅｄ　　Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓｉｎ　Ｍｅｄｉｃｉｎ
ｅ、　　Ｖｏｌ、　　ｌ　／１９７８／　　ＩＡＥＡ　
ｐ　　１４３−１５４）。

固相の例としては、ゲルを形成するように膨張可能であ
り且つ非水溶性であり、ＯＨ又はＮｌ１２基（例えばポ
リアミド、ポリサッカライド、ポリヒドロキンアクリル
アクリレート及び対応するメタクリル酸等）を含む粒子
状親水性基質が挙げられる。不溶形態では、使用される
抗体は共有結合又は吸着により非水溶性基質と結合され
る。

上述のように、免疫反応は試料中に存在している免疫グ
ロブリンがポリペプチド又はその標識化された類似体（
ａｎａｌｏｇ）と好ましくない方法で結合しないような
条件下で実施される。即ち原則としてＩ）Ｉ＋を４未満
とすべきであり、例えばプロティン人及びプロティンＧ
の場合、ｐｌｌは３．５未満とすべきである。ｐｌｌは
抗原−抗体結合を解離するほど低過ぎてはならない。従
って、ｐｌｌは約２．７より高く、好ましくは約３．０
より高くなるように選択すべきである。ｐＨ２，７〜４
．０に好適な緩衝液系が、この範囲内で高い緩衝性を有
しており且つ免疫反応に干渉しない系である。例として
クエン酸塩、グリシン−ＨＣｌ及びクエン酸塩−リン酸
塩緩衝液が挙げられる。一方、試料のＩｇとポリペプチ
ドとの間の結合反応を阻害する他の剤を使用することは
除外するものではない。選択される温度は原則として１
０〜４０℃の範囲とすべきである。

免疫学的試験法に干渉し得る物質としては種々の物質が
ある。これは、しばしばこれらの物質が分析物のエピト
ープと直接に反応するか又はこれと等しいエピトープを
有するためである。例えばポリペプチド、親和性の高い
対応抗体及び対応する抗イデイオタイプ抗体は、相互間
の定量に干渉し得る。当業者であればこのような干渉の
危険を経験的に予想し、この干渉が特定の測定の結果に
どのように影響するか認識できよう。

ポリペプチドとその抗体との免疫反応は、６〜９の正常
ｐＨよりら実質的に低いＩ）ＩＩで実施される。免疫吸
着精製法の場合、脱着は約３以下のｐ）Ｉで実施され、
即ちｐＨが約３より低いと抗原−抗体結合は破壊される
。プロティンＡ−１ｇＧ複合体は約ｐＨ３〜４で解離す
る。本発明は、ポリペプチドに対して特異的であり且つ
ポリペプチドの一般１ｇ結合性が実質的に低下するよう
な条件下で抗体活性を有する抗体製剤を製造することが
できるという事実の発見に基づいている。

以下、単に本発明を説明する目的であってこれを限定す
るものではない実施例により本発明を説明する。

実施例１ プロティンＡ（スウェーデン国つプサラ市ファルマシア
社）とイヌＩｇＧ（プロティンＡセファロース（登録商
標５ｅｐｈａｒｏｓｅ、スウェーデン国ファルマシア社
）上でアフィニティクロマトグラフィによりイヌ血清か
ら分離）との混合物を筋向注射により３匹のウサギに感
作した。等量の５０％ＣＦＡ１５０％ＩＦＡ（ＣＦＡ＝
完全フロインドアジュバント、１ＰＡ＝不完全フロイン
ドアジユバント）中に乳化された２５０／４１のプロテ
ィンＡ／ＩｇＧ混合物を、７週間にわたって各動物に３
回注射した。１８週間後にブースター注射を実施した。

２０週目跡らウサギの放血を開始した（血液４０ｍＡが
血清２０ｄに対応）。次の８週間の間に各ウサギに対し
て５回の放血を実施した。収集した材料をプールし、こ
れは２９０ｍｔｌの抗プロティンＡ抗血清に対応した。

抗プロティンＡの精製 固相と結合されたヒトＩｇＧ及びウサギＩｇＧ（それぞ
れカラム容量が５１ｍ１７及び３０１ｒｄｌ）に、２９
０−の抗プロティンＡ抗血清を吸着させた。吸着させた
抗血清をセファデックスＧ−２５（スウェーデン国ファ
ルマシア社）上で脱塩し、０．０７５Ｍトリス−ＨＣＩ
（ｐＨ８，０）で平衡化されたＤＥＡＥ−セファロース
ＣＬ　６Ｂ（スウェーデン国ファルマシア社）上でイオ
ン交換クロマトグラフィにより１ｇフラクションを精製
した。遅延していないフラクションを収集し、限外濾過
によりｌｌ６ｍ＆　Ｘ　１１．９ｍｇ＝　１３８０町の
Ｉｇに凝縮した。次に材料を０．１Ｍ酢酸塩緩衝液（ｐ
Ｈ４，５）に透析し、ペプシン（５０：ｌ　ｗ／ｗ）を
用いて１６時間消化させた。セファデックスＧ−１００
（スウェーデン国ファルマシア社）上でゲル濾過により
Ｆ（ａｂ’）ｚフラグメントを単離させ、合計７５７町
のＦ（ａｂ’）、抗プロティンＡを得た。プロティンＡ
反応性Ｆ（ａｂ’）２フラグメントのフラクションをプ
ロティンＡセファロース（スウェーデン国ファルマシア
社）上でアブィニティクロマトグラフィにより精製した
。セファデックスＧ−２５（スウェーデン国ファルマシ
ア社）上で脱塩後、最終材料は２５．４ｒｎｇのＦ（ａ
ｂ’）＊抗プロティンＡから構成されていた。免疫電気
泳動で抗体製剤は市販のプロティンＡ（スウェーデン国
ファルマシア社）を沈降させた。正常なヒト及びイヌ直
情に対する反応性は何ら観察されなかった。

緩衝液ｌ 標準希釈剤として、０．０５Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ７
，４）、０．５ＭのＮａＣＬ　Ｏ，０５％トウィーン（
登録商標Ｔｗｅｅｎ）２０．０．０５％アジ化ナトリウ
ム。

緩衝液２ インキュベーション用として、０．３Ｍクエン酸酸塩液
液ｐ１１３．２）、０．０５％トウィーン２０゜標準 １ｉの蒸留水中でプロティンＡ（スウェーデン国ファル
マシア社）を再調製した。得られた水溶液を、■！当タ
リノフロテインＡａ度カ５００．１００．５０、ｌ０１
５及びｌｕｇになるまで標準緩衝液で希釈した。

プロティンへのヨウ素処理 プロティンＡをクロラミン−Ｔ法（Ｈｕｎｔｅｒ　ａｒ
（ｄＧｒｅｅｎｗｏｏｄ：　Ｎａｔｕｒｅ　１９４　／
１９６２／　ｐ　４９５−）によりヨウ素処理した。得
られた比活性はプロティンＡｌｑ当たり約１．９４ｍＢ
ｑ、濃度４．５町バであった。

セファデックス抗体複合体 １〜１０ＩＩＩｎの粒子寸法を有する超微細なセファデ
ックスＧ−２５（スウェーデン国ファルマシア社）をＢ
ｒＣＮ（Ａｘｏｎ　Ｒｅｔ　ａｌ：　Ｎａｔｕｒｅ　２
１４　／１９６７／　ｐ　１３０２−１３０４による）
で活性化させた。１００町の活性化されたセファデック
スＧ−２５に、Ｗｉｄｅ　Ｌ：　Ａｃｔａ　Ｂｎｄｏｃ
ｒｉｎｏ−１ｏｇｉｃａ　５ｕｐｐｌ　１４２　／１９
６９／　ｐ　２０７−２２１に記載の方法に従って１０
０１ｉの抗血清（０，３９町の抗プロティンＡＦ（ａｂ
’　）＊）を結合させた。

試験手順 ０．２−の標識プロティンＡ（ｌｎｇの１５１−プロテ
ィンＡ）、０．０５ｒｒｆｌのプロティンＡ標準溶液又
は０．０５艷の希釈していない患者の血清、及び１００
■／ｌのセファデックスとこれに付着した抗体とを含む
０．２−の抗体懸濁液を各試験管に加えた。抗体懸濁液
をクエン酸塩緩衝液及び標識プロティンＡ製剤中で希釈
した。全試料（試験管）とも２個ずつ処理した。試験管
を室温で４時間又は１晩震盪した。粒子を遠心分離及び
吸引により０．９％のＮａＣ１で３回洗浄した。

結果の計算 プロティンＡを含まない標準の計数の平均値（Ｂｏ）を
計算した。次にプロティンＡを含む各標準の計数（Ｂｘ
）をＢ。の百分率として表した。次にプロティンＡ濃度
に対してＢ。の百分率、とじて標準の計数を片対数的に
プロットすることにより標準曲線を構成することができ
た。こうして各未知の試料の計数の平均値をＢｏの百分
率で表し、標準曲線からプロティンＡの濃度を読み取る
ことができる。各標準の（Ｂｘ／Ｂｏ）Ｘ　１００を第
１Ａ表に示す。標準曲線から、プロティンＡｌ７７ｇ／
ｊのプロティンＡ検出下限を決定することが可能である
。

ヒトＩ’ｇＧの存在下における試験例の作用既知量のプ
ロティンＡをヒト血漿に加え、本発明の上記実施例に従
って試験した。結果を第１Ｂ表に示す。標準曲線の勾配
又は感度に大きな差異は認められず、大量の正常なヒト
１ｇＧの存在がｐｌ！３．２の試験の特徴に何ら影響し
ないことがわかる。

種々の異なるｐＨレベルで試験を行った。ｐｎ３．。

未満では免疫反応は生じなかった。ｐＨ値が３．５より
高いと標識プロティンＡは血清免疫グロブリンと反応し
、従ってＢ。は急速にゼロまで減少する（Ｃｐ　Ｊ　Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ　Ｍｅｔｈ　６３／１９８３／　ｐ　１４
５−５７）。

供血者からの血漿をプロティンＡセファロース（スウェ
ーデン国ファルマシア社）に吸着させた後、溶出液のｐ
ｌを４．５．４．０．３６５．３．０及び２．７〜２．
８と漸次低下させることにより、吸着されたＩｇＧを吸
着体から遊離させた。ｐＨ３，０を越えることなくｐＨ
２，７〜２．８で溶出された血漿フラクション中では、
試験例に阻害効果を有する因子が５０％の供血者の場合
に検出できた。該因子はその阻害効果によりプロティン
Ａ値を著しく高めた。該因子は親和性の高い抗プロティ
ンＡ抗体であると考えられる。

該因子はＩｇＧ製剤中、又はプロティンＡ−１ｇＧの解
離ｐ１はりも高いｐＨでプロティンＡ吸着体から遊離さ
れるか又は該吸着体を通された他の血漿フラクション中
には存在すべきでない。他の変形例では、該因子はプロ
ティンＡとその抗体との反応を阻害する必要がない。こ
れは、特に過剰量の抗プロティンＡ抗体を使用する方式
（例えば「サンドイッチ」方式）に適用できる。

上記脱着実験の結果、約２．７５のｐｌでプロティン八
と結合する抗プロティンＡ抗体の存在が明らかになった
。

第１Ａ表及び第１Ｂ表 （Ａ）　　　　　　　　（Ｂ） 緩衝液系　　　　　　血清 １　　　　　　　９８、３　　　　　　　９８．０５　
　　　　　　９５．１　　　　　　　８９．５１０　　
　　　　　８９．０　　　　　　　８３．５５０　　　
　　　　６１．２　　　　　　　５５．５１００　　　
　　　　４１．４　　　　　　　３８．５５００　　　
　　　　　９．６　　　　　　　１１．５友ｍＭ２ プロティンへの定量のための二重抗体固相（ＤＡＳＰ）
夾 プロティンＡに対して特異性を有する抗体（抗プロティ
ンＡＦ（ａｂ’　）２）、緩衝液１１緩衝液２、標準及
び実施例１から得られたヨウ素標識プロティンＡを使用
した。

２人　　ヒツジ抗つサギＩｇＧ抗体とＢｒＣＮ活性化ア
ガロースとの結合 アガロースビーズ（０，５〜５虜、ファルマシア社）を
ＢｒＣＮで活性化させ（Ａｘｇｎ　Ｒｅｔ　ａｌ：　Ｎ
ａｔｕｒｅ　２１４／１９６７／　Ｉ）　１３０２−１
３０４による）、ガラスフィルタ漏斗で吸引した。活性
化されたゲル８ｇを３６ＴＴｆ！のＮａ１ｌＣＯｉ　（
０、１Ｍ）中の４■のヒツジ抗ウサギ抗体と混合し、＋
４℃で震盪器上に１晩インキユベートした。

次に反応混合物を２０ＱＯＸ４で１０分間遠心分離し、
上清を吸引により除去した。次に、４０ｍ１の０．１Ｍ
トリス緩衝液＋ＩＭのＮａＣＩ（ｐＨ８，１）で洗浄し
、１０分間遠心分離及び吸引した。４０威の酢酸塩緩衝
液＋ＩＭのＮａＣ１（ｐＨ４，０）でインキュベーショ
ンし、１０分間遠心分離及び吸引した。４０ｍｆｌ’の
１Ｍエタノールアミン−ＨＣＩ（ｐＨ９，０）でインキ
ュベーションし、１時間遠心分離及び吸引した。面記ト
リス援衝液及び酢酸塩緩衝液による洗浄を２回繰り返し
た。次に０．０５Ｍリンリン酸塩緩衝液中のＮａＣ１＋
０．０１ＭのＥＤＴＡ＋　０．０５％のトウィーン２０
から成る混合物４０ｍ１を加え、１０分間インキュベー
ションした。次に遠心分離及び吸引した。リン酸塩緩衝
液による洗浄を２回繰り返した。ゲルをリン酸塩緩衝液
中で０．３ｇ／−に希釈し、超音波処理した。

２Ｂ　　プロティンＡの定量 緩衝液２中に１０００倍に希釈した０、２ｄの標識プロ
ティンＡ（実施例１による）を各試験管に加えた。

５００．１００．５０．１０．５及び１縄バの濃度でヒ
ト血漿中に希釈された標準溶液０．０５ｄを試験管１〜
１２に加え、希釈されていない患者の血清を多数の試験
管に加えた。緩衝液２中に１００００倍に希釈された抗
体０．２ｍｅを全試験管に加えた。混合物を震盪器上に
４時間インキュベーションした。

６０倍に希釈した２Ａからの希釈ゲル２威を加え、室温
で１時間インキュベーションした。３０００ｒｐｍで１
０分間遠心分離し、傾瀉した。試験管をγカウンタ内に
置いた。標準溶液の単位時間当たりの計数をＢ。の％と
して計算し、未知の試験試料中のプロティンＡの量を計
算可能な線形対数図表に挿入した。

第２Ａ表 血漿（ｐＨ３，２）中におけるプロティンＡ（１〜５０
０塊／２）の標準曲線 プロティンＡ（縄バ）　　　　　　（ＢＸ／ＢＯ）Ｘ％
５００　　　　　　　　　　３６、１ １００　　　　　　　　　　６１．０ ５０　　　　　　　　　　７３．２ １０　　　　　　　　　　８９．９ ５　　　　　　　　　　９３．０ １　　　　　　　　　　９９．２ 本発明は、本明細書の一部を構成する添付の特許請求の
範囲に記載された通りである。

実施例３ パパイン処理連鎖球菌から産生されたプロティン容量１
２！の発酵器内のトリプトン培地でヒトＧ連鎖球菌株Ｇ
１４８を培養した。対数用の終わりに、遠心分離によっ
て細菌を得た。１２乏の培養基からのバイオマス収量は
約１００ｇ（湿潤重量）であった。

Ｂｊδｒｃｋ　ａｎｄ　Ｋｒｏｎｖａｌｌ　（Ｊ　Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ　１３３　／１９８４／　ｐ９６９−７４）
に記載の方法に従ってプロティンＧを可溶化させた。簡
単に説明するなら、１０ｍＭのトリス（ＨＣＬ）（ｐＦ
！８．０）中に細菌を約１０％（ｗ／ｖ）まで懸濁させ
た。細菌懸濁液１ｄにっき１００ｄの０．４Ｍのし一シ
スティン（Ｓｉｇｍａ）及び８０乏ｇのパパイン（Ｓｉ
ｇｍａ、　Ｐ−３１２５）を同一の緩衝液中に添加する
ことにより消化させた。混合物を回転置型器上で３７℃
に１時間インキュベーションした。最終濃度が６ｍＭに
なるまでイオドアセトアミド（Ｓｉｇｍａ）を添加する
ことにより反応を停止した。遠心分離により約１１の上
清を回収した。イオン交換クロマトグラフィ及びアフイ
ニティクロマトグラフィにより上清からプロティンＧを
単離した。

イオン交換クロマトグラフィでは、ｐＨ８，０の１０ｍ
Ｍトリス（ＨＣＩ）中にＤＥＡＥ−セファセル（ファル
マシア社）ｌｏｏｍｔ’を平衡化させた。Ｎ　ａ　０１
１を添加することによりパパイン−消化物（ｄｉｇｅｒ
ａｔｅ）のｐＨを（ｐｎｓ、７から）８．０に調整し、
イオン交換ゲルに該消化物を加えた。スラリーを回転置
型器上で室温で２時間攪拌した。ガラスフィルタ上で平
衡緩衝液で洗浄後、ゲルをに２６／４０カラム（ファル
マシア社）中に充填した。吸着された材料を、０〜０．
５Ｍの直線勾配のＮａＣｌ３００−により溶出した。（
ポリクローナルウシＩｇＧに対する）免疫拡散法により
検出されたプロティンＧを含むフラクションをプールし
た。

アフィニティクロマトグラフィでは、イオン交換体から
のプロティンＧを含むプール約２２０−を等量のＰＢＳ
Ｔ（３０ｍＭのＮａ−Ｐｏ４、Ｑ、１２！１１のＮａＣ
１（ｐｌ！７．２）、０．０５％のトウィーン２０を含
む）で希釈した。ＰＢＳＴ中でＩｇＧ−セファロース４
Ｂ（ファルマシア社）１５ｄを平衡化させ、イオン交換
体からの希釈溶出物に加えた。スラリーを回転置型器上
で室温で２．５時間攪拌した。次にガラスフィルタ上で
ゲルを洗浄し、Ｋ１６／２０カラム内に充填した。結合
した物質を均一（ｉｓｏｃｒａｔｉｃ）な溶出により脱
着させた。溶出剤はｐ＋＋２．５の０．１Ｍトリス（Ｈ
ＣＩ）とし、流量はＩＯ−／ｈ（５ｃｍ／ｈ）とした。

溶出された物質をＰＤ−１０カラム（ファルマシア社）
上で脱塩し、ｐＨ７，２の３０ｍＭのＮａ−ＰＯ，とし
た。

脱塩後のＡｔａｏは約１．７／ｄ、容量は１６通であっ
た。

結果及び検討 パパイン処理連鎖球菌からのプロティンＧ蛋白質加水分
解酵素であるパパインを使用して連鎖球菌からのプロテ
ィンＧを可溶化させた。ＤＥＡＥ−セファセル及びＩｇ
Ｇ−セファロース４Ｂ上で精製後、モノＱ　ＩＩＲ５１
５カラム上で分析用クロマトグラフィによりプロティン
Ｇを特徴付けた。クロマトグラムの様相はパパインの抽
出方法によって著しく異なり、この可溶化手順の困難さ
を示している。

パパイン処理時間を延長すると、ピークの数が増え且つ
ピークの大きさが減少した。同様にクロマトグラムの様
相は使用されるパパインの種類及び／又はバッチにより
著しく異なった。一般に（免疫拡散法により決定される
ような）主プロティンＧ活性を含むピークとして、２つ
の主なピークを観察することができた。これらの２つの
ピークの他に幾つかの小さいピークも観察された。小さ
いピークもある程度プロティンＧ活性を含んでいた。

５ＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した場合も、精製された
プロティンＧの様相は同様に異なっていた。一般にそれ
ぞれ約１００００及び１５０００の見掛けのｍ、ｖ、ｓ
、を有する２つの主要な帯が現れた。試料を２−メルカ
プトエタノールで処理しても５Ｏ８−ＰＡＧＥパターン
に影響なく、プロティンＧにジスルフィド結合が存在し
ていないことがわかる。プロティンＧの等電点をＩＥＦ
により決定した。一般に、約４．７及び４，２のｐｌに
対応する２つの帯が観察された。プロティンＧの２つの
主なフラクションのアミノ酸組成を決定し、２つのフラ
クション間の密接な関係が明らかになった。

免疫拡散、直接沈降又は沈降阻害により、各種抗体（種
及びザブクラス）に対するプロティンＧの反応性を試験
した。一般に、プロティンＧは試験された抗体の大部分
で直接沈降することがわかった。ポリクローナルウサギ
ＩｇＧ、モノクローナルマウスＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａ
には弱い相互作用（直接沈降でなく沈降阻害）が観察さ
れた。更に、ポリクローナルなイヌ、ラット及びニワト
リＩｇＧ並びにヒト骨髄腫からのＩｇＭ’、’　　Ｉｇ
Ａ及びＩｇＤはプロティンＧと反応しなかった。

プロティンＧによる免疫感作 ０．５ｍｌの完全フロインドアジュバントで乳化された
０、５ｍｌの塩類中に２５０４のプロティンＧと２５０
４の精製ヒツジＩｇＧとを混合−してなる混合物を３匹
のウサギに筋向に感作した。

２箇月間に３回連続的に注射後、３週間に２回の周期で
ウサギの放血を定期的に行った。抗血清を収集し、上述
のように調製されたプロティンＧ製剤とヒツジＩｇＧと
に対して免疫電気泳動で試験した。

３匹のウサギは、いずれも沈査を形成するプロティンＧ
に対する強い抗血清反応を示した。これに対して、プロ
ティンＧ−ヒツジＩｇＧの感作以前に同一の動物から収
集した血清は沈査を示さなかった。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）（ｉ）免疫グロブリンのＦｃ部分と結合可能な細
   菌ポリペプチド及び／又は（ｉｉ）該ポリペプチドに対
   する親和性の高い対応抗体を定量するための免疫検定法
   であって、該ポリペプチドと結合する能力のある免疫グ
   ロブリンが該ポリペプチドと実質的に結合しないような
   条件下で抗体活性を有する該ポリペプチドに対する抗体
   製剤を使用し、該抗体製剤と該ポリペプチドとの間の免
   疫反応を前記条件下で実施する前記免疫検定法。
2. （２）プロテインＡ又はその対応抗体とプロテインＧ又
   はその対応抗体とをそれぞれ定量するべく、プロテイン
   Ａ及びプロテインＧから構成される群から選択されたポ
   リペプチドに対する抗体製剤を使用することを特徴とす
   る特許請求の範囲第１項に記載の免疫検定法。
3. （３）免疫反応をｐＨ４．０未満、好ましくはｐＨ３．
   ５未満で実施することを特徴とする特許請求の範囲第１
   項又は第２項に記載の免疫検定法。
4. （４）競合的免疫検定法を使用することを特徴とする特
   許請求の範囲第１項ないし第３項のいずれかに記載の免
   疫検定法。
5. （５）ヘテロジニアス免疫検定法を使用することを特徴
   とする特許請求の範囲第１項ないし第４項のいずれかに
   記載の免疫検定法。