JP2015531487A - 酸性条件でアナライトを測定するための方法およびキット - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、アナライトが少なくとも一部複合体形態で、典型的には免疫複合体として存在し得る液体サンプル中の当該アナライトの総濃度の測定に関する。より具体的には、本発明は、予め形成されたアナライト複合体がアナライト測定前に解離しているアッセイ方法および当該方法を行うためのキットに関する。
イムノアッセイを確実に行うためには、選択された抗体によって規定された、標的分子またはアナライト上の選択されたエピトープへの無制限の接近が、アナライトの定量的測定に必要である。生理的条件下で互いに相互作用できる2種以上の異なるタンパク質が複合体を形成しているならば、この2種の相互作用物の相互作用の性質および濃度に依存して、低濃度の成分が一部そのカウンターパートと複合体の形態をとる。このことは、アッセイに使用される幾つかのエピトープが複合体内に隠れ得るために、特に低濃度のカウンターパートの定量化において不都合であると証明されるかもしれない。
・ヒトIgGのFc部分が関与する古典的相互作用(7)。
・免疫グロブリンクラス(8)と無関係に、重鎖の可変ドメインのVHIII(9)群に属する免疫グロブリンが関与する他の相互作用。
・変性工程を助ける化合物の存在下で、プロテインAの定量化に使用されるサンプル中に存在するIgG成分の熱変性(14)。プロテインAはこのような処理による変性に耐えると考えられる。複合体のIgG成分が変性すると、本工程は、正確な定量化のためにプロテインA部分を放出する(15)。
・予め形成された複合体を解離するためのサンプルの酸処理、および、酸条件下でのイムノアッセイの実施(16;WO 91/10911)。ここで、イムノアッセイに使用される免疫試薬は、選択された酸条件に耐える必要がある。最適には、選択されたpHは、一方でプロテインAとIgGの複合体を定量的に解離し(すなわちプロテインAをFcおよび/またはFab領域から解離する)、他方でアッセイがなお機能すべきであるが、この組み合わせは実現が困難であることが証明されている。
上記の目的は、一方で液体サンプル中の予め形成された複合体(例えばプロテインA−IgG複合体)を解離し、他方でイムノアッセイを行うための別々のpHで、すなわち、複合体の再形成が大部分阻止され、かつ大量の複合体形成成分の存在下でさえ、アナライトの用量応答を得るのに十分な程、捕捉分子、典型的には抗体が活性であるpHを使用する、改善された方法によって達成される。
a) 存在するアナライト複合体を少なくとも実質的に解離し、実質的に全てのアナライトを遊離形で提供するためにサンプルを第1の酸性pHに付し、
b) 第1の酸性pHを、複合体の再形成を(少なくとも大部分)阻止するが、アナライトのリガンドへの結合を可能とする第2の酸性pHまで上げ、
c) サンプル中のアナライトを定量的に測定するために、アナライトのリガンドへの結合を測定する
工程を含む方法を提供する。
典型的には、リガンドは、固体支持体に固定化される。
・アナライトに結合できる検出試薬、
・好ましくは約1.5〜約3.2の範囲のpHを有する第1の酸性緩衝液、
・第1の酸性緩衝液より高いpHを有する、好ましくは約2.7〜約4.5の範囲のpHを有する第2の酸性緩衝液
を含むキットを提供する。
好ましくは、捕捉試薬はビオチン化され、リガンドはアビジンまたはストレプトアビジンである。
他の好ましい態様を従属項に示す。
簡潔にするため、用語“MabSelect SuRe(商標) リガンド”は、下でしばしば“MabSelect SuRe”という。
上記のとおり、本発明は、サンプル中の予め形成された複合体を解離するためおよびイムノアッセイを行うための別々の酸性pHを使用する原理に基づいており、より具体的には、最初に、複合体を効率的に解離するために相対的に低いpHを使用し、続いて、複合体の復元は大部分阻止されるが、捕捉試薬(典型的には抗体)は、定量化するアナライトを効率的に捕捉するのに十分活性である高目の酸性pHでアッセイを行うことによるものである。
好ましくは、固定化されたアナライト特異的リガンドを有する固体支持体表面を含む不均一アッセイ系を、固体支持体表面に結合したアナライト(サンドイッチアッセイを含む直接的アッセイまたはディスプレイスメントアッセイ)または検出可能なアナライトアナログ(競合アッセイ)の何れかの量を、直接的または間接的に検出することによってアナライト濃度を測定するために使用する。固体支持体表面は、それ自体当技術分野で知られている多様な形状を有してよく、例えば、典型的に微小流体チャネルまたはキャビティーで提供される充填床の粒子であっても、キュベットまたはウェルの、例えばマイクロウェルまたはフローセルまたはチャネルなどの表面領域であってもよい。
・トロポニンIの分析においてIgG自己抗体から解離するトロポニンI
・癌をスクリーニングするとき、抗体の測定における癌抗原に対する自己抗体の解離
・アミロイドβを測定するとき、アミロイドβのホモマー(凝集体および原線維)の解離
・メタロプロテアーゼ/TIMP阻害の解離などの、免疫化学的方法による酵素の測定における酵素/酵素阻害剤の解離。
材料および試薬の調製
捕捉抗体
ポリクローナルニワトリ抗プロテインA抗体を、Cygnus Technologies, Southport, NC, U.S.A. (www.cygnustechnologies.com)から購入した。抗体の一定量を、EZ−結合スルホNHS−LC−ビオチン(21338, Thermo Scientific, Rockford, IL, USA - www.piercenet.com)を用いて、製造者の指示書に従ってビオチンで標識した。Rexxip(商標) ADA 緩衝液(Gyros AB, Uppsala, Sweden)を用いた。
“捕捉抗体”の表題の下に、上に記載した抗プロテインA抗体(Cygnus Technologies)および特製抗プロテインA抗体の一定量を、それぞれ、Alexa Fluor(商標) 647 (A20186, Life Technologies, Carlsbad, CA, U.S.A.)を用いて、製造者の指示書に従って、フルオロフォアで標識した。Rexxip(商標) ADA 緩衝液(Gyros AB, Uppsala, Sweden)を用いた。
静脈内投与用ポリクローナルヒトIgG(hIgG)であるOctagam(商標)(Octapharma AB, Stockholm Sweden) 50mg/mlを処方に基づき薬局から購入した。この製剤をアルコール分画によって精製し、決してプロテインAまたは何らかのプロテインA誘導体と接触させなかった。
Humira(商標) (治療用抗体, Abbott Laboratories, Abbott Park, Illinois, USAが販売)を処方に基づき薬局から購入した。
Herceptin(商標) (治療用抗体, F. Hoffmann-La Roche Ltd, Basel, Switzerlandが販売)を処方に基づき薬局から購入した。
緩衝液を、固形化学物質から、適切な緩衝能およびpHで調製した。
プロテインA (天然, 17-0872-05)およびその誘導体(MabSelect SuRe(商標) リガンド, 28-4018-60)を、GE Healthcare Life Sciences, Uppsala, Sweden (www.gelifesciences.com)から購入した。
CDMX1(P0020026)は、“Gyrolab ADA CD”ともいい、Gyros AB, Uppsala, Sweden (www.gyros.com)から得た。カラム充填は(15μm)ストレプトアビジン誘導Dynospheres(商標) (Invitrogen Dynal A.S., Oslo, Norway)であった。
PBS(pH 7.4)中5mg/mlのポリクローナルIgGでプロテインAを希釈して、プロテインAとIgGの複合体を形成させることによって、標準曲線サンプルを調製した。
クオリティーコントロール(QC)サンプルを、5mg/mlのポリクローナルまたはモノクローナルIgGの存在下で、既知濃度のプロテインAで別々の希釈で調製した。
分析前サンプルの自動化酸解離方法をCDMX1で開発した。この5mg/mlのIgG存在下でのMabSelect SuRe(商標) リガンドの自動化された酸解離および分析方法は図3に記載されており、2つのパネルは、捕捉カラムと分析前サンプルでの処理を示している。W=カラム洗浄、C=捕捉試薬、S=サンプル、1=酸解離1、2=酸解離2、SA=サンプルの捕捉カラムへの適用、および、D=検出試薬。矢印は、異なる処理工程がどのように連結されるかを示す。
下に記載する通り、CDMX1を用いて上に概説した通りに行った実験は、一方でサンプル中の予め形成されたプロテインA−IgG複合体を解離し、他方で複合体の再形成が大部分阻止され、かつ5mg/mlのIgGの存在下でMabSelect SuRe(商標) リガンドの用量応答を得るのに十分捕捉抗体が活性であるイムノアッセイを行うための、別々のpHを使用する原理を証明する。
捕捉抗体および検出抗体としてニワトリポリクローナル抗プロテインA抗体(pH 2.5で解離、pH 3.5で捕捉)
MabSelect SuRe
早い段階で、MabSelect SuRe(商標) リガンドと比べて大過剰のIgGの存在によるある小さな残留効果が、回収結果を多少悪化させる兆候があった。このことは、図4の曲線1および2の比較により見られる。図4は、MabSelect SuRe(商標) リガンドのみ(1)、および、本方法について記載された通りにpH 2.5およびpH 3.5で処理した後のMabselect SuRe+5mg/mlのhIgG(2)を含む標準曲線サンプルのアッセイの用量応答関係を図示している。対照として、5mg/mlのhIgGを含むMabSelect SuReの標準曲線サンプルをpH 2.5で解離させるが、アッセイをpH 8.0での中和後に行い(3)、最後に、5mg/mlのhIgGでのMabSelect SuReの標準曲線(用量応答曲線)サンプルは解離をさせず、アッセイをpH 7.4で行った(4)。
天然プロテインA
また、上と同じ原理の手順を用いて天然プロテインAを分析する可能性を、評価した。この場合は、天然プロテインAを含む標準曲線サンプルを、5mg/mlのポリクローナルヒトIgGの存在下での30〜0.12ng/mlの範囲で調製した。解離工程をpH 2.3で行い、分析工程をpH 3.3で行った。他の全ての局面で MabSelect SuRe リガンドの分析に関する原理と同じ原理で行った。この実験のデータを下の図7および表3に示す。
MabSelect SuRe
上に記載されたものと基本的に対応する実験を、CDMX1において、市販ニワトリポリクローナル抗体の代わりに特製捕捉ポリクローナル抗体を用いて、図3に示した手順、すなわちpH 2.5およびpH 2.8で処理するなどを行った。
残留MabSelect SuReが混入したIgG含有(Humira(商標))サンプルを提供した。最初にサンプルを5g/Lの濃度に希釈することによって標準化した。次いで、pH 2.5での酸解離およびpH 2.8での捕捉を含む上で概説した手順を用いて、サンプルをプロテインAについて分析した。用量応答 対 MabSelect SuReの濃度についての標準曲線を、図11に示した通り作成した。次いで、元のサンプル中の残留MabSelect SuReの濃度を標準曲線を用いて決定し、希釈因子に対して補正することによって計算した。デュプリケートの測定の精度(CV%)を記載する。結果を下の表6に示す。
上に示した通り、MabSelect SuRe(商標) リガンド、すなわち免疫グロブリンの親和性クロマトグラフィーからの潜在的浸出液が高濃度のIgGの存在下で正確に定量できる完全自動化微小流体手順が、成功裏に実行された。
検出できるMabSelect SuRe(商標) リガンドの相対濃度は、5mg/mlのIgG(w/w)で、0.2〜0.5ppmの範囲であり、不純物の規制許容レベル(13)よりはるかに小さい相対濃度である。
また、主な解離および分析手順は、5mg/mlのポリクローナルヒトIgG中の天然プロテインAに適合している。
IgG存在下で残留プロテインA(またはMabSelect SuRe)の分析を行うための典型的なキットは、下記の試薬A〜Iを含む。試薬A、BおよびCをそれぞれ希釈試薬G、HおよびIで希釈することを意図したストック溶液として提供する。キット全体は、240個のデータ点(48個/CD)を得る5個のGyrolab(商標) ADA CD (Gyros AB)に十分な量の9種の異なるタイプの液体からなる。
試薬A: 捕捉試薬, ビオチン化抗プロテインA抗体, 625μg/ml
試薬B: 検出試薬, フルオロフォア標識抗プロテインA抗体, 200nM
試薬C: 天然のプロテインA, 1000μg/L
試薬D: 酸解離緩衝液1, 0.25Mのグリシン−HCl(pH 2.5)
試薬E: 酸解離緩衝液2, 0.1Mのクエン酸緩衝液(pH 3.4)
試薬F: 酸性洗浄緩衝液, 1部の試薬Dを一部の試薬Eと混合
試薬G(2バイアル): 中性洗浄緩衝液および捕捉試薬A希釈用の緩衝液
試薬H(2バイアル): サンプル希釈用のサンプル希釈緩衝液, Rexxip(商標) ADA (P0020027, Gyros AB)
試薬I: 希釈検出試薬B(0.5ml)のための検出抗体緩衝液, Rexxip(商標) F (P0004825, Gyros AB)
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Claims (13)
- 液体サンプル中のアナライトを、該アナライトに特異的に結合できるリガンドに結合させることを含むイムノアッセイにより定量的に測定する方法であって、該アナライトが少なくとも一部アナライト複合体として存在し、
a) 存在するアナライト複合体を少なくとも実質的に解離し、実質的に全てのアナライトを遊離形で提供するためにサンプルを第1の酸性pHに付し、
b) 第1の酸性pHを、複合体の再形成を阻止するがアナライトのリガンドへの結合が可能である第2の酸性pHまで上げ、
c) サンプル中の該アナライトを定量的に測定するために、アナライトのリガンドへの結合を測定する
工程を含む方法。 - リガンドが抗体である、請求項1に記載の方法。
- リガンドが固体支持体に固定化されている、請求項1または2に記載の方法。
- アナライトが、プロテインA、プロテインG、プロテインA/G、プロテインLおよびそれらの誘導体から選択され、サンプルがIgGを含む、請求項1、2または3に記載の方法。
- 第1の酸性pHが約1.5〜約3.2の範囲から選択され、第2の酸性pHが約2.7〜約4.5、好ましくは約2.8〜約4.5の範囲から選択される、請求項1〜4の何れか1項に記載の方法。
- 第1の酸性pHが約2.3〜約2.5の範囲から選択され、および/または、第2の酸性pHが約2.8〜約3.2の範囲から選択される、請求項5に記載の方法。
- 第2の酸性pHが、約3.0〜約3.2の範囲から選択される、請求項4または5に記載の方法。
- アナライト濃度を決定するとき、応答 対 アナライト濃度の標準曲線を用いることを含み、標準曲線が、アナライト、および、アナライトと複合体形成できる少なくとも1つの種を含むサンプルを用いて作成される、請求項1〜7の何れか1項に記載の方法。
- 微小流体系で行われる、請求項1〜8の何れか1項に記載の方法。
- 微小流体系が回転可能なディスクを含み、液体輸送が遠心力によって達成され得る、請求項9に記載の方法。
- 液体サンプル中で少なくとも一部複合体形態で存在するアナライトのイムノアッセイを行うためのキットであって、
アナライトに結合できる検出試薬、
約1.5〜約3.2の範囲のpHを有する第1の酸性緩衝液、
約2.7〜約4.5の範囲のpHを有する第2の酸性緩衝液
を含むキット。 - アナライトが固相に固定化されたリガンドに結合でき、キットがさらに固相に結合できるアナライト用捕捉試薬を含む、請求項11に記載のキット。
- 捕捉試薬がビオチン化されており、リガンドがアビジンまたはストレプトアビジンである、請求項11または12に記載のキット。
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