JP2010503854A - 分析物濃度を求める方法 - Google Patents

Abstract

分析物の少なくとも一部が分析物結合性物質との複合体として存在する流体試料中の分析物の総濃度を決定する方法であり、ａ）試料を、実質的にあらゆる分析物複合体を解離し実質的に全ての分析物を遊離形態で提供するように分析物と分析物結合性物質との間の結合親和性を充分に低下させる条件に付す工程、ｂ）試料を、分析物と分析物結合性物質との間の結合親和性を回復させる条件に付す工程、及びｃ）結合親和性が回復された直後、分析物の実質的な複合体再形成が起こる前に、試料中の遊離分析物の濃度を決定する工程を含んでいる。試料中の複合体結合分析物の濃度を決定する方法も開示されている。
【選択図】 なし

Description

本発明は、流体試料中の分析物の総濃度を求める方法に関する。分析物は少なくとも部分的に複合体の形態、通例免疫複合体として存在し得る。本発明は、かかる流体試料中で、総分析物濃度が遊離の分析物と複合体として結合した分析物との間でどのように分布しているのかを求める方法にも関する。

免疫原性は、特定の物質が抗体の産生のような免疫応答を引き起こすことができる能力又はその程度である。免疫原性の研究において、免疫複合体中に「隠れた」成分を測定し定量することが次第に重要になっている。例えば、治療用抗体のようなタンパク質薬剤の研究において、その薬剤に対して生じた抗体を検出することが重要である。しかしながら、薬剤は血清中にかなり高い濃度で存在し得るので、抗−薬剤抗体は大体においてその薬剤と免疫複合体を形成し得る。特定の病原性タンパク質に対する免疫反応を引き出すのに使用する免疫療法用タンパク質の場合は状況が逆である。抗体は抗原に対して大過剰であり、高レベルの免疫複合体が複合体の活性化を開始し得るのでどの程度の抗原が複合体として結合しているのかを知ることが重要である。しかしながら、今日まで、血清試料中の遊離の分析物及び複合体として結合している分析物の総濃度、又はどの程度の分析物がそれぞれ遊離形態及び複合体形態であるのかを測定する便利で効率的な技術は存在しない。

Moxness, M. S., et al., “Immunogenicity Testing for Antibodies Directed Against Therapeutic Human Monoclonal Antibodies Using Electrochemiluminescent Detection”, Abstract 59 and Poster, 37th Annual Oak Ridge Conference, April 14 & 15, 2005, Baltimore, MDには、ヒト治療用モノクローナル抗体（薬剤）に対する免疫応答をモニターするためのアッセイが開示されている。各薬剤に対して特異的なウサギポリクローナル抗体を代理分析物として使用し、血清に添加した。次に、薬剤を添加し、血清を酸（ｐＨ３．３）で１時間処理して分析物−薬剤複合体を解離させ、中性ｐＨにし、アッセイした。このアッセイにおいては、中性にされた血清試料を、（ｉ）エレクトロルミネッセンス（ＥＣＬ）により光を放出するルテニウム錯体と結合した薬剤、及び（ii）ビオチンと結合した薬剤と共に一晩インキュベートした。次いで、混合物を、電極を備えているストレプトアビジンを塗布したプレートに移してビオチン−薬剤／分析物−ルテニウム薬剤複合体を捕獲し、ＥＣＬ信号をＥＣＬ−分析器で測定し、アッセイ毎に負対照に対して規格化した。しかしながら、両方の結合部位でビオチン−薬剤コンジュゲートと、又は両方の結合部位でルテニウム−薬剤コンジュゲートと複合体を形成している分析物は検出されないので、複合体として結合している全ての分析物を測定することはできず、従って総分析物濃度を決定することはできない。

Tomimori-Yamashita, J., et al., Lepr. Rev. (1999) 70: 261-271には、ハンセン病患者における抗−ＰＧＬ−Ｉ特異的循環免疫複合体の測定が開示されている。ポリエチレングリコールを添加することにより血清中の循環免疫複合体を沈降させ、その沈殿を遠心分離により単離する。沈殿をＥＤＴＡに溶解させた後、その溶液をＨＣｌ−グリシンで酸性化し、次いでリン酸水素カリウムで中和した。その後、３０分以内にＰＧＬ−１に対するＩｇＧ又はＩｇＭ抗体のレベルをＥＬＩＳＡにより試験した。すなわち、ＰＧＬ−Ｉを塗布したウェル中で９０〜１８０分溶液をインキュベートし、酵素コンジュゲート及び基質と反応させ、酵素活性によって生じた色を分光光度法で読み取った。しかしながら、当技術分野でよく知られているように、ＰＥＧは複合体を形成した分析物を全て沈降させるわけではなく、従って総分析物濃度は決定されない。

Moxness, M. S., et al., "Immunogenicity Testing for Antibodies Directed Against Therapeutic Human Monoclonal Antibodies Using Electrochemiluminescent Detection", Abstract 59 and Poster, 37th Annual Oak Ridge Conference, April 14 & 15, 2005, Baltimore, MD Tomimori-Yamashita, J., et al., Lepr. Rev. (1999) 70: 261-271

上記した従来技術の方法はどちらも、長時間のインキュベーションを必要とし、従ってフローセルアッセイ形式には適さない。従って、遊離の分析物及び複合体を形成した分析物の測定が可能であり、全ての複合体を形成した分析物を検出することができ、またフローセル用にも適する迅速で実施が容易なアッセイに対するニーズがある。

上記及びその他の目的及び利点は、遊離の分析物及び複合体を形成した分析物の総濃度を決定する方法によって提供される。この方法では、最初に試料を処理してあらゆる分析物複合体を分裂させることにより、全ての分析物を遊離形態にする。次に、試料を処理して、分析物の複合体再形成を可能にすると同時に遊離分析物の複合体再形成が実質的な程度まで起こり得る前に試料中の遊離分析物の濃度を決定する。従って、この決定された遊離分析物の濃度は試料中の分析物の総濃度を表す。

１つの態様において、本発明は、分析物の少なくとも一部が分析物結合性物質との複合体として存在する流体試料中の分析物の総濃度を決定する方法を提供し、この方法は以下の工程を含んでなる。
ａ）実質的にあらゆる分析物複合体を解離し実質的に全ての分析物を遊離形態で提供するのに充分な程度に分析物と分析物結合性物質との間の結合親和性を低下させる条件に試料を付す。
ｂ）分析物と分析物結合性物質との間の結合親和性を回復させる条件に試料を付す。
ｃ）結合親和性が回復した直後、分析物の実質的な複合体再形成が起こる前に、試料中の遊離分析物の濃度を決定する。

好ましい実施形態において、遊離分析物の測定は、分析物結合性リガンドが固定化されている固体支持体表面に試料を接触させて分析物をリガンドに結合させることを含む。

別の態様において、本発明は、以下の工程を含む、試料中の複合体として結合している分析物（以下、単に、複合体結合分析物ともいう）の濃度を決定する方法を提供する。
ａ）上記態様の方法に従って試料中の分析物の総濃度を決定する。
ｂ）試料中の遊離分析物の濃度を決定する。
ここで、工程ａ）とｂ）で得られた濃度の差が複合体結合分析物の濃度を表す。

さらに別の態様において、本発明は、分析物を含有する試料中でその分析物が１種以上の物質と複合体を形成する能力を決定する方法を提供し、この方法は以下の工程を含む。
ａ）実質的にあらゆる分析物複合体を解離し実質的に全ての分析物を遊離形態で提供するのに充分な程度に分析物と分析物結合性物質との間の結合親和性を低下させる条件に試料を付す。
ｂ）分析物と分析物結合性物質との間の結合親和性を回復させる条件に試料を付す。
ｃ）結合親和性が回復した直後、分析物の実質的な複合体再形成が起こる前に、分析物が固定化されている固体支持体と試料を接触させる。
ｄ）固定化された分析物に結合した物質を分析する。

以下の詳細な説明及び図面を参照することによって、本発明並びにそのさらなる特徴及び利点がさらに完全に理解されるであろう。

図１は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）に基づくバイオセンサーシステムの概略側面図である。 図２は、工業用バイオセンサー機器の一体型(integrated)ミクロ流体カートリッジ内の流路の概略部分説明図である。 図３は、２つの流体を混合する１つの変形例を説明するミクロ流体システムの概略部分図である。 図４Ａ及び４Ｂは、２つの流体を混合する別の変形例を説明するミクロ流体システムの概略部分図である。

上で述べたように、本発明は、分析物が少なくとも部分的に分析物結合性物質との複合体、通例免疫複合体として存在し得る流体試料中の分析物の総濃度を決定する方法に関する。

本発明によると、最初に試料を、（分析物と分析物結合性物質との間の結合に対する親和性を低下させることにより）、通例解離剤を試料に添加することにより、試料中に存在するあらゆる複合体を解離する条件に付すことによって、全ての分析物を遊離形態にする。次に、その試料を、結合親和性を回復させる条件に付し、分析物の実質的な複合体再形成が起こる実質的に直前に、好ましくは分析物特異的なリガンドへの結合によって、試料中の遊離分析物の濃度を決定する。

試料は、少なくとも部分的に複合体形態にある所定の分析物を含有するか又は含有すると疑われるいかなる試料であってもよい。しかしながら、通例、試料は哺乳類、好ましくはヒトに由来する血清又は血漿試料であり、複合体は免疫複合体（すなわち抗原−抗体複合体）である。

例えば、分析物は、ある薬剤、例えば治療用抗体のようなタンパク質薬剤に応答して生じた抗体であり得る。

本明細書で使用する場合、用語「抗体」とは、天然又は部分的若しくは全体的に合成的に製造され得る免疫グロブリンをいい、またＦａｂ抗原−結合性断片、一価断片及び二価断片を始めとする活性断片も包含する。この用語はまた、免疫グロブリン結合ドメインと相同な結合ドメインを有するあらゆるタンパク質も包含する。かかるタンパク質は天然源由来であることができ、又は部分的若しくは全体的に合成することもできる。代表的な抗体は免疫グロブリンアイソタイプ並びにＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄＡｂ、及びＦｄ断片である。

分析物を測定可能にするために解離する必要があり得る他の分析物複合体（通常タンパク質複合体）の例としてはＰＳＡ（前立腺特異的抗原）であり、ＰＳＡは大部分が複合体形態にあり複合体の割合を決定することができるということが重要なタンパク質である。血液中において、ＰＳＡの約７０〜９０％がα−１−抗キモトリプシンとの複合体であるが、ＰＳＡはまた例えばプロテインＣインヒビター、α−１−抗トリプシン及びα−２−マクログロブリンと共に複合体を形成することも知られている。総ＰＣＡに対する遊離の比は前立腺癌の有用なマーカーであろうが、現在のところα−２−マクログロブリンとの複合体を検出するのに使用することができる抗体はなく、ＰＳＡはその複合体においてα−２−マクログロブリンにより完全に包囲されている（Balk et al. (2003) J. Clin. Oncology 21, 383-391）。おそらく、他のタンパク質複合体でもそうであろう。

分析物を含有する複合体の解離を達成するには様々な試薬と条件を使用することができる。免疫複合体は、例えば、複合体をそれぞれ低いか又は高いｐＨ条件にする酸性又は塩基性剤によって解離することができる。この場合、分析物の結合活性の回復はその酸性化又はアルカリ化された試料を実質的に中性のｐＨにすることによって実施し得る。他の試薬と条件として、例えば、カオトロピック塩、高又は低イオン強度の有機塩がある。

本発明の基本的な特徴は、酸性化又はアルカリ化された試料の中和のような、（リガンド及び複合体形成性物質に対する）結合能を回復させるための処理が試料に対して行われた実質的に直後に、分析物濃度の測定が行われるということである。「実質的に直後」とは、（とりわけ分析物、複合体形成性物質及び使用するアッセイ装置に応じて）分析物の複合体再形成が認識できる程度に起こる時間がないということである。他方、（とりわけ試薬及び使用するアッセイ装置に応じて）測定が行われる前に、分析物の結合能を回復させるための試料の中和のような処理が実質的に完了するのに充分な時間がなければならない。しかしながら、各々の特定のアッセイシステムに対する測定のための最適な時間を見出すのは当業者の技能の範囲内である。好ましくは、分析物濃度を測定するとき、約５％以下、より好ましくは約１％未満の分析物が複合体形態であるべきである。

また、複合体を解離することなく分析物濃度を決定することにより、試料中の遊離分析物の複合体結合分析物に対する割合を決定することもできる。

好ましくは、固体支持体表面に固定化された分析物特異的なリガンドを含む不均一アッセイシステムを用いて、固体支持体表面に対する分析物（直接アッセイ、例えばサンドイッチアッセイ又は置換アッセイ）又は検出可能な分析物アナログ（競合アッセイ）の結合の量を直接又は間接に検出することによって分析物濃度を測定する。

固体支持体表面はそれ自体が当技術分野で公知の様々な形状をとることができるが、通例キュベット又はマイクロウェル若しくは、好ましくはフローセルウェルのような表面領域を含む。

分析物が抗体の場合、固定化されたリガンドは抗原であり得る。他方、分析物が例えばＰＳＡであるとき、固体支持体表面には例えば抗−ＰＳＡ並びに好ましくはα−１−抗キモトリプシン、プロテインＣインヒビター、α−１−抗トリプシン及びα−２−マクログロブリンも固定化され得る。

本発明の概念に基づく不均一アッセイはいわゆるリガンドフィッシング(ligand fishing)で使用することもできよう。例えば、インビボで特定のタンパク質に結合するタンパク質のような物質を知ることが重要であるとしよう。その際、特定のタンパク質を固体支持体表面に固定化し、表面を処理して最初に複合体を解離させ、次いで相互作用性物質の結合親和性を回復させた直後に、特定のタンパク質を含有する試料（例えば細胞抽出物又は血漿）を表面に接触させる（試料のかかる処理がないと、全て又は実質的に全ての結合性タンパク質が既に試料中の特定のタンパク質に結合していると、結合性タンパク質と表面の結合は殆ど又は全く起こらない）。その後、表面上に固定化された特定のタンパク質に結合したタンパク質を質量分析法などにより同定することができる。

上で述べたように、試料を処理して分析物の結合能を回復させた実質的に直後に試料を固体支持体表面、又は検出領域と接触させることが重要である。従って、フローセルの場合後者は、接合部を介して第１及び第２の導管に接続された入口からなり得る。解離した複合体を含有する試料は第１の導管内に導入し得、分析物の結合能を回復させるための作用物質を含有する流体は第２の導管に導入し得、その結果２つの流体はフローセル入口導管の接合部で混合され、その混合した流体は固体支持体領域を超えてフローセルを通過する。

検出領域と接合部との間の間隔、並びに第１及び第２の導管内の流体の流速を選択して、混合した流体が固体支持体領域に到達したときに、分析物の結合能が実質的に回復している（例えば、酸性化された試料がアルカリ性流体により実質的に中和されている）が、分析物の複合体再形成は実質的に起こっていないようにしなければならない。

場合により、混合は、例えば、流体混合物をサイドチャンネル若しくはループに流した後にその混合物をフローセル内に入れる、又はその他手段によって、改良することができる。

分析物濃度を測定するのに使用する検出システムは標識を使用する系でもよいし、又は好ましくは標識を用いないものとすることができる。好ましくは、検出はバイオセンサーのようなセンサーで実施するが、この場合固体支持体表面が（バイオ）センサーの感知面である。

バイオセンサーは広い意味で、半導体の物理化学的変換器と直接結合しているか、又は変換器と共同する移動性の担体ビーズ／粒子と共に分子識別用の部品（例えば、固定化された抗体を有する層）を使用する装置と定義される。かかるセンサーは通例固定化された層の質量、屈折率又は厚さの変化を検出する標識なしの技術に基づいているが、ある種の標識付けを利用するバイオセンサーもある。本発明の目的に合う典型的なセンサーとしては、限定されることはないが、質量検出法、例えば光学的方法及び圧電又は音響波法、例えば表面音響波（ＳＡＷ）及び水晶振動子マイクロバランス（ＱＣＭ）法がある。代表的な光学的検出方法としては、質量表面濃度を検出するもの、例えば、角度、波長、分極、若しくは位相分解し得る外部及び内部反射法の両方を含む反射−光学法、例えば表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を介したエバネッセント場増強を含み得るエバネッセント波偏光解析及びエバネッセント波分光法（ＥＷＳ、又は内部反射分光法）、ブリュースター角屈折計法、臨界角屈折計法、フラストレーティッド・トータル・リフレクション（ＦＴＲ）、散乱全反射（ＳＴＩＲ）（散乱増強標識を含み得る）、導光板センサー、外部反射イメージング、エバネッセント波系イメージング、例えば臨界角解像イメージング、ブリュースター角分解イメージング、ＳＰＲ−角度分解イメージング、などがある。さらに、光度計及びイメージング／顕微鏡法「自体」又はこれと、例えば表面増強ラマン分光法（ＳＥＲＳ）、表面増強共鳴ラマン分光法（ＳＥＲＲＳ）、エバネッセント波蛍光（ＴＩＲＦ）及びリン光に基づく反射法との組合せ、並びに導波干渉計、導波漏洩型分光法、反射干渉分光法（ＲＩｆＳ）、透過干渉法、ホログラフィック分光法、及び原子間力顕微鏡（ＡＦＲ）を挙げることができる。

ＳＰＲ及びその他の検出技術に基づくバイオセンサーシステムは今日市販されている。代表的なかかるＳＰＲ−バイオセンサーには上述のＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）機器がある。Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）機器の技術的な面及びＳＰＲの現象の詳細な説明は米国特許第５３１３２６４号に見られる。バイオセンサー感知面に対するマトリックスコーティングのより詳細な情報は例えば、米国特許第５２４２８２８号及び同第５４３６１６１号にある。加えて、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）機器に関連して使用されるバイオセンサーチップの技術的な面の詳細な説明は米国特許第５４９２８４０号に見られる。上述の米国特許の開示内容は全て援用により本明細書の一部をなす。

ここで、図１及び２を参照して、例示の目的のみで、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）又は類似のバイオセンサーシステムによりどのように本発明を実施し得るかを簡単に説明する。

Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）機器の処理装置は通例、センサーチップ表面上を通る液体の一定の流れを維持するためと、試料を取り扱うためとの２つの液体配送ポンプ、オートサンプラー、液体配送チャンネル、試料ループ及び弁を有する一体型ミクロ流体カートリッジ（ＩＦＣ）、ＳＰＲ応答を作成し測定するための光学的及び電子的部品を含む検出器ユニット、ＩＦＣをセンサーチップに押し付けることによって形成される４つの検出器フローセル、並びにポンプ、オートサンプラー及びＩＦＣ弁を制御し、ＳＰＲ信号をベイシック処理するためのマイクロプロセッサーを含んでいる。

検出システムの概略説明図を図１に示す。センサーチップ１は、流路５を通る、例えば抗原を有する分析物４を含む試料の流れに暴露される捕捉用分子３（リガンド）、例えば抗体を支持する金膜２を有している。センサーチップ１と共に流路は「フローセル」を画定し、抗体を含む金膜が「感知面」を形成している。光源７からの単色のｐ−偏光した光６がプリズム８によりガラス／金属界面９とカップリングし、そこで光が全反射する。反射した光ビーム１０の強度を光学的検出ユニット１１（光検出器アレイ）により検出する。

試料中の分子がセンサーチップ表面上の捕捉用分子に結合すると、その表面の濃度、従って屈折率が変化し、ＳＰＲ応答が検出される。相互作用中の時間に対して応答をプロットすることにより、その相互作用の進行の定量的尺度が得られる。かかるプロットは通常センサーグラムといわれる。Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムにおいて、ＳＰＲ応答値は共鳴単位（ＲＵ）で表される。１ＲＵは最小反射光強度の角度における０．０００１度の変化を表し、これは殆どのタンパク質の場合センサー表面上における約１ｐｇ／ｍｍ^２の変化とほぼ等価である。

液体のセンサーチップへの配送は、プラスチックハウジングに入れられた一連のチャンネルと空気弁からなる上述のＩＦＣによって制御される。試料はオートサンプラーから、検出器フローセルと直接接続しているＩＦＣ中に注入する。

図２は、以下の実施例で使用するＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ１００のＩＦＣと類似のＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）３０００機器のフローセル及び試料ループ部分の概略説明図である。

図２で、以下ではループチャンネルというチャンネル２１は、フローセル２２（簡明にするために、４つのフローセルのうちの１つのみを示す）の入口端とチャンネル２１上でフローセルに近接する接合部２３との間でループ様に延在している。典型的なＩＦＣにおいて、ループチャンネルは約１００μｌの容量をもっている。試料のための入口チャンネル２４（オートサンプラー入口）は、フローセル入口からさらに離れた接合部２５でチャンネル２１に接続している。連続的な液体の流れ（緩衝液）のための入口チャンネル２６が、接合部２７でチャンネル２１のループ端部に接続されている。フローセル２２の出口端は第１の廃液チャンネル２８に開放されている。第２の廃液チャンネル２９がチャンネル２１上の接合部２３と２５の間の接合部３０から延在している。第３の廃液チャンネル３１が接合部３２でチャンネル２１に取り付けられている。空気弁３３〜３６がチャンネル２１上に設けられており、弁３７が試料入口チャンネル２４上に設けられており、弁３８と３９がそれぞれ廃液チャンネル２９と３１上に設けられている。これらの弁は圧縮空気システム（図には示してない）によって作動する。チャンネル２１の接合部２５と３２との間に延在する部分は、以下に説明するように試料を装填するための「試料ループ」として使用できる。入口チャンネル２４及び２６並びに廃液チャンネル２８、２９及び３１は、ＩＦＣの（フローセル２２に対して）遠隔端まで延びており、そこで緩衝液の流れと試料／試薬のための２つの入口（オートサンプラーニードル口）を有するコネクターブロック（図には示してない）に接続している。

試料の注入は、弁とポンプの適正な制御により２つの操作モード、「直接注入」と「ループ注入」で行うことができる。

直接注入では、弁３４、３６及び３８を閉じ、残りの弁を開く。試料は、試料入口チャンネル２４及びループチャンネル２１の接合部２５とフローセル２２との間に延在する部分を介してポンプで直接フローセル２２中に送る。

一方、ループ注入では、最初弁３３、３５及び３８を閉じ、残りの弁を開き、試料を試料入口チャンネル２４を介してループチャンネル２１中に装填する一方、緩衝液の一定の流れを入口チャンネル２６を介してポンプでフローセル２２に通す。次に、弁３３及び３５を開くと共に弁３６、３７及び３９を閉じ、緩衝液をポンプで入口チャンネル２６を通ってループチャンネル２１中に流して、装填された試料体積を装填とは反対方向で試料ループからフローセル２２中に押し込む。

ここで、抗体と抗原−抗体複合体を形成する抗原を試料が含有しており、従って標的抗体の少なくとも一部分が複合体形態にある場合の試料中の抗体を検出すると仮定しよう。本発明の方法を実施するために、図２においてフローセル２２の感知面が抗原を支持している。最初に試料を酸性化して抗原−抗体複合体を解離し、次にこの酸性化された試料溶液を中和して抗体の結合能を回復させ、遊離抗体を含有する中和された試料溶液をフローセルに通して流して、感知面上に固定化された抗原に抗体を結合させる。上で述べたように、中和用の溶液がフローセル感知面に到達する前に抗原−抗体複合体の再形成が実質的な程度まで起こることがないように確実にするために、酸性化された試料と中和用の溶液の混合はフローセル入口に近接して起こるべきである。Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）機器の外で溶液を混合し、中和した試料を、例えば上記直接注入モードで注入すると、試料がフローセルに到達する前に試料中で広範に過ぎる複合体再形成が起こり得ることが明らかになった。従って、修正された注入モードを開発した。

このモードでは、図２を参照して、上記試料の装填の場合と同様に、中和用溶液を試料入口２４を介して導入し、試料ループ２１内に装填する、すなわち弁３３、３５及び３８を閉じ、残りの弁を開く。次に、入口２６を通る緩衝液の流れを使用して、上記のように、中和用溶液をフローセル２２中に注入する。すなわち、弁３３及び３５を開き、弁３６及び３９を閉じ、緩衝液を入口チャンネル２６を介してループチャンネル２１中にポンプで送ると同時に、酸性化された試料溶液を試料入口２４を通して供給する。こうして、酸性化された試料溶液と中和用溶液は接合部２５で出会って混合し始める。酸性化された試料溶液と中和用溶液の割合は試料入口２４及び入口２６を通る流体の流れの流速比を変えることによって変えることができる。

また、当然であるが、試料溶液を試料ループ内に装填し、中和用溶液を試料入口２４を介して供給してもよい。

２つの流体の混合の起こり方のより詳細な表示を図３、４Ａ及び４Ｂに概略的に示す。これらは各々サイドチャンネル４１及び４２を有する第１のチャンネル４０、及びサイドチャンネル４４を有する交差チャンネル４３を含むマイクロ流体システムの一部分を示す。このチャンネルシステムを通ってポンプで送られる流体の通過を制御するために弁（図には示してない）が設けられている。

図３は、図２に関連して上記したものに対応する混合の変形を示しており、ここでは２つの溶液が混合され、次に直接フローセルに導かれる。酸性化された試料溶液４５はサイドチャンネル４２を通して導入され、中和用溶液４６はサイドチャンネル４１を通して導入される。又はこの逆である。次いで、これら２つの溶液はチャンネル４４を介してフローセル（図には示してない）に至るまでの間に混合される。

代わりの混合の変形を図４Ａと４Ｂに示す。ここでは、溶液混合物を最初にサイドチャンネル（又はループ）に導いた後にフローセルに再導入する。酸性化された試料溶液４５及び中和用溶液４６はそれぞれサイドチャンネル４２及び４１を介して導入する。しかしながら、混合溶液４５と４６は次に第１工程（図４Ａ）で図３のように直接サイドチャンネル４４を通ってフローセルに導かれるのではなく、サイドチャンネル接合部を過ぎてさらにチャンネル４３中に流れる。次いで、この流れを止め、逆転させて、混合した流体体積をサイドチャンネル４４を通してフローセル（図４Ｂ）にポンプで送る。これを各回に少量の流体体積で繰り返して行って、２つの溶液が（複合体再形成を防止するために）あまりに長時間混合されず、すなわち混合流体の長時間の注入ではなく複数のパルスがフローセルに送られるようにする。図３における変形と比較して、図４Ａと４Ｂの混合手順は、２つの溶液の互いのより良好な混合を確実にし得、その結果センサーチップに対する非特異的な結合を低下させ得る。

当然であるが、マイクロ流体システムにおける混合を改良する多くの他の方法がある。例えば、チャンネルシステムに層流を崩す静止狭窄部、屈曲部などを含むように設計したり、又は活性ミキサーを使用する。後者の場合、例えば、上述のＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）３０００及びＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ１００機器のマイクロ流体システム中に存在する弁膜のような膜を、振動させて層流を崩す撹拌を生じさせるアクチュエーターとして使用してもよい。代わりに、一方又は両方の流体の流れをパルスにして、試料と中和用緩衝液を好ましくは非常に小さい区分に分割することができる。さらに他の代わりの手法として、流れを微細に分割する交互弁、マイクロ−プロペラー、不安定フラップ、磁気攪拌機、磁性ビーズなどを使用するものがある。活性ミキサーの代わりに、超音波場又は電場のような外部場を使用して混合を加速することも可能であろう。

以下の実施例で、本発明の様々な態様を例示のためにより具体的に開示するが、限定するものではない。

計測
Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ１００（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ（スウェーデン、ウプサラ））を使用した。この機器は、センサーチップ上の金表面における表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）検出に基づいており、４つの個別に検出されるフローセル（Ｆｃ１〜Ｆｃ４、個別又は直列）に試料を通し緩衝液を流すためにマイクロ流体システム（一体型マイクロ流体カートリッジ（ＩＦＣ））を使用する。ＩＦＣはドッキング機構によりＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ１００機器内に押し込まれてセンサーチップと接触する。

センサーチップとしてＳｅｒｉｅｓ ＣＭ５（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ（スウェーデン、ウプサラ））を使用したが、これはカルボキシメチル−修飾デキストランポリマーの共有結合したヒドロゲルマトリックス（約１００ｎｍ）と共に金を塗布した（約５０ｎｍ）表面をもっている。

機器の出力は、検出器応答（「共鳴単位」ＲＵで測定）を時間の関数としてプロットした「センサーグラム」である。１０００ＲＵの増大が、およそ１ｎｇ／ｍｍ²のセンサー表面の質量の増大に対応する。

以下の実施例で、分析は直列に結合したフローセルＦｃ１〜Ｆｃ４を用いて行った。図２を参照して上記したのと同様にしてフローセル上に注入する間ＩＦＣのフローセルに隣接して２つの溶液を混合する「プロトタイプ注入」を使用した。

流す緩衝液として、ＨＢＳ−ＥＰ＋（０．０１ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ及び０．０５％ｖ／ｖのＳｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０、ｐＨ７．４）（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ）を使用した。特に断らない限り、流速は試料が５ｍｌ／ｍｉｎ、中和用溶液が３０ｍｌ／ｍｉｎであり、温度は２５℃であった。

高濃度ＨＳＡ存在下での少量の抗−ＨＳＡ抗体の緩衝液中の測定
ヒト血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ、ＵＳＡ）を１０ｍＭアセテート（ｐＨ５．０）中で５０μｇ／ｍｌに希釈し、標準アミンカップリング（アミンカップリングキット、Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ）を用いてＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ１００内のフローセル３（Ｆｃ３）に約９ｋＲＵで固定化した。

１１０μｇ／ｍｌのＨＳＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と様々な濃度の抗−ＨＳＡ（社内試薬）を含有する１００μｌの試料を調製した。対照として、ＨＳＡを含まない試料を用いた。

試料を５０μｌの０．２Ｍグリシン（ｐＨ２．８）で酸性化した。

次に、プロトタイプ注入を用いて各試料をＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ１００中に注入し、試料をＨＢＳ−ＥＰ＋（０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ及び０．０５％ｖ／ｖのＳｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０、ｐＨ７．４（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ））と１５：８５の割合で混合することにより試料を中和した後、順次ＩＦＣの全てのフローセルに通した。検出はＦｃ３で行った（以前の実験で、酸性試料と中和用溶液の混合物はこのフローセルで最適であることが示されていた。すなわち、Ｆｃ１とＦｃ２では試料の中和が完全ではなく、一方Ｆｃ４では複合体再形成が開始していた）。ＨＳＡの再生は１０ｍＭグリシン（ｐＨ２．０、Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ）で行った。結果を次の表Ｉに示す。

表に示されているように、５μｇ／ｍｌの抗−ＨＳＡを５０倍モル過剰のＨＳＡの存在下で検出することができる。

β−２−マイクログロブリン含有及び非含有の緩衝液中の抗−β−２−マイクログロブリンの測定
標準アミンカップリング（アミンカップリングキット、Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ）を用いて、１０ｍＭアセテート（ｐＨ４．５、Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ）中の２０μｇ／ｍｌのβ−２−マイクログロブリン（β２μ）（社内試薬）をＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ１００内のフローセル３（Ｆｃ３）に約１．７ｋＲＵで固定化した。

ＨＢＳ−ＥＰ＋（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ）中に１００μｇ／ｍｌの抗−β−２−マイクログロブリン（抗−β２μ）（社内試薬）と様々な濃度のβ−２−マイクログロブリン（β２μ）（社内試薬）を含有する１００μｌの緩衝液試料を調製した。次に、５０μｌの０．２Ｍグリシン（ｐＨ２．８）と混合することにより緩衝液試料を酸性化した。対照試料は酸性化しなかった。

次いで、プロトタイプ注入を用いて各試料をＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ１００中に注入し、試料をＨＢＳ−ＥＰ＋（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ）と１５：８５の割合で混合することにより試料を中和した後、順次ＩＦＣの全てのフローセルに通した。再生はグリシン（ｐＨ１．５、Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ）で行った。結果を下記表IIに示す。

表から分かるように、酸性化された試料の場合、β２μが添加されたかされなかったに関係なく（抗−β２μとβ２μとの複合体が分裂された）ほぼ同じ応答レベルが得られたが、対照試料（酸性化されてない）の場合β２μが存在すると（抗−β２μとの複合体形成）応答レベルが劇的に低下した。

β−２−マイクログロブリン含有及び非含有のヒト血漿中での抗−β−２−マイクログロブリンの測定
標準アミンカップリング（アミンカップリングキット、Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ）を用いて、１０ｍＭアセテート（ｐＨ４．５、Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ）中の２０μｇ／ｍｌのβ２μ（社内試薬）をＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ１００内のフローセル３（Ｆｃ３）に約１．７ｋＲＵで固定化した。

（ｉ）５０μｇ／ｍｌの抗−β２μ又は（ii）５０μｇ／ｍｌの抗−β２μ及び５μｇ／ｍｌのβ２μ、並びに１％ｖ／ｖのＳｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ）を含有する１００μｌのヒト血漿試料を調製した（ヒト血漿試料は通常約１μｇ／ｍｌのβ２μを含有する）。次に、１５μｌの１Ｍ ＨＣｌと混合することにより血漿試料を酸性化した（ｐＨ２〜３になった）。

次いで、プロトタイプ注入を用いて、各試料をＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ１００中に注入し、試料を０．１Ｍ Ｋ₂ＨＰＯ₄（ｐＨ９．０）、及び１％ｖ／ｖのＳｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ）と１５：８５の割合で混合することにより試料を中和した後、順次ＩＦＣの全てのフローセルに通した。再生はグリシン（ｐＨ１．５、Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ）で行った。結果を以下の表IIIに示す。

表から分かるように、抗体がβ２μと複合体を形成しているかいないかに関係なく、抗体応答は各々２つずつの試料で実質的に同じであった。血漿試料間で変わる応答レベルは、様々な場合に様々なセンサーチップを用いて実験を行ったためである。これは、血漿試料のうちの３つを上記のように流したが、１つの同じセンサーチップ表面で同じ時間実験したときに得られた結果を示す下記表IVによって明らかである。血漿試料は１００μｇ／ｍｌの抗−β２μと１％ｖ／ｖのＳｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０を含有していた。対照として、１００μｇ／ｍｌの抗−β２μ（社内試薬）と１％ｖ／ｖのＳｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０をＨＢＳ−ＥＰ＋（ｐＨ７．４）中に含有する緩衝液試料を用いた。

表から分かるように、様々な血漿試料間で良好な一致が見られた。血漿試料の値はまた緩衝液中の抗体に対する値ともうまく対応していた。

本発明は上記した本発明の特定の実施形態に限定されることはなく、本発明の範囲は特許請求の範囲によって決定されるものと理解されたい。

Claims (16)

1. 分析物の少なくとも一部が分析物結合性物質との複合体として存在する流体試料中の分析物の総濃度を決定する方法であって、
   ａ）試料を、実質的にあらゆる分析物複合体を解離すると共に実質的に全ての分析物を遊離形態で提供するように分析物と分析物結合性物質との間の結合親和性を充分に低下させる条件に付す工程、
   ｂ）試料を、分析物と分析物結合性物質との間の結合親和性を回復させる条件に付す工程、及び
   ｃ）結合親和性が回復した直後、分析物の実質的な複合体再形成が起こる前に、試料中の遊離分析物の濃度を決定する工程
   を含んでなる方法。
2. 試料中の遊離分析物の決定が、分析物結合性リガンドが固定化されている固体支持体と試料を接触させて、固定化されたリガンドに分析物を結合させることを含む、請求項１記載の方法。
3. 工程ａ）において結合親和性を低下させ、工程ｂ）において結合親和性を回復させる条件が、試料のｐＨ−値を変化させることからなる、請求項１又は請求項２記載の方法。
4. 複合体が酸で解離可能な複合体であり、工程ａ）が試料を酸性化することを含み、工程ｂ）が酸性化された試料を中和することを含む、請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の方法。
5. 複合体が免疫複合体である、請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載の方法。
6. 分析物が治療用抗体に対する抗体であり、試料が治療用抗体を含有する、請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載の方法。
7. 請求項１の工程ｃ）において、分析物の濃度を、標識を用いない検出技術を用いて決定する、請求項１乃至請求項６のいずれか１項記載の方法。
8. 標識を用いない検出技術が、エバネッセント波感知、特に表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を含む、請求項７記載の方法。
9. 少なくとも工程ｃ）をフローセル内で行う、請求項１乃至請求項８のいずれか１項記載の方法。
10. フローセルが、固定化されたリガンドを有する検出領域、及び接合部を介して第１及び第２の導管に接続された入口を含んでおり、請求項１の工程ｂ）が解離された分析物複合体を有する試料を第１の導管に、また分析物の結合能を回復させることができる流体を第２の導管に流すことを含んでいて、その結果２つの流体がフローセルの入口導管の接合部で混合し、この混合した流体がフローセルの検出領域上を通過する、請求項９記載の方法。
11. （ｉ）検出領域と接合部との間隔、及び（ii）第１及び第２の導管内の流体の流速を、混合した流体が検出領域に到達したときに、分析物の結合能が実質的に回復しているが、分析物の複合体再形成が実質的に起こっていないように選択する、請求項１０記載の方法。
12. 第１の導管内を流れる流体が酸性化された試料であり、第２の導管内を流れる流体がアルカリ性流体である、請求項１０又は請求項１１記載の方法。
13. 混合した流体が検出領域に到達したとき、酸性化された試料が実質的に中和されているが、分析物の複合体再形成は実質的に起こらない、請求項１１又は請求項１２記載の方法。
14. 試料中の複合体結合分析物の濃度を決定する方法であって、
    ａ）請求項１乃至請求項１３のいずれか１項記載の方法に従って試料中の分析物の総濃度を決定する工程、
    ｂ）試料中の遊離分析物の濃度を決定する工程
    を含んでなり、工程ａ）及びｂ）で得られた濃度の差が複合体結合分析物の濃度を表す、方法。
15. 工程ａ）における総分析物及び工程ｂ）における遊離分析物の決定が、分析物結合性リガンドが固定化されている固体支持体と試料を接触させて、固定化されたリガンドに分析物を結合させることを含む、請求項１４記載の方法。
16. 分析物を含有する試料中でその分析物が１種以上の物質と複合体を形成する能力を決定する方法であって、
    ａ）試料を、実質的にあらゆる分析物複合体を解離すると共に実質的に全ての分析物を遊離形態で提供するように分析物と分析物結合性物質との間の結合親和性を充分に低下させる条件に付す工程、
    ｂ）試料を、分析物と分析物結合性物質との間の結合親和性を回復させる条件に付す工程、
    ｃ）結合親和性が回復された直後、分析物の実質的な複合体再形成が起こる前に、分析物が固定化されている固体支持体と試料を接触させる工程、及び
    ｄ）固定化された分析物に結合した物質を分析する工程
    を含んでなる方法。

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