JPH02286700A - 免疫グロブリンのフラグメントの精製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は免疫グロブリンのフラグメントの精製法に関す
る。さらに詳しくは、免疫グロブリンのフラグメント溶
液を疎水クロマトグラフィにかけることにより、効率よ
く短時間に簡便に、しかも純度良く該物質を精製する方
法に関する。

（従来の技術） 免疫グロブリンのフラグメントの精製方法は従来よりい
くつか知られている。なかでも代表的な例は、精製され
たマウス免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）をペプシンにて限
定分解した後ゲル濾過で分離精製する方法である。未消
化１ｇＧＦ（ａｂ−）２フラグメント、分解小ペプチド
のピークか順に現れるので目的物質を分取することがで
きる。しかしながら、ゲル濾過法では、完全に未消化Ｉ
ｇＧとＦ（ａｂ−）２フラグメントを収率よく分画する
ことは難しい。また１回の操作で処理できる試料容積が
少ないため大量精製にはむいていない。他のプロテアー
ゼを使っても本質的に上記ような欠点を補うことは不可
能である。

その他にイオン交換クロマトグラフィを利用する精製法
が知られている。プロテアーゼ処理した免疫グロブリン
の試料溶液を塩濃度の低い緩衝液に透析し、カチオン交
換樹脂（スルホプロピル（ＳＰ）、カルボキシメチル（
ＣＭ）基を有する樹脂）、またはアニオン交換樹脂（ジ
エチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）、　クオータナリイア
ミノエチル（ＱＡＥ）基を有する樹脂）のカラムに吸着
させ、塩濃度を徐々に上げたり、−度に上げたりするこ
とにより吸着した免疫グロブリンのフラグメントを選択
的に溶出させ単離精製する方法である。この方法では多
くの免疫グロブリンのフラグメントはカラムを素通りで
溶出してしまい若干の不純物は分離できない。また、容
積も増えてしまう。加えて、カラムにかける前処理とし
て開始緩衝液に透析し、脱塩する煩雑な操作を必要とす
る。

一方、免疫グロブリンのフラグメントに対する親和性を
もつタンパク質や免疫グロブリンの抗原特異性をうまく
利用した精製方法もある。免疫グロブリンのＦ（ａｂ−
）２に特異性を持つ抗体や抗原自体を不溶性の支持体に
固定化し、免疫グロブリンのフラグメントを特異的にか
つ可逆的に吸着させた後、ジオキサン（１０％）などの
有機溶媒、プロピオン酸（ｐＨ＝２．５　、　　Ｉ　Ｍ
）　、塩酸（ｐＨ＝２．５）などの酸性の溶液、エチレ
ングリコール（５０％）、カオトロピックイオン（■Ｃ
Ｆ３Ｃｏｏ−、５ＣＮ−、ＣＣｌ３　Ｃｏ。

ｐ　Ｈ−７，０〜８．０．３Ｍ）等で免疫グロブリンの
フラグメントとそれに対する抗体あるいは抗原との相互
作用を減少させることにより、または尿素（ｐＨ＝７．
０．８Ｍ）、塩酸グアニジン（ｐ　Ｈ＝３．１．６Ｍ）
等のタンパク変性剤により免疫グロブリンのフラグメン
トを遊離させ溶出させることができる。溶出の最適条件
は抗原抗体反応の結合の強さと抗体の安定性によって決
まるものであり、一般的に抗体の活性や収率の低下は免
れ得ないものである。また担体の劣化も早く、再現性や
コストの面でも不利である。

大量に免疫グロブリンのフラグメントを得ようとする際
に、後者の精製方法を使用するにはコメト的な問題か大
きいので、通常、大量分取するには前者の・イオン交換
クロマトグラフィを用いた非特異的な精製方法が用いら
れる。

しかしながら前者のイオン交換クロマトグラフィを用い
た精製方法で行う場合、前処理として塩濃度の低い開始
緩衝液に透析し、脱塩する操作を必ず行わなければなら
ない。よって、タンパク質試料を稀薄溶液というタンパ
ク質にとっては非常に不安定な条件にさらすことになる
。試料によっては非可逆的に沈殿してしまうため、クロ
マトグラフィーの開始緩衝液を高い塩濃度で始めなけれ
ばならないという、不都合を生じる場合もある。

さらにその場合、塩濃度グラジェントをかけて溶出を行
うと、溶出されるピークがブロード化してしまうという
ことがしばしば観察され、夾雑タンパク質の混入を余儀
無くされることもある。

（発明か解決しようとする課題） 本発明の目的は、従来の方法よりも簡便な操作で、前処
理せずかつ短時間に、くわえて効率良く高純度に、しか
も−度に大量の免疫グロブリンのフラグメントを精製す
る方法を提供するものである。

（課題を解決するための手段） 本発明者らは上記課題に関し鋭意検討した結果、本発明
に到達した。すなわち本発明は、免疫グロブリンのフラ
グメントを含む試料溶液を、疎水クロマトグラフィを用
いて、フラグメントを選択的に分離溶出させることを特
徴とする免疫グロブリンのフラグメントの精製法である
。

本発明で用いられる免疫グロブリンのフラグメントを含
む試料溶液の調製方法には、特に限定はない。免疫グロ
ブリンの由来としては、ハイブリドーマを移植した動物
の腹水液、ハイブリドーマおよび／またはリンパ球の培
養液、または動物の血清等があげられる。免疫グロブリ
ンは、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいず
れでもよく、モノクローナル抗体の場合、ＩｇＧＩｇＡ
、ＩｇＥ、ＩｇＤ、またはＩｇＭのいずれのサブクラス
に属するものであってもよい。これらの免疫グロブリン
をフラグメント化するには、例えば、プロテアーゼ、ｓ
−ｓ結合還元剤などが用いられる。プロテアーゼとして
一例を上げると、パパイン、ペプシン、トリプシン、キ
モトリプシン、カテプシンＤ、カテプシンＥ、プラスミ
ン。

またはズブチリシン等があるが、これらに限定されるも
のではない。

このようにして得られたＦａｂ。

Ｆ　（ａｂ−）２＋　　Ｆｃ等のフラグメント、未消化
免疫グロブリン、分解小ペプチド等は、疎水クロマトグ
ラフィを用いて、各フラグメントを選択的に分離溶出さ
せることができる。

疎水クロマトグラフィの疎水性基をもつ樹脂としては、
フェニル基、オリゴエチレングリコール基、炭素数か４
ないし１８個である直鎖または分枝状の炭化水素鎖を共
有結合させた親水性ポリマ系樹脂または親水性シリカゲ
ル樹脂、スチレン系樹脂、アクリレート系コポリマー、
メタアクリレート系コポリマー、アガロース、セルロー
スまたはデキストランの一種等があげられるが、これに
限定されるものではない。

上述の疎水クロマトグラフィーに、免疫グロブリンのフ
ラグメントを含む試料を吸着させ、塩濃度を変化させる
ことにより、目的とする免疫グロブリンのフラグメント
を選択的に分離溶出させることができる。このとき用い
られる塩溶液としては、例えば硫酸アンモニウム、硫酸
ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム等があ
げられる。塩濃度は、直線的に変化させても、段階的に
変化させてもよい。

（発明の効果） 以上の説明から明らかなように、本発明によれば、従来
法に比べてより簡便な操作で短時間に、かつ効率よく高
純度にしかも一度に大量の免疫グロブリンのフラグメン
トを精製することが可能である。

（実施例） 以下、その条件等、実施例を挙げて詳細に説明する。し
かし、これら実施例のみに本発明は限定されるものでは
ない。

［実施例１］ （１）ペプシンをマウス腹水に反応させる工程ヒト成長
ホルモンに対するモノクローナル抗体（Ｉ　ｇＧｌ　）
を産生ずるハイブリドーマを移植したマウスの腹水液１
１ｍ１に、１００％飽和硫酸アンモニウム水溶液（（Ｎ
Ｈ４）２　ＳＯ４、ｐＨ＝７．４）９ｍｌを氷上で攪拌
しながら滴下した。

次にその試料を１１，０００回転（１０，０００ｘ　ｇ
）、２０分間、４℃で遠心して沈殿を得た。再度同様の
操作を行い、−り清を除去した後、沈殿を６ｍｌのリン
酸緩衝化生理食塩水（０，８５％ＮａＣ１含有０．０１
％リン酸緩衝液、ｐＨ７，２：以下ＰＢＳ）に溶解し可
溶化した。この試料を透析チューブに移し、１００倍量
の容積のＰＢＳに４℃で攪拌しなから透析し、試料の伝
導度がＰＢＳのそれと同じになるまで繰り返しＰＢＳを
交換した。

試料の２８０ｎｍにおける紫外吸光度は、１３．４であ
った。この試料３．６ｍｌをサンプル管にとり、０．４
ｍｌの１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ＝２．５）を加えて、
さらにＩＮの塩酸で試料のｐＨを３．７に調製した。こ
の試料に０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ＝３．７）に溶
解したペプシン（シグマ社製）を試料に対する重量比で
０，５％（ｗ　／　ｗ　）添加した。ただちに上記試料
を３７℃で攪拌しなから２時間放置し、次に３Ｍのトリ
ス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液を０．４ｍ
ｌ加え試料のｐＨを中性に調製しペプシンの酵素反応を
停止し、反応物を１０．０００回転で２０分間遠心し、
沈殿物を除いた後、免疫グロブリンの酵素分解物を得た
。

（２）疎水クロマトグラフィによる分離精製上記の免疫
グロブリンの酵素分解物２ｍｌに３Ｍの硫酸アンモニウ
ムを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，４）１ｍｌを
加え、攪拌混合した。

同試料３ｍｌを、１Ｍの硫酸アンモニウムを含む２０ｍ
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，４）で平衡化したＴＳＫ−Ｇ
ｅｌ　　Ｐｈｅｎｙｌ−５ＰＷ（商品名；東ソー社製）
のカラム（φ７．５ｍｍｘ７．５ｃｍ）にアプライした
。該カラムによる高速液体クロマトグラフィのチャート
を図１に示す。

約１０ｍ１の同緩衝液でカラムを洗浄すると夾雑タンパ
ク質が溶出された（図］：ピーク１゜４．６２分）。溶
出されるタンパク質のピーク（２８０ｎｍにおける吸光
度）が終わったところで（図］：矢印のところ、１０分
）、溶出液を、硫酸アンモニウム濃度１ＭからＯＭの、
２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，４）で、直線的に硫酸
アンモニウム濃度を６０分間かけて下げた。さらに、純
水で１０分間溶出しカラムを洗浄した。この時の溶離液
の流速は１ｍｌ／ｍｉｎで、検出波長は２８０ｎｍであ
った。この条件で免疫グロブリンのフラグメントのピー
クは約３９分に現れた（図１；ピーク２，３９．７３分
）。このピークを分取して精製免疫グロブリンフラグメ
ント画分とした。カラムはさらに未消化ＩｇＧ１を含む
ピークを約５２分に溶出した（図１：ピーク３゜５２．
７７分）。以上で−通りの精製操作が終了した。分取し
たピーク２及びピーク３はそれぞれメルカプトエタノー
ル還元下の１２％５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動を行った。結果を図２に示す。図２からも明らかな
ように、均一の］　］ 免疫グロブリンのＦ（ａｂ）２と未消化ＩｇＧ１である
ことが確認された。

（３）免疫グロブリンのＦ（ａｂ−）２精製物と未処理
１ｇＧＬ精製物の抗体力価の酵素免疫学的測定法による
検査 未処理マイクロタイタープレー１−（９６ウエル・ヌン
クプレート、インターメッド社製）の各ウェルに０．１
Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９，６）に溶解した１μ
ｇ　／　ｍ　ｌのヒト成長ホルモンの溶液５０μｌを加
えて、４℃で一夜インキユベートした。各ウェルの溶液
を除去し、リン酸緩衝化生理食塩水（０，８５％ＮａＣ
１含有０．０１％リン酸緩衝液、ｐＨ７，２：以下ＰＢ
Ｓ）に０．０４％ツイーン（ｔｗｅｅｎ）−２０を含ん
だ溶液（以下ＰＢＳ−Ｔ）で３回洗浄した後、０．１％
ウシ血清アルブミン（以下ＢＳＡ）を溶解したＰＢＳ＝
Ｔ溶液３００μｌを各ウェルに加えて、４℃でブロッキ
ング処理しそのまま保存した。マイクロタイタープレー
１・を室温にもどし、ＰＢＳ−Ｔ溶液で洗浄した後、２
８０ｎｍの紫外吸光度を０．００５になるようＰＢＳで
希釈したＦ（ａｂ−）２又は未処理ＩｇＧを含む試料を
各ウェルにそれぞれ５０μｍ加えた。この状態で３７°
Ｃで９０分間放置した。つぎにペルオキシダーゼ標識ウ
サギ抗マウスＩｇＧ（Ｆｃフラグメント特異的、ジャク
ソン・イムノケミカル社製）抗体又はペルオキシダーゼ
標識ヤギ抗マウスＩ　ｇＧ　ＣＦ　（ａｂ　　）　２フ
ラグメント特異的；カペル社製）抗体をＰＢＳ−Ｔ溶液
で５０００倍に希釈し、各ウェルにそれぞれ５０μｍず
つ添加した。そのまま室温で９０分間インキュベートし
た後、溶液を除去しＰＢＳ＋−Ｔ溶液で３回洗浄した。

それに、０．３ｍｇ／ｍｌの　２，２−アジノジ（３−
エチルベンズチアゾリン硫酸）−ジアンモニウム塩（Ａ
ＢＴＳ）及び０．０１％過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を含有
する０、１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４，１）から成る基
質溶液を各ウェルに１００μｌ添加し゛、室温で３０分
間呈色反応させた後、２００ｍＭシュウ酸溶液を１００
μｌ加えて酵素反応を停止させた。上記マイクロタイタ
プレートを各ウェルについて、波長４１５ｎｍ。

対照波長４９２ｎｍの吸光強度を自動マイクロタイター
プＩノートリーダー（東ソー株式会社製、ＭＰＲ−Ａ４
、商品名）で測定した結果を図３−１図３−２に示す。

図３−１は、未処理１ｇＧ又はＦ（ａｂ−）を、二次抗
体としてＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩ　ｇＧ　（Ｆ　（ａ
ｂ　　）　２特異的）抗体を用イテ測定した結果である
。この図からも明らかなように、本発明による精製法を
行っても、抗体活性に悪影響を及ぼさないことが示され
た。

図３−２は、未処理ＩｇＧ又はＦ（ａｂ−）ｚを、二次
抗体としてＨＲＰ標識ウサつ抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ特異
的）抗体を用いて測定した結果である。Ｆ（ａｂ−）２
は本発明法により精製され、Ｆｃ部分の混入かないこと
が示された。

［比較例１］ イオン交換クロマトグラフィによる分離精製実施例１の
（１）で調製したＦ（ａｂ−）２７ラグメントと未消化
１ｇＧを含む試料２ｍｌを４０ｍＭ塩化すトリウムを含
む２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）５００ｍ
ｌに一昼夜透析した。同試料２ｍｌを、４０ｍＭ塩化ナ
トリウムを含む２０　ｍ　Ｍ　）リス−塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ８，０）で平衡化したＴＳＫ−Ｇｅｌ　　ＤＥＡＥ５
ＰＷ（商品名；東ソー側製）のカラム（φ７．５ｍｍＸ
７．５ｃｍ）にアプライした。該カラムによる高速液体
クロマトグラフィのチャートを図４に示す。約１０ｍ１
の同緩衝液で流速１　ｍｌ／ｍｉｎでカラムを洗浄する
とＦ（ａｂ−）２フラグメントと夾雑タンパク質が溶出
された（図４；ピーク１，５．１７分）。これは素通り
画分であり、このピークを分取して精製Ｆ（ａｂ−）２
両分とした。溶出されるタンパク質のピーク（２８０ｎ
ｍにおける吸光度）が終わったところ（図４．矢印のと
ころ、１０分）で溶出液を、塩化すトリウム濃度４０ｍ
Ｍから５００ｍＭの２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ
８，０＞で、直線的に塩化ナトリウム濃度を６０分間か
けて高くした。この時の溶離液の流速は１ｍｌ／ｍｉｎ
てあった。カラムはさらに未消化１ｇＧ１を含むピクを
約２６分に溶出した（図４；ピーク２２６．０７分）。

以上で−通りの精製操作が終了した。これらＦ（ａｂ′
）２フラグメントと未消化１ｇＧの抗体活性は、実施例
１（３）の方法で確認し、ともに陽性であった。しかし
、精製Ｆ（ａｂ−）２両分は、大量の夾雑タンパク質を
含んでいた。

【図面の簡単な説明】

図１は、実施例１における高速液体クロマ）・グラフィ
のチャートを、図２は実施例１における電気泳動ゲルの
結果を、図３−１及び図３−２は実施例１での抗体価を
反映した呈色反応の４１５ｎｍでの吸光度を縦軸に、抗
原の濃度（ｎｇ／ｍ１）を横軸にその関係をそれぞれ示
した図である。図４は、比較例１における高速液体クロ
マトグラフィのチャートを示した図である。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. （１）免疫グロブリンのフラグメントを含む試料溶液を
   、疎水クロマトグラフィを用いて、フラグメントを選択
   的に分離溶出させることを特徴とする免疫グロブリンの
   フラグメントの精製法。
2. （２）疎水クロマトグラフィの疎水性基をもつ樹脂が、
   フェニル基、オリゴエチレングリコール基、炭素数が４
   ないし１８個である直鎖または分枝状の炭化水素鎖を共
   有結合させた親水性ポリマー系樹脂または親水性シリカ
   ゲル樹脂、スチレン系樹脂、アクリレート系コポリマー
   、メタアクリレート系コポリマー、アガロース、セルロ
   ースまたはデキストランの一種である特許請求の範囲第
   １項記載の方法。
3. （３）免疫グロブリンが、ハイブリドーマを移植した動
   物の腹水液、ハイブリドーマおよび／またはリンパ球の
   培養液、または動物の血清由来である特許請求の範囲第
   １項または第２項記載の方法。
4. （４）免疫グロブリンが、ポリクローナル抗体、ＩｇＧ
   、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、またはＩｇＭのいずれかの
   サブクラスに属するモノクローナル抗体である特許請求
   の範囲第１〜３項いずれかの項に記載の方法。
5. （５）疎水クロマトグラフィで使用する塩溶液が、硫酸
   アンモニウム、硫酸ナトリウム、リン酸カリウム、リン
   酸ナトリウムのいずれかである特許請求の範囲第１〜４
   項いずれかの項に記載の方法。
6. （６）免疫グロブリンのフラグメントを含む試料溶液が
   、パパイン、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、
   カテプシンＤ、カテプシンＥ、プラスミン、またはズブ
   チリシンを用いて調製されたものである特許請求の範囲
   第１〜５項いずれかの項に記載の方法。