JPH0577679B2 - - Google Patents

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JPH0577679B2
JPH0577679B2 JP59504143A JP50414384A JPH0577679B2 JP H0577679 B2 JPH0577679 B2 JP H0577679B2 JP 59504143 A JP59504143 A JP 59504143A JP 50414384 A JP50414384 A JP 50414384A JP H0577679 B2 JPH0577679 B2 JP H0577679B2
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prothrombin
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ligand
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Buruusu Ii Fuyuurii
Baabara Shii Fuyuurii
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NYUU INGURANDO MEDEIKARU SENTAA HOSUPITARUZU Inc
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NYUU INGURANDO MEDEIKARU SENTA
NYUU INGURANDO MEDEIKARU SENTAA HOSUPITARUZU Inc
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Description

請求の範囲 １ タンパク質含有混合物から該タンパク質を単
離する方法において、 配位子と複合体を形成した前記タンパク質とは
反応性があるが、配位子と複合体を形成していな
い前記タンパク質とは本質的に反応しない抗体
を、固体支持体上に固定化し、 前記配位子の存在下で前記混合物を前記固定化
抗体と接触させて、前記配位子と複合体を形成し
た前記タンパク質が前記固定化抗体に結合した免
疫複合体を形成せしめ、および 前記免疫複合体を、前記配位子に対して前記タ
ンパク質より高い結合親和力を持つ化合物と接触
させて、前記固定化抗体から前記タンパク質を遊
離させることを特徴とする方法。
２ 前記タンパク質が血液凝固に関連するタンパ
ク質であり、前記配位子が3000以下の分子量を持
つ化合物である請求の範囲第１項記載の方法。
３ 前記配位子が２価または３価の金属陽イオン
である請求の範囲第１項記載の方法。
４ 前記陽イオンがCa++、Mn++、Co++、Gd++
またはMg++である請求の範囲第３項記載の方
法。
５ 前記高い結合親和力を持つ化合物が金属キレ
ート剤である請求の範囲第３項記載の方法。
６ 前記タンパク質がγ−カルボキシグルタミン
酸を含有し、前記配位子が２価または３価の金属
陽イオンであり、前記陽イオンが前記タンパク質
と前記γ−カルボキシグルタミン酸含有結合部位
で複合体を形成する請求の範囲第１項記載の方
法。
７ 前記タンパク質が哺乳類タンパク質因子、
因子、因子、因子、因子、プロトロンビ
ン、タンパク質Ｃ、タンパク質Ｓまたは血清アル
ブミンの一つである請求の範囲第１項記載の方
法。
８ 前記タンパク質が酵素である請求の範囲第１
項記載の方法。
９ タンパク質を該タンパク質を含有する混合物
から単離する方法において、 前記タンパク質と反応性があるが配位子と複合
体を形成している前記タンパク質とは本質的に反
応しない抗体を、固体支持体上に固定化し、 前記混合物を前記配位子が前記タンパク質と複
合体を形成しない条件下で前記固定化抗体と接触
させて、前記タンパク質が前記固定化抗体に結合
した免疫複合体を形成せしめ、および 前記免疫複合体を前記配位子が前記タンパク質
と複合体を形成できる条件下で前記配位子と接触
させて、前記固定化抗体から前記タンパク質を遊
離させることによりなる方法。
１０ 前記タンパク質が哺乳類ビタミンＫ−依存
性タンパク質であり、前記配位子が3000以下の分
子量を持つ化合物である請求の範囲第９項記載の
方法。
１１ 前記配位子が２価または３価の金属陽イオ
ンである請求の範囲第９項記載の方法。
１２ 前記陽イオンがCa++、Mn++、Co++、
Gd++またはMg++である請求の範囲第１１項記載
の方法。
１３ 前記タンパク質がγ−カルボキシグルタミ
ン酸含有の配位子結合部位を持ち、該配位子が２
価または３価の金属陽イオンであり、および前記
陽イオンが前記タンパク質と前記結合部位で複合
体を形成する請求の範囲第９項記載の方法。
１４ 前記タンパク質がヒトタンパク質因子、
因子、因子、因子、因子、プロトロンビ
ン、タンパク質Ｃ、タンパク質Ｓまたは血清アル
ブミンの一つである請求の範囲第９項記載の方
法。
１５ 前記タンパク質が酵素である請求の範囲第
９項記載の方法。
〔技術分野〕
本出願は1983年10年28日付で出願した米国出願
Ｓ・N546364号の部分継続出願である。
本発明は一般的に体液中のタンパク質の混合物
から例えば血液凝固タンパク質のごときタンパク
質の分離法に関する。タンパク質は通常免疫アフ
イニテイー・クロマトグラフイーにより精製さ
れ、そこではタンパク質含有混合物を固定化され
た特定のタンパク質に対する抗体と接触せしめ、
その後タンパク質一抗体複合体を分裂させる非特
異的な苛酷な条件を用いてタンパク質を溶出せし
める。
免疫アフイニテイーが試みられているタンパク
質の一つの種類は血液凝固過程に関与するタンパ
ク質である。血液凝固の一般的な全過程には二つ
の段階が含まれる：多くの因子およびカルシウム
イオンの作用により前酵素プロトロンビンがその
活性酵素型であるトロンビンに変換される活性化
段階、タンパク分解性酵素トロンビンがフイブリ
ノーゲンに作用して、生成した血液要素を保持す
る３次元網状組織を形成するフイブリンを生成す
る変換段階である。
血液凝固の必須な印子はすべてタンパク質であ
り、そのいくつかは構造および機能においていく
つかの類似性を共有し、一方あるものは他のいず
れとも異る81個の部分をもつ。例えば、次の４つ
の血液凝固タンパク質（“ビタミンＫ−依存性タ
ンパク質”）はそれらの完全な合成のためビタミ
ンＫを必要とする：因子、因子、因子およ
びプロトロンビン。
これらの１つの群のタンパク質はアミノ酸配列
に顕著な相同性を共有し、制限タンパク分解によ
りチモーゲンから活性酵素型へ活性化され、新規
の金属結合アミノ酸、γ−カルボキシグルタミン
酸を含有する。これらの血液凝固タンパク質は多
くの２価および３価陽イオンと結合できる独特な
種類の金属イオン結合タンパク質の代表である。
カルシウム、マグネシウム、マンガンおよびガド
リニウムイオンのごとき金属イオンとの結合によ
り、これらのタンパク質はペプチド主鎖の変化お
よび特定のアミノ酸残基の露出の変化を含む構造
的コンホメーシヨン遷移を起こし、それは螢光、
円偏光二色性または免疫化学的技術によりモニタ
ーできる。
他の血液凝固タンパク質もまた金属イオンに結
合するこの能力を持つている。因子（プロアク
セレリン）はプロトロンビンのトロンビンへの転
化に必須であり、また、それは非常に不安定なタ
ンパク質であり、保存された血漿からは急速に消
滅する。因子（抗血友病性因子）はトロンビン
を作るのに必須であり、古典的血友病のヒトの血
漿において欠乏している。血友病は先天性であ
り、血友病者の血液は因子の欠乏を除いて凝固
機構に関して正常であるように思われる。
後天的には、肝臓疾患、ビタミンＫ欠乏、およ
びワルフアリンナトリウム（クマジン）のごとき
ビタミンＫ拮抗薬の存在下ビタミンＫ依存タンパ
ク質が欠乏する。血友病Ｂは因子の遺伝的な欠
乏で特徴付けられる疾病である：米国においては
25000人が血友病であり、その約10−12％が血友
病Ｂに罹患している。
後天的または遺伝的血液凝固タンパク質欠乏の
疾病を持つ患者の治療は高い危険性を持つ高価な
療法が続けられている。例えば血友病Ｂは現在次
の２通りの方法で治療されている：新鮮な凍結血
漿の使用または因子の市販製品の使用。後者の
物質は正常ヒト血漿の部分分画により得られた濃
縮製剤であり、最もよいものでも中程度の純度で
ある。凍結血漿および不純な因子濃縮製剤を使
う両方の療法とも、患者への肝炎の著しい危険性
が存在するが、因子濃縮製剤はプールされたヒ
ト血漿から製造されるのでより大きな感染の危険
性がある。これらの血漿製品の両方を多く投与さ
れるすべての血友病患者は事実上肝炎にさらされ
てきており、そのような暴露の血清学的証拠が示
される。臨床的には多くはある種の型の異常な肝
臓機能を持つている。しかしながら不純な因子
濃縮製剤は伝染性脈管内凝固、血栓症および肝炎
のごとき主要な合併症の危険を増加させ、特に調
製製剤中の不純物により直接に起こされるかまた
は悪化させられると信じられている。最近では高
度に致死性の後天的免疫欠乏症候群（AIDS）の
発現に対する危険の増加が血漿濃縮製剤を受けて
いる血友病患者において報告されている。血漿タ
ンパク質注入療法はこれらの疾病における特別の
治療法ではあるが、そのような注入療法の合併症
が調製製剤中の不純物により直接起こされる事が
明らかであるのでその使用および有効性が減少し
ている。この理由のため、血液凝固血漿タンパク
質を実質的に純粋に濃縮した形のものを供給する
方法は、現在の注入療法の好ましくない医学的合
併症をなくすか、または著しく減少させる。その
ような進走は長く認識されている要求を満足させ
更なる利点を提供するので、血友病患者によりそ
の疾病に伴うタンパク質欠病を減少または除くた
め規則的および予防的に注入療法が使用されるで
あろう。
〔背景の技術〕
上記のごとく、血漿中の血液凝固タンパク質を
精製する一般的な過程は知られており、通常ビー
ズ型のセフアロースのごとき不活性なマトリツク
ス支持体に単離すべき因子の抗体を結合せしめた
アフイニテイクロマトグラフイーカラムを通して
血漿を通過せしめる。因子は特異的に固定化抗体
と複合体を形成しその後因子（抗原）をカラムか
ら溶出する。しかしながら本発明以前には血液凝
固因子をうまく溶出する事が非常に困難であつた
のでこの方法により、治療上有益な純度で所望の
血液凝固因子を得る事は非常に困難な事であつ
た。これはタンパク質から抗体を分離するのに必
要な化学または物理条件がタンパク質の機能も破
壊するためである。
従つて、構造的および機能的に完全なタンパク
質を残し、タンパク質が定量的に回収できる、
個々の血液凝固因子を含むタンパク質の単離のた
めの方法を提供する事が非常に望まれる。
〔発明の開示〕
一般に、本発明は配位子と複合体を形成した場
合コンホメーシヨン変化（即ち３次元構造の変
化）を起こすタンパク質を単離するための非常に
有効な方法を特徴とする。本方法は、タンパク質
−配位子複合体と特異的に反応し、配位子不在下
では実質的にタンパク質と反応しない、または配
位子なしのタンパク質と特異的に反応し、配位子
と複合体を形成したタンパク質とは実質的に反応
しないいづれかの抗体（ポリクローナルまたはモ
ノクローナル）を用いる（タンパク質は一般的に
配位子により安定化されるので、配位子と複合体
形成したタンパク質を以後ときどき“配位子−安
定化”コンホーマーと称する）。
本発明に使用する抗体が単離しようとするタン
パク質の配位子−安定化コンホーマーに特異的な
場合は、本方法で固定支持体上に抗体を固定化
し、その後配位子存在下、タンパク質を含有する
混合物を固定化抗体と接触せしめ、配位子−安定
化タンパク質を固定化抗体に結合せしめる。タン
パク質を放出させるため、タンパク質−抗体複合
体をタンパク質の配位子に対する親和力よりも強
い配位子への結合親和力を持つ化合物と接触せし
める；この強い親和力の化合物はタンパク質から
配位子を除去し、タンパク質のコンホメーシヨン
を変化せしめ、抗体はもはやそれに結合せず、こ
のようにしてタンパク質が放出される。この放出
段階は特異的で緩和な条件下実施され、タンパク
質を通常免疫アフイニテイカラムから溶出する非
特異的な苛酷な条件に付随する変性および機能の
損失の危険性がなく高度に精製できる。
本方法に使用する抗体が非配位子安定化タンパ
ク質に特異的な場合は、本方法は固体支持体上に
抗体を固定化し、その後タンパク質を含有する混
合物を配位子不在下（または配位子がタンパク質
に結合しない条件下）、固定化抗体と接触せしめ、
タンパク質を固定化抗体に結合せしめる。タンパ
ク質の放出のためには、タンパク質−抗体複合体
を配位子と接触せしめ、それによりタンパク質の
コンホメーシヨンが変化し、もはや抗体とは結合
しなくなる。配位子−安定化タンパク質に特異的
な抗体を使用する方法の場合は、放出段階は特異
的で緩和であり、そのため変性は起こらない。
本発明の方法はさらに非常に重要な利点を提供
する：例えばヒト血液凝固に関与するタンパク質
のごときタンパク質は混合物中の他のタンパク質
からだけではなく同様に混入ウイルスからも分離
される。この事はしばしば通常の因子および因
子濃縮製剤からのＢ型肝炎に接触する血友病患
者にとつて非常に重要な事である。
さらに、本発明の方法はわずかな単純な工程で
高度な精製を提供し、低価な自動化および規模拡
大を行い易い。
本発明の他の特徴および利点は、以下に記載す
る良好な実施態様および請求の範囲から明らかに
なるであろう。
〔発明を実施するための最良の形態〕
第１に図を記載する。
図 図１は塩化カルシウム中（●）およびエチレン
ジアミン四酢酸（Γ）中でのコンホメーシヨン特
異性抗−因子ポリクローナルウサギ抗体の因子
への結合を示すグラフであり； 図２は塩化カルシウムの存在および不在下での
コンホメーシヨン特異性抗−因子モノクローナ
ル抗体（HL12−21）の因子への直接結合を示
すグラフであり； 図３はコンホメーシヨン特異性抗−因子：
Ca++ポリクローナル抗体の特異性を示すグラフ
である。因子（●）による置換が観察される因
子（▲）またはプロトロンビン（Γ）では観察
されない。
図４は本発明の方法を用いる部分精製血漿から
のヒト因子の精製および単離を示すグラフであ
る。
図５は、塩化カルシウム存在下のコンホメーシ
ヨン特異性抗−プロトロンビンモノクローナル抗
体のプロトロンビンへの結合およびエチレンジア
ミン四酢酸によるその溶出を示すグラフである。
図６は、本発明の方法を用いた、Ｂ型肝炎−混
入血漿からのＢ型肝炎表面抗原の除去を示すグラ
フである。カラムからの分画につきタンパク質濃
度（280nmでの吸収●）およびＢ型肝炎表面抗原
を競合ラジオイムノアツセイ（HBsAgΓ）によ
り検定した。肝炎ウイルスの定量的存在はRIAに
おけるcpmの増加により表現される（非特異的結
合は124cpmであり、陽性試料は250cpm以上であ
る。） タンパク質および配位子 本発明の方法はタンパク質が配位子と複合体形
成した場合そのコンホメーシヨンが変化する任意
のタンパク質の単離に使用できる。
そのようなタンパク質の一つの種類は血液凝固
に関連するヒトおよび他の哺乳類の血漿タンパク
質である（即ち、因子、、、、、プロ
トロンビン、タンパク質Ｓおよびタンパク質Ｃ）。
これらのタンパク質はある種の低分子量（＜
3000）の配位子、特にCa++、Mg++、Co++およ
びGd+++のごとき二価または三価の金属イオンと
複合体形成した場合にコンホメーシヨン変化を起
こす。これらのタンパク質のいくつかは（例え
ば、プロトロンビンおよび因子）は金属イオン
結合部位含有Vγ−カルボキシグルタミン酸を持
つが、他のタンパク質（例えばγ−カルボキシグ
ルタミン酸を含まない因子）も金属イオンと複合
体形成によりコンホメーシヨン変化を起こす。
本発明の方法を用いて精製できる他のタンパク
質は、配位子と複合体形成して安定な複合体を形
成でき、その複合体の３次元構造が非複合体形成
の酵素のそれと異なるような酵素である。そのよ
うな配位子の例は非常に希少な基質；阻害基質
（即ち、酵素により活性化され酵素と共有結合を
形成するような基質）：阻害剤として機能する基
質類似体；および酵素阻害剤である。
抗体産生 本方法で使用される抗体は常法により産生され
るポリクローナルおよびモノクローナル抗体のい
ずれでもよい。抗体の産生に使用する抗原の性質
はどの一般的精製技術を用いるかに依存してい
る。もし抗体が配位子−安定化コンホーマーに特
異的であるべきなら、タンパク質の配位子−安定
化コンホーマーを用いて免疫し、またはもし、配
位子がすでに免疫化動物に存在していれば、配位
子なしのタンパク質単独で使用できる；動物に存
在する配位子が免疫化タンパク質とインビボで複
合体になり、配位子−安定化コンホーマーに対す
る抗体を産生する。例えば、動物血液中にカルシ
ウムは存在するので、因子のごときCa++−安
定化ヒト血液タンパク質に対する抗体は、Ca++
と複合体形成していない因子で免疫して発生で
きる。一方、もし例えば酵素の基質のごとく免疫
動物の血清に存在しない配位子なら、配位子−安
定化タンパク質を用いて免疫化を実施する。
タンパク質の非配位子安定化コンホーマーに対
し特異的な抗体を用いるタンパク質単離法では、
もし配位子が免疫動物に存在しない場合は配位子
の不在下、タンパク質で免疫化を実施する。もし
免疫動物に配位子が存在するならば（例えばもし
配位子がCa++であり、タンパク質がプロトロン
ビンのごときCa++−安定化ヒト血漿タンパク質
ならば）天然に存在する配位子と複合体形成を行
なわないであろうタンパク質の抗原性類似体を用
いて免疫化を実施しなければならない。正常の状
態では、配位子結合部位含有γ−カルボキシグル
タミン酸を持つ血液タンパク質の場合、タンパク
質の異常なデス−γ−カルボキシグルタミン酸型
を用いて免疫化を実施できる（プロトロンビンお
よび因子のごときビタミンＫ依存性タンパク質
の場合、異常なデス−γ−カルボキシグルタミン
酸型のタンパク質がビタミン欠乏症の患者の血液
から単離できる）。もしくは、免疫化抗原は配位
子と複合体形成するには小さすぎるタンパク質の
部分に対応するペプチドから成り立たせる事も出
来；もし必要であれば、ペプチドをウシ血清アル
ブミンまたはキーホールアオガイヘモシアニンの
ごときより大きな分子で担持する事もできる。
抗体スクリーニングおよび精製 通常のスクリーニング技術を用い、タンパク質
の一つのコンホーマーに結合し、他のものには結
合しない能力で抗体をスクリーニングする。抗体
は抗体が特異的であるタンパク質のコンホーマー
が結合したアフイニテイカラムを用い精製する；
もし、カラムが配位子−安定化コンホーマーに対
する抗体を含むなら、配位子に対しより強い親和
力を持つ化合物で溶出し、またはもしカラムが非
−配位子−安定化コンホーマーに対する抗体を含
むなら配位子で溶出する。
固体支持体への結合 精製体をタンパク質精製技術で使用される通常
の任意の固体支持体に結合する、例えば交叉アガ
ロース、ポリアクリルアミドまたはセルロースが
例えば臭化シアノジエン、カルボジイミドまたは
タンパク質Ａを通して結合されたアフイニテイク
ロマトグラフイーカラム。例えば種々の重合ビー
ズのごとき通常の固体支持体が非−クロマトグラ
フイーアフイニテイ精製法に同様に使用できる。
タンパク質単離 タンパク質含有混合物を適当な支持体−結合抗
体と適当な配位子の存在または不在下（方法に依
存して）接触せしめ、タンパク質を単離する。免
疫複合体の分裂は配位子の除去または添加による
結合タンパク質のコンホメーシヨン変化により達
成される。結合タンパク質が金属イオン−安定化
の場合、分裂はEDTA，EGTA，クエン酸塩、
シユウ酸塩またはリン酸塩のごとき金属キレータ
ーを用いて良好に達成される。
以下の特定の実施例は本発明をより特別に指摘
しようとするものであり、その範囲を制限するも
のではない。
実施例 １ 精製ヒト因子濃縮製剤の製造 ヒト因子抗原の調製 因子は新鮮凍結ヒト血漿から、ローゼンベル
ク（Rosenberg）ら、（1974）ジエイ．バイオロ．
ケム．（J.Biol.Chem.）、250：1607−1617；およ
びミレチヒ（Miletich）ら、（1978）ジエイ．バ
イオロ．ケム．（J.Biol.Chem.）、253：6908−
6916に記載された方法に従つてDEAEセフアデツ
クスクロマトグラフイー、DEAEセルロースクロ
マトグラフイーおよびヘパリン−セフアロースク
ロマトグラフイーの連続的なクエン酸バリウム吸
着および溶出により単離される。精製因子はド
デシル硫酸によりポリアクリルアミドゲルでの電
気泳動で単一のバンドとして移動する。因子活
性は因子−欠乏血漿を用いる２段階検定により
決定し、180−200単位／mgの比活性を持つ事が示
された。
精製因子は臭化シアノジエン−活性化セフア
ロース4Bにセフアロースml当り4.3mgの濃度で結
合せしめる（総量４mlセフアロース）。
抗−因子：Ca++抗体の調製 ニユージランド白色ウサギ因子で免疫する。
因子の金属−安定化コンホーマーに対して特異
的な抗体（抗−因子：Ca++）タイ（Tai）ら
（1980）ジエイ．バイオロ．ケム．（J.Biol.
Chem.）、255：2790−2795による技術を改良した
ヒト因子−セフアロースカラム（1.5×３cm）
上のアフイニテイクロマトグラフイーにより以下
のごとく精製した。抗血清は0.05Mトリス
HCl8；PH7.4、0.14M NaCl、3mM CaCl2、0.05
％NaN3（TBS／CaCl2）で一夜透析する。因子
−セフアロースカラムを同一の緩衝液で平衝化
し、抗血清をカラムにかける。カラムを徹底的に
TBS／CaCl2で洗浄し、非結合タンパク質を除去
する。抗−因子；Ca++抗体はTBS／5mM
EDTAで溶出する。金属イオン不在で因子と
結合する結合・抗−因子抗体は4Mグアニジン
HClで溶出する。
5mM EDTAで溶出する抗体（Ca++−安定化
コンホーマー特異性）をプールし、限外過によ
り濃縮する；これらは抗血清中、約20％の抗体を
示す。ウサギ抗−因子：Ca++抗体は臭化シア
ノジエン−活性化セフアロース4Bにセフアロー
スml当り3.3mgの濃度で（総容量２mlセフアロー
ス）カトレカサス（Cuatrecasas）ら、（1969）
ビーエヌエイエス・ユーエスエイ（PNAS
USA）61：636−643の方法に従つて結合する。
モノクローナルコンホメーシヨン特異性−因子
抗体の調整 Balb／ｃマウスを最初50μｇのヒト因子抗原
を含む完全フロインドアジユバントを腹腔に注射
して複合する。これらのマウスはその後25μｇの
因子を含む完全フロインド補助液で２週間ごと
に３ケ月免疫する。続いての１ケ月間は更なる免
疫化を行なわず、次の引き続いての細胞融合に先
立つ３日間はこれらのマウスに25μｇの因子を
含む0.15M NaCl溶液を静脈内に注射する。
免疫マウスからの脾臓細胞（約５×107細胞）
をSp2/0血漿細胞株（28％ポリエチレングリコー
ル5000、シグマ（Sigma）社、中５×106細胞）
とコーラー（Kohler）およびミルシユタイン
（Milstein）〔コーラー、G.らネイチヤー（ロンド
ン）（Nature）（London））、256：495−497
（1975）〕の方法を用いて融合する。融合細胞は
RPMI1640、15％ドナー（Donor）ウシ血清、
10mμヘペス（Hepes）緩衝液、4mμグルタミン
および20μｇ／mlのゲインマイシンから成る完全
培地に懸濁し、この培地中48時間増殖させる。細
胞懸濁液を微量力価トレーの個々の二重のウエル
中へ、細胞増殖を続ける為ウエル当り約３×105
細胞を含むように分配する。数週間後各々のウエ
ルからの上澄み液の抗−因子抗体産生を検定す
る。選択された培養細胞を限外希釈法〔マツケル
ン（Makearn）、T.J.ら、モノクローナル・アン
テイボデイーズ（Monoclonal Antibodies）、ブ
レナム・プレス（Plenum Press）、ニユーヨーク
（New York）〕によりクローン化する。因子
に反応性のあるモノクローナル抗体を産生する多
くのクローンが同定されるが、単一のクローン
（HL12−２と称される）が金属イオン存在下で
のみ因子と反応し、金属イオン不在下では因子
と反応しないコンホメーシヨン−特異性抗体を
産生する。
抗−因子抗体の評価のための検定 固相酵素結合免疫吸着検定（ELISA）法をポ
リクローナルウサギおよびモノクローナルネズミ
抗−因子：Ca++抗体の評価のために使用した。
微量力価プレートの適当な数のウエルを0.05Mホ
ウ酸（PH8.5）中20μｇ／mlの濃度ヒト因子で４
℃にて16時間覆う。プレートを徹底的に50mMト
リスHCl（PH7.2）、0.1N NaClおよび0.05％NaN3
からなる緩衝液Ａで洗浄し、２％ウシ血清アルブ
ミンを含有する緩衝液Ａを24℃で30分間添加す
る。緩衝液Ａのみでよく洗浄した後、50μの組
織培養上澄み液またはモノクローナル抗−因子
抗−血清を各々、個々のウエルに添加し、その後
プレートを37℃にて１時間インキユベートする。
各々のウエルを50mμトリスHCl（PH7.2）、0.14N
NaCl、1.5mμMgCl2、2mμベーターメルカプト
エタノール、、0.05NaN3、および0.05％ウイーン
（Tween）20からなる緩衝液Ｂで徹底的に洗浄す
る。ヒツジで作成された抗マウスＩｇのFabフラ
グメント（50μ）を緩衝液Ｂ中でベーターガラ
クトジダーゼと結合させ、各々のウエルに添加す
る。プレートを再び24℃で２時間インキユベート
した後、緩衝液Ｂで３回以上洗浄する。ｐ−ニト
ロフエニル−Ｄ−ガラクトシド（0.05Mリン酸ナ
トリウム：PH7.2、中50μ）、1.5mμMgCl2および
100mμベーターメルカプトエタノールから成る酵
素基質を各々のウエルに添加し、24℃にて30から
60分間の間反応せしめる。反応生成物はダイナテ
ツク（Dymatech）MR580微量−ELISA自動読
み取り機を使用して405ナノメータの吸光度を測
定する事によりモニターする。
抗体−因子相互作用に対するカルシウムイオ
ンの効果を評価するこれらの研究のためELISA
過程に追加の工程を加える。因子被覆ウエルで
モノクローナル抗体をインキユベート後プレート
を50mμトリスHCl、0.14M NaCl、Ω7.2、
10mμEDTAかまたは5mμCaCl2を含有する緩衝
液で洗浄する。CaCl2またはEDTA含有緩衝液で
２回洗浄後、結合マウス免疫グロブリンを前記の
ごとく検出、定量する。
さらに、モノクローナルウサギ抗体を用いる実
験においては、ヒツジで高められた抗−ウサギIg
（50μ）をアルカリホスフアートとβ−メルカ
プトエタノールなしの緩衝液Ｂ中で結合し、この
液を適当なウエルに添加し、続いて24℃にて２時
間インキユベートする。ウエルを緩衝液Ｂで洗浄
後、ｐ−ニトロフエニルリン酸２ナトリウム
（50μ）を含む1Mグリシン、1.5mM MgCl2、
PH10、を各々のウエルに添加し24℃にて60分間反
応を進行させ3N NaOHで反応を停止する。反応
生成物は405nmにおける吸光度でモニターし測定
する。
ポリクローナルおよびモノクローナルコンホメ
ーシヨン特異性抗−因子：Ca++抗体を評価し
た結果はグラフにより図１および２に図示してあ
る。図１はCaCl2かまたはEDTA存在下のウサギ
抗−因子：Ca++モノクローナル抗体の結合能
力を示しており、図から明らかなように、因子
抗原に結合するこれらのコンホメーシヨン特異性
抗体の能力はEDTA存在下で本質的に減少して
いる。図２は連続的に希釈したカルシウムイオン
またはEDTAの存在下での因子抗原に対する
HL12−21ネズミモノクローナル抗体の直接結合
を図示している。一つの抗体クローン、HL12−
21はEDTA存在下ではコンホメーシヨン特異性
モノクローナル抗体が因子抗原に結合する能力
がない事を明確に示している。
抗−因子：Ca++に対する抗体特異性の評価 コンホメーシヨン特異性抗−因子抗原ネズミ
ポリクローナルおよびウサギポリクローナル抗体
の抗原特異性の決定は２つの型の検定を利用す
る。第１の検定は混合した20μ／mlのヒトプロ
トロンビン、因子または因子で被覆されたウ
エルを持つ微量力価プレートを用い、コンホメー
シヨン特異性抗体と反応せしめる。試験した抗体
母集団のすべてが（ネズミモノクローナルコンホ
メーシヨン特異性抗体およびポリクローナルウサ
ギコンホメーシヨン特異性抗体）ヒト因子抗原
と独占的に反応および結合した事が観察された。
第２の検定においては（図３）、ヒトプロトロン
ビン、因子および因子を個々に別々のウエル
中濃度を変化させて、一定量のネズミモノクロー
ナルまたはウサギポリクローナルコンホメーシヨ
ン特異性抗体に添加する。最初の30分間の反応時
間に続いてプロトロンビン、因子または因子
からなるこれらのウエルの反応液は次いで因子
抗原で被覆した他の微量力価プレートのウエルに
添加する。コンホメーシヨン特異性抗−因子：
Ca++抗体を含有する最初の反応液と固定化因子
抗原のかわりの他の血漿タンパク質との相互作
用は因子含有固定化固相へ結合する免疫グロブ
リンの量の減少としてモニターする。結果はグラ
フにより図３に図示してあり、ウサギポリクロー
ナル抗−因子：Ca++抗体がヒトプロトロンビ
ンまたは因子と競合せずもしあつたとしてもご
くわずか（10000×以下）である事がカルシウム
イオン存在下因子に対するこれらのコンホメー
シヨン特異性抗体の特異性を決定的に示してい
る。
コンホメーシヨン特異性抗−因子抗体−セフア
ロースマトリツクスを用いる精製ヒト因子の単
離 コンホメーシヨン特異性ポリクローナルまたは
モノクローナル抗−因子の結合特異性は確立さ
れた方法〔カトレカサスP.らプロス．ナルト．ア
カド．サイ．（Proc.Natl.Acad.Sci）USA、61：
636（1969）〕を用いネズミモノクローナル抗−因
子：Ca++抗体またはウサギポリクローナル抗
−因子：Ca++抗体が臭化シアノジエン−活性
化セフアロースに結合したものからなるアフイニ
テイマトリツツクスへ精製ヒト因子、因子ま
たはプロトロンビンを加える事により示される。
これらのビタミンＫ依存性凝固タンパク質の精製
調製試料は1mM CaCl2および1mMのベンズアミ
ジン（PH7.5）を含有する緩衝液Ａに対して透析
し、この透析液で平衝化したアフイニテイマトリ
ツクスへ注ぐ。因子タンパク質はアフイニテイ
マトリツクスへ結合する。一方因子およびプロ
トロンビンタンパク質は透析溶液により溶出され
る。続いてアフイニテイマトリツクスに結合して
いる因子タンパク質を1mMベンズアミジンお
よび3mM EDTAを含む緩衝液Ａ（PH7.5）で溶出
する。回収された因子タンパク質は10mMリン
酸ナトリウム、0.14N NaCl（PH7.0）に対して透
析し、−70℃で凍結する。アフイニテイマトリツ
クスからの各々の血漿タンパク質の分離および
個々の溶出は280nmでの吸光度の測定によりモニ
ターする。アフイニテイマトリツクスから単離さ
れた精製ヒト因子タンパク質の分画活性は検定
により評価する。すべての場合、精製因子タン
パク質は構造的に無傷で機能的に活性である事が
観察された。さらに、アフイニテイマトリツクス
カラムを通つた最初の溶出溶液中に回収された因
子およびプロトロンビンの機能活性を、
Russellのまむし毒液−ケフアリン凝固法を用い
て因子−または因子−欠乏ウシ血漿の凝
固を促進する各々のタンパク質の能力を試験する
事により検定した。DEAEセフアセル
（Sephael）により更に精製されたクエン酸バリ
ウム吸着血漿または市販のプロプレツクス
（Proplex ）濃縮製剤からのヒト因子の選択
的精製の他の実証を前記の方法により実施した。
この溶出液を用いて得られるタンパク質分画の結
果を図４に図式的に示した。EDTA含有液によ
り溶出される因子タンパク質分画（図４）の純
度はドデシル硫酸含有ポリアクリルアミドゲル中
の電気泳動により評価し、アフイニテイカラムに
注がれた部分的精製血漿タンパク質物質の電気泳
動ゲルと比較し、CaCl2含有溶出溶存在下ではカ
ラムに結合しない図４の流れ通つただけの溶出タ
ンパク性物質と比較した。部分精製血漿タンパク
質物質中のヒト因子タンパク質の比活性はタン
パク質mg当り12.6単位であつた。ウサギポリクロ
ーナル抗−因子：Ca++抗体から成るアフイニ
テイマトリツクスカラムからEDTA含有溶出液
を用いてヒト因子タンパク質単離した後は、因
子タンパク質の比活性（透析後）は152単位／
mgであつた。この13倍の純度の増加は以前に知ら
れている多段階技術により得られた因子タンパ
ク質の場合と等しいかより以上である。この方法
は他のタンパク質同様混入している因子および
プロトロンビン活性をほとんど除去し、あつても
ごくわずかである。結果を表１に示した。理由は
まだ完全には明らかでないが、モノクローナル抗
体を用いるよりポリクローナル抗体を用いた方が
良好な結果が得られた。
この精製法により得られる主要な利点としては
以下のような事が挙げられる：現在知られている
古典的な多段階精製技術よりかなり簡単なアフイ
ニテイマトリツクス精製過程を一貫して用いる事
より著しく純粋な（95−100％の間の均一性を持
つ）濃縮製剤を得る事ができる；現在入手可能な
血漿注入療法製品およびコニン （Konyne ）
または他の市販濃縮製剤と比較して、20から
12000倍純度の高い純粋タンパク質製品を得る事
ができる。当事者はこの方法論が、商業規模への
拡大が血漿注入製品の製造の価格の大きな低下を
まねき、また現在の血漿注入療法の結果目下起こ
つている望ましくない合併症を除去するであろう
優れた製品を提供する事を理解するであろう。
Ｂ型肝炎ウイルスから因子の分離 血友病Ｂの治療に使用されている部分精製因子
濃縮製剤は肝炎ウイルス混入の高い危険性を伴
つている。我々は免疫アフイニテイークロマトグ
ラフイーにより製造された精製因子にはウイル
ス混入がないかどうかを問題にした。Ｂ型肝炎表
面抗原による検定によりＢ型肝炎ウイルスが豊富
な事が測定された原発性肝細胞癌の患者からの腹
水（１ml）を新鮮凍結血漿（200ml）に添加する。
抗−因子：Ca++−セフアロースを使用して因
子を免疫アフイニテイクロマトグラフイーによ
り前記のごとく精製する。カラム分画中のウイル
ス表面抗原をラジオイムノアツセイにより測定す
る。すべてのＢ型肝炎表面抗原はアフイニテイマ
トリツクスに結合しなかつた。因子を含有する
EDTA溶出液中に検出できるほどの肝炎ウイル
スは存在しない（図６）。因子分画を50倍濃縮
後も肝炎ウイルスは検出されなかつた。これらの
結果は、検出限界内において、因子がその精製
中に肝炎ウイルスから分離された事を示してい
る。
実施例 ２ 精製ヒトプロトロンビン濃縮製剤の製造 ヒトプロトロンビンはプロトロンビンのCa++
−安定化コンホーマーに特異的な固定化抗体を用
いるか、またはCa++−安定化コンホーマーに反
応しない異常デス−γ−カルボキシグルタミン酸
プロトロンビンに特異的な固定化抗体を用いて単
離できる。前者の抗体はプロトロンビンで免疫し
て、後者は異常プロトロンビンで免疫して作られ
る。因子精製の場合のごとく、第１段階は免疫
法のための抗原の調製である。
プロトロンビン抗原の調製 ヒトプロトロンビンは新鮮凍結血漿から以下の
順序のタンパク質沈殿の確立された方法を用いて
調製される：クエン酸バリウム吸着、硫酸アンモ
ニウム沈殿、イオン交換クロマトグラフイーおよ
び硫酸デキストラン−アガロースクロマトグラフ
イー〔ローゼンベルグ（Rosenberg）、J.S.ら、
ジエイ．バイオロ．ケム．（J.Biol.Chem.）、
250：1607−17（1974）およびミレツチ
（Miletch）、J.P.ら、ジエイ．バイオロ．ケム．
（J.Biol.Chem.）、253：6908−6914（1978）〕。この
方法で得た精製プロトロンビンは凝固検定により
10単位／mgの比活性を持つ事が示された〔フラー
トン（Fullerton）、K.W.、ランセツト
（Lancet）、２：195（1940）〕。
ポリクローナルおよびモノクローナルコンホメー
シヨン特異性抗−プロトロンビン抗体の調整 プロトロンビンに対するポリクローナルコンホ
メーシヨン特異性抗体は実施例１に記載した方法
でニユージーランド白色ウサギの免疫法により高
められる。静脈穿刺による血液の採取および遠心
分離の後、血清分画を抗体源として使用し、それ
は続いてカラムマトリツクス上のアフイニテイク
ロマトグラフイーにより除去する。アフイニテイ
マトリツクスは確立された方法を用いて臭化シア
ノジエシー活性化セフアロースに共有結合的に結
合されているプロトロンビンから成つている。抗
−プロトロンビン：Ca++抗体はアフイニテイマ
トリツクスからEDTA含有緩衝液Ａを用いて溶
出される。
ネズミモノクローナルコンホメーシヨン特異性
抗−プロトロンビン抗体の調製およびそのような
コンホメーシヨン特異性抗体の評価は一般的に実
施例１に各々示されたそれぞれの記載に続く
ELISA方法論によりなされる。
モノクローナル抗体特異性の評価 ELISA方法論に基づく競合検定を用い、RL1.3
およびRL1.9と同定されたクローンから誘導され
た数種のモノクローナル抗体の抗原特異性が評価
された。これらのクローンからの抗体は同定化ヒ
トプロトロンビンに結合する事が示された；さら
に抗体のための固定化プロトロンビンと競合する
遊離プロトロンビンをその後加える。この競合検
定を使用し、これらのモノクローナル抗体とプロ
トロンビンフラグメント１、異常（デス−γ−カ
ルボキシグルタミン酸）プロトロンビン、トロン
ビン、プロトロンビン１およびウシプロトロンビ
ンとの相互作用を試験した。両方の型のモノクロ
ーナル抗体（RL1.3およびRL1.9）はフラグメン
ト１（プロトロンビンのNH2−末端の1/3の部分）
と結合するが、一方両方ともプロトロンビン１
（プロトロンビンのCOOH末端の2/3の部分）に
結合しないという結果が示された。
これらの抗体は少しもトロンビン（前もつてｐ
−アミジノフエニルメタンスルホニルフルオリド
で処理した）と結合しない。抗体−固定化プロト
ロンビン相互作用の50％阻害にはプロトロンビン
に比較して著しい高濃度の（２倍から10倍の範
囲）のプロトロンビンフラグメント１が必要とさ
れる。さらに、これらのモノクローナル抗体型の
両方ともにウシプロトロンビンとは結合しない。
３つのハイブリドーマ培養上澄み液からのモノ
クローナル抗体がカルシウムイオン存在または不
在下のプロトロンビン結合活性を試験された。ク
ローンRL1.3、RL1.9およびHL10.6が5mM
CaCl2存在下プロトロンビンと結合するのが
0.01MEDTA存在下では有意な結合を示さないコ
ンホメーシヨン特異性抗プロトロンビン抗体を産
生した。クローンRL1.3はAmerican Type
Culture Collection（ATCC）に供託され、
ATCC受入れ番号第HB837号を受けた。
モノクローナル抗体プールからのコンホメーシヨ
ン特異性抗−プロトロンビン抗体の精製 種々の抗−プロトロンビン抗体産生ハイブリツ
ドクローンを確立された方法〔ルイス（Lewis）、
R.ら、バイオケミストリー（Biochemistry）、
22：948−954（1983）〕を用いて多量の培養液中で
増殖させる。いくつかの型の抗体がアフイニテイ
クロマトグラフイーによりその液の50％硫酸アン
モニウム分画から精製される。トリス−HCl（PH
7.5）、0.5M NaClおよび5mM CaCl2からなる溶
出液で前もつて平衝化されたアガロースに共有結
合で結合されたプロトロンビンからなる２×６cm
カラムアフイニテイマトリツクスに抗体プールを
応用する（図５）。このアフイニテイマトリツク
スを通つた後得られる溶出分画は分画の280nmに
おける吸光度を測定する事によりモニターされ
る。非結合タンパク質がなくなるまでアフイニテ
イマトリツクスを洗浄した後、結合タンパク質分
画は0.05Mトリス−HCl（PH7.5）、0.5M NaClお
よび10mM EDTAから成る溶出液で溶出する。
この溶出液のタンパク質を、0.05Mトリス−HCl
（PH7.5）、0.15M NaClおよび0.02％アジ化ナトリ
ウムから成る透析液に対して16時間透析し、続い
て−20℃で保存する。
コンホメーシヨン特異性抗−プロトロンビン抗体
とプロトロンビンとの相互作用 RL1.3から得られたモノクローナル抗体とプロ
トロンビンとの相互作用は広い範囲のカルシウム
イオン濃度でELISA法を用いて研究した。この
検定において重大な誤りの源となる混入カルシウ
ムイオンを除くため固定化プロトロンビンを含む
微量力価プレートはEDTAを含む緩衝液で洗浄
し、金属イオンを含まない水で調製された0.05N
トリス−HCl（PH7.5）および0.15M NaClからな
る液体で徹底的に洗浄する。結果は、固定化プロ
トロンビンへのモノクローナル抗体結合のすべて
がカルシウム依存である事を示している。最大結
合は、0.9mM NaCl2の濃度で観察され、最大の
半分の結合は0.1mM CaCl2濃度で観察された。
同様に、RL1.3抗体の不溶化プロトロンビンへの
結合が過剰のプロトロンビンで被覆した微量力価
プレートへ種々の濃度のRL1.3抗−プロトロンビ
ン抗体を加えて測定した。得られた経験的データ
を用いて、スカツチヤード（Scatchard）プロツ
トを行い、モノクローナル抗−プロトロンビンコ
ンホメーシヨン特異性抗体の結合定数（Ka）は
2.3×109M-1と計算された。評価した範囲の全部
の範囲で結合曲線が直線的であり、モノクローナ
ル特異性抗体調製に期待される抗体結合部位の単
一の母集団が含まれている事を示している事が注
目される。
精製プロトロンビンの単離のためのモノクローナ
ルまたはオリゴクローナルアフイニテイマトリツ
クスの調製 カルシウムイオンと結合してプロトロンビンの
カルシウムイオン安定化型を形成するプロトロン
ビンタンパク質の単離のためのアフイニテイマト
リツクスの調製にこれらのモノクローナル、コン
ホメーシヨン特異性抗−プロトロンビン抗体を使
用する。ポリクローナルまたはモノクローナル抗
−因子：Ca++アフイニテイマトリツクスの使
用に関しては、使用する方法は前に実施例１に記
載した方法と同様である。ハイブリドーマ産生モ
ノクローナル抗−プロトロンビン抗体の一つの主
要な利点は、明白に異つたモノクローナル抗体母
集団（各々プロトロンビンのカルシウムイオン安
定化型に対してコーホメーシヨン特異性である）
をわかつている部分で結合でき、純粋な分子とし
て結合プロトロンビンが続いて溶出される最適の
プロトロンビン結合素質を提供するオリゴクロー
ナル抗体プールが形成できる点である。このオリ
ゴクローナル抗体のプールをモノクローナルまた
はポリクローナル抗血清と同一の方法で臭化シア
ノジエン−活性化アガロースへ結合し、アフイニ
テイマトリツクスを形成する。プロトロンビン含
有液または調製分画を5mM CaCl2存在下アフイ
ニテイマトリツクスに適用し、続いてカルシウム
イオン含有緩衝液を用いて非結合物質を溶出す
る；アフイニテイマトリツクスはその後クエン酸
緩衝液または10mM EDTA含有溶出液で洗う。
アフイニテイマトリツクスに結合しているプロト
ロンビンの金属イオン安定化型中のカルシウムイ
オンは優先的にクエン酸緩衝液またはEDTAに
結合するようになり、その結果、アフイニテイマ
トリツクス表面で、プロトロンビン−抗−プロト
ロンビン複合体が解離する。この優先的な金属陽
イオン（この例ではカルシウムイオン）の
EDTAまたはクエン酸緩衝液への結合がプロト
ロンビン−抗体複合体の解離および同時にプロト
ロンビンの金属イオン安定化型の付随した解離を
起こす事が理解されるであろう。使用された金属
イオンが正確に同一であるのかと無関係に、およ
び単離された血液凝固血漿タンパク質が同一であ
るかどうかと無関係に、すべての例において抗原
−抗体複合体の機構は類似している。
抗−異常プロトロンビンを用いるプロトロンビン
の精製 抗−因子および抗−カルシウム−安定化プロ
トロンビンのために前に記載したごとく、抗−異
常プロトロンビンもアフイニテイマトリツクスの
調製に使用できる。異常プロトロンビンに対する
ポリクローナルまたはモノクローナル抗体の両方
を使用してマトリツクスを調製できる。一つのそ
のようなモノクローナル抗体（本質的にCa++−
安定化プロトロンビンに反応しないもの）が
ATCCに供託されておりATCC受託番号HB8638
を受けている。
プロトロンビン含有液はCaCl2不在下マトリツ
クスに応用でき、マトリツクスを洗浄して非結合
物質を除去する。マトリツクスはその後、プロト
ロンビンと複合体形成し、抗体により認められな
いコンホーマーを形成する5mM CaCl2で洗浄す
ると、プロトロンビンを放出する。
他の実施態様も以下の請求の範囲内である。
JP59504143A 1983-10-28 1984-10-29 コンホメ−ション特異性抗体を用いる血液凝固タンパク質の精製および単離法 Granted JPS61500226A (ja)

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