JPH0449299A

JPH0449299A - 免疫グロブリンフラグメントの精製法

Info

Publication number: JPH0449299A
Application number: JP15410290A
Authority: JP
Inventors: Yoshitaka Iba; 善孝伊庭; Koichi Morimoto; 康一森本; Nobuyuki Kawai; 信之河合; Kuniyo Inoue; 國世井上
Original assignee: Tosoh Corp
Current assignee: Tosoh Corp
Priority date: 1990-06-14
Filing date: 1990-06-14
Publication date: 1992-02-18

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本發明は免疫グロブリンのフラグメントの精製法に関す
る。さらに詳しくは免疫グロブリンをプロテアーゼで酵
素分解した試料を疎水クロマトグラフィーにかｌするこ
とにより、効率よく短時間に簡便にしかも純度良く該物
質を精製する方法に関する。

（従来の技術）免疫グロブリンのフラグメントの精製方法は従来よりい
くつか知られている。なかでも代表的な例は、精製され
たマウス免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）をパパインにて限
定分解した後、ゲル濾過で分離精製する方法である。未
消化１ｇＧ。

Ｆ（ａｂ−）２フラグメント、Ｆｃフラグメント。

分解小ペプチドのピークが順に現れるので目的物質を分
取することができる。しかしながら、ゲル濾過法では、
完全に未消化ＩｇＧ。

Ｆ（ａｂ−）２フラグメント、Ｆｃフラグメントを収率
よく分画することは難しい。また１回の操作で処理でき
る試料容積が少ないため大量精製にはむいていない。他
のプロテアーゼを使っても本質的に上記のような欠点を
補うことは不可能である。

その他にイオン交換クロマトグラフィーを利用する精製
法が知られている。プロテアーゼ処理した免疫グロブリ
ンの試料溶液を塩濃度の低い緩衝液に透析し、カチオン
交換樹脂（スルホプロピル（ＳＰ）、カルボキシメチル
（ＣＭ）基を有する樹脂）、またはアニオン交換樹脂（
ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）、　　クオータナリ
イアミノエチル（ＱＡＥ）基を有する樹脂）のカラムに
吸着させ、塩濃度を徐々に上げたり、−度に上げたりす
ることにより吸着した免疫グロブリンのフラグメントを
選択的に溶出させ単離精製する方法である。この方法で
は多くの免疫グロブリンのフラグメントはカラムを素通
りで溶出してしまい若干の不純物は分離できない。また
、容積も増えてしまう。加えてカラムにかける前処理と
して開始緩衝液に透析し、脱塩する煩雑な操作を必要と
する。

一方、免疫グロブリンのフラグメントに対する親和性を
もつタンパク質や免疫グロブリンの抗原特異性をうまく
利用した精製方法もある。免疫グロブリンのＦ（ａｂ−
）２に特異性を持つ抗体や抗原自体を不溶性の支持体に
固定化し免疫グロブリンのフラグメントを特異的にかつ
可逆的に吸着させた後、ジオキサン（１０％）などの有
機溶媒、プロピオン酸（ｐＨ−２，５，１Ｍ）　、塩酸
（ｐＨ−２，５）などの酸性の８液、エチレングリコー
ル（５０％）、カオトロピックイオン（Ｉ−、ＣＦ、Ｃ
ＯＯ−，５ＣＮ− ＣＣ１３ＣＯＯ−ｐＨ−７，０〜８．０．３Ｍ）等で免
疫グロブリンのフラグメントとそれに対する抗体あるい
は抗原との相互作用を減少させることにより、または尿
素（ｐＨ−７，０，８Ｍ）、塩酸グアニジン（ｐＨ−３
，１，６Ｍ）等のタンパク変性剤により免疫グロブリン
のフラグメントを遊離させ溶出させる。溶出の最適条件
は抗原抗体反応の結合の強さと抗体の安定性によって決
まるものであり、−船釣に抗体の活性や収率の低下は免
れ得ないものである。また担体の劣化も早く、再現性や
コストの面でも不利である。さらに、この方法ではＦ（
ａｂ−）２フラグメントを精製することはできるがＦｃ
フラグメントを同時に精製することはできない。

大量に免疫グロブリンのフラグメントを得ようとする際
に後者の精製方法を使用するにはコスト的な問題が大き
いので、通常、大量分取するには前者のイオン交換クロ
マトグラフィーを用いた非特異的な精製方法が用いられ
る。

しかしながら前者のイオン交換クロマトグラフィーを用
いた精製方法で行う場合、前処理として塩濃度の低い開
始緩衝液に透析し、脱塩する操作を必ず行わなければな
らない。よって、タンパク質試料を稀薄溶液というタン
パク質にとっては非常に不安定な条件にさらすことにな
る。試料によっては非可逆的に沈殿してしまうため、ク
ロマトグラフィーの開始緩衝液を高い塩濃度で始めなけ
ればならないという、不都合を生じる場合もある。

さらに、その場合、塩濃度グラジェントをかけて溶出を
行うと溶出されるピークがブロードしてしまうというこ
とがしばしば観察され、夾雑タンパク質の混入を余儀無
くされることもある。

（発明が解決しようとする課題）本発明の目的は、上記精製方法より大巾に利用価値のあ
る免疫グロブリンのフラグメントを精製する方法を提供
するものである。

（課題を解決するための手段）本発明者らは上記課題に関し鋭意検討した結果、本発明
を完成するに至った。すなわち本発明は、免疫グロブリ
ンを含む試料溶液にプロテアーゼを反応させ、限定分解
により免疫グロブリンのフラグメントを調製し、そのフ
ラグメント溶液に塩溶液を加え、疎水クロマトグラフィ
ーを用いて目的とする免疫グロブリンのフラグメントお
よび夾雑タンパク質を塩溶液中で吸着させ、塩濃度を下
げることにより免疫グロブリンのフラグメントを選択的
に脱離させ分離溶出することを特徴とする免疫グロブリ
ンのフラグメントの精製法である。以下その詳細につい
て説明する。

免疫グロブリンを含む試料としては、とくに限定はない
。例えば、ポリクローナル抗体、ＩｇＧ。

ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＭのいずれかのサブクラ
スに属するモノクローナル抗体等があげられる。試料溶
液の由来も特に限定はないが、例えば、ハイブリドーマ
を移植した動物の腹水液、ハイブリドーマ及びリンパ球
の培養液、動物の血清、または精製された免疫グロブリ
ン等である。

上記のような試料溶液をプロテアーゼと反応させ、限定
分解する。プロテアーゼとしては特に限定はないが、例
えば、パパイン、ペプシン、トリプシン、キモトリプシ
ン、カテブシンＤ、Ｅ、プラスミンまたはズブチリシン
等があげられ、特にパパインが好ましい。この様なプロ
テアーゼにより、試料は限定分解され、Ｆ　（ａｂ）２
、Ｆｃなどのフラグメントが生成する。

次に疎水クロマトグラフィーを用いて、目的のフラグメ
ントの分離を行う。このとき用いられる塩溶液は、通常
の疎水クロマトグラフィーに使用する塩を用いればよい
。例えば、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、リン酸
カリウム、またはリン酸ナトリウム等があげられる。疎
水クロマトグラフィーとしては、疎水性基をも樹脂がフ
ェニル基、オリゴエチレングリコール基または炭素数が
４ないし１８で直鎖もしくは分枝状の炭化水素鎖を共有
結合させた親水性ポリマー系樹脂または親水性シリカゲ
ル樹脂等があげられる。また、疎水クロマトグラフィー
の疎水性基をもつ樹脂が、スチレン系樹脂、（メタ）ア
クリレート系コポリマアガロース、セルロースまたはデ
キストラン等もあげられる。試料中に含まれる免疫グロ
ブリンのフラグメント及びきょう雑蛋白質を、塩溶液を
用いて疎水クロマトグラフィーに吸着させ、徐々に塩濃
度を下げて、免疫グロブリンのフラグメントを選択的に
脱離させ分離溶出させればよい。

（発明の効果）以上の説明から明らかなように本発明によれば、従来法
に比べてより簡便な操作で短時間に、かつ効率よく高純
度にしかも一度に大量に免疫グロブリンのフラグメント
を精製することが可能である。

また本発明によれば、免疫グロブリンＦ（ａｂ−）２及びその類縁体と、Ｆｃフラグメントお
よびその類縁体とを、１回のクロマトグラフィーで同時
に分離精製することが可能となった。

（実施例）以下、その条件等、実施例を挙げて詳細に説明する。し
かし、これら実施例のみに本発明は限定されるものでは
ない。

（１）パパインを精製抗体に反応させる工程（ａ）精製
抗体の調製抗ヒトミオグロビン・モノクローナル抗体ＭＢＨ（Ｉ　
ｇＧ、　）を含むマウス腹水からイオン交換クロマトグ
ラフィーによりＭＢＨを精製し、これを５０ｍＭリン酸
ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ７，０）に対して十分透析し
抗体溶液を得た。

（ｂ）活性化パパインの調製パパイン（ＥＬＡＳＴＩＮ　ＰＲＯＤＬＩＣＴＳＣＯＲ
ＰＯＲＡＴＩＯＮ製）を１０　ｍ　ｇ　／　ｍ　１の濃
度で１０ｍＭシスティンおよび５ｍＭ　　ＥＤＴＡ（エ
チレンジアミン四酢酸）を含む５０ｍＭ酢酸ナトリウム
緩衝溶液（ｐＨ４６５）中、３７℃で１時間インキュベ
ートし活性化した。その後この活性化パパインを含む溶
液をＴＳＫ−Ｇｅ　Ｉ　　Ｇ３０ＣＩＯ５ＷＸＬ（商品
名；東ソー製）のカラム（φ７．８ｍｍＸ３０ｃｍ）に
アプライし、ゲル濾過（カラム中を流す溶媒は５ｍＭ　
　ＥＤＴＡを含む５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝溶液（
ｐＨ７，０））を行ってシスティンを含まない活性化パ
パイン溶液を得た。

（Ｃ）パパインによる精製抗体の限定分解上記実施例１
の（１）−（ａ）で得た抗体溶液および（１）−（ｂ）
で得たシスティンを含まない活性化パパイン溶液および
０．１Ｍ　　ＥＤＴＡを含む５０ｍＭリン酸ナトリウム
緩衝溶液（ｐＨ７，０）および蒸留水を、最終濃度が抗
体５ｍ　ｇ　／　ｍ　１　、パパイン０．４ｍｇ／ｍｌ
、５ｍＭＥＤＴＡ、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝溶液
（ｐＨ７，０）、最終溶液量が２ｍｌになるように混合
し、３７℃でインキュベートした。インキュベート後、
２時間４０分、３時間４５分、５時間２０分のときシス
ティンを含まない活性化パパインをそれぞれ０．２．０
．１．０．２ｍｇ追加した。インキュベート後、７時間
のとき反応溶液を凍結し反応を停止した（最終溶液量は
２６４ｍ１）。

（２）疎水クロマトグラフィーによる分離精製上記の免
疫グロブリンの酵素分解物１ｍｌに３Ｍの硫酸アンモニ
ウムを含むリン酸緩衝化生理食塩水（０，８５％ＮａＣ
１含有０．０１％リン酸緩衝液、ｐＨ７，２：以下ＰＢ
Ｓ）０．５ｍｌを加え、攪拌混合した。同試料１．５ｍ
ｌを、１Ｍの硫酸アンモニウムを含むＰＢＳで平衡化し
たＴＳＫ−Ｇｅｌ　　Ｐｈｅｎｙｌ−５ＰＷ（商品名；
東ソー製、フェニル基を導入した親水性合成高分子樹脂
）のカラム（φ７．５ｍｍＸ７．５ｃｍ）にアプライし
た。１５ｍ１の同緩衝液でカラムを洗浄後、硫酸アンモ
ニウム濃度を１ＭからＯＭまで直線的に９０分間かけて
下げタンパク質の溶出を行った。溶出パターンを図１に
示した。この時の溶出液の流速は１　ｍ　ｌ　／　ｍ　
ｉ　ｎで、検出波長は２８０ｎｍであった。この条件で
、６３．３分（図１；ピーク１）、７８．３分（図１；
ピーク２）および８６．６分（図１；ピーク３）に２８
０ｎｍの吸収のピークが現れた。これらのピークを分取
して精製免疫グロブリンフラグメント画分とした。なお
ピーク１の画分を画分Ｐ１、ピーク２の画分を画分Ｐ２
．　　ピーク３の画分を画分Ｐ３とする。分取した各両
分に対しそれぞれゲル濾過および、β−メルカプトエタ
ノール還元下および非還元下の１２％５ＤＳ−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動を行うことにより均一の免疫グ
ロブリンのフラグメントであることを確認した。ゲル濾
過は充填カラムとしてＴＳＫ−ｇｅ　１Ｇ３０００ＳＷ
ＸＬ（東ソー製）を用いた高速液体クロマトグラフィー
により行った。結果を図２ａ〜ｅに示す。図２ａ及び２
ｂはそれぞれ対象として測定した、精製ＭＢＨおよびパ
パインによる限定分解７時間後の反応液の高速液体クロ
マトグラフィーの結果である。図２　ｃ　−２ｄ　ｓ　
２　ｅはそれぞれｐｌ、ｐ２、ｐ３を測定した高速液体
クロマトグラフィーの結果を示す図である。また図３ａ
にβ−メルカプトエタノール還元下、図３ｂに非還元下
での１２％５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の
結果を示す。ここで各レーンは、以下の通りである。

レーン１；画分ｐ１２；画分ｐ２３；画分ｐ３４；ペプシンの限定分解による、Ｐ（ａｂ’）２フラグ
メントの精製物５；精製ＭＢＨ６；分子量マーカーゲル濾過および１２％５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動の結果から、実施例（２）で得た画分Ｐ１はＩ
ｇＧのＦｃフラグメント、画分Ｐ２はペプシンによるＩ
ｇＧの限定分解によって得られるＦ（ａｂ−）２フラグ
メントよりもＨ鎖が短いＦ（ａｂ−）２様フラグメント
、画分Ｐ３は未消化ＩｇＧであると考えられた。

（３）精製免疫グロブリンフラグメント画分の酵素免疫
学的測定法（Ｅｎｚｙｍｅ　Ｌｉｎｋｅｄ　Ｉｍａｕｎ
。

５ｏｒｂｅｎｔ　Ａｓ５ａｙ　；　ＥＩｊＳＡ　）によ
るフラグメント同定未処理マイクロタイタープレート（９６ウエルーヌンク
プレート、インターメッド社製）の各ウェルにＰＢＳに
溶解したＩｇＧ（モノクローナル抗体ＭＢＨ）あるいは
各両分（ＰＩ、Ｐ２またはＰ３）の希釈系列溶液（２８
０ｎｍの吸光度が０．００５になるようにＰＢＳ−Ｔで
希釈した溶液をＰＢＳ−Ｔで０．　１／２５Ｂ、　　ｌ
／１２ｇ、　　ｌ／６４゜１／３２．　１／１６．　１
／８．　１／４．　１／２倍に希釈した溶液）５０μｌ
を加えて４℃で一夜インキユベートし、ＩｇＧあるいは
各両分の希釈系列を固相に固定化したイムノプレートを
作製した。その後、各ウェルの溶液を除去し、０，０４
％ツイーン（ｔｗｅｅｎ）−２０を含むＰＢＳ　（以下
ＰＢＳ−Ｔ）で３回洗浄した後、０．５％ウシ血清アル
ブミンを溶解したＰＢＳ溶液３００μｍを各ウェルに加
えて、４℃で一夜放置してブロッキング処理しそのまま
保存した。その後、ＰＢＳ−Ｔ溶液で洗浄した後、ペル
オキシダーゼ標識ウサギ抗マウスＩｇＧ（Ｆｃフラグメ
ント特異的；ジ、ヤクソン・イムノケミカル社製）抗体
（標識抗体はＰＢＳ−Ｔで５０００倍に希釈した）を各
ウェルにそれぞれ５０μｌずつ入れ、室温で１．５時間
インキュベートした。その後、溶液を除去しＰＢＳ−Ｔ
溶液で３回洗浄した後、Ｏ，，３ｍｇ／ｍｌの２゜２−
アジノジー（３−エチルベンズチアゾリン硫酸）−ジア
ンモニウム塩（ＡＢＴＳ）及び０．０１％過酸化水素（
Ｈ２０□）を含有する０、１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４
，１）から成る基質溶液を各ウェルに５０μｍ添加し、
室温で３０分間呈色反応させた後、０．５Ｍシュウ酸溶
液を５０μｍ加えて酵素反応を停止させ、呈色したウェ
ルの４１５ｎｍにおける吸光度を自動マイクロタイター
プレートリーダー（東ソー株式会社製、ＭＰＲ−Ａ４、
商品名）で測定した。同様の操作を、ペルオキシダーゼ
標識ウサギ抗マウスＩｇＧ（Ｆｃフラグメント特異的；Ｊａｃｋｓｏｎ　　Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａ１社製
）抗体を用いる代わりにペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マ
ウスＩｇＧ　（Ｆ　（ａｂ−）２フラグメント特異的、
ＣＡＰＰＥＬ社製）抗体（標識抗体はＰＢＳ−Ｔで２０
００倍に希釈した）を用いて行った。測定結果を図４に
示した。図４ａは標識抗体としてＦｃフラグメント特異
的抗体を用いた場合、図４ｂはＦ（ａｂ−）２フラグメ
ント特異的抗体を用いた場合の図である。

この結果から、画分Ｐ１はＩｇＧのＦｃフラグ）ｌ＞ト
、画分Ｐ２はＩｇＧのＦ（ａｂ−）２様フラグメント、
画分Ｐ３は未消化ＩｇＧであると考えられた。

（４）酵素免疫学的測定法（Ｅｎｚｙｍｅ　Ｌｉｎｋｅ
ｄ　ｌｍ１ｕｎ。

５ｏｒｂｅｎｔ　Ａｓ５ａｙ　；　ＥＬＩＳＡ−）によ
るＩｇＧのＦ（ａｂ−）２精製物と未消化ＩｇＧ精製物
の抗体力価の検査ヒトミオグロビンの希釈系列（０，３，９，７，８゜１
５．６．　３１Ｊ、　　８２．５．　１２５．　２５０
．　５００．　１１０００ｎ／ｍｌ、　　Ｐ　Ｂ　Ｓ中
）を作りこれらを５０μｌずっ９６ウエルプレート（ヌ
ンク社製イムノプレート）の各ウェルに分注して４℃で
一夜インキユベートし、抗原の希釈系列を固相に固定化
したイムノプレートを作製した。その後、各ウェルの溶
液を除去し０．０５％ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ（
以下ＰＢＳ−Ｔ）で３回洗浄した後、０．５％ウシ血清
アルブミンを含むＰＢＳ溶液を３００μｍずつ各ウェル
に加えて４℃で一夜静置して各ウェルをウシ血清アルブ
ミンでブロッキングしそのまま冷蔵保存した。その後、
各ウェルの溶液を除去しＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、
抗原の希釈列を固相に固定化したウェルに、精製１ｇＧ
（モノクローナル抗体ＭＢＨ）の溶液を２８０ｎｍの吸
光度が０．００５になるようにＰＢＳ−Ｔで希釈した溶
液を５０μｍずつ入れ、室温で１，５時間インキュベー
トした。次に、各ウェルの溶液を除去しＰＢＳ−Ｔで３
回洗浄した後、ペルオキシダーゼ標識ウサギ抗マウスＩ
ｇＧ（Ｆｃフラグメント特異的：ジャクソン・イムノケ
ミカル社製）抗体（標識抗体はＰＢＳ−Ｔで５０００倍
に希釈した）を各ウェルに５０μｌずつ入れ、室温で１
．５時間インキュベートした。その後、各ウェルの溶液
を除去しＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、０．３ｍｇ／ｍ
ｌの２，２−アジノジ−（３−エチルベンズチアゾリン
硫酸）−ジアンモニウム塩（ＡＢＴＳ）及び０．０１％
過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を含有する０、１Ｍクエン酸緩
衝液（ｐ）１４）から成る基質溶液を各ウェルに５０μ
ｌ添加し、室温で３０分間呈色反応させた後、０．５Ｍ
シュウ酸溶液を５０μｍ加えて酵素反応を停止させ、呈
色したウェルの４１５ｎｍにおける吸光度を自動マイク
ロタイタープレートリーダ（東ソー株式会社製、ＭＰＲ
−Ａ４、商品名）で測定した。同様の操作を、精製１ｇ
Ｇ（七ツクローナル抗体ＭＢＩ（）を用いる代わりに実
施例（２）で得た画分Ｐ１および画分Ｐ２および画分Ｐ
３を用いて行った。さらに、ペルオキシダーゼ標識ウサ
ギ抗マウスＩｇＧ（Ｆｃフラグメント特異的；Ｊａｃｋ
ｓｏｎＩｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉ　ｃａ　１社製）抗体を用いる
代わりにペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ　Ｃ
Ｆ　（ａｂ）２フラグメント特異的：ＣＡＰＰＥＬ社製
）抗体（標識抗体はＰＢＳ−Ｔで２０００倍に希釈した
）を用いて上記と同様の操作を行った。測定結果を図５
に示した。図５ａは標識抗体としてＦｃフラグメント特
異的抗体を用いた場合、図５ｂはＦ（ａｂ−）２フラグ
メント特異的抗体を用いた場合の図である。この結果か
ら、画分Ｐ１はＩｇＧのＦｃフラグメント、画分Ｐ２は
ＩｇＧのＦ（ａｂ−）２様フラグメント、画分Ｐ３は未
消化１ｇＧであることが確認された。

【図面の簡単な説明】

図１は実施例（２）で行った疎水クロマトグラフィーに
おける溶出パターンを示した図である。図２　ａ　−ｅは実施例（２）で行ったゲル濾過のチャ
ートを示す図である。図３ａ、ｂは実施例（２）で行った１２％５ＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動の結果を示した図である。図４ａ、ｂは実施例（３）で吸光度とＩｇＧあるいは各
画分の濃度の関係を示した図である。図５ａ、ｂは実施例（４）で吸光度と抗原の濃度の関係
を示した図である。第１図ビーク２

Claims

【特許請求の範囲】

（１）免疫グロブリンを含む試料溶液にブロテアーゼを
反応させ、限定分解により免疫グロブリンのフラグメン
トを調製し、そのフラグメント溶液に塩溶液を加え、疎
水クロマトグラフィーを用いて目的とする免疫グロブリ
ンのフラグメントおよび夾雑タンパク質を塩溶液中で吸
着させ、塩濃度を下げることにより免疫グロブリンのフ
ラグメントを選択的に脱離させ分離溶出することを特徴
とする免疫グロブリンのフラグメントの精製法。
（２）疎水クロマトグラフィーの疎水性基をもつ樹脂が
、フェニル基、オリゴエチレングリコール基または、炭
素数が４ないし１８個である直鎖もしくは分枝状の炭化
水素鎖を共有結合させた親水性ポリマー系樹脂または親
水性シリカゲル樹脂である特許請求の範囲第１項記載の
方法。
（３）疎水クロマトグラフィーの疎水性基をもつ樹脂が
、スチレン系樹脂である特許請求の範囲第１項記載の方
法。
（４）疎水クロマトグラフィーの疎水性基をもつ樹脂が
、（メタ）アクリレート系コポリマー、アガロース、セ
ルロースまたはデキストランの一種である特許請求の範
囲第１項記載の方法。
（５）免疫グロブリンを含む試料溶液がハイブリドーマ
を移植した動物の腹水液、ハイブリドーマおよびリンパ
球の培養液、動物の血清、または精製された免疫グロブ
リンである特許請求の範囲第１項記載の方法。
（６）試料溶液に含まれる免疫グロブリンがポリクロー
ナル抗体、またはＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、Ｉ
ｇＭのいずれかのサブクラスに属するモノクローナル抗
体である特許請求の範囲第１項記載の方法。
（７）塩溶液が硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、リ
ン酸カリウム、またはリン酸ナトリウムのいずれかであ
る特許請求の範囲第１項記載の方法。
（８）プロテアーゼがパパイン、ペプシン、トリプシン
、キモトリプシン、カテプシンＤ、Ｅ、プラスミン、ま
たはズブチリシンのいずれかである特許請求の範囲第１
項記載の方法。