JPH06100603B2 - 特定の細菌ポリペプチド及びそれに対する抗体の定量法 - Google Patents
特定の細菌ポリペプチド及びそれに対する抗体の定量法Info
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- JPH06100603B2 JPH06100603B2 JP61127857A JP12785786A JPH06100603B2 JP H06100603 B2 JPH06100603 B2 JP H06100603B2 JP 61127857 A JP61127857 A JP 61127857A JP 12785786 A JP12785786 A JP 12785786A JP H06100603 B2 JPH06100603 B2 JP H06100603B2
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、（ｉ）哺乳動物Ig（即ち哺乳動物からの免疫
グロブリン）のFc部分に対して親和性を有する細菌ポリ
ペプチド、又は（ii）該ポリペプチドに対する抗体を免
疫学的に定量するための方法及び手段に係る。
グロブリン）のFc部分に対して親和性を有する細菌ポリ
ペプチド、又は（ii）該ポリペプチドに対する抗体を免
疫学的に定量するための方法及び手段に係る。
該ポリペプチドは哺乳動物Igにより沈降可能であること
が知られており、これは、該ポリペプチドがFc結合性に
加えてFab結合性を有するためであると考えられてい
る。
が知られており、これは、該ポリペプチドがFc結合性に
加えてFab結合性を有するためであると考えられてい
る。
ここで「細菌ポリペプチド」とは、細菌又は他の微生物
により天然に産生されるポリペプチド又は蛋白質の意で
ある。同語は更に、所謂組換えDNA技術を適用した場合
に非細菌細胞により発現される細菌ポリペプチドも包含
する。
により天然に産生されるポリペプチド又は蛋白質の意で
ある。同語は更に、所謂組換えDNA技術を適用した場合
に非細菌細胞により発現される細菌ポリペプチドも包含
する。
「Fc結合性（即ち哺乳動物IgのFc部分に対する親和性）
を有するポリペプチド」の概念は、Fc結合性を有し、場
合によりFab結合性を有するポリペプチドとそのフラグ
メント及びその誘導体を包含する。
を有するポリペプチド」の概念は、Fc結合性を有し、場
合によりFab結合性を有するポリペプチドとそのフラグ
メント及びその誘導体を包含する。
この種のポリペプチド及びその使用については多数の研
究論文が発表されており、例えばLangoneJ J:Abv Immun
ol 32/1982/p.157−252を参照されたい。
究論文が発表されており、例えばLangoneJ J:Abv Immun
ol 32/1982/p.157−252を参照されたい。
1966年、黄色ブドウ球菌（S.aureus）からのプロテイン
ＡはFc結合性を示すことが発見された（Fors−gren A
＆ Sjquist J: J Immunol 17/1966/p822−27）。数年
後、同様の蛋白質（即ちプロテインＧ）が肺炎双球菌
（Streptococcus pneumoniae）中に発見された（Kronva
ll G: J Immunol 111/1973/p 1401−06,and Myhre E B
＆ Dronvall G: Infect ＆ Immunity 17/1977/p 475−8
2）。
ＡはFc結合性を示すことが発見された（Fors−gren A
＆ Sjquist J: J Immunol 17/1966/p822−27）。数年
後、同様の蛋白質（即ちプロテインＧ）が肺炎双球菌
（Streptococcus pneumoniae）中に発見された（Kronva
ll G: J Immunol 111/1973/p 1401−06,and Myhre E B
＆ Dronvall G: Infect ＆ Immunity 17/1977/p 475−8
2）。
その後、Fc結合性ポリペプチドは他の細菌種にも検出さ
れた。プロテインＡ及びＧは各細菌属内の種に従って構
造変化を示すという結果も報告されている。近年では、
これらの蛋白質がFc結合性に加えて第二（alternativ
e）の弱いFab結合性を有し得ることが発表されている
（Ingns M et al:Scand J Immunol 14/1981/p 379−8
8,and Erntell M et al: Scand J Immunol 17/1983/p 2
01−９）。「第二反応性」と称されるこの特性は、免疫
グロブリンの個々のクラスに無関係であると考えられて
いる。これらの２種の結合性はIg間即ち異種間及び異な
る細胞クローンに由来するIg間で変化を生じ、Fab結合
性については最大の変化が認められている。これらの反
応性の正確な生物学的意義はまだ解明されていないが、
病原性に関係があると予想されている（Forsgren A: In
fect ＆ Immunity 2/1979/p 672−3,and Forsgren A: A
cta Path Microbiol Scand Sect B 80 /1972/p 564−7
0）。
れた。プロテインＡ及びＧは各細菌属内の種に従って構
造変化を示すという結果も報告されている。近年では、
これらの蛋白質がFc結合性に加えて第二（alternativ
e）の弱いFab結合性を有し得ることが発表されている
（Ingns M et al:Scand J Immunol 14/1981/p 379−8
8,and Erntell M et al: Scand J Immunol 17/1983/p 2
01−９）。「第二反応性」と称されるこの特性は、免疫
グロブリンの個々のクラスに無関係であると考えられて
いる。これらの２種の結合性はIg間即ち異種間及び異な
る細胞クローンに由来するIg間で変化を生じ、Fab結合
性については最大の変化が認められている。これらの反
応性の正確な生物学的意義はまだ解明されていないが、
病原性に関係があると予想されている（Forsgren A: In
fect ＆ Immunity 2/1979/p 672−3,and Forsgren A: A
cta Path Microbiol Scand Sect B 80 /1972/p 564−7
0）。
実際にプロテインＡは種々の方法で利用されており、Fc
結合性を有する他の細菌ポリペプチドも同様に利用でき
る可能性があると考えられている。プロテインＡについ
ては多くの研究が為されており、固相と結合したプロテ
インＡ上で腫瘍患者（Terman D S et al: N Eng J Med
305 /1981/p 1195−）又は実験動物（Terman D S et a
l: J Immunol 124/1980/p 794−,and Science 209 /198
0/ p 1257−）からの血漿を潅流及び循環処理すること
により、腫瘍を著しく退行させ得ることが示されてい
る。プロテインＡ自体が強い生物学的反応を生じ得るの
で、潅流中に生じ得るプロテインＡの漏れを完全に制御
することが肝要である。従って、免疫グロブリンを含有
する製剤中におけるプロテインＡの汚染を高感度で特異
的に検定できることが特に重要である。
結合性を有する他の細菌ポリペプチドも同様に利用でき
る可能性があると考えられている。プロテインＡについ
ては多くの研究が為されており、固相と結合したプロテ
インＡ上で腫瘍患者（Terman D S et al: N Eng J Med
305 /1981/p 1195−）又は実験動物（Terman D S et a
l: J Immunol 124/1980/p 794−,and Science 209 /198
0/ p 1257−）からの血漿を潅流及び循環処理すること
により、腫瘍を著しく退行させ得ることが示されてい
る。プロテインＡ自体が強い生物学的反応を生じ得るの
で、潅流中に生じ得るプロテインＡの漏れを完全に制御
することが肝要である。従って、免疫グロブリンを含有
する製剤中におけるプロテインＡの汚染を高感度で特異
的に検定できることが特に重要である。
この目的にかなう一検定法が既に知られている（Langon
e J J et al: J Immunol Meth 63 /1983/p 145−57）。
この方法は標識したプロテインＡと標識しないプロテイ
ンＡとをニワトリ抗プロテインＡ抗体に対して競合させ
るコンペティティブ方式を使用するものであり、得られ
た免疫複合体を硫酸アンモニウムＦ（ab′）２ウサギIg
G抗ニワトリIgGで沈降させる。しかしながらこの方法の
使用は、プロテインＡと強く結合するIgG（例えばヒトI
gG及びイヌIgG）を有する動物からの血清との干渉現象
により制限される。従って、該方法はこれらの動物の免
疫グロブリンを含む製剤の特性付けのためには不適当で
ある。製剤を非経口で使用しようとする場合、該方法は
特に高い品質を要求される。
e J J et al: J Immunol Meth 63 /1983/p 145−57）。
この方法は標識したプロテインＡと標識しないプロテイ
ンＡとをニワトリ抗プロテインＡ抗体に対して競合させ
るコンペティティブ方式を使用するものであり、得られ
た免疫複合体を硫酸アンモニウムＦ（ab′）２ウサギIg
G抗ニワトリIgGで沈降させる。しかしながらこの方法の
使用は、プロテインＡと強く結合するIgG（例えばヒトI
gG及びイヌIgG）を有する動物からの血清との干渉現象
により制限される。従って、該方法はこれらの動物の免
疫グロブリンを含む製剤の特性付けのためには不適当で
ある。製剤を非経口で使用しようとする場合、該方法は
特に高い品質を要求される。
前記干渉は、試料のIgGが標識されたプロテインＡと結
合するためである。この結合性は、試料が希釈されるか
否かに関係なく生じる現象である。
合するためである。この結合性は、試料が希釈されるか
否かに関係なく生じる現象である。
優先期間中に、プロテインＡを定量するための別の方法
について記載した２件の論文が発表された（Dertzbaugh
M T et al; J Immunol Meth 83 /1985/ p 169−78 and
kinet J P et al; Eur J Clin Invest 16 /1986/ p 43
−49）。
について記載した２件の論文が発表された（Dertzbaugh
M T et al; J Immunol Meth 83 /1985/ p 169−78 and
kinet J P et al; Eur J Clin Invest 16 /1986/ p 43
−49）。
本発明の目的のひとつは、前記ポリペプチドに対する試
料血清IgGの前記干渉を単純且つ実用的に最小化する検
定法を提供することにある。第二の目的は、改良された
精度、感度及び選択性を有する検定法を提供することに
ある。第三の目的は、活性物質として前記ポリペプチド
を含む親和性吸着体中の漏れを分析する方法を提供する
ことにある。第四の目的は、血清免疫グロブリン（特に
ヒトIgG）が前記ポリペプチドと結合しないような条件
下で当該型のポリペプチドに対して特異的な抗体製剤を
提供することにある。第五の目的は、Fab部分を介して
当該型のポリペプチド、好ましくは第二反応性に対応す
るエピトープと強い結合性を示すような免疫グロブリン
を検定する方法を提供することにある。ここで「強い」
結合性とは、3.5未満のpHで結合が生じることを意味
し、従ってこれらの免疫グロブリンは所謂親和性の高い
抗体である。
料血清IgGの前記干渉を単純且つ実用的に最小化する検
定法を提供することにある。第二の目的は、改良された
精度、感度及び選択性を有する検定法を提供することに
ある。第三の目的は、活性物質として前記ポリペプチド
を含む親和性吸着体中の漏れを分析する方法を提供する
ことにある。第四の目的は、血清免疫グロブリン（特に
ヒトIgG）が前記ポリペプチドと結合しないような条件
下で当該型のポリペプチドに対して特異的な抗体製剤を
提供することにある。第五の目的は、Fab部分を介して
当該型のポリペプチド、好ましくは第二反応性に対応す
るエピトープと強い結合性を示すような免疫グロブリン
を検定する方法を提供することにある。ここで「強い」
結合性とは、3.5未満のpHで結合が生じることを意味
し、従ってこれらの免疫グロブリンは所謂親和性の高い
抗体である。
本発明は既知のプロテインＡ定量法の改良である。
第二反応性に対する抗プロテインＡ抗体については既に
研究されている（Ingans M et al; Scand J Immunol
14 /1981/ p 379−88）。しかしながら、ここで使用さ
れた製剤は４未満のpHで特に高い抗体活性を示していな
い。
研究されている（Ingans M et al; Scand J Immunol
14 /1981/ p 379−88）。しかしながら、ここで使用さ
れた製剤は４未満のpHで特に高い抗体活性を示していな
い。
本発明の免疫検定の新規特徴は、試料中の他の免疫グロ
ブリンに対するポリペプチドの反応性が抑制されるよう
な条件下でポリペプチドのエピトープとこれに対する抗
体との免疫反応を生じさせることにある。反応で使用さ
れる抗体は、該抗体が反応混合物中で主にそのFab部分
を介してポリペプチドと反応するように選択された。
ブリンに対するポリペプチドの反応性が抑制されるよう
な条件下でポリペプチドのエピトープとこれに対する抗
体との免疫反応を生じさせることにある。反応で使用さ
れる抗体は、該抗体が反応混合物中で主にそのFab部分
を介してポリペプチドと反応するように選択された。
一般的な型の免疫検定法として多くの方法が公知であ
り、本発明中で潜在的に有用である。
り、本発明中で潜在的に有用である。
免疫学的検定法（イムノアッセイ法）は免疫複合体を形
成するために免疫反応体を使用するものであり、この形
成により、添加された反応体の免疫学的対応部分が試料
中に存在していたことがわかる。定量及び検出を容易に
するために、反応体の１種はしばしば標識された形態で
添加され、即ち反応体は分析的に検出可能な基を備えて
いる。反応体の添加量は、複合体中に導入されるか又は
非複合状態で遊離している標識反応体の量が検定すべき
種の尺度となるように注意深く選択される。
成するために免疫反応体を使用するものであり、この形
成により、添加された反応体の免疫学的対応部分が試料
中に存在していたことがわかる。定量及び検出を容易に
するために、反応体の１種はしばしば標識された形態で
添加され、即ち反応体は分析的に検出可能な基を備えて
いる。反応体の添加量は、複合体中に導入されるか又は
非複合状態で遊離している標識反応体の量が検定すべき
種の尺度となるように注意深く選択される。
一分類方式によると、検定法はホモジニアス又はヘテロ
ジニアス法のいずれかに分類され得る。ホモジニアス法
は、複合化された（複合物と結合された）標識反応体を
非複合反応体から物理的に分離することなしに標識反応
体を検定する方法である。ホモジニアス法は、複合化さ
れるか否かに従って活性が変化するマーカーを使用し、
従って、複合化及び非複合化形態のマーカーを含む反応
混合物から信号を測定することが可能であり、分析すべ
き種の量に関して得られる値から結論を導くことが可能
である。ヘテロジニアス法は、複合化された標識反応体
を非複合化反応体から物理的に分離する工程を含むもの
である。ヘテロジニアス法の場合、マーカーの活性を変
化させる必要はない。標識反応体の２形態の一方が反応
混合物に不溶性であり且つ液相から容易に分離可能な固
相又は他の相と既に結合しているか又は結合中であると
いう場合に分離可能になる。こうして、分析的に検出可
能な基は２相のいずれか一方又は両方で定量される。
ジニアス法のいずれかに分類され得る。ホモジニアス法
は、複合化された（複合物と結合された）標識反応体を
非複合反応体から物理的に分離することなしに標識反応
体を検定する方法である。ホモジニアス法は、複合化さ
れるか否かに従って活性が変化するマーカーを使用し、
従って、複合化及び非複合化形態のマーカーを含む反応
混合物から信号を測定することが可能であり、分析すべ
き種の量に関して得られる値から結論を導くことが可能
である。ヘテロジニアス法は、複合化された標識反応体
を非複合化反応体から物理的に分離する工程を含むもの
である。ヘテロジニアス法の場合、マーカーの活性を変
化させる必要はない。標識反応体の２形態の一方が反応
混合物に不溶性であり且つ液相から容易に分離可能な固
相又は他の相と既に結合しているか又は結合中であると
いう場合に分離可能になる。こうして、分析的に検出可
能な基は２相のいずれか一方又は両方で定量される。
第二の分類方式によると、検定法はコンペティティブ
（競合的）又は非コンペティティブ法のいずれかに分類
され得る。コンペティティブ法では、免疫学的対応部分
上の不十分な数の対応結合部位に対して共通のエピトー
プを有する２種の反応体を競合させる。一般に該方式
は、分析すべき種と標識又は固相と結合された該種の変
異体との間に競合が生じるように選択される。免疫学的
対応部分と結合する量が、分析される種の尺度となる。
非コンペティティブ法では、競合が生じないように反応
体を選択する。非コンペティティブ法として特に所謂
「サンドイッチ」方式が注目できる。
（競合的）又は非コンペティティブ法のいずれかに分類
され得る。コンペティティブ法では、免疫学的対応部分
上の不十分な数の対応結合部位に対して共通のエピトー
プを有する２種の反応体を競合させる。一般に該方式
は、分析すべき種と標識又は固相と結合された該種の変
異体との間に競合が生じるように選択される。免疫学的
対応部分と結合する量が、分析される種の尺度となる。
非コンペティティブ法では、競合が生じないように反応
体を選択する。非コンペティティブ法として特に所謂
「サンドイッチ」方式が注目できる。
第三の分類方式によると、検定法は沈降法又は非沈降法
のいずれかに分類され得る。沈降法の場合、まず均一液
相中で免疫反応を行い、その後、ポリエチレングリコー
ル、抗血清又は固相と結合された抗体のような沈降剤
（但し抗血清又は固相と結合した抗体は標識反応体と反
応しないように選択される）により、得られた免疫複合
体を沈降させる。
のいずれかに分類され得る。沈降法の場合、まず均一液
相中で免疫反応を行い、その後、ポリエチレングリコー
ル、抗血清又は固相と結合された抗体のような沈降剤
（但し抗血清又は固相と結合した抗体は標識反応体と反
応しないように選択される）により、得られた免疫複合
体を沈降させる。
第四の分類方式によると、検定法は使用されるマーカー
によって分類され得、従って放射線、酵素、蛍光、化学
ルミネセンス、酵素−基質等の免疫法が挙げられる。
によって分類され得、従って放射線、酵素、蛍光、化学
ルミネセンス、酵素−基質等の免疫法が挙げられる。
免疫検定法において、抗体及び抗原は場合によっては相
互に生物学的に特異的な親和性を有する他の反応体に置
換えられ得る。
互に生物学的に特異的な親和性を有する他の反応体に置
換えられ得る。
現在知見されている限りでは、本発明は好ましくはヘテ
ロジニアス型のコンペティティブ方式で実施される。
ロジニアス型のコンペティティブ方式で実施される。
本発明に関連して、好適なコンペティティブ法は、場合
によっては固相と結合された、分析物（analyte）の免
疫学的対応部分の結合部位に対して標識及び非標識分析
物間の競合を使用すべきであることが特に注目できる。
によっては固相と結合された、分析物（analyte）の免
疫学的対応部分の結合部位に対して標識及び非標識分析
物間の競合を使用すべきであることが特に注目できる。
本発明が適用可能な試料は血清試料又は血漿試料から構
成され得る。必要に応じて、例えば体外シャントのよう
な固相と結合した形態のプロテインＡ又はプロテインＧ
等の被分析種をこの試料に予め吸着させておいてもよ
い。更に試料は、免疫グロブリン製剤又は例えばポリペ
プチドもしくは親和性の高いそれに対する抗体のような
被検出種を含有していると予想される他の製剤でもよ
い。
成され得る。必要に応じて、例えば体外シャントのよう
な固相と結合した形態のプロテインＡ又はプロテインＧ
等の被分析種をこの試料に予め吸着させておいてもよ
い。更に試料は、免疫グロブリン製剤又は例えばポリペ
プチドもしくは親和性の高いそれに対する抗体のような
被検出種を含有していると予想される他の製剤でもよ
い。
本発明によると、場合によっては好適な緩衝液で希釈さ
れた試料に、標識分析物及び／又はポリペプチドの対応
（homologous）抗体を添加する。次の段階で、例えば既
に添加された反応体に対する１種の抗体等、更に別の免
疫反応体を添加してもよい。本発明に関連して使用され
る抗体については、（ｉ）試験に干渉するように（標識
されるか又はされていない）ポリペプチドと反応するこ
とはないFc部分を有するか又は（ii）Fc部分が除去又は
不活性化されていることが好ましい。使用される抗体
は、例えば周知の免疫グロブリンフラグメントFab、Fa
b′又はＦ（ab′）２であり得る。ポリペプチド−Ig干
渉は、特定のクラスの免疫グロブリン、細胞クローン及
び動物種から抗体を選択することにより回避することも
できる。使用される抗体製剤は、本発明による使用に必
要な特異性、親和性、結合活性及び力値を有している。
該製剤は、所望の特異性が得られるように吸着剤の形態
であり得る。該製剤は例えば抗体のIgG製剤であり得
る。該製剤は、例えば凍結乾燥又は噴霧乾燥による乾燥
製剤の形態であり得る。該製剤は、好適な緩衝液中で復
元され、テストキットの一部を構成し得る密閉パッキン
内に収容された製剤であり得る。
れた試料に、標識分析物及び／又はポリペプチドの対応
（homologous）抗体を添加する。次の段階で、例えば既
に添加された反応体に対する１種の抗体等、更に別の免
疫反応体を添加してもよい。本発明に関連して使用され
る抗体については、（ｉ）試験に干渉するように（標識
されるか又はされていない）ポリペプチドと反応するこ
とはないFc部分を有するか又は（ii）Fc部分が除去又は
不活性化されていることが好ましい。使用される抗体
は、例えば周知の免疫グロブリンフラグメントFab、Fa
b′又はＦ（ab′）２であり得る。ポリペプチド−Ig干
渉は、特定のクラスの免疫グロブリン、細胞クローン及
び動物種から抗体を選択することにより回避することも
できる。使用される抗体製剤は、本発明による使用に必
要な特異性、親和性、結合活性及び力値を有している。
該製剤は、所望の特異性が得られるように吸着剤の形態
であり得る。該製剤は例えば抗体のIgG製剤であり得
る。該製剤は、例えば凍結乾燥又は噴霧乾燥による乾燥
製剤の形態であり得る。該製剤は、好適な緩衝液中で復
元され、テストキットの一部を構成し得る密閉パッキン
内に収容された製剤であり得る。
使用される抗プロテインＡ抗体製剤は、当該ポリペプチ
ド好ましくは第二反応性に対応するエピトープに対して
特異性を有している。該製剤の抗体はそれ自体既知の方
法で免疫感作及び精製により産生され得、免疫感作は混
血脊椎動物にアジュバントと共にポリペプチドを注射す
ることにより実施される。一般に使用される動物は、例
えばニワトリのようなキジ目鳥類、及びラット、ウサ
ギ、ヒツジ、イヌ、ウマ等の哺乳動物である。免疫感作
を実施すると、動物の血液及び鳥類の場合には卵から抗
体が回収され得る。意図する特定の検定法で必要な純度
を生じるように、それ自体既知の方法で抗体をIS精製
（免疫吸着精製）することもできる。本発明に関連し
て、一般に当該細菌ポリペプチドに対して比較的低反応
性（Fab反応性）の免疫グロブリンを有する動物の場
合、非常に良好な免疫応答が得られた。従って、ウサギ
又はニワトリの免疫感作が有利であり、ヤギのような他
の動物も使用できる。発明者らは、ポリペプチドと強く
結合するFc部分を有する非対応（heterologous）Igと複
合したポリペプチド（例えばプロテインＡ−イヌIgG複
合体）を用いて免疫感作を実施した場合に特に良好な結
果を得た。
ド好ましくは第二反応性に対応するエピトープに対して
特異性を有している。該製剤の抗体はそれ自体既知の方
法で免疫感作及び精製により産生され得、免疫感作は混
血脊椎動物にアジュバントと共にポリペプチドを注射す
ることにより実施される。一般に使用される動物は、例
えばニワトリのようなキジ目鳥類、及びラット、ウサ
ギ、ヒツジ、イヌ、ウマ等の哺乳動物である。免疫感作
を実施すると、動物の血液及び鳥類の場合には卵から抗
体が回収され得る。意図する特定の検定法で必要な純度
を生じるように、それ自体既知の方法で抗体をIS精製
（免疫吸着精製）することもできる。本発明に関連し
て、一般に当該細菌ポリペプチドに対して比較的低反応
性（Fab反応性）の免疫グロブリンを有する動物の場
合、非常に良好な免疫応答が得られた。従って、ウサギ
又はニワトリの免疫感作が有利であり、ヤギのような他
の動物も使用できる。発明者らは、ポリペプチドと強く
結合するFc部分を有する非対応（heterologous）Igと複
合したポリペプチド（例えばプロテインＡ−イヌIgG複
合体）を用いて免疫感作を実施した場合に特に良好な結
果を得た。
別の方法としては、（例えば上述のように）免疫感作さ
れた動物のリンパ球を所謂モノクローナル技術（Ｋhl
er ＆ Milstein C; Nature 256 /1975/ p 495−７）に
適用する。こうして好適な特異性及び親和性を有するモ
ノクローナル抗体が得られる。該抗体は次に所謂単純な
モノクローナル又は複合モノクローナルのいずれかとし
て使用され得る。尚、該複合モノクローナルとは異なる
決定基に対する特異性を有するか及び／又は異なる親和
性を有する２種以上のモノクローナル製剤の混合物であ
る。
れた動物のリンパ球を所謂モノクローナル技術（Ｋhl
er ＆ Milstein C; Nature 256 /1975/ p 495−７）に
適用する。こうして好適な特異性及び親和性を有するモ
ノクローナル抗体が得られる。該抗体は次に所謂単純な
モノクローナル又は複合モノクローナルのいずれかとし
て使用され得る。尚、該複合モノクローナルとは異なる
決定基に対する特異性を有するか及び／又は異なる親和
性を有する２種以上のモノクローナル製剤の混合物であ
る。
本発明の「抗体製剤」は、当然のことながら抗体活性フ
ラグメント（例えばFab、Ｆ（ab′）２等）及び誘導体
（固相と結合され且つ標識された抗体）を含む製剤を包
含する。
ラグメント（例えばFab、Ｆ（ab′）２等）及び誘導体
（固相と結合され且つ標識された抗体）を含む製剤を包
含する。
使用すべき抗体製剤は、少なくともポリペプチドと試料
中の対応するFc結合性免疫グロブリンとの関係の特徴を
表す親和定数よりも小さい親和定数（モル／で表す）
を有する。親和定数を／モルで表す場合にはこの逆で
ある。定数は当然該当条件、即ち本発明の各具体例に属
する条件下で比較すべきである。
中の対応するFc結合性免疫グロブリンとの関係の特徴を
表す親和定数よりも小さい親和定数（モル／で表す）
を有する。親和定数を／モルで表す場合にはこの逆で
ある。定数は当然該当条件、即ち本発明の各具体例に属
する条件下で比較すべきである。
本発明の抗体製剤は、pHにほとんど依存しない抗体活性
を有している。因みにpH3.2〜3.5の活性はpH7.4の活性
の30％、例えば50％よりも高い。特に実施例１で使用さ
れているような抗プロテインＡ抗体製剤の場合、即ち抗
体活性成分がセファデックス（登録商標Sephadex、スウ
ェーデン国ファルマシア社）と結合されている場合、pH
7.4及びpH3.2で一定量の抗プロテインＡセファデックス
を一定量のプロテインＡと混合し、pH3.2の結合活性はp
H7.4の結合活性の50％であった。
を有している。因みにpH3.2〜3.5の活性はpH7.4の活性
の30％、例えば50％よりも高い。特に実施例１で使用さ
れているような抗プロテインＡ抗体製剤の場合、即ち抗
体活性成分がセファデックス（登録商標Sephadex、スウ
ェーデン国ファルマシア社）と結合されている場合、pH
7.4及びpH3.2で一定量の抗プロテインＡセファデックス
を一定量のプロテインＡと混合し、pH3.2の結合活性はp
H7.4の結合活性の50％であった。
本発明のある種の具体例又は変形例では所謂固相結合抗
体が使用され得る。抗体と固相との結合は従来技術の方
法に従って実施される（例えばWideL: Radioimmunoassa
y and Related Procedures in Medicine, Vol. I/1978/
IAEA p 143−154）。固相の例としては、ゲルを形成す
るように膨張可能であり且つ非水溶性であり、OH又はNH
2基（例えばポリアミド、ポリサッカライド、ポリヒド
ロキシアクリルアクリレート及び対応するメタクリル酸
等）を含む粒子状親水性基質が挙げられる。不溶形態で
は、使用される抗体は共有結合又は吸着により非水溶性
基質と結合される。
体が使用され得る。抗体と固相との結合は従来技術の方
法に従って実施される（例えばWideL: Radioimmunoassa
y and Related Procedures in Medicine, Vol. I/1978/
IAEA p 143−154）。固相の例としては、ゲルを形成す
るように膨張可能であり且つ非水溶性であり、OH又はNH
2基（例えばポリアミド、ポリサッカライド、ポリヒド
ロキシアクリルアクリレート及び対応するメタクリル酸
等）を含む粒子状親水性基質が挙げられる。不溶形態で
は、使用される抗体は共有結合又は吸着により非水溶性
基質と結合される。
上述のように、免疫反応は試料中に存在している免疫グ
ロブリンがポリペプチド又はその標識化された類似本
（analog）と好ましくない方法で結合しないような条件
下で実施される。即ち原則としてpHを４未満とすべきで
あり、例えばプロテインＡ及びプロテインＧの場合、pH
は3.5未満とすべきである。pHは抗原−抗体結合を解離
するほど低過ぎてはならない。従って、pHは約2.7より
高く、好ましくは約3.0より高くなるように選択すべき
である。pH2.7〜4.0に好適な緩衝液系が、この範囲内で
高い緩衝性を有しており且つ免疫反応に干渉しない系で
ある。例としてクエン酸塩、グリシン−HC1及びクエン
酸塩−リン酸塩緩衝液が挙げられる。一方、試料のIgと
ポリペプチドとの間の結合反応を阻害する他の剤を使用
することは除外するものではない。選択される温度は原
則として10〜40℃の範囲とすべきである。
ロブリンがポリペプチド又はその標識化された類似本
（analog）と好ましくない方法で結合しないような条件
下で実施される。即ち原則としてpHを４未満とすべきで
あり、例えばプロテインＡ及びプロテインＧの場合、pH
は3.5未満とすべきである。pHは抗原−抗体結合を解離
するほど低過ぎてはならない。従って、pHは約2.7より
高く、好ましくは約3.0より高くなるように選択すべき
である。pH2.7〜4.0に好適な緩衝液系が、この範囲内で
高い緩衝性を有しており且つ免疫反応に干渉しない系で
ある。例としてクエン酸塩、グリシン−HC1及びクエン
酸塩−リン酸塩緩衝液が挙げられる。一方、試料のIgと
ポリペプチドとの間の結合反応を阻害する他の剤を使用
することは除外するものではない。選択される温度は原
則として10〜40℃の範囲とすべきである。
免疫学的試験法に干渉し得る物質としては種々の物質が
ある。これは、しばしばこれらの物質が分析物のエピト
ープと直接に反応するか又はこれと等しいエピトープを
有するためである。例えばポリペプチド、親和性の高い
対応抗体及び対応する抗イディオタイプ抗体は、相互間
の定量に干渉し得る。当業者であればこのような干渉の
危険を経験的に予想し、この干渉が特定の測定の結果に
どのように影響するか認識できよう。
ある。これは、しばしばこれらの物質が分析物のエピト
ープと直接に反応するか又はこれと等しいエピトープを
有するためである。例えばポリペプチド、親和性の高い
対応抗体及び対応する抗イディオタイプ抗体は、相互間
の定量に干渉し得る。当業者であればこのような干渉の
危険を経験的に予想し、この干渉が特定の測定の結果に
どのように影響するか認識できよう。
ポリペプチドとその抗体との免疫反応は、６〜９の正常
pHよりも実質的に低いpHで実施される。免疫吸着精製法
の場合、脱着は約３以下のpHで実施され、即ちpHが約３
より低いと抗原−抗体結合は破壊される。プロテインＡ
−IgG複合体は約pH3〜４で解離する。本発明は、ポリペ
プチドに対して特異的であり且つポリペプチドの一般Ig
結合性が実質的に低下するような条件下で抗体活性を有
する抗体製剤を製造することができるという事実の発見
に基づいている。
pHよりも実質的に低いpHで実施される。免疫吸着精製法
の場合、脱着は約３以下のpHで実施され、即ちpHが約３
より低いと抗原−抗体結合は破壊される。プロテインＡ
−IgG複合体は約pH3〜４で解離する。本発明は、ポリペ
プチドに対して特異的であり且つポリペプチドの一般Ig
結合性が実質的に低下するような条件下で抗体活性を有
する抗体製剤を製造することができるという事実の発見
に基づいている。
以下、単に本発明を説明する目的であってこれを限定す
るものではない実施例により本発明を説明する。
るものではない実施例により本発明を説明する。
実施例１ 標識プロテインＡと固相結合抗体とを使用する競合法。
ウサギ抗プロテインＡの調製。
ウサギ抗プロテインＡの調製。
プロテインＡ（スウェーデン国ウプサラ市ファルマシア
社）とイヌIgG（プロテインＡセファロース（登録商標S
epharose、スウェーデン国ファルマシア社）上でアフィ
ニティクロマトグラフィによりイヌ血清から分離）との
混合物を筋内注射により３匹のウサギに感作した。等量
の50％CFA/50％IFA（CFA＝完全フロイントアジュバン
ト、IFA＝不完全フロイントアジュバント）中に乳化さ
れた250μｇのプロテインA/IgG混合物を、７週間にわた
って各動物に３回注射した。18週間後にブースター注射
を実施した。20週目からウサギの放血を開始した（血液
40mlが血清20mlに対応）。次の８週間の間に各ウサギに
対して５回の放血を実施した。収集した材料をプール
し、これは290mlの抗プロテインＡ抗血清に対応した。
社）とイヌIgG（プロテインＡセファロース（登録商標S
epharose、スウェーデン国ファルマシア社）上でアフィ
ニティクロマトグラフィによりイヌ血清から分離）との
混合物を筋内注射により３匹のウサギに感作した。等量
の50％CFA/50％IFA（CFA＝完全フロイントアジュバン
ト、IFA＝不完全フロイントアジュバント）中に乳化さ
れた250μｇのプロテインA/IgG混合物を、７週間にわた
って各動物に３回注射した。18週間後にブースター注射
を実施した。20週目からウサギの放血を開始した（血液
40mlが血清20mlに対応）。次の８週間の間に各ウサギに
対して５回の放血を実施した。収集した材料をプール
し、これは290mlの抗プロテインＡ抗血清に対応した。
抗プロテインＡの精製 固相と結合されたヒトIgG及びウサギIgG（それぞれカラ
ム容量が51ml及び30ml）に、290mlの抗プロテインＡ抗
血清を吸着させた。吸着させた抗血清をセファデックス
Ｇ−25（スウェーデン国ファルマシア社）上で脱塩し、
0.075Mトリス−HCl（pH8.0）で平衡化されたDEAE−セフ
ァロースCL 6B（スウェーデン国ファルマシア社）上で
イオン交換クロマトグラフィによりIgフラクションを精
製した。遅延していないフラクションを収集し、限外
過により116ml×11.9mg＝1380mgのIgに凝縮した。次に
材料を0.1M酢酸塩緩衝液（pH4.5）に透析し、ペプシン
（50:1 w/w）を用いて16時間消化させた。セファデック
スＧ−100（スウェーデン国ファルマシア社）上でゲル
過によりＦ（ab′）２フラグメントを単離させ、合計
757mgのＦ（ab′）２抗プロテインＡを得た。プロテイ
ンＡ反応性Ｆ（ab′）２フラグメントのフラクションを
プロテインＡセファロース（スウェーデン国ファルマシ
ア社）上でアフィニティクロマトグラフィにより精製し
た。セファデックスＧ−25（スウェーデン国ファルマシ
ア社）上で脱塩後、最終材料は25.4mgのＦ（ab′）２抗
プロテインＡから構成されていた。免疫電気泳動で抗体
製剤は市販のプロテインＡ（スウェーデン国ファルマシ
ア社）を沈降させた。正常なヒト及びイヌ血清に対する
反応性は何ら観察されなかった。
ム容量が51ml及び30ml）に、290mlの抗プロテインＡ抗
血清を吸着させた。吸着させた抗血清をセファデックス
Ｇ−25（スウェーデン国ファルマシア社）上で脱塩し、
0.075Mトリス−HCl（pH8.0）で平衡化されたDEAE−セフ
ァロースCL 6B（スウェーデン国ファルマシア社）上で
イオン交換クロマトグラフィによりIgフラクションを精
製した。遅延していないフラクションを収集し、限外
過により116ml×11.9mg＝1380mgのIgに凝縮した。次に
材料を0.1M酢酸塩緩衝液（pH4.5）に透析し、ペプシン
（50:1 w/w）を用いて16時間消化させた。セファデック
スＧ−100（スウェーデン国ファルマシア社）上でゲル
過によりＦ（ab′）２フラグメントを単離させ、合計
757mgのＦ（ab′）２抗プロテインＡを得た。プロテイ
ンＡ反応性Ｆ（ab′）２フラグメントのフラクションを
プロテインＡセファロース（スウェーデン国ファルマシ
ア社）上でアフィニティクロマトグラフィにより精製し
た。セファデックスＧ−25（スウェーデン国ファルマシ
ア社）上で脱塩後、最終材料は25.4mgのＦ（ab′）２抗
プロテインＡから構成されていた。免疫電気泳動で抗体
製剤は市販のプロテインＡ（スウェーデン国ファルマシ
ア社）を沈降させた。正常なヒト及びイヌ血清に対する
反応性は何ら観察されなかった。
緩衝液１ 標準希釈剤として、0.05Mリン酸塩緩衝液（pH7.4）、0.
5MのNaCl、0.05％トウィーン（登録商標Tween）20、0.0
5％アジ化ナトリウム。
5MのNaCl、0.05％トウィーン（登録商標Tween）20、0.0
5％アジ化ナトリウム。
緩衝液２ インキュベーション用として、0.3Mクエン酸塩衝液（pH
3.2）、0.05％トウィーン20。
3.2）、0.05％トウィーン20。
標準 1mlの蒸溜水中でプロテインＡ（スウェーデン国ファル
マシア社）を再調製した。得られた水溶液を、１当た
りのプロテインＡ濃度が500、100、50、10、５及び１μ
ｇになるまで標準緩衝液で希釈した。
マシア社）を再調製した。得られた水溶液を、１当た
りのプロテインＡ濃度が500、100、50、10、５及び１μ
ｇになるまで標準緩衝液で希釈した。
プロテインＡのヨウ素処理 プロテインＡをクロラミン−Ｔ法（Hunter and Greenwo
od: Nature 194 /1962/ p 495−）によりヨウ素処理し
た。得られた比活性はプロテインAlμｇ当たり約1.94mB
q、濃度4.5mg/であった。
od: Nature 194 /1962/ p 495−）によりヨウ素処理し
た。得られた比活性はプロテインAlμｇ当たり約1.94mB
q、濃度4.5mg/であった。
セファデックス抗体複合体 １〜10μｍの粒子寸法を有する超微細なセファデックス
Ｇ−25（スウェーデン国ファルマシア社）をBrCN（Ax
n R et al: Nature 214 /1967/ p 1302−1304による）
で活性化させた。100mgの活性化されたセファデックス
Ｇ−25に、Wide L: Acta Endocrinologica suppl 142 /
1969/ p 207−221に記載の方法に従って100μの抗血
清（0.39mgの抗プロテインAF（ab′）２）を結合させ
た。
Ｇ−25（スウェーデン国ファルマシア社）をBrCN（Ax
n R et al: Nature 214 /1967/ p 1302−1304による）
で活性化させた。100mgの活性化されたセファデックス
Ｇ−25に、Wide L: Acta Endocrinologica suppl 142 /
1969/ p 207−221に記載の方法に従って100μの抗血
清（0.39mgの抗プロテインAF（ab′）２）を結合させ
た。
試験手順 0.2mlの標識プロテインＡ（1ngの125I−プロテイン
Ａ）、0.05mlのプロテインＡ標準溶液又は0.05mlの希釈
していない患者の血清、及び100mg/のセファデックス
とこれに付着した抗体とを含む0.2mlの抗体懸濁液を各
試験管に加えた。抗体懸濁液をクエン酸塩緩衝液及び標
識プロテインＡ製剤中で希釈した。全試料（試験管）と
も２個ずつ処理した。試験管を室温で４時間又は１震盪
した。粒子を遠心分離及び吸引により0.9％のNaClで３
回洗浄した。
Ａ）、0.05mlのプロテインＡ標準溶液又は0.05mlの希釈
していない患者の血清、及び100mg/のセファデックス
とこれに付着した抗体とを含む0.2mlの抗体懸濁液を各
試験管に加えた。抗体懸濁液をクエン酸塩緩衝液及び標
識プロテインＡ製剤中で希釈した。全試料（試験管）と
も２個ずつ処理した。試験管を室温で４時間又は１震盪
した。粒子を遠心分離及び吸引により0.9％のNaClで３
回洗浄した。
結果の計算 プロテインＡを含まない標準の計数の平均値（B0）を計
算した。次にプロテインＡを含む各標準の計数（Bx）を
B0の百分率として表した。次にプロテインＡ濃度に対し
てB0の百分率として標準の計数を片対数的にプロットす
ることにより標準曲線を構成することができた。こうし
て各未知の試料の計数の平均値をB0の百分率で表し、標
準曲線からプロテインＡの濃度を読み取ることができ
る。各標準の（Bx/B0）×100を第1A表に示す。標準曲線
から、プロテインAlμg/のプロテインＡ検出下限を決
定することが可能である。
算した。次にプロテインＡを含む各標準の計数（Bx）を
B0の百分率として表した。次にプロテインＡ濃度に対し
てB0の百分率として標準の計数を片対数的にプロットす
ることにより標準曲線を構成することができた。こうし
て各未知の試料の計数の平均値をB0の百分率で表し、標
準曲線からプロテインＡの濃度を読み取ることができ
る。各標準の（Bx/B0）×100を第1A表に示す。標準曲線
から、プロテインAlμg/のプロテインＡ検出下限を決
定することが可能である。
ヒトIgGの存在下における試験例の作用 既知量のプロテインＡをヒト血漿に加え、本発明の上記
実施例に従って試験した。結果を第1B表面に示す。標準
曲線の勾配又は感度に大きな差異は認められず、大量の
正常なヒトIgGの存在がpH3.2の試験の特徴に何ら影響し
ないことがわかる。
実施例に従って試験した。結果を第1B表面に示す。標準
曲線の勾配又は感度に大きな差異は認められず、大量の
正常なヒトIgGの存在がpH3.2の試験の特徴に何ら影響し
ないことがわかる。
種々の異なるpHレベルで試験を行った。pH3.0未満では
免疫反応は生じなかった。pH値が3.5より高いと標識プ
ロテインＡは血清免疫グロブリンと反応し、従ってB0は
急速にゼロまで減少する（Cp J Immunol Meth 63/1983/
p 145−57）。
免疫反応は生じなかった。pH値が3.5より高いと標識プ
ロテインＡは血清免疫グロブリンと反応し、従ってB0は
急速にゼロまで減少する（Cp J Immunol Meth 63/1983/
p 145−57）。
供血者からの血漿をプロテインＡセファロース（スウェ
ーデン国ファルマシア社）に吸着させた後、溶出液のpH
を4.5、4.0、3.5、3.0及び2.7〜2.8と漸次低下させるこ
とにより、吸着されたIgGを吸着体から遊離させた。pH
3.0を越えることなくpH2.7〜2.8で溶出された血漿フラ
クション中では、試験例に阻害効果を有する因子が50％
の供血者の場合に検出できた。該因子はその阻害効果に
よりプロテインＡ値を著しく高めた。該因子は親和性の
高い抗プロテインＡ抗体であると考えられる。該因子は
IgG製剤中、又はプロテインＡ−IgGの解離pHよりも高い
pHでプロテインＡ吸着体から遊離されるか又は該吸着体
を通された他の血漿フラクション中には存在すべきでな
い。他の変形例では、該因子はプロテインＡとその抗体
との反応を阻害する必要がない。これは、特に過剰量の
抗プロテインＡ抗体を使用する方式（例えば「サンドイ
ッチ」方式）に適用できる。
ーデン国ファルマシア社）に吸着させた後、溶出液のpH
を4.5、4.0、3.5、3.0及び2.7〜2.8と漸次低下させるこ
とにより、吸着されたIgGを吸着体から遊離させた。pH
3.0を越えることなくpH2.7〜2.8で溶出された血漿フラ
クション中では、試験例に阻害効果を有する因子が50％
の供血者の場合に検出できた。該因子はその阻害効果に
よりプロテインＡ値を著しく高めた。該因子は親和性の
高い抗プロテインＡ抗体であると考えられる。該因子は
IgG製剤中、又はプロテインＡ−IgGの解離pHよりも高い
pHでプロテインＡ吸着体から遊離されるか又は該吸着体
を通された他の血漿フラクション中には存在すべきでな
い。他の変形例では、該因子はプロテインＡとその抗体
との反応を阻害する必要がない。これは、特に過剰量の
抗プロテインＡ抗体を使用する方式（例えば「サンドイ
ッチ」方式）に適用できる。
上記脱着実験の結果、約2.75のpHでプロテインＡと結合
する抗プロテインＡ抗体の存在が明らかになった。
する抗プロテインＡ抗体の存在が明らかになった。
実施例２ プロテインＡの定量のための二重抗体固相（DASP）法 プロテインＡに対して特異性を有する抗体（抗プロテイ
ンAF（ab′）２）、緩衝液１、緩衝液２、標準及び実施
例１から得られたヨウ素標識プロテインＡを使用した。
ンAF（ab′）２）、緩衝液１、緩衝液２、標準及び実施
例１から得られたヨウ素標識プロテインＡを使用した。
2A ヒツジ抗ウサギIgG抗体とBrCN活性化アガロースと
の結合 アガロースビーズ（0.5〜５μｍ、ファルマシア社）をB
rCNで活性化させ（Axn R et al: Nature 214/1967/ p
1302−1304による）、ガラスフィルタ漏斗で吸引し
た。活性化されたゲル8gを36mlのNaHCO3（0.1M）中の4m
gのヒツジ抗ウサギ抗体と混合し、＋４℃で震盪器上に
１晩インキュベートした。次に反応混合物を2000×ｇで
10分間遠心分離し、上清を吸引により除去した。次に、
40mlの0.1Mトリス緩衝液＋1MのNaCl（pH8.1）で洗浄
し、10分間遠心分離及び吸引した。40mlの酢酸塩緩衝液
＋1MのNaCl（pH4.0）でインキュベーションし、10分間
遠心分離及び吸引した。40mlの1Mエタノールアミン−HC
1（pH9.0）でインキュベーションし、１時間遠心分離及
び吸引した。前記トリス緩衝液及び酢酸塩緩衝液による
洗浄を２回繰り返した。次に0.05Mリン酸塩緩衝液＋1M
のNaCl＋0.01MのEDTA＋0.05％のトウィーン20から成る
混合物40mlを加え、10分間インキュベーションした。次
に遠心分離及び吸引した。リン酸塩緩衝液による洗浄を
２回繰り返した。ゲルをリン酸塩緩衝液中で0.3g/mlに
希釈し、超音波処理した。
の結合 アガロースビーズ（0.5〜５μｍ、ファルマシア社）をB
rCNで活性化させ（Axn R et al: Nature 214/1967/ p
1302−1304による）、ガラスフィルタ漏斗で吸引し
た。活性化されたゲル8gを36mlのNaHCO3（0.1M）中の4m
gのヒツジ抗ウサギ抗体と混合し、＋４℃で震盪器上に
１晩インキュベートした。次に反応混合物を2000×ｇで
10分間遠心分離し、上清を吸引により除去した。次に、
40mlの0.1Mトリス緩衝液＋1MのNaCl（pH8.1）で洗浄
し、10分間遠心分離及び吸引した。40mlの酢酸塩緩衝液
＋1MのNaCl（pH4.0）でインキュベーションし、10分間
遠心分離及び吸引した。40mlの1Mエタノールアミン−HC
1（pH9.0）でインキュベーションし、１時間遠心分離及
び吸引した。前記トリス緩衝液及び酢酸塩緩衝液による
洗浄を２回繰り返した。次に0.05Mリン酸塩緩衝液＋1M
のNaCl＋0.01MのEDTA＋0.05％のトウィーン20から成る
混合物40mlを加え、10分間インキュベーションした。次
に遠心分離及び吸引した。リン酸塩緩衝液による洗浄を
２回繰り返した。ゲルをリン酸塩緩衝液中で0.3g/mlに
希釈し、超音波処理した。
2B プロテインＡの定量 緩衝液２中に1000倍に希釈した0.2mlの標識プロテイン
Ａ（実施例１による）を各試験管に加えた。500、100、
50、10、５及び１μg/の濃度でヒト血漿中に希釈され
た標準溶液0.05mlを試験管１〜12に加え、希釈されてい
ない患者の血清を多数の試験管に加えた。緩衝液２中に
10000倍に希釈された抗体0.2mlを全試験官に加えた。混
合物を震盪器上に４時間インキュベーションした。
Ａ（実施例１による）を各試験管に加えた。500、100、
50、10、５及び１μg/の濃度でヒト血漿中に希釈され
た標準溶液0.05mlを試験管１〜12に加え、希釈されてい
ない患者の血清を多数の試験管に加えた。緩衝液２中に
10000倍に希釈された抗体0.2mlを全試験官に加えた。混
合物を震盪器上に４時間インキュベーションした。
60倍に希釈した2Aからの希釈ゲル2mlを加え、室温で１
時間インキュベーションした。3000rpmで10分間遠心分
離し、傾瀉した。試験管をγカウンタ内に置いた。標準
溶液の単位時間当たりの計数をB0の％として計算し、未
知の試験試料中のプロテインＡの量を計算可能な線形対
数図表に挿入した。
時間インキュベーションした。3000rpmで10分間遠心分
離し、傾瀉した。試験管をγカウンタ内に置いた。標準
溶液の単位時間当たりの計数をB0の％として計算し、未
知の試験試料中のプロテインＡの量を計算可能な線形対
数図表に挿入した。
本発明は、本明細書の一部を構成する添付の特許請求の
範囲に記載された通りである。
範囲に記載された通りである。
実施例３ パパイン処理連鎖球菌から産生されたプロテインＧ 容量12の発酵器内のトリプトン培地でヒトＧ連鎖球菌
株G148を培養した。対数相の終わりに、遠心分離によっ
て細菌を得た。12の培養基からのバイオマス収量は約
100g（湿潤重量）であった。Bjrck and Kronvall （J
Immunol 133 /1984/ p 969−74）に記載の方法に従っ
てプロテインＧを可溶化させた。簡単に説明するなら、
10mMのトリス（HCL）（pH8.0）中に細菌を約10％（w/
v）まで懸濁させた。細菌懸濁液1mlにつき100μの0.4
MのＬ−システイン（Sigma）及び80μｇのパパイン（Si
gma,P−3125）を同一の緩衝液中に添加することにより
消化させた。混合物を回転震盪器上で37℃に１時間イン
キュベーションした。最終濃度が6mMになるまでイオド
アセトアミド（Sigma）を添加することにより反応を停
止した。遠心分離により約１の上清を回収した。イオ
ン交換クロマトグラフィ及びアフィニティクロマトグラ
フィにより上清からプロテインＧを単離した。
株G148を培養した。対数相の終わりに、遠心分離によっ
て細菌を得た。12の培養基からのバイオマス収量は約
100g（湿潤重量）であった。Bjrck and Kronvall （J
Immunol 133 /1984/ p 969−74）に記載の方法に従っ
てプロテインＧを可溶化させた。簡単に説明するなら、
10mMのトリス（HCL）（pH8.0）中に細菌を約10％（w/
v）まで懸濁させた。細菌懸濁液1mlにつき100μの0.4
MのＬ−システイン（Sigma）及び80μｇのパパイン（Si
gma,P−3125）を同一の緩衝液中に添加することにより
消化させた。混合物を回転震盪器上で37℃に１時間イン
キュベーションした。最終濃度が6mMになるまでイオド
アセトアミド（Sigma）を添加することにより反応を停
止した。遠心分離により約１の上清を回収した。イオ
ン交換クロマトグラフィ及びアフィニティクロマトグラ
フィにより上清からプロテインＧを単離した。
イオン交換クロマトグラフィでは、pH8.0の10mMトリス
（HCl）中にDEAE−セファセル（ファルマシア社）100ml
を平衡化させた。NaOHを添加することによりパパイン−
消化物（digerate）のpHを（pH5.7から）8.0に調整し、
イオン交換ゲルに該消化物を加えた。スラリーを回転震
盪器上で室温で２時間撹拌した。ガラスフィルタ上で平
衡緩衝液で洗浄後、ゲルをK26/40カラム（ファルマシア
社）中に充填した。吸着された材料を、０〜0.5Mの直線
勾配のNaCl500mlにより溶出した。（ポリクローナルウ
シIgGに対する）免疫拡散法により検出されたプロテイ
ンＧを含むフラクションをプールした。
（HCl）中にDEAE−セファセル（ファルマシア社）100ml
を平衡化させた。NaOHを添加することによりパパイン−
消化物（digerate）のpHを（pH5.7から）8.0に調整し、
イオン交換ゲルに該消化物を加えた。スラリーを回転震
盪器上で室温で２時間撹拌した。ガラスフィルタ上で平
衡緩衝液で洗浄後、ゲルをK26/40カラム（ファルマシア
社）中に充填した。吸着された材料を、０〜0.5Mの直線
勾配のNaCl500mlにより溶出した。（ポリクローナルウ
シIgGに対する）免疫拡散法により検出されたプロテイ
ンＧを含むフラクションをプールした。
アフィニティクロマトグラフィでは、イオン交換体から
のプロテインＧを含むプール約220mlを等量のPBST（30m
MのNa−PO4、0.12MのNaCl（pH7.2）、0.05％のトウィー
ン20を含む）で希釈した。PBST中でIgG−セファロース4
B（ファルマシア社）15mlを平衡化させ、イオン交換体
からの希釈溶出物に加えた。スラリーを回転震盪器上で
室温で2.5時間撹拌した。次にガラスフィルタ上でゲル
を洗浄し、K16/20カラム内に充填した。結合した物質を
均一（isocratic）な溶出により脱着させた。溶出剤はp
H2.5の0.1Mトリス（HCl）とし、流量は10ml/h（5cm/h）
とした。溶出された物質をPD−10カラム（ファルマシア
社）上で脱塩し、pH7.2の30mMのNa−PO4とした。脱塩後
のA280は約1.7/ml、容量は16mlであった。
のプロテインＧを含むプール約220mlを等量のPBST（30m
MのNa−PO4、0.12MのNaCl（pH7.2）、0.05％のトウィー
ン20を含む）で希釈した。PBST中でIgG−セファロース4
B（ファルマシア社）15mlを平衡化させ、イオン交換体
からの希釈溶出物に加えた。スラリーを回転震盪器上で
室温で2.5時間撹拌した。次にガラスフィルタ上でゲル
を洗浄し、K16/20カラム内に充填した。結合した物質を
均一（isocratic）な溶出により脱着させた。溶出剤はp
H2.5の0.1Mトリス（HCl）とし、流量は10ml/h（5cm/h）
とした。溶出された物質をPD−10カラム（ファルマシア
社）上で脱塩し、pH7.2の30mMのNa−PO4とした。脱塩後
のA280は約1.7/ml、容量は16mlであった。
結果及び検討 パパイン処理連鎖球菌からのプロテインＧ 蛋白質加水分解酵素であるパパインを使用して連鎖球菌
からのプロテインＧを可溶化させた。DEAE−セファセル
及びIgG−セファロース4B上で精製後、モノQ HR 5/5カ
ラム上で分析用クロマトグラフィによりプロテインＧを
特徴付けた。クロマトグラムの様相はパパインの抽出方
法によって著しく異なり、この可溶化手順の困難さを示
している。
からのプロテインＧを可溶化させた。DEAE−セファセル
及びIgG−セファロース4B上で精製後、モノQ HR 5/5カ
ラム上で分析用クロマトグラフィによりプロテインＧを
特徴付けた。クロマトグラムの様相はパパインの抽出方
法によって著しく異なり、この可溶化手順の困難さを示
している。
パパイン処理時間を延長すると、ピークの数が増え且つ
ピークの大きさが減少した。同様にクロマトグラムの様
相は使用されるパパインの種類及び／又はバッチにより
著しく異なった。一般に（免疫拡散法により決定される
ような）主プロテインＧ活性を含むピークとして、２つ
の主なピークを観察することができた。これらの２つの
ピークの他に幾つかの小さいピークも観察された。小さ
いピークもある程度プロテインＧ活性を含んでいた。
ピークの大きさが減少した。同様にクロマトグラムの様
相は使用されるパパインの種類及び／又はバッチにより
著しく異なった。一般に（免疫拡散法により決定される
ような）主プロテインＧ活性を含むピークとして、２つ
の主なピークを観察することができた。これらの２つの
ピークの他に幾つかの小さいピークも観察された。小さ
いピークもある程度プロテインＧ活性を含んでいた。
SDS−PAGEによって分析した場合も、精製されたプロテ
インＧの様相は同様に異なっていた。一般にそれぞれ約
10000及び15000の見掛けのm.w.s.を有する２つの主要な
帯が現れた。試料を２−メルカプトエタノールで処理し
てもSDS−PAGEパターンに影響なく、プロテインＧにジ
スルフィド結合が存在していないことがわかる。プロテ
インＧの等電点をIEFにより決定した。一般に、約4.7及
び4.2のpIに対応する２つの帯が観察された。プロテイ
ンＧの２つの主なフラクションのアミノ酸組成を決定
し、２つのフラクション間の密接な関係が明らかになっ
た。
インＧの様相は同様に異なっていた。一般にそれぞれ約
10000及び15000の見掛けのm.w.s.を有する２つの主要な
帯が現れた。試料を２−メルカプトエタノールで処理し
てもSDS−PAGEパターンに影響なく、プロテインＧにジ
スルフィド結合が存在していないことがわかる。プロテ
インＧの等電点をIEFにより決定した。一般に、約4.7及
び4.2のpIに対応する２つの帯が観察された。プロテイ
ンＧの２つの主なフラクションのアミノ酸組成を決定
し、２つのフラクション間の密接な関係が明らかになっ
た。
免疫拡散、直接沈降又は沈降阻害により、各種抗体（種
及びサブクラス）に対するプロテインＧの反応性を試験
した。一般に、プロテインＧは試験された抗体の大部分
で直接沈降することがわかった。ポリクローナルウサギ
IgG、モノクローナルマウスIgGl及びIgG2aには弱い相互
作用（直接沈降でなく沈降阻害）が観察された。更に、
ポリクローナルなイヌ、ラット及びニワトリIgG並びに
ヒト骨髄腫からのIgM、IgA及びIgDはプロテインＧと反
応しなかった。
及びサブクラス）に対するプロテインＧの反応性を試験
した。一般に、プロテインＧは試験された抗体の大部分
で直接沈降することがわかった。ポリクローナルウサギ
IgG、モノクローナルマウスIgGl及びIgG2aには弱い相互
作用（直接沈降でなく沈降阻害）が観察された。更に、
ポリクローナルなイヌ、ラット及びニワトリIgG並びに
ヒト骨髄腫からのIgM、IgA及びIgDはプロテインＧと反
応しなかった。
プロテインＧによる免疫感作 0.5mlの完全フロイントアジュバントで乳化された0.5ml
の塩類中に250μｇのプロテインＧと250μｇの精製ヒツ
ジIgGとを混合してなる混合物を３匹のウサギに筋内に
感作した。
の塩類中に250μｇのプロテインＧと250μｇの精製ヒツ
ジIgGとを混合してなる混合物を３匹のウサギに筋内に
感作した。
２箇月間に３回連続的に注射後、３週間に２回の周期で
ウサギの放血を定期的に行った。抗血清を収集し、上述
のように調製されたプロテインＧ製剤とヒツジIgGとに
対して免疫電気泳動で試験した。
ウサギの放血を定期的に行った。抗血清を収集し、上述
のように調製されたプロテインＧ製剤とヒツジIgGとに
対して免疫電気泳動で試験した。
３匹のウサギは、いずれも沈査を形成するプロテインＧ
に対する強い抗血清反応を示した。これに対して、プロ
テインＧ−ヒツジIgGの感作以前に同一の動物から収集
した血清は沈査を示さなかった。
に対する強い抗血清反応を示した。これに対して、プロ
テインＧ−ヒツジIgGの感作以前に同一の動物から収集
した血清は沈査を示さなかった。
Claims (5)
- 【請求項１】（ｉ）免疫グロブリンのFc部分と結合可能
な細菌ポリペプチド及び／又は（ii）該ポリペプチドに
対して親和性の高い特異的な抗体を定量するために該ポ
リペプチドと該ポリペプチドのエピトープに対する抗体
製剤との間の免疫反応をpH4未満の条件下で実施するこ
とからなる免疫検定法であって、該pH条件下で該ポリペ
プチドと結合する能力のある免疫グロブリンのFc部分は
該ポリペプチドと実質的に結合せず且つ該抗体製剤は抗
体活性を有することを特徴とする前記免疫検定法。 - 【請求項２】プロテインＡ又はその対応抗体とプロテイ
ンＧ又はその対応抗体とをそれぞれ定量するべく、プロ
テインＡ及びプロテインＧから構成される群から選択さ
れたポリペプチドのエピトープに対する抗体製剤を使用
することを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の免
疫検定法。 - 【請求項３】免疫反応をpH2.7〜3.5で実施することを特
徴とする特許請求の範囲第１項に記載の免疫検定法。 - 【請求項４】競合的免疫検定法を使用することを特徴と
する特許請求の範囲第１項ないし第３項のいずれかに記
載の免疫検定法。 - 【請求項５】ヘテロジニアス免疫検定法を使用すること
を特徴とする特許請求の範囲第１項ないし第４項のいず
れかに記載の免疫検定法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SE8502722-5 | 1985-06-03 | ||
| SE8502722A SE448190B (sv) | 1985-06-03 | 1985-06-03 | Sett att bestemma fc-dels-bindande bakteriella polypeptider |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6212859A JPS6212859A (ja) | 1987-01-21 |
| JPH06100603B2 true JPH06100603B2 (ja) | 1994-12-12 |
Family
ID=20360424
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61127857A Expired - Lifetime JPH06100603B2 (ja) | 1985-06-03 | 1986-06-02 | 特定の細菌ポリペプチド及びそれに対する抗体の定量法 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4752571A (ja) |
| EP (1) | EP0213093B1 (ja) |
| JP (1) | JPH06100603B2 (ja) |
| AT (1) | ATE57016T1 (ja) |
| CA (1) | CA1265999A (ja) |
| DE (1) | DE3674511D1 (ja) |
| SE (1) | SE448190B (ja) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5985599A (en) * | 1986-05-29 | 1999-11-16 | The Austin Research Institute | FC receptor for immunoglobulin |
| WO1991010911A1 (en) * | 1990-01-19 | 1991-07-25 | Repligen Corporation | Immunoassay of protein a under acidic conditions |
| ATE452337T1 (de) | 1998-06-19 | 2010-01-15 | Ge Healthcare Bio Sciences Ab | Verfahren für die quantitative freisetzung von natürlichen oder rekombinanten proteinen, polypeptiden oder peptiden |
| WO2004048975A1 (ja) * | 2002-11-22 | 2004-06-10 | Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd. | 黄色ブドウ球菌の検査方法 |
| SG177202A1 (en) * | 2008-09-15 | 2012-01-30 | Emd Millipore Corp | Methods for quantifying protein leakage from protein based affinity chromatography resins |
| CN104718453B (zh) * | 2012-10-03 | 2017-03-08 | Gyros专利公司 | 酸性条件下分析物测定用方法和试剂盒 |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2322533C2 (de) * | 1972-11-06 | 1986-08-28 | Pharmacia AB, Uppsala | Verfahren zum Binden von Immunoglobulin und Hilfsmittel zur Durchführung des Verfahrens |
| US3966868A (en) * | 1974-12-09 | 1976-06-29 | Hope Henry F | Strip straightening apparatus, product and method |
| SE8003732L (sv) * | 1980-05-19 | 1981-11-20 | Pharmacia Diagnostics Ab | Sett vid bestemningsmetoder involverande biospecifika affinitetsreaktioner |
| US4409330A (en) * | 1980-11-24 | 1983-10-11 | American Hoechst Corporation | Material and method for removing immunoglobulins from whole blood |
| US4471058A (en) * | 1982-07-26 | 1984-09-11 | Board Of Trustees Operating Michigan State University | Method for the detection and/or determination of a polyvalent antigen using at least two different monoclonal antibodies |
| US4590168A (en) * | 1983-02-14 | 1986-05-20 | The Children's Medical Center Corporation | Protein immunoassaying and purification |
| US4617266A (en) * | 1983-04-28 | 1986-10-14 | Genex Corporation | Production of Protein A |
-
1985
- 1985-06-03 SE SE8502722A patent/SE448190B/sv not_active IP Right Cessation
-
1986
- 1986-05-21 CA CA000509670A patent/CA1265999A/en not_active Expired - Fee Related
- 1986-05-22 US US06/865,853 patent/US4752571A/en not_active Expired - Fee Related
- 1986-05-28 DE DE8686850190T patent/DE3674511D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1986-05-28 EP EP86850190A patent/EP0213093B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-05-28 AT AT86850190T patent/ATE57016T1/de not_active IP Right Cessation
- 1986-06-02 JP JP61127857A patent/JPH06100603B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6212859A (ja) | 1987-01-21 |
| EP0213093A1 (en) | 1987-03-04 |
| SE8502722D0 (sv) | 1985-06-03 |
| ATE57016T1 (de) | 1990-10-15 |
| SE8502722L (sv) | 1986-12-04 |
| EP0213093B1 (en) | 1990-09-26 |
| CA1265999A (en) | 1990-02-20 |
| SE448190B (sv) | 1987-01-26 |
| DE3674511D1 (de) | 1990-10-31 |
| US4752571A (en) | 1988-06-21 |
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