JPS6340858A - 炎症の検出とその新しい抗体 - Google Patents
炎症の検出とその新しい抗体Info
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Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6863—Cytokines, i.e. immune system proteins modifying a biological response such as cell growth proliferation or differentiation, e.g. TNF, CNF, GM-CSF, lymphotoxin, MIF or their receptors
- G01N33/6869—Interleukin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
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- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
- C07K16/244—Interleukins [IL]
- C07K16/245—IL-1
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
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- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
[産業上の利用分野]
本発明は免疫学に関するものであり、より詳しくは、体
液中のインターロイキン−1(“IL−1”)のレベル
の測定に抗体を用いることによる炎症の検出、および、
」二記測定を行うためのキットに関するものである。
液中のインターロイキン−1(“IL−1”)のレベル
の測定に抗体を用いることによる炎症の検出、および、
」二記測定を行うためのキットに関するものである。
[従来技術]
多くの急性疾患および慢性疾患は、血管およびその隣接
器官の炎症を引き起こす。−上記疾患および異常は、病
原体の侵入、および、過敏症のような免疫系機能障害な
どの、多様な原因から生じる。過敏症は抗体媒介性免疫
反応、あるいは、細胞媒介性免疫反応、または、その双
方に由来するものである。抗体媒介性免疫反応の例とし
ては、枯堕熱、ぜんそく、じんましんなどのアナフィラ
キシ−反応(anaphylaxis reactio
ns)がある。
器官の炎症を引き起こす。−上記疾患および異常は、病
原体の侵入、および、過敏症のような免疫系機能障害な
どの、多様な原因から生じる。過敏症は抗体媒介性免疫
反応、あるいは、細胞媒介性免疫反応、または、その双
方に由来するものである。抗体媒介性免疫反応の例とし
ては、枯堕熱、ぜんそく、じんましんなどのアナフィラ
キシ−反応(anaphylaxis reactio
ns)がある。
他の免疫媒介性反応には、アルラス反応(Arthus
reactions)、および、多様な免疫複合病、例
えば、糸球体腎炎、ウィルス性肝炎、クリオグロプリン
血症、および気管支肺アスペルギルス症(broneh
opulmonary aspergillosis)
が含まれるO細胞媒介性過敏症反応に関与する疾患の例
には、皮膚炎、薬剤感受症、および、甲状腺炎が劇まれ
る。
reactions)、および、多様な免疫複合病、例
えば、糸球体腎炎、ウィルス性肝炎、クリオグロプリン
血症、および気管支肺アスペルギルス症(broneh
opulmonary aspergillosis)
が含まれるO細胞媒介性過敏症反応に関与する疾患の例
には、皮膚炎、薬剤感受症、および、甲状腺炎が劇まれ
る。
抗体媒介性反応および細胞媒介性反応の双方を含む、炎
症を引き起こす過敏症は、自己免疫反応から生じる自己
免疫病を含む。上記反応は、自己成分に対する免疫寛容
(immunological tolerance)
の欠陥を示し、自己抗原に対するレセプターを庁するT
細胞およびB細胞の“禁止クローン(forbidde
n clones)”の出現を引き起こす。自己免疫病
は、甲状腺(橋本甲状腺炎)、じんましん(交感性眼炎
(sympathetic ophthalmia))
、腎臓(グツド・パスツール症候群 (Good P
a5ture’ssyndrome) )、赤血球(自
己免疫溶1fIl 性貧血) 、肝臓〔第一胆管硬変症
(primary bilary eirrhosis
))および、滑脱(synovial [llembr
anes) (リューマチ様関節炎(rhcumato
id arthritis))を含む、はとんど全ての
身体部分に影響を及ぼす。
症を引き起こす過敏症は、自己免疫反応から生じる自己
免疫病を含む。上記反応は、自己成分に対する免疫寛容
(immunological tolerance)
の欠陥を示し、自己抗原に対するレセプターを庁するT
細胞およびB細胞の“禁止クローン(forbidde
n clones)”の出現を引き起こす。自己免疫病
は、甲状腺(橋本甲状腺炎)、じんましん(交感性眼炎
(sympathetic ophthalmia))
、腎臓(グツド・パスツール症候群 (Good P
a5ture’ssyndrome) )、赤血球(自
己免疫溶1fIl 性貧血) 、肝臓〔第一胆管硬変症
(primary bilary eirrhosis
))および、滑脱(synovial [llembr
anes) (リューマチ様関節炎(rhcumato
id arthritis))を含む、はとんど全ての
身体部分に影響を及ぼす。
炎症は、局部的血管拡張を含む、患部血管およびその隣
接組織における、複雑な一連の細胞学的および組織学的
反応に関与しており、赤色化や発熱を誘発し、組織部分
への、血しょう、タンパク質、および、食細胞の流入を
可能にし、それによって隆起部が生じる。他の血管およ
び組織反応性酵素の部分的な放出あるいは活性化、およ
び、組織の圧迫の増大は、痛みの原因となる、部分的神
経終末を生じさせる。
接組織における、複雑な一連の細胞学的および組織学的
反応に関与しており、赤色化や発熱を誘発し、組織部分
への、血しょう、タンパク質、および、食細胞の流入を
可能にし、それによって隆起部が生じる。他の血管およ
び組織反応性酵素の部分的な放出あるいは活性化、およ
び、組織の圧迫の増大は、痛みの原因となる、部分的神
経終末を生じさせる。
正確な炎症試験は、上記の多数の免疫機能障害および他
の異常を引き起こす炎症の診断の可能性を増大させ、ま
た、疾患に対して選択された治療法の−a効件の追跡の
大きな助けになると思われるにもかかわらず、以前は、
炎症を正確に検出することが不可能であった。これは、
一つには、炎症の四つの主要な兆候、即ち、熱、赤色化
、腫れ、および、痛みの全てが常に存在するとは限らな
いことによる。さらに、患者による痛みの評価は、炎症
のH用な指標として用いるには、しばしば主観的過ぎる
。また、以前に炎症試験に用いられた診断法は、有効で
あると証明されてはいない。−1−記診断法には、接合
流動性の検出を行う多数の物理的診断法に加え、白血球
、プロスタグランジン(prostaglandins
)、および、自己反応性抗体の面中の水準の測定、血清
や血しょう中の急性過程タンパク質(acute ph
ase protein)の検出を含む0一般的に、上
記試験は、その非再現性、および、ある場合には、ある
疾患過程との決定的でない相関のために、有用性が制限
されてきた。炎症を引き起こす個々の疾患のために多様
な特異的試験が発達してきたが、しかしながら、1−記
試験は、炎症が他の疾患による場合は酊効ではない。さ
らに、プロスタグランジンは、主に、多くの宿主免疫お
よび代謝機能に関与している。プロスタクランジンは、
コロニー刺激因子生成における負のフィードバック効果
による血液細胞生成の“ダウンレギュレーション(do
vn−regu l at ton)″と密接に関係し
ている。このように、元来プロスタグランジンは、多様
な代謝機能を調節しているので、該分子のレベルの上昇
を測定することは、炎症反応の正確な指標にはなり寿な
いであろう。出願人らは、モノカインIL−1がしばし
ば炎症の初期指示物質であり、いくつかの経路で炎症反
応生成に中心的に関与していることを見いだした。例え
ば、IL−1は、直接的に発熱源となり得、急性過程タ
ンパク質合成を開始させることが可能であり、軟骨分解
と同様に、直接に骨の脱鉱化作用さえ行うことが出来る
。さらに、炎症の期間中には、体液中でIL−ルベルの
上昇が認められる。例えば、IL−ルベルの上昇は、多
様な関節炎状態の患者から得られるリューマチ性滑液で
みられる。
の異常を引き起こす炎症の診断の可能性を増大させ、ま
た、疾患に対して選択された治療法の−a効件の追跡の
大きな助けになると思われるにもかかわらず、以前は、
炎症を正確に検出することが不可能であった。これは、
一つには、炎症の四つの主要な兆候、即ち、熱、赤色化
、腫れ、および、痛みの全てが常に存在するとは限らな
いことによる。さらに、患者による痛みの評価は、炎症
のH用な指標として用いるには、しばしば主観的過ぎる
。また、以前に炎症試験に用いられた診断法は、有効で
あると証明されてはいない。−1−記診断法には、接合
流動性の検出を行う多数の物理的診断法に加え、白血球
、プロスタグランジン(prostaglandins
)、および、自己反応性抗体の面中の水準の測定、血清
や血しょう中の急性過程タンパク質(acute ph
ase protein)の検出を含む0一般的に、上
記試験は、その非再現性、および、ある場合には、ある
疾患過程との決定的でない相関のために、有用性が制限
されてきた。炎症を引き起こす個々の疾患のために多様
な特異的試験が発達してきたが、しかしながら、1−記
試験は、炎症が他の疾患による場合は酊効ではない。さ
らに、プロスタグランジンは、主に、多くの宿主免疫お
よび代謝機能に関与している。プロスタクランジンは、
コロニー刺激因子生成における負のフィードバック効果
による血液細胞生成の“ダウンレギュレーション(do
vn−regu l at ton)″と密接に関係し
ている。このように、元来プロスタグランジンは、多様
な代謝機能を調節しているので、該分子のレベルの上昇
を測定することは、炎症反応の正確な指標にはなり寿な
いであろう。出願人らは、モノカインIL−1がしばし
ば炎症の初期指示物質であり、いくつかの経路で炎症反
応生成に中心的に関与していることを見いだした。例え
ば、IL−1は、直接的に発熱源となり得、急性過程タ
ンパク質合成を開始させることが可能であり、軟骨分解
と同様に、直接に骨の脱鉱化作用さえ行うことが出来る
。さらに、炎症の期間中には、体液中でIL−ルベルの
上昇が認められる。例えば、IL−ルベルの上昇は、多
様な関節炎状態の患者から得られるリューマチ性滑液で
みられる。
体液中のIL−ルベルの平常時を越える程度が、存在す
る炎症の程度の指標となり得る。
る炎症の程度の指標となり得る。
[発明が解決しようとする問題点コ
単純な溶液中におけるIL−1のレベルを決定するアッ
セイ法は存在する。出願人および共同研究者によって開
発された、上記アッセイの一つに、IL−1試料による
CD−1マウス山来胸腺細胞の増殖誘導能力を測定する
ものがある。クロンハイム(Kronheim)他、J
、 Exp、 Mad。
セイ法は存在する。出願人および共同研究者によって開
発された、上記アッセイの一つに、IL−1試料による
CD−1マウス山来胸腺細胞の増殖誘導能力を測定する
ものがある。クロンハイム(Kronheim)他、J
、 Exp、 Mad。
161 : 490 −502 (1985)。別のア
ッセイ(“コミトジエネシスアツセイ(eoiitog
encsfs assay) ”と呼ぶ)では、IL−
1およびフィトヘマグルチニン(phytohcmag
glutlnin)の準細胞分裂誘起的投与に対応する
マウス胸腺細胞の増殖を測定する。
ッセイ(“コミトジエネシスアツセイ(eoiitog
encsfs assay) ”と呼ぶ)では、IL−
1およびフィトヘマグルチニン(phytohcmag
glutlnin)の準細胞分裂誘起的投与に対応する
マウス胸腺細胞の増殖を測定する。
マイゼル(Mizcl)他、J、 1mmuno1.
L20 (5) :14!117 (1973)。第三
のアッセイは、出願人らが開発したものであるが、イン
ター口・イキンー2(“IL−2″)非産生マウス上要
細胞系LBRM−33−IA5を、IL−2を産生ずる
ように転換し、IL−2依存性連続T IJンバ細胞系
(CTLL−2)におけるマイトジエネシスを刺激する
IL−1の能力を利用するものである。全ての上記アッ
セイの限界は、それらがIL−1の生物活性を基礎にし
ていることである。そのため、上記試験は、研究所・診
療所間で標準化することがほとんど不可能である。さら
に、!L−1機能の生物学的評価によるため、上記アッ
セイは、血清、血しょう、尿などに存在する他の生物媒
介物質によって、重度の阻害を非常に受けやすく、従っ
て、上記の様な患者体液中のIL−1の存在を追跡する
場合には不正確である。一方、本発明のイムノアッセイ
は、新しいモノクローナル抗体を含む、抗体を使用し、
IL−1によって引き起こされる時間的に後の効果を追
跡するのではなく、IL−1の物理的存在を特異的に検
出するものであり、そのため、患者体液試料中の、同定
された、あるいは、同定されていない他の媒介物質の存
在によって影響を受けない。
L20 (5) :14!117 (1973)。第三
のアッセイは、出願人らが開発したものであるが、イン
ター口・イキンー2(“IL−2″)非産生マウス上要
細胞系LBRM−33−IA5を、IL−2を産生ずる
ように転換し、IL−2依存性連続T IJンバ細胞系
(CTLL−2)におけるマイトジエネシスを刺激する
IL−1の能力を利用するものである。全ての上記アッ
セイの限界は、それらがIL−1の生物活性を基礎にし
ていることである。そのため、上記試験は、研究所・診
療所間で標準化することがほとんど不可能である。さら
に、!L−1機能の生物学的評価によるため、上記アッ
セイは、血清、血しょう、尿などに存在する他の生物媒
介物質によって、重度の阻害を非常に受けやすく、従っ
て、上記の様な患者体液中のIL−1の存在を追跡する
場合には不正確である。一方、本発明のイムノアッセイ
は、新しいモノクローナル抗体を含む、抗体を使用し、
IL−1によって引き起こされる時間的に後の効果を追
跡するのではなく、IL−1の物理的存在を特異的に検
出するものであり、そのため、患者体液試料中の、同定
された、あるいは、同定されていない他の媒介物質の存
在によって影響を受けない。
[問題点を解決するための手段および発明の効果]本発
明によると、非生物学的アッセイにより、例えば血清の
ような、体液中のIL−1の物理的存在および水準を追
跡することによって、正確、迅速かつ簡便に、炎症を検
出および定量する。前述のように、多くの感染症および
免疫機能障害は炎症の原因となるため、体液仲のIL−
1の水準を測定することは、上記状態の診断に使用でき
、また、疾患に対して選択される治療法の有効性を選択
および追跡に使用することが可能である。
明によると、非生物学的アッセイにより、例えば血清の
ような、体液中のIL−1の物理的存在および水準を追
跡することによって、正確、迅速かつ簡便に、炎症を検
出および定量する。前述のように、多くの感染症および
免疫機能障害は炎症の原因となるため、体液仲のIL−
1の水準を測定することは、上記状態の診断に使用でき
、また、疾患に対して選択される治療法の有効性を選択
および追跡に使用することが可能である。
体液中のIL−1の水準を測定することは、末梢関節の
対称性炎症が特徴である、リューマチ性関節炎の診断に
特に自゛効である。さらに、IL−1は、リューマチ性
関節炎による肯の脱鉱化作用および軟骨分解の媒介物質
である。600万人以」−のアメリカ人が、リューマチ
性関節炎に冒されている点で、上記状態の診断試験とし
ての本発明の使用は実質的に−a用である。
対称性炎症が特徴である、リューマチ性関節炎の診断に
特に自゛効である。さらに、IL−1は、リューマチ性
関節炎による肯の脱鉱化作用および軟骨分解の媒介物質
である。600万人以」−のアメリカ人が、リューマチ
性関節炎に冒されている点で、上記状態の診断試験とし
ての本発明の使用は実質的に−a用である。
炎症を検出するための、体液中のIL−1の測定は、前
述の、以前の炎症検出法よりも有効である。例えば、出
願人らは、体液中のIL−1水準が、炎症初期過程に」
二重することを見いだし、そのため、本発明は他の検出
法よりもすい時期に炎症の検出が可能である。これは、
炎症の検出にプロスタグランジンの水準を使用する試み
に比較して、特に当てはまる。前述のように、IL−1
の機能の一つは、プロスタグランジン合成の誘導であり
、従って、IL−1の測定は、」二足目的で血中のプロ
スタグランジン水準を測定する場合に可能な時期よりも
1f(い炎症発達過程で、炎症の検出が行える。
述の、以前の炎症検出法よりも有効である。例えば、出
願人らは、体液中のIL−1水準が、炎症初期過程に」
二重することを見いだし、そのため、本発明は他の検出
法よりもすい時期に炎症の検出が可能である。これは、
炎症の検出にプロスタグランジンの水準を使用する試み
に比較して、特に当てはまる。前述のように、IL−1
の機能の一つは、プロスタグランジン合成の誘導であり
、従って、IL−1の測定は、」二足目的で血中のプロ
スタグランジン水準を測定する場合に可能な時期よりも
1f(い炎症発達過程で、炎症の検出が行える。
本発明によれば、以下に示すように、本発明のアッセイ
に使用するために、新しいポリクローナル抗体およびモ
ノクローナル抗体が作成された。
に使用するために、新しいポリクローナル抗体およびモ
ノクローナル抗体が作成された。
IL−1は、IL−1αおよびIL−1βで示される、
少なくとも二種類の異なる成分から描成されていること
は、出願人らおよび共同研究者により、以前に発見され
ており、マーチ(March)他、Nature (L
ondon) 315 : 641 (1985)を
参考として挙げる。
少なくとも二種類の異なる成分から描成されていること
は、出願人らおよび共同研究者により、以前に発見され
ており、マーチ(March)他、Nature (L
ondon) 315 : 641 (1985)を
参考として挙げる。
まだ、完全に解明されてはいないが、炎症初期段階にお
いて、体液中で両方の成分の水準が上昇すると、考えら
れている。以−にのように、本発明は、IL−1の」二
足双方の種のアッセイに使用する、新しい抗体を含む。
いて、体液中で両方の成分の水準が上昇すると、考えら
れている。以−にのように、本発明は、IL−1の」二
足双方の種のアッセイに使用する、新しい抗体を含む。
ポリクローナル抗体は、ウサギ、げっ歯類動物や、他の
動物を、IL−1あるいはIL−1ペプチドで免疫し、
同動物の血清から抗体を精製することにより得られる。
動物を、IL−1あるいはIL−1ペプチドで免疫し、
同動物の血清から抗体を精製することにより得られる。
新しいモノクローナル抗体は、IL−1分子あるいはペ
プチドを、宿主動物に注入し、免疫した動物体由来のリ
ンパ球を腫瘍細胞と融合させ、IL−1分子に特異的に
結合する新しいモノクローナル抗体を発現可能なハイブ
リドーマを作成することにより調製した。
プチドを、宿主動物に注入し、免疫した動物体由来のリ
ンパ球を腫瘍細胞と融合させ、IL−1分子に特異的に
結合する新しいモノクローナル抗体を発現可能なハイブ
リドーマを作成することにより調製した。
本発明の、別の側面では、体液中のIL−1の物理的存
在および水準を、IL−1分子上に存在する単独の抗原
決定基に特異的な一つ以−ヒの新しい抗体を使用する多
様なイムノアッセイ法によって測定する。イムノアッセ
イでは、IL−1と、それに特異的な抗体との反応性は
、例えば、蛍光標識、放射性標識あるいは酵素標識によ
って、IL−1抗体複合体の形成を検出することにより
決定する。上記複合体が形成される程度は、試料中に存
在するIL−1量の指標となり、また、疾患によって生
じる炎症の状態および水準に関連している。
在および水準を、IL−1分子上に存在する単独の抗原
決定基に特異的な一つ以−ヒの新しい抗体を使用する多
様なイムノアッセイ法によって測定する。イムノアッセ
イでは、IL−1と、それに特異的な抗体との反応性は
、例えば、蛍光標識、放射性標識あるいは酵素標識によ
って、IL−1抗体複合体の形成を検出することにより
決定する。上記複合体が形成される程度は、試料中に存
在するIL−1量の指標となり、また、疾患によって生
じる炎症の状態および水準に関連している。
本発明のより詳しい局面では、体液試料を、■L−1分
子に単独に特徴的な第一抗体部位に特異的な本発明の新
しい第一抗体と反応させ、次に、第一抗体あるいは第一
抗体に対する特異的結合分子のいずれかに結合した標識
によって生成されるシグナルを測定することによって抗
体複合体の形成を測定することにより、炎症状態を直接
検出する。イムノアッセイはまた、体液試料を、IL−
1に特徴的な第一抗原部位に特異的な、本発明の新しい
第一抗体と接触させる、二重決定アッセイを含む。」−
記のように形成された第一抗体−IL−1複合体を、第
一抗IL−1抗体反応性の抗原部位とは異なるIL−1
分子」−の単独の第二抗原部位に対して誘導した本発明
の新しい第二抗IL−1抗体と接触させる。非結合成分
の分離後、第一抗体に“トラップされた(trappe
d)“ IL−1量を決定するために、第二抗体−IL
−1複合体を測定する。上記反応性は、第二抗体あるい
は第二抗体に対する特異的結合分子に結合した標識によ
って生成されるシグナルを測定することにより決定する
。
子に単独に特徴的な第一抗体部位に特異的な本発明の新
しい第一抗体と反応させ、次に、第一抗体あるいは第一
抗体に対する特異的結合分子のいずれかに結合した標識
によって生成されるシグナルを測定することによって抗
体複合体の形成を測定することにより、炎症状態を直接
検出する。イムノアッセイはまた、体液試料を、IL−
1に特徴的な第一抗原部位に特異的な、本発明の新しい
第一抗体と接触させる、二重決定アッセイを含む。」−
記のように形成された第一抗体−IL−1複合体を、第
一抗IL−1抗体反応性の抗原部位とは異なるIL−1
分子」−の単独の第二抗原部位に対して誘導した本発明
の新しい第二抗IL−1抗体と接触させる。非結合成分
の分離後、第一抗体に“トラップされた(trappe
d)“ IL−1量を決定するために、第二抗体−IL
−1複合体を測定する。上記反応性は、第二抗体あるい
は第二抗体に対する特異的結合分子に結合した標識によ
って生成されるシグナルを測定することにより決定する
。
本発明のさらに別の局面では、IL−1アツセイは、反
応物質が、体液試料、一定量の本発明の新しい抗IL−
1抗体、および、一定量の標識IL−1抗体を含む、競
合アッセイの形式を取ることも可能である。試料中に存
在するIL−1、および、標識IL−1のいずれも、反
応時に存在するそれらの相対量に比例して、IL−1抗
体と特異的に結合することが可能である。反応によって
結合した成分と、結合していない成分とを分離した後、
結合成分あるいは非結合成分中の、あるいは双方に存在
する標識によって生成される検出可能なシグナルの水準
を測定する。上記アッセイの複合体成分によって生成さ
れるシグナル水準は、測定される試料中に存在するIL
−1量に反比例する。
応物質が、体液試料、一定量の本発明の新しい抗IL−
1抗体、および、一定量の標識IL−1抗体を含む、競
合アッセイの形式を取ることも可能である。試料中に存
在するIL−1、および、標識IL−1のいずれも、反
応時に存在するそれらの相対量に比例して、IL−1抗
体と特異的に結合することが可能である。反応によって
結合した成分と、結合していない成分とを分離した後、
結合成分あるいは非結合成分中の、あるいは双方に存在
する標識によって生成される検出可能なシグナルの水準
を測定する。上記アッセイの複合体成分によって生成さ
れるシグナル水準は、測定される試料中に存在するIL
−1量に反比例する。
本発明のさらに異なる局面では、本発明のアッセイ法を
行うための診断用キットを含む。上記キットは、IL−
1分子上に存在する単独の抗1皇部位に対して誘導され
た、抗体を含む。−り記キットは、例えば、標識と本発
明の新しい抗IL−1抗体分子との複合体、あるいは、
標識と、新しい抗IL−1抗体分子に対する特異的結合
物質との複合体からなる、シグナル生成系をさらにSむ
。
行うための診断用キットを含む。上記キットは、IL−
1分子上に存在する単独の抗1皇部位に対して誘導され
た、抗体を含む。−り記キットは、例えば、標識と本発
明の新しい抗IL−1抗体分子との複合体、あるいは、
標識と、新しい抗IL−1抗体分子に対する特異的結合
物質との複合体からなる、シグナル生成系をさらにSむ
。
−ト記標識は、蛍光団、発色団、放射性同位体、色素生
成酵素、および、常磁性金属を含む。特異的結合分子は
、抗IL−1抗体分子に対して反応性のポリクローナル
、あるいは、モノクローナル抗体、あるいは、抗体分子
自体に不可逆的に結合可能なあらゆる分子を含む。
成酵素、および、常磁性金属を含む。特異的結合分子は
、抗IL−1抗体分子に対して反応性のポリクローナル
、あるいは、モノクローナル抗体、あるいは、抗体分子
自体に不可逆的に結合可能なあらゆる分子を含む。
本発明によれば、IL−1分子上の独立の抗原決定部位
に対する一つ以上の特異的抗体を用いて体液中のIL−
1水準を測定することにより、疾患による炎症の存在を
検出することが出来る。上記抗原部位は、IL−1分子
に特異的であり、従って、他の分子あるいは細胞から、
IL−1を区別する。“炎症”という語は、傷害、ある
いは、物理的、化学的、あるいは生物学的作用物質によ
って引き起こされる異常刺激に対して、動物体の患部血
管および隣接器官で生じる、細胞学的および組織学的反
応を言う。上記反応は、局部的なものであり、形態学的
変化、有害物質の破壊あるいは除去、および、患部組織
の治療、回復の原因となる。しかしながら、慢性的な炎
症は、持続性感染あるいは病状の進行に、しばしば関係
している。
に対する一つ以上の特異的抗体を用いて体液中のIL−
1水準を測定することにより、疾患による炎症の存在を
検出することが出来る。上記抗原部位は、IL−1分子
に特異的であり、従って、他の分子あるいは細胞から、
IL−1を区別する。“炎症”という語は、傷害、ある
いは、物理的、化学的、あるいは生物学的作用物質によ
って引き起こされる異常刺激に対して、動物体の患部血
管および隣接器官で生じる、細胞学的および組織学的反
応を言う。上記反応は、局部的なものであり、形態学的
変化、有害物質の破壊あるいは除去、および、患部組織
の治療、回復の原因となる。しかしながら、慢性的な炎
症は、持続性感染あるいは病状の進行に、しばしば関係
している。
本発明の炎症検出法では、液体試料を、IL−1に特異
的に反応する新しい抗体と接触もしくは反応させ、次に
、試料と抗体間の反応性のG無を、望ましくは、イムノ
アッセイ法によって確定する。使用可能な多様なイムノ
アッセイ法のうち、IL−1と新しい抗体との反応性は
、例えば、蛍光法、放射性同位体法、あるいは、酵素法
によって、IL−1抗体複合体の形成を#Ilす定する
ことにより、決定する。上記複合体が形成される程度は
、試料中に存在するIL−1水準の指標となり、従って
、疾患による炎症の状態および程度を示すものである。
的に反応する新しい抗体と接触もしくは反応させ、次に
、試料と抗体間の反応性のG無を、望ましくは、イムノ
アッセイ法によって確定する。使用可能な多様なイムノ
アッセイ法のうち、IL−1と新しい抗体との反応性は
、例えば、蛍光法、放射性同位体法、あるいは、酵素法
によって、IL−1抗体複合体の形成を#Ilす定する
ことにより、決定する。上記複合体が形成される程度は
、試料中に存在するIL−1水準の指標となり、従って
、疾患による炎症の状態および程度を示すものである。
抗 体
本発明においては、体液試料中のIL−1の存在を検出
するアッセイに使用するために、IL−1に対する新し
い抗体を単離した。また、検出可能なマーカーで標識し
た抗体は、IL−1と結合した抗IL−1抗体を同定す
るために使用した。
するアッセイに使用するために、IL−1に対する新し
い抗体を単離した。また、検出可能なマーカーで標識し
た抗体は、IL−1と結合した抗IL−1抗体を同定す
るために使用した。
本発明の抗IL−1アッセイに使用する抗体の望ましい
型は、モノクローナル抗体であるが、ポリクローナル抗
体も、上記目的のために、また、抗IL−1抗体に対す
る標識第二抗体としても使用可能である。ポリクローナ
ル抗体は、IL−1αおよびIL−1βに対して、IL
−1の対応する種の生成した天然IL−1および(ある
いは)組換えIL−1でウサギやモルモットのような動
物を免疫することにより作成した。局所的炎症の誘導に
より抗体産生を促進するために、注射するIL−1は、
完全あるいは不完全フロイント捕助i?II(1″rc
und’s adjuvant)の様な補助剤と混合す
るのがよい。rL−1に対する抗体のin vlvoで
の産生を誘導するために、−回以上の免疫を、定量的に
、様々な量で行うことが望ましい。また、fL−1の全
量を動物体の特定部分に一度に注入するよりも、谷々の
場合に、動物体の異なる部位に、複数の注入を皮下的お
よび(あるいは)皮肉的に行うことが望ましい。潜伏期
間中に、動物体の採血をし、血清試料の抗IL−1反応
を、酵素結合性免疫溶剤アッセイ(enzyme−1i
nkcdlwIIunoabsorbent assa
y、 ’CLISA ’ )などの適当なアッセイ法
により検査する。エングバル(Cngvall)および
パールマン(Pcrlgan)、l5sunoehes
8 : 871−874 (1971)。血清力価が
、rL−1に対して十分に高い反応性を示した場合は、
動物体の採血を行い、血清を直接ポリクローナル抗体源
として使用する。もしくは、Aタンパク質アフィニティ
クロマトグラフィーあるいは、IL−1あるいはIL−
1ペプチドを固定したカラムを用いたアフィニティ精製
等の標顯的方法で、抗体を血清から精製することが出来
る。精製されたイムノグロブリン(IgG)画分は、あ
るいは、本発明のアッセイ法のための抗体源として使用
可能である。前述のように、IL−1に対するモノクロ
ーナル抗体は、体液中のIL−1のアッセイに特にG用
である。
型は、モノクローナル抗体であるが、ポリクローナル抗
体も、上記目的のために、また、抗IL−1抗体に対す
る標識第二抗体としても使用可能である。ポリクローナ
ル抗体は、IL−1αおよびIL−1βに対して、IL
−1の対応する種の生成した天然IL−1および(ある
いは)組換えIL−1でウサギやモルモットのような動
物を免疫することにより作成した。局所的炎症の誘導に
より抗体産生を促進するために、注射するIL−1は、
完全あるいは不完全フロイント捕助i?II(1″rc
und’s adjuvant)の様な補助剤と混合す
るのがよい。rL−1に対する抗体のin vlvoで
の産生を誘導するために、−回以上の免疫を、定量的に
、様々な量で行うことが望ましい。また、fL−1の全
量を動物体の特定部分に一度に注入するよりも、谷々の
場合に、動物体の異なる部位に、複数の注入を皮下的お
よび(あるいは)皮肉的に行うことが望ましい。潜伏期
間中に、動物体の採血をし、血清試料の抗IL−1反応
を、酵素結合性免疫溶剤アッセイ(enzyme−1i
nkcdlwIIunoabsorbent assa
y、 ’CLISA ’ )などの適当なアッセイ法
により検査する。エングバル(Cngvall)および
パールマン(Pcrlgan)、l5sunoehes
8 : 871−874 (1971)。血清力価が
、rL−1に対して十分に高い反応性を示した場合は、
動物体の採血を行い、血清を直接ポリクローナル抗体源
として使用する。もしくは、Aタンパク質アフィニティ
クロマトグラフィーあるいは、IL−1あるいはIL−
1ペプチドを固定したカラムを用いたアフィニティ精製
等の標顯的方法で、抗体を血清から精製することが出来
る。精製されたイムノグロブリン(IgG)画分は、あ
るいは、本発明のアッセイ法のための抗体源として使用
可能である。前述のように、IL−1に対するモノクロ
ーナル抗体は、体液中のIL−1のアッセイに特にG用
である。
抗IL−1モノクローナル抗体は、IL−1分子上の単
一の抗原決定基と反応し、無制限に生産可能であり、そ
のため、ポリクローナル抗体の異種反応性や個別の特異
性の問題を除去することが出来る点で、ポリクローナル
抗体よりも有用である。しかしながら、IL−1に対す
るモノクローナル抗体を単離することは、研究者にとっ
て、困難であった。その理由の一つは、IL−1水準の
上昇は、マウスに対して′G害なことである。従って、
IL−1に対する抗体を産生させるためにマウスに導入
するIL−1ffiは、低水準に抑えなければならず、
そのため、IL−1に対する抗体を産生ずる可能性を減
少させる。さらに、rL−1は著しく発熱性であるため
、IL−1がマウスに全身的に侵入すると、しばしば高
熱を引き起こし、そのため、動物体が免疫抑制となり、
それによって、体液性抗体媒介免疫応答を増大させる可
能性を低減させる。それにも関わらず、出願人らは、I
L−1の二つの種、IL−1αおよびIL−1βの双方
に対する多数の新しいモノクローナル抗体を生成するこ
とが出来た。
一の抗原決定基と反応し、無制限に生産可能であり、そ
のため、ポリクローナル抗体の異種反応性や個別の特異
性の問題を除去することが出来る点で、ポリクローナル
抗体よりも有用である。しかしながら、IL−1に対す
るモノクローナル抗体を単離することは、研究者にとっ
て、困難であった。その理由の一つは、IL−1水準の
上昇は、マウスに対して′G害なことである。従って、
IL−1に対する抗体を産生させるためにマウスに導入
するIL−1ffiは、低水準に抑えなければならず、
そのため、IL−1に対する抗体を産生ずる可能性を減
少させる。さらに、rL−1は著しく発熱性であるため
、IL−1がマウスに全身的に侵入すると、しばしば高
熱を引き起こし、そのため、動物体が免疫抑制となり、
それによって、体液性抗体媒介免疫応答を増大させる可
能性を低減させる。それにも関わらず、出願人らは、I
L−1の二つの種、IL−1αおよびIL−1βの双方
に対する多数の新しいモノクローナル抗体を生成するこ
とが出来た。
本発明の新しい抗IL−1モノクローナル抗体を産生ず
るための実施例においては、生成した天然のrL−1お
よび組換えIL−1の双方をマウスのような動物体を免
疫するのに使用した。数回の免疫感作を定期的な間隔を
置いて行うことが望ましい。ポリクローナル抗体を調製
する方法と同様に、モノクローナル抗体産生を促進する
ために、注射に先立ち、IL−1を70インド補助剤な
どの、補助剤で乳化することが望ましい。また、谷々の
場合に、動物体に複数の注射を行うことが望ましい。免
疫感作間間中に、以下に詳述する、ELISAなどの方
法で、動物体の血清試料の抗IL−1応答を測定する。
るための実施例においては、生成した天然のrL−1お
よび組換えIL−1の双方をマウスのような動物体を免
疫するのに使用した。数回の免疫感作を定期的な間隔を
置いて行うことが望ましい。ポリクローナル抗体を調製
する方法と同様に、モノクローナル抗体産生を促進する
ために、注射に先立ち、IL−1を70インド補助剤な
どの、補助剤で乳化することが望ましい。また、谷々の
場合に、動物体に複数の注射を行うことが望ましい。免
疫感作間間中に、以下に詳述する、ELISAなどの方
法で、動物体の血清試料の抗IL−1応答を測定する。
陽性を示した動物体から、肺臓を回収する。肺臓細胞由
来の単一細胞懸濁液は、抗体産生細胞数を増やすために
、多数の添加物を加えた組織培養培地中で培養する。
来の単一細胞懸濁液は、抗体産生細胞数を増やすために
、多数の添加物を加えた組織培養培地中で培養する。
IL−1と反応性の免疫グロブリン分子の基本的な塩基
配列をコードする染色体を有する肺臓細胞は、マウスあ
るいはヒトなどに出来する、骨髄腫細胞あるいはリンフ
オーマ(lymphoIIa)細胞と融合させることに
より不死化し、ハイブリドーマを形成させる。融合過程
を促進するために、多数の融合試薬が使用される。上記
融合試薬には、ポリエチレングリコール(”PEG”)
1500などの、異なる型のエチレン酸化物縮合重合
体水溶itMを含む。池の使用可能な融合試薬としては
、センダイウィルスなどの、形質転換されたデオキシリ
ボヌクレオチド(”DNA“)ウィルスや、それから得
られた融合タンパク質を含む。最適条件で融合を行うた
めには、融合試薬の量および濃度を凋節しなければなら
ない。例えば、I)EG 1500を使用する場合には
、同試薬は、およそ40%(wt/voN )含まれる
べきである。しかし、PEG 1500の体積は、06
5から3ミリリットル(ml)の範囲にあり、[’lE
G 1500の濃度は、培地の35%から60%(wt
/voJ2 )の範囲であればよい。
配列をコードする染色体を有する肺臓細胞は、マウスあ
るいはヒトなどに出来する、骨髄腫細胞あるいはリンフ
オーマ(lymphoIIa)細胞と融合させることに
より不死化し、ハイブリドーマを形成させる。融合過程
を促進するために、多数の融合試薬が使用される。上記
融合試薬には、ポリエチレングリコール(”PEG”)
1500などの、異なる型のエチレン酸化物縮合重合
体水溶itMを含む。池の使用可能な融合試薬としては
、センダイウィルスなどの、形質転換されたデオキシリ
ボヌクレオチド(”DNA“)ウィルスや、それから得
られた融合タンパク質を含む。最適条件で融合を行うた
めには、融合試薬の量および濃度を凋節しなければなら
ない。例えば、I)EG 1500を使用する場合には
、同試薬は、およそ40%(wt/voN )含まれる
べきである。しかし、PEG 1500の体積は、06
5から3ミリリットル(ml)の範囲にあり、[’lE
G 1500の濃度は、培地の35%から60%(wt
/voJ2 )の範囲であればよい。
融合したハイブリドーマを含む、得られた細胞は、多数
の添加物、および、選択された抑制試薬を含む組織培養
培地で増殖させ、融合していない骨髄肝細胞、二重骨髄
腫ハイブリッド、融合していない肝臓細胞、および、二
重肝臓細胞ノ\イブリッドの増殖を不可能にし、それに
よって、抗IL−1抗体を産生ずるモノクローナル細胞
を遊離させる。上記インヒビターあるいは抑制物質とし
ては、ヒポキサンチン、アミノプテリン、及び、チミジ
ン(以降、まとめて“HAT”と呼ぶ)を含む。本方式
によって生成されたハイブリドーマ細胞は、ELISA
アッセイなどで、抗IL−1抗体応答に関してスクリー
ニングを行う。陽性を示したハイブリッド細胞を回収し
、米国特許第4.411,933号に詳述され、ここに
参考として含める、制限希釈法によってクローン化及び
サブクローン化する。制限希IR法では、抗IL−1抗
体産生ハイブリッド細胞を個々に、HA Tを含む培地
中でin VitrOで培養する。ハイブリッド♀(1
胞か増殖したクローニング培ri:液は、IL−1に対
する反応性でスクリーニングを行う。陽性を示すクロー
ン化されたハイブリドーマを回収し、次に、大量産生の
ために、より大きな体積で、in VitrOで培養す
る。もしくは、クローン化された/’%イブリドーマ細
胞を、適当なは乳動物宿主の腹腔に注射し、その後、高
濃度の抗IL−1抗体を含む腹腔的腹水を回収すること
により、in vivoで抗IL−1抗体を増やすこと
も可能である。腹水中に含まれる抗体は、硫酸アンモニ
ウム沈澱分画に続いて、ゲルカラムクロマトグラフィー
を行うなどの、既知の方法により、単離、濃縮すること
が出来る。必要であれば、−1−記抗体は、イオン交換
クロマトグラフィー、および(或は)、スタフィロコッ
カス・アウレウス(5taphy Ioeoccusa
urcus)由来のAタンパク質に結合する、抗体の性
質を利用したアフィニティクロマトグラフィー、および
(あるいは)、IL−1あるいはIL−1ペプチドを固
定したカラムでのアフイニテイクロマトグラフィーによ
ってさらに精製が可能である。
の添加物、および、選択された抑制試薬を含む組織培養
培地で増殖させ、融合していない骨髄肝細胞、二重骨髄
腫ハイブリッド、融合していない肝臓細胞、および、二
重肝臓細胞ノ\イブリッドの増殖を不可能にし、それに
よって、抗IL−1抗体を産生ずるモノクローナル細胞
を遊離させる。上記インヒビターあるいは抑制物質とし
ては、ヒポキサンチン、アミノプテリン、及び、チミジ
ン(以降、まとめて“HAT”と呼ぶ)を含む。本方式
によって生成されたハイブリドーマ細胞は、ELISA
アッセイなどで、抗IL−1抗体応答に関してスクリー
ニングを行う。陽性を示したハイブリッド細胞を回収し
、米国特許第4.411,933号に詳述され、ここに
参考として含める、制限希釈法によってクローン化及び
サブクローン化する。制限希IR法では、抗IL−1抗
体産生ハイブリッド細胞を個々に、HA Tを含む培地
中でin VitrOで培養する。ハイブリッド♀(1
胞か増殖したクローニング培ri:液は、IL−1に対
する反応性でスクリーニングを行う。陽性を示すクロー
ン化されたハイブリドーマを回収し、次に、大量産生の
ために、より大きな体積で、in VitrOで培養す
る。もしくは、クローン化された/’%イブリドーマ細
胞を、適当なは乳動物宿主の腹腔に注射し、その後、高
濃度の抗IL−1抗体を含む腹腔的腹水を回収すること
により、in vivoで抗IL−1抗体を増やすこと
も可能である。腹水中に含まれる抗体は、硫酸アンモニ
ウム沈澱分画に続いて、ゲルカラムクロマトグラフィー
を行うなどの、既知の方法により、単離、濃縮すること
が出来る。必要であれば、−1−記抗体は、イオン交換
クロマトグラフィー、および(或は)、スタフィロコッ
カス・アウレウス(5taphy Ioeoccusa
urcus)由来のAタンパク質に結合する、抗体の性
質を利用したアフィニティクロマトグラフィー、および
(あるいは)、IL−1あるいはIL−1ペプチドを固
定したカラムでのアフイニテイクロマトグラフィーによ
ってさらに精製が可能である。
−1−記方法により、本発明のイムノアッセイ法で前動
な新しいモノクローナル抗体が単離される。
な新しいモノクローナル抗体が単離される。
これらの独立なモノクローナル抗体には二つの型があり
、第一の型は、IL−1αと特異的に反応12、第二の
型は、IL−1βと特異的に反応する。
、第一の型は、IL−1αと特異的に反応12、第二の
型は、IL−1βと特異的に反応する。
出願人らが単離した、IL−1αと特異的に反応する新
しいモノクローナル抗体の一つを、15A4と命名した
。15A4モノクロ一ナル抗体は、オフタロ二−免疫拡
散法(Ouchterlony immunodil’
l’usion)や、免疫電気泳動等の標準的方法によ
り、分類、解析が可能である。15A4モノクロ一ナル
抗体は、IgG、クラスであり、rL−1αと特異的に
反応し、他のいかなるリンホカイン〔即ち、IL−2、
IL−1β、顆t+7球マクロファージコロニー刺激囚
子(GM−C8F)など〕とも結合せず、沈降反応も起
こさない。
しいモノクローナル抗体の一つを、15A4と命名した
。15A4モノクロ一ナル抗体は、オフタロ二−免疫拡
散法(Ouchterlony immunodil’
l’usion)や、免疫電気泳動等の標準的方法によ
り、分類、解析が可能である。15A4モノクロ一ナル
抗体は、IgG、クラスであり、rL−1αと特異的に
反応し、他のいかなるリンホカイン〔即ち、IL−2、
IL−1β、顆t+7球マクロファージコロニー刺激囚
子(GM−C8F)など〕とも結合せず、沈降反応も起
こさない。
出願人らが単離した、IL−1βに特異的に反応する新
しいモノクローナル抗体の一つを、7[34と命名した
。7B4モノクロ一ナル抗体も、オフタロ二−免疫拡散
法や、免疫電気泳動等の標準的方法の使用により、分類
、解析を行うことが出来る。
しいモノクローナル抗体の一つを、7[34と命名した
。7B4モノクロ一ナル抗体も、オフタロ二−免疫拡散
法や、免疫電気泳動等の標準的方法の使用により、分類
、解析を行うことが出来る。
7B4抗体は、IgG1クラスであり、IL−1βと特
異的に反応し、池のいかなるリンホカイン(即ち、IL
−2、IL−1α、GM−C3Fなど)とも結合せず、
沈降反応も起こさない。
異的に反応し、池のいかなるリンホカイン(即ち、IL
−2、IL−1α、GM−C3Fなど)とも結合せず、
沈降反応も起こさない。
本発明の新しい抗体の特定の例は、IgG抗体からなる
が、これは制限を与えるものではない。
が、これは制限を与えるものではない。
上記抗体および同等の機能を−1するものは、マウス、
ヒI・を含むは乳類、あるいは池の動物、あるいは、そ
れらの他の組合せから得ることか出来る。
ヒI・を含むは乳類、あるいは池の動物、あるいは、そ
れらの他の組合せから得ることか出来る。
また、抗体は、IgG以外のクラス、例えば、アイソタ
イプを含む、IgM、IgA、IgEも可能である。上
記の同定されたモノクローナル抗体と同等の機能を示す
、F (ab) 2フラグメントからなるもののような
、ハイブリッド抗体もまた、本発明の範囲に含まれる。
イプを含む、IgM、IgA、IgEも可能である。上
記の同定されたモノクローナル抗体と同等の機能を示す
、F (ab) 2フラグメントからなるもののような
、ハイブリッド抗体もまた、本発明の範囲に含まれる。
“機能的に同等”という語は、IL−1分子に特異的に
結合でき、−に記分子に結合する際に、他の抗体や、機
能的同等物質と競合できるような、抗体、アイソタイプ
、抗体フラグメント、抗体ハイブリッド、及び、タンパ
ク質産物をSむ。言い替えれば、機能的同等物質は、I
L−1やそのフラグメントを含む試料と混合した場合に
、IL−1あるいはそのフラグメントに結合し、他の抗
体あるいは機能的同等物質が、IL−1に結合すること
を妨げるものである。
結合でき、−に記分子に結合する際に、他の抗体や、機
能的同等物質と競合できるような、抗体、アイソタイプ
、抗体フラグメント、抗体ハイブリッド、及び、タンパ
ク質産物をSむ。言い替えれば、機能的同等物質は、I
L−1やそのフラグメントを含む試料と混合した場合に
、IL−1あるいはそのフラグメントに結合し、他の抗
体あるいは機能的同等物質が、IL−1に結合すること
を妨げるものである。
抗IL−1抗体を生成するのに使用するIL−1は、天
然のもの、及び、組換え体のいずれも可能である。天然
IL−1は、ρ11えば、クロンハイム(Kronhc
im)他、J、 IExp、 Mad、、前述、に示さ
れ、ここに参考として含める方法によって、産生じ、精
製する。前述のように、出願人らと共同研究者らは、I
L−1αおよびIL〜1βと呼ばれる、IL−1の二つ
の種を既に同定している。組換えIL−1αおよびIL
−1βの産生法は、マーチ(March)他、Natu
re、前座、に示されている。
然のもの、及び、組換え体のいずれも可能である。天然
IL−1は、ρ11えば、クロンハイム(Kronhc
im)他、J、 IExp、 Mad、、前述、に示さ
れ、ここに参考として含める方法によって、産生じ、精
製する。前述のように、出願人らと共同研究者らは、I
L−1αおよびIL〜1βと呼ばれる、IL−1の二つ
の種を既に同定している。組換えIL−1αおよびIL
−1βの産生法は、マーチ(March)他、Natu
re、前座、に示されている。
天然あるいは組換えIL−1分子全体で、動物体を免疫
感作するのではなく、同分子の一部からなるペプチドを
使用することも可能である。」−記ペブチドの使用は、
IL−1分子上の特定の抗原決定部位に対して誘導され
るモノクローナル抗体の生成を促進しうる。
感作するのではなく、同分子の一部からなるペプチドを
使用することも可能である。」−記ペブチドの使用は、
IL−1分子上の特定の抗原決定部位に対して誘導され
るモノクローナル抗体の生成を促進しうる。
アッセイ法実施例
本発明の新しい抗IL−1抗体を一種類以上使用して、
体液中に物理的に存在するIL−1水準を7111定す
るために、多様なイムノアッセイ法を用いることが出来
る。以下に示すのは、上記イムノアッセイ法の、実施例
であるが、制限的なものではない。第一の、“直接”法
は、IL−1を^むと思われる液体試料を、検出可能な
マーカーあるいは標識とIL−1分子上の抗原部位に特
異的な本発明の新しい抗体との混合物と反応させ、抗原
(IL−1) −抗体複合体を形成させるものである
。試料中に含まれるIL−1量は、以下により詳しく述
べるように、使用した標識の種類に応じた標準的なシグ
ナル検出法により、IL−1に対する抗体の反応性の程
度を測定することにより決定できる。一般的には、IL
−1−抗体複合体を、結合していないアッセイ成分と分
離し、複合体を定性的及び(あるいは)定量的に分析す
る。
体液中に物理的に存在するIL−1水準を7111定す
るために、多様なイムノアッセイ法を用いることが出来
る。以下に示すのは、上記イムノアッセイ法の、実施例
であるが、制限的なものではない。第一の、“直接”法
は、IL−1を^むと思われる液体試料を、検出可能な
マーカーあるいは標識とIL−1分子上の抗原部位に特
異的な本発明の新しい抗体との混合物と反応させ、抗原
(IL−1) −抗体複合体を形成させるものである
。試料中に含まれるIL−1量は、以下により詳しく述
べるように、使用した標識の種類に応じた標準的なシグ
ナル検出法により、IL−1に対する抗体の反応性の程
度を測定することにより決定できる。一般的には、IL
−1−抗体複合体を、結合していないアッセイ成分と分
離し、複合体を定性的及び(あるいは)定量的に分析す
る。
第一の直接アッセイ法の応用として、マーカーを直接抗
IL−1抗体に結合させる代わりに、マーカーを新しい
抗IL−1抗体の適当な特異的結合分子に結合させるこ
とも可能である。結合分子は、抗IL−1抗体、あるい
は、抗IL−1抗体に特異的な抗イムノグロブリン上の
単独の抗原決定部位に対して誘導したモノクローナルあ
るいはポリクローナル抗体がよい。本アッセイ法では、
第二抗体は、より標識に結合しやすいものが−a効であ
る。また、第二抗体の使用により、マーカーの抗IL−
1抗体に対する結合が抗IL−1抗体の親和性に悪影響
を及ぼす可能性が除かれる。さらに、第二抗体はポリク
ローナル的でよく、一般的にモノクローナル抗体よりも
精製が簡単である。
IL−1抗体に結合させる代わりに、マーカーを新しい
抗IL−1抗体の適当な特異的結合分子に結合させるこ
とも可能である。結合分子は、抗IL−1抗体、あるい
は、抗IL−1抗体に特異的な抗イムノグロブリン上の
単独の抗原決定部位に対して誘導したモノクローナルあ
るいはポリクローナル抗体がよい。本アッセイ法では、
第二抗体は、より標識に結合しやすいものが−a効であ
る。また、第二抗体の使用により、マーカーの抗IL−
1抗体に対する結合が抗IL−1抗体の親和性に悪影響
を及ぼす可能性が除かれる。さらに、第二抗体はポリク
ローナル的でよく、一般的にモノクローナル抗体よりも
精製が簡単である。
さらに、抗IL−1抗体に対して誘導された第二抗体を
使用することにより、より大きな複合体ができ、アッセ
イの非結合成分からより容易に分離できる。
使用することにより、より大きな複合体ができ、アッセ
イの非結合成分からより容易に分離できる。
液体試料中のIL−1の存在および量は、また、“競合
的“イムノアッセイによっても分析可能である。この型
のアッセイでは、既知量の本発明の新しい抗IL−1抗
体と、既知量の標識したIL−1とを、アッセイする試
料と共にインキュベートする。抗体は、標識IL−1と
非標識IL−1とを区別しないので、その相対量に比例
して、標識IL−1および非標識II、−1に結合する
。その後、本アッセイの結合成分、即ち、IL−1−抗
体および標識IL−1−抗体複合体を、遊離成分あるい
は非反応成分から分離し、以下に示す標準的方法によっ
て結合量を測定する。
的“イムノアッセイによっても分析可能である。この型
のアッセイでは、既知量の本発明の新しい抗IL−1抗
体と、既知量の標識したIL−1とを、アッセイする試
料と共にインキュベートする。抗体は、標識IL−1と
非標識IL−1とを区別しないので、その相対量に比例
して、標識IL−1および非標識II、−1に結合する
。その後、本アッセイの結合成分、即ち、IL−1−抗
体および標識IL−1−抗体複合体を、遊離成分あるい
は非反応成分から分離し、以下に示す標準的方法によっ
て結合量を測定する。
この型の競合的アッセイ系では、抗IL−1抗体の特異
的濃度を用いる。IL−1抗体の希釈は、抗体が標識抗
原のおよそ50%に結合するように選択することが望ま
しい。その結果、上記成分の、結合−遊離比が、およそ
1:1となる。しかしながら、本発明の範囲および本質
を離れることなく、他の抗IL−1抗体希釈法を選択し
得ることは、理解されるべきである。
的濃度を用いる。IL−1抗体の希釈は、抗体が標識抗
原のおよそ50%に結合するように選択することが望ま
しい。その結果、上記成分の、結合−遊離比が、およそ
1:1となる。しかしながら、本発明の範囲および本質
を離れることなく、他の抗IL−1抗体希釈法を選択し
得ることは、理解されるべきである。
」二足の競合的アッセイでは、任意の試料のアッセイに
先立ち、様々な量の非標識IL−1を固定量の標識IL
−1および固定量の新しい抗IL−1抗体と共にインキ
ュベ−1・する。次に、標識IL−1が抗IL−1抗体
と結合する程度を、各既知量の非標識IL−1を含む試
料について測定する。上記δ1り定の結果から、ある量
の非標識IL−1存在下での標識IL−1とその抗体と
の結合程度を示す、標準曲線を描くことが出来る。
先立ち、様々な量の非標識IL−1を固定量の標識IL
−1および固定量の新しい抗IL−1抗体と共にインキ
ュベ−1・する。次に、標識IL−1が抗IL−1抗体
と結合する程度を、各既知量の非標識IL−1を含む試
料について測定する。上記δ1り定の結果から、ある量
の非標識IL−1存在下での標識IL−1とその抗体と
の結合程度を示す、標準曲線を描くことが出来る。
次に、未知量の非標識IL−1を含む任意の試料をアッ
セイする場合には、試料中の非標識IL−1濃度は、標
識IL−1が抗IL−1抗体に結合する程度を測定した
標準曲線から決定する。
セイする場合には、試料中の非標識IL−1濃度は、標
識IL−1が抗IL−1抗体に結合する程度を測定した
標準曲線から決定する。
本発明は、また、体液中のIL−1水準を測定する“二
重決定“イムノアッセイに、出願人らが単離した新しい
抗体を用いることをも意図する。
重決定“イムノアッセイに、出願人らが単離した新しい
抗体を用いることをも意図する。
この型のアッセイでは、IL−1分子上の単独の認識部
位に反応性の新しい第一抗体を、試験を行う試料と接触
させる。IL−1が試料中に存在していれば、IL−1
は第一抗体分子に特異的に結合する。非結合IL−1を
、例えば洗浄などて、結合IL−1から分離した後、第
一抗体IL−1複合体を、“トラップされた″ IL−
1分子の別の認識部位と反応性の第二抗体と接触させ、
第二抗体を用量依存的に結合IL−1と結合させる。
位に反応性の新しい第一抗体を、試験を行う試料と接触
させる。IL−1が試料中に存在していれば、IL−1
は第一抗体分子に特異的に結合する。非結合IL−1を
、例えば洗浄などて、結合IL−1から分離した後、第
一抗体IL−1複合体を、“トラップされた″ IL−
1分子の別の認識部位と反応性の第二抗体と接触させ、
第二抗体を用量依存的に結合IL−1と結合させる。
二重決定アッセイでは、二種類の抗IL−1抗体が、I
L−1分子」二の関連のないエピトープに結合し、それ
によって、IL−1分子に二つの抗体が結合することに
よる立体構造的影響が防止されることが重要であること
は、理解されるであろう。
L−1分子」二の関連のないエピトープに結合し、それ
によって、IL−1分子に二つの抗体が結合することに
よる立体構造的影響が防止されることが重要であること
は、理解されるであろう。
第二抗体は、以下により詳しく述べるように、標準的方
法によって、第二抗体のIL−1に対する結合の程度を
測定できるように標識を施してよい。第二抗体を直接標
識するよりも、マーカーに結合した、第二抗体への結合
分子を使用してもよい。結合分子は、第二抗体に特異的
な二次抗体が使用できる。前述のように、抗IL−1抗
体の標識の必要性を避けることにより、標識が抗体の親
和性を変化させる可能性を排除する。さらに、二次抗体
として使用する抗体は、標識の容易さ、結合抗体の生成
の能率、および、非結合抗体からの結合抗体の分離の容
易さなどの望ましい性質に基づいて選択する。二重決定
アッセイにおいては、′I L −1分子を“トラップ
“するのに新しい第一抗体を用い、次に、同分子を検出
するために新しい第二抗体を使用し、非常に感度の高い
イムノアッセイとなることが理解されるであろう。
法によって、第二抗体のIL−1に対する結合の程度を
測定できるように標識を施してよい。第二抗体を直接標
識するよりも、マーカーに結合した、第二抗体への結合
分子を使用してもよい。結合分子は、第二抗体に特異的
な二次抗体が使用できる。前述のように、抗IL−1抗
体の標識の必要性を避けることにより、標識が抗体の親
和性を変化させる可能性を排除する。さらに、二次抗体
として使用する抗体は、標識の容易さ、結合抗体の生成
の能率、および、非結合抗体からの結合抗体の分離の容
易さなどの望ましい性質に基づいて選択する。二重決定
アッセイにおいては、′I L −1分子を“トラップ
“するのに新しい第一抗体を用い、次に、同分子を検出
するために新しい第二抗体を使用し、非常に感度の高い
イムノアッセイとなることが理解されるであろう。
上記のように、様々な型のイムノアッセイを述べたが、
他の型のイムノアッセイと同様に、上記アッセイの多く
の応用も使用できることは理解されるであろう。例えば
、標識IL−1あるいは非標識IL−1は、抗体が反応
できる適当に標識したIL−1特異的ペプチドと置き換
えることが出来る。
他の型のイムノアッセイと同様に、上記アッセイの多く
の応用も使用できることは理解されるであろう。例えば
、標識IL−1あるいは非標識IL−1は、抗体が反応
できる適当に標識したIL−1特異的ペプチドと置き換
えることが出来る。
本発明では、上記イムノアッセイに際して、多様な型の
不溶性分離基質あるいは支持体を使用することが予測さ
れる。例えば、競合的アッセイでは、抗IL−1抗体は
、共有結合的あるいは非共有結合的に、適当な支持体に
結合させる。二重決定アッセイで用いる抗IL−1抗体
も同様である。
不溶性分離基質あるいは支持体を使用することが予測さ
れる。例えば、競合的アッセイでは、抗IL−1抗体は
、共有結合的あるいは非共有結合的に、適当な支持体に
結合させる。二重決定アッセイで用いる抗IL−1抗体
も同様である。
支持体は、プラスチックあるいはガラスの微量タイター
プレートウェル、あるいは、アッセイが行える他の反応
容器を含む。もしくは、支持体は、IL−1を含む液体
試料中に浸すか、置くことの出来る、プラスチック、セ
ルロース、あるいはグラスファイバーの円盤、板、小片
状の形態が可能である。プラスチック支持体は、ポリビ
ニル、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、アクリルア
ミド、ポリプロピレン、あるいは、ポリカーボネート等
の、多様な組成が可能である。紙状支持体は、ニトロセ
ルロース、酢酸セルロース、あるいは、ABM紙などが
可能である。また、支持体は、反応容器中に含まれる、
メツシュ状物質や、球状等のビーズのような、様々な形
態の基質も可能である。ビーズを用いる場合は、アガロ
ース、前述のプラスチックの一種、ガラス、セルロース
、デキストラン、あるいは、セファロースなどから作成
することが出来る。本分野では知られているように、抗
体を共U結合的に固体支持体に結合させるために、多様
な活性化物質を使用できる。そのような活性化試薬は、
例えば、ブロモシアンCCNBr ) 、カルポジイミ
ド、グルタルアルデヒド、ポリエチレングリコール、お
よび、タンニン酸等を含む。
プレートウェル、あるいは、アッセイが行える他の反応
容器を含む。もしくは、支持体は、IL−1を含む液体
試料中に浸すか、置くことの出来る、プラスチック、セ
ルロース、あるいはグラスファイバーの円盤、板、小片
状の形態が可能である。プラスチック支持体は、ポリビ
ニル、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、アクリルア
ミド、ポリプロピレン、あるいは、ポリカーボネート等
の、多様な組成が可能である。紙状支持体は、ニトロセ
ルロース、酢酸セルロース、あるいは、ABM紙などが
可能である。また、支持体は、反応容器中に含まれる、
メツシュ状物質や、球状等のビーズのような、様々な形
態の基質も可能である。ビーズを用いる場合は、アガロ
ース、前述のプラスチックの一種、ガラス、セルロース
、デキストラン、あるいは、セファロースなどから作成
することが出来る。本分野では知られているように、抗
体を共U結合的に固体支持体に結合させるために、多様
な活性化物質を使用できる。そのような活性化試薬は、
例えば、ブロモシアンCCNBr ) 、カルポジイミ
ド、グルタルアルデヒド、ポリエチレングリコール、お
よび、タンニン酸等を含む。
本発明のアッセイは、穏やかなpHおよび温度下のil
に体温媒中で行うことが望ましい。溶媒は、水溶性で酊
ればよいが、3%アルブミン(ヒツジ、ウシ、ヒト)を
含む0.1モル(M)トリス緩衝化生理食塩水の様な、
緩衝塩溶液で有ることが望ましい。溶媒のpllは、5
−10の範囲が望ましく、およそ6−9がより望ましく
、約7.2が理想的である。pHは、IL−1と抗体と
の特異的結合は促進するが、抗体に結合したマーカーに
よって生成されるシグナルに対して、あらゆるU意な負
の効果を及ぼさないように選択する。望みのpHを達成
し、維持するためには、アッセイ朋間中に多数の緩衝液
を使用する。適当な緩衝液の例としては、N−2−ヒド
ロキシ−エチルピペラジン−N−2−エタン−スルホン
酸(“HEPES“)、トリス、ホウ酸、リン酸、カル
ボン酸、および、バルビツールなどを含む。
に体温媒中で行うことが望ましい。溶媒は、水溶性で酊
ればよいが、3%アルブミン(ヒツジ、ウシ、ヒト)を
含む0.1モル(M)トリス緩衝化生理食塩水の様な、
緩衝塩溶液で有ることが望ましい。溶媒のpllは、5
−10の範囲が望ましく、およそ6−9がより望ましく
、約7.2が理想的である。pHは、IL−1と抗体と
の特異的結合は促進するが、抗体に結合したマーカーに
よって生成されるシグナルに対して、あらゆるU意な負
の効果を及ぼさないように選択する。望みのpHを達成
し、維持するためには、アッセイ朋間中に多数の緩衝液
を使用する。適当な緩衝液の例としては、N−2−ヒド
ロキシ−エチルピペラジン−N−2−エタン−スルホン
酸(“HEPES“)、トリス、ホウ酸、リン酸、カル
ボン酸、および、バルビツールなどを含む。
前述のように、本アッセイは、−回以」二のインキュベ
ーション過程を含む。例えば、二重決定アッセイ法では
、対象となる試料は、まず、不溶性支持体と結合した第
一抗IL−1抗体とともにインキュベートする。その後
、第二の過程として、第一抗IL−1複合体を第二抗I
L−1抗体とともにインキュベートする。インキュベ−
1・期間の長さ、およびインキュベート温度は、IL−
1の抗体に対する結合速度、および、使用する標識に著
しく依存する。インキュベーション期間は、数分から数
時間にわたり、典型的には5分から24時間である。イ
ンキュベーション温度は、一般的に、およそ16Cから
32℃であり、理想的にはおよそ4℃である。
ーション過程を含む。例えば、二重決定アッセイ法では
、対象となる試料は、まず、不溶性支持体と結合した第
一抗IL−1抗体とともにインキュベートする。その後
、第二の過程として、第一抗IL−1複合体を第二抗I
L−1抗体とともにインキュベートする。インキュベ−
1・期間の長さ、およびインキュベート温度は、IL−
1の抗体に対する結合速度、および、使用する標識に著
しく依存する。インキュベーション期間は、数分から数
時間にわたり、典型的には5分から24時間である。イ
ンキュベーション温度は、一般的に、およそ16Cから
32℃であり、理想的にはおよそ4℃である。
本発明では、抗IL−1抗体自体あるいは、独立した、
抗IL−1抗体に対して誘導された第二抗体は、試料中
のIL−1の存在に関連したシグナルを生成する、検出
可能なマーカーと結合している。検出可能なマーカーは
、本分野で知られているフルオロフォア、染色剤、酵素
、発色剤、補酵素、化学発光物質、酵素阻害剤、ガドリ
ニウムなどの常磁性体、フェリチン、および、放射性核
種から選択することが出来る。使用可能な特定の酵素の
例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホ
スファターゼ、およびB−ガラクトシダーゼなどが含ま
れるが、制限的なものではない。
抗IL−1抗体に対して誘導された第二抗体は、試料中
のIL−1の存在に関連したシグナルを生成する、検出
可能なマーカーと結合している。検出可能なマーカーは
、本分野で知られているフルオロフォア、染色剤、酵素
、発色剤、補酵素、化学発光物質、酵素阻害剤、ガドリ
ニウムなどの常磁性体、フェリチン、および、放射性核
種から選択することが出来る。使用可能な特定の酵素の
例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホ
スファターゼ、およびB−ガラクトシダーゼなどが含ま
れるが、制限的なものではない。
染色剤の、制限的でない例としては、アミノブラック、
およびエオシンが倉まれる。蛍光物質の、制限的でない
例としては、フルオレセイン、イソチオシアネート、ダ
ンシル、ヨウ素プロビジウム(propidium 1
odine>、およびフィコエリトリンのようなフィコ
フォアがAまれる。
およびエオシンが倉まれる。蛍光物質の、制限的でない
例としては、フルオレセイン、イソチオシアネート、ダ
ンシル、ヨウ素プロビジウム(propidium 1
odine>、およびフィコエリトリンのようなフィコ
フォアがAまれる。
検出可能なマーカーとしては、放射性同位体も用いるこ
とが出来る。抗体標識に使用される技術は、用いる放射
性同位体の種類によって異なる。
とが出来る。抗体標識に使用される技術は、用いる放射
性同位体の種類によって異なる。
例えば、標識は、抗体分子のあるぶ子を、対応する放射
性同位体で置換することにより行われる。
性同位体で置換することにより行われる。
具体的な例として、水素原子は、トリチウム(3H)で
置換され;炭素原子は、炭素−14(14C)、ストロ
ンチウム原子は、ストロンチウム−38(38Sr)で
置換される。別の標識法では、抗体の原子を放射性同位
体で置き換えるのではなく、抗体分子に同位体を加える
。通常使用される」1記放射性同位体は、例えば、ヨウ
素−125(125■)、および、鉄−59(59Fc
)をSむ。
置換され;炭素原子は、炭素−14(14C)、ストロ
ンチウム原子は、ストロンチウム−38(38Sr)で
置換される。別の標識法では、抗体の原子を放射性同位
体で置き換えるのではなく、抗体分子に同位体を加える
。通常使用される」1記放射性同位体は、例えば、ヨウ
素−125(125■)、および、鉄−59(59Fc
)をSむ。
使用される各々のマーカーあるいは標識は、使用される
イムノアッセイの個々の種類、および、標識される抗I
L−1抗体あるいは第二抗体の生物学的および生化学的
性質などの、様々な要因に依存することは、理解される
であろう。用いるマーカーの種類が何であろうと、勿論
、標識抗体とその特異的認識部位との間の特異的に顕著
な変化を生じさせるものであってはならない。
イムノアッセイの個々の種類、および、標識される抗I
L−1抗体あるいは第二抗体の生物学的および生化学的
性質などの、様々な要因に依存することは、理解される
であろう。用いるマーカーの種類が何であろうと、勿論
、標識抗体とその特異的認識部位との間の特異的に顕著
な変化を生じさせるものであってはならない。
本発明のアッセイの各々のインキュベーション後、アッ
セイの複合成分、あるいは、結合成分は、一般的に、非
結合成分、非複合IL−1、過剰抗IL−1抗体および
二次抗体から分離する。その方法は、例えば、生理食塩
水のみ、あるいは、遠心分離と組み合わせた、単純な洗
浄を含む。分離は、限外ろ過、透析、あるいは、塩)J
7を含む。他の分離方法としては、クロマトグラフィー
、電気泳動、クロマト電気泳動、およびゲルろ過などの
、生化学的な移動度の差異を基にしたものがある。
セイの複合成分、あるいは、結合成分は、一般的に、非
結合成分、非複合IL−1、過剰抗IL−1抗体および
二次抗体から分離する。その方法は、例えば、生理食塩
水のみ、あるいは、遠心分離と組み合わせた、単純な洗
浄を含む。分離は、限外ろ過、透析、あるいは、塩)J
7を含む。他の分離方法としては、クロマトグラフィー
、電気泳動、クロマト電気泳動、およびゲルろ過などの
、生化学的な移動度の差異を基にしたものがある。
使用される分離方法の個々の型は、用いられる谷々のイ
ムノアッセイ法、および、アッセイ試薬の特性に依存す
る。
ムノアッセイ法、および、アッセイ試薬の特性に依存す
る。
診断用キット
本発明は、また、炎症の存在を検出するための、前述の
IL−1アツセイを行う診断用キットを禽む。キットの
個々の成分は、使用する個々のイムノアッセイ法に対応
する。おそらくもっとも単純な態様においては、上記診
断用キットは、検出可能なシグナルを生成できる適当な
マーカーと結合している、IL−1に対して誘導された
本発明の新しいポリクローナル抗体あるいはモノクロー
ナル抗体を含む。アッセイを行うためには、試料を、抗
体−マーカー複合体と接触させる。その後、複合成分を
、アッセイの遊離成分から分離し、次に、マーカーによ
って生成されたシグナルを検出し、イムノアッセイ反応
の結合成分あるいは】分離成分のいずれかを定量する。
IL−1アツセイを行う診断用キットを禽む。キットの
個々の成分は、使用する個々のイムノアッセイ法に対応
する。おそらくもっとも単純な態様においては、上記診
断用キットは、検出可能なシグナルを生成できる適当な
マーカーと結合している、IL−1に対して誘導された
本発明の新しいポリクローナル抗体あるいはモノクロー
ナル抗体を含む。アッセイを行うためには、試料を、抗
体−マーカー複合体と接触させる。その後、複合成分を
、アッセイの遊離成分から分離し、次に、マーカーによ
って生成されたシグナルを検出し、イムノアッセイ反応
の結合成分あるいは】分離成分のいずれかを定量する。
前述のように、アッセイ成分は、抗体が共G結合的ある
いは非共有結合的に結合した不溶性支持体、イムノアッ
セイ反応の望ましいpHを保つための緩衝液、および流
動体試料を希釈するための結合溶媒を含んでよい。また
、に記キットは、EL I SAの適当な酵素試薬や、
検出可能なシグナルを増感させる試薬のような、シグナ
ルを生成するマーカーに必要とされる試薬も含んでよい
。
いは非共有結合的に結合した不溶性支持体、イムノアッ
セイ反応の望ましいpHを保つための緩衝液、および流
動体試料を希釈するための結合溶媒を含んでよい。また
、に記キットは、EL I SAの適当な酵素試薬や、
検出可能なシグナルを増感させる試薬のような、シグナ
ルを生成するマーカーに必要とされる試薬も含んでよい
。
他の実際的で、しかも、制限的でない例においては、診
断用キットは、IL−1に対する新しいポリクローナル
あるいはモノクローナル抗体、および、抗IL−1抗体
に対する二次抗体を含んでよく、この二次抗体には検出
可能なシグナルを生成できる適当なマーカーが結合して
よい。上記アッセイキットの態様と同様に、本キットの
態様はまた、更に他の成分を含みつる。アッセイを行う
ために、試料を抗IL−1抗体と接触させ、次に、複合
成分を、遊離成分から分離する。その後、複合成分を、
IL−1に結合した抗IL−1抗体と特異的に結合する
標識二次抗体に接触させる。
断用キットは、IL−1に対する新しいポリクローナル
あるいはモノクローナル抗体、および、抗IL−1抗体
に対する二次抗体を含んでよく、この二次抗体には検出
可能なシグナルを生成できる適当なマーカーが結合して
よい。上記アッセイキットの態様と同様に、本キットの
態様はまた、更に他の成分を含みつる。アッセイを行う
ために、試料を抗IL−1抗体と接触させ、次に、複合
成分を、遊離成分から分離する。その後、複合成分を、
IL−1に結合した抗IL−1抗体と特異的に結合する
標識二次抗体に接触させる。
非結合二次抗体をアッセイの複合成分から除いた後、ア
ッセイ反応の結合成分あるいは非結合成分のいずれかの
、標識によって生成されたシグナルを測定する。
ッセイ反応の結合成分あるいは非結合成分のいずれかの
、標識によって生成されたシグナルを測定する。
本発明のさらに例示的な態様として、上記診断用キット
は、前述の二重決定アッセイ法を行うのに必要な成分を
含んでよい。この特定のキットの成分は、IL−1分子
上の別々の決定部位に対する新しい一次抗体および二次
抗体を含む。必須ではないが、第一抗体は、支持物質に
共U結合的あるいは非共有結合的に結合していることが
望ましい。第二抗IL−1抗体は、検出可能なシグナル
を生成できる適当なマーカーに結合しているか、もしく
は、第二抗IL−1抗体に対して誘導された、第三の標
識二次抗体を用いることもできる。
は、前述の二重決定アッセイ法を行うのに必要な成分を
含んでよい。この特定のキットの成分は、IL−1分子
上の別々の決定部位に対する新しい一次抗体および二次
抗体を含む。必須ではないが、第一抗体は、支持物質に
共U結合的あるいは非共有結合的に結合していることが
望ましい。第二抗IL−1抗体は、検出可能なシグナル
を生成できる適当なマーカーに結合しているか、もしく
は、第二抗IL−1抗体に対して誘導された、第三の標
識二次抗体を用いることもできる。
また、前述のように、キットは、アッセイ法を、効果的
にし、あるいは、促進するために、様々な他の成分を含
むこともある。
にし、あるいは、促進するために、様々な他の成分を含
むこともある。
反応性の測定
試料中に存在するIL−1と、それに対する抗体との間
の結合の測定に使用する方法および装置は、用いる検出
可能なマーカーの種類に依存する。
の結合の測定に使用する方法および装置は、用いる検出
可能なマーカーの種類に依存する。
マーカーが、酵素或は染色剤を使用するマーカーの場合
は、アッセイで生成される色は、適当な自動化装置、例
えば、マルチスキャンプレートリーダー(フローラボラ
トリーズ、バージニア州マクリーン)によって、適当な
波長で測定される。蛍光マーカーを用いる場合には、ア
ッセイ成分の反応性は、例えば、FAC3440マイク
ロフルオリネイタ−(ベクトン・ディキンソン、カリフ
ォルニア州パロ・アルド)あるいは、スクリーンマシン
(パンデックス社、イリノイ州マンゾリン)を用いて、
流動微少蛍光測定によって分析する。放射性マーカーを
使用する場合には、ガンマ線を放射する同位体にはガン
マカウンターを、ベータ線を放出する同位体には液体シ
ンチレーションカウンターを用いる。上記カウンターは
、一般的に人手可能である。
は、アッセイで生成される色は、適当な自動化装置、例
えば、マルチスキャンプレートリーダー(フローラボラ
トリーズ、バージニア州マクリーン)によって、適当な
波長で測定される。蛍光マーカーを用いる場合には、ア
ッセイ成分の反応性は、例えば、FAC3440マイク
ロフルオリネイタ−(ベクトン・ディキンソン、カリフ
ォルニア州パロ・アルド)あるいは、スクリーンマシン
(パンデックス社、イリノイ州マンゾリン)を用いて、
流動微少蛍光測定によって分析する。放射性マーカーを
使用する場合には、ガンマ線を放射する同位体にはガン
マカウンターを、ベータ線を放出する同位体には液体シ
ンチレーションカウンターを用いる。上記カウンターは
、一般的に人手可能である。
本発明の方法および産物は、本発明で使用した個々の方
法のアルファベット順に示す実施例によって更に示し、
次に、数字で示した実施例によって示す。以下の実施例
は、本発明を説明し、同様の物を作成し、使用するため
の通常の技術の一つの補助のために示したものである。
法のアルファベット順に示す実施例によって更に示し、
次に、数字で示した実施例によって示す。以下の実施例
は、本発明を説明し、同様の物を作成し、使用するため
の通常の技術の一つの補助のために示したものである。
実施例は、開示の範囲あるいは、本発明の特許による保
護を制限するためのものではない。
護を制限するためのものではない。
[実施例 Aコ
EL I SAアッセイ
前述のように、ポリクローナル抗体、ハイブリドーマ培
養上清、および、モノクローナル抗体が、ELISAア
ッセイの抗IL−1応答に関する試験に用いられる。本
アッセイでは、精製された天然のIL−1あるいは組換
えIL−1を、ウシ血清アルブミンを含む0.1M ト
リス緩衝生理食塩水(T−BSA)1マイクロリツトル
あたり、およそ1ナノグラム(1ng/μg)の濃度に
希釈する。
養上清、および、モノクローナル抗体が、ELISAア
ッセイの抗IL−1応答に関する試験に用いられる。本
アッセイでは、精製された天然のIL−1あるいは組換
えIL−1を、ウシ血清アルブミンを含む0.1M ト
リス緩衝生理食塩水(T−BSA)1マイクロリツトル
あたり、およそ1ナノグラム(1ng/μg)の濃度に
希釈する。
同溶液の約20マイクロリツトル(μg)を多段式連続
ピペットを用いて、200μgニトロセルロースELI
SAプレートの各ウェルに加える。同溶液由来の流動体
は、蒸発させ、それによってIL−1をニトロセルロー
スに非特異的に付着させる。
ピペットを用いて、200μgニトロセルロースELI
SAプレートの各ウェルに加える。同溶液由来の流動体
は、蒸発させ、それによってIL−1をニトロセルロー
スに非特異的に付着させる。
にに代わる方法としては、」−記のようにT−BSAで
希釈したIL−1でプレートのウェルをコートすること
も可能である。37℃で50分インキュベートしたのち
、過剰の流動体は真空でニトロセルロースフィルターか
ら除去する。
希釈したIL−1でプレートのウェルをコートすること
も可能である。37℃で50分インキュベートしたのち
、過剰の流動体は真空でニトロセルロースフィルターか
ら除去する。
次に、ウェルの非反応部分を100μgのT−BSAで
、37℃で60分間ブロックする。それによって、T
−BSAは問題となる抗体のウェルへの非特異的吸着を
阻止する。そのインキュベーション期間後、ウェルをリ
ン酸(0,05M)mi化生理食塩水(0,15M)
(“PBS”)でpH7,2において、吸引により3
回洗浄する。
、37℃で60分間ブロックする。それによって、T
−BSAは問題となる抗体のウェルへの非特異的吸着を
阻止する。そのインキュベーション期間後、ウェルをリ
ン酸(0,05M)mi化生理食塩水(0,15M)
(“PBS”)でpH7,2において、吸引により3
回洗浄する。
50−100μgの被験試料(ポリクローナル抗体を含
む動物血清、モノクローナル抗体、あるいは、ハイブリ
ドーマ上/i7)をウェルに加え、約60分間37℃で
インキュベートする。インキュベート後、抗体溶液を除
去し、各ウェルを生理食塩水で3回から5回吸引によっ
て洗浄する。次に、約50−100μgの体積の酵素標
識抗イムノグロブリン抗体、例えば、アルカリホスファ
ターゼ結合二次抗体を各ウェルに加える。ハイブリドー
マ上清の抗IL−1反応性を分析するために本アッセイ
を使用する場合には、アルカリホスファターゼを結合し
た試薬は、ヤギ抗マウスIgG抗体(シグマケミカル社
、ミズーリ州セントルイス)を3%T−BSAで約1:
500に希釈して用いることが望ましい。本アッセイを
、例えばウサギ由来の、IL−1に対するポリクローナ
ル抗体を検出するために用いる場合には、アルカリホス
ファターゼを結合した試薬は、ヤギ抗つサギIgG抗体
(シグマケミカル社)を3%T−BSAで約1:200
に希釈することが望ましい。
む動物血清、モノクローナル抗体、あるいは、ハイブリ
ドーマ上/i7)をウェルに加え、約60分間37℃で
インキュベートする。インキュベート後、抗体溶液を除
去し、各ウェルを生理食塩水で3回から5回吸引によっ
て洗浄する。次に、約50−100μgの体積の酵素標
識抗イムノグロブリン抗体、例えば、アルカリホスファ
ターゼ結合二次抗体を各ウェルに加える。ハイブリドー
マ上清の抗IL−1反応性を分析するために本アッセイ
を使用する場合には、アルカリホスファターゼを結合し
た試薬は、ヤギ抗マウスIgG抗体(シグマケミカル社
、ミズーリ州セントルイス)を3%T−BSAで約1:
500に希釈して用いることが望ましい。本アッセイを
、例えばウサギ由来の、IL−1に対するポリクローナ
ル抗体を検出するために用いる場合には、アルカリホス
ファターゼを結合した試薬は、ヤギ抗つサギIgG抗体
(シグマケミカル社)を3%T−BSAで約1:200
に希釈することが望ましい。
適当なアルカリホスファターゼ結合抗体と共に、30分
間インキュベート後、各ウェルを生理食塩水で3回から
5回洗浄する。次に、約100μΩの無色のアルカリホ
スファターゼ基質を各ウェルに加える。望ましい基質の
一つは、パラニトロフェニルリン酸(シグマケミカル社
)である。この基質は、0.1Mグリシン(pHlO,
4) 、 1mM塩化亜鉛、および1111M塩化マ
グネシウムからなる基質緩衝液で、およそ1 mg/
mlの強度に調製する。30分間インキュベーション後
、各ウェルから50−75μgのアリコートを取り、E
L I SAプレートに移す。
間インキュベート後、各ウェルを生理食塩水で3回から
5回洗浄する。次に、約100μΩの無色のアルカリホ
スファターゼ基質を各ウェルに加える。望ましい基質の
一つは、パラニトロフェニルリン酸(シグマケミカル社
)である。この基質は、0.1Mグリシン(pHlO,
4) 、 1mM塩化亜鉛、および1111M塩化マ
グネシウムからなる基質緩衝液で、およそ1 mg/
mlの強度に調製する。30分間インキュベーション後
、各ウェルから50−75μgのアリコートを取り、E
L I SAプレートに移す。
抗IL−1抗体がプレートに結合したIL−1に結合す
ると、何色の産物が形成される。発色の光学的濃度は、
マルチイスカンプレート読み取り機(フローラボラトリ
ーズ)で色素の405ナノメートルでの吸収を測定する
ことによって確認し得る。測定した光学的濃度の値は、
ウェル試料中のIL−1抗体量に正比例する。
ると、何色の産物が形成される。発色の光学的濃度は、
マルチイスカンプレート読み取り機(フローラボラトリ
ーズ)で色素の405ナノメートルでの吸収を測定する
ことによって確認し得る。測定した光学的濃度の値は、
ウェル試料中のIL−1抗体量に正比例する。
[実施例 B]
IL−1α値の放射性標識
IL−1α種を、改良クロラミン−T法によりて、
■で放射性標識を行った。本方法では、131z g
(7,43XlO”モル)のIL−1αを、 1.5
マイクロキユリー(μCi) (6XlO’モル)の
N;11 (NIEN)および、4 X 10−”Mの
タロラミン−T (ehloraminc−T) (シ
グマケミカル社)の0.05Mリン酸ナトリウム緩衝液
(pH7,0)中の溶液を65μg加え、氷−ヒで30
分間インキュベートする。NaIIL−1複合体は、充
填体積1mlのバイオゲルP6−カラム(バイオラッド
社、カリフォルニア州すッチモンド)で、結合していな
いNa 1251− IL−1を分離する。ドデシル
硫酸すトリウム−ポリアクリルアミド電気泳動(SDS
−PAGE)によって、放射性標識されたIL−1αは
、分子量的17,500ダルトンの、単一の125■ポ
リペプチドを含むことが見いだされた。放射性標識IL
−1αは、また、95%以上TCAで沈殿し、IL−ル
セブター保U細胞に95%以上結合可能であり、1〜5
X 11015CP/dの範囲の比活性を示した。
■で放射性標識を行った。本方法では、131z g
(7,43XlO”モル)のIL−1αを、 1.5
マイクロキユリー(μCi) (6XlO’モル)の
N;11 (NIEN)および、4 X 10−”Mの
タロラミン−T (ehloraminc−T) (シ
グマケミカル社)の0.05Mリン酸ナトリウム緩衝液
(pH7,0)中の溶液を65μg加え、氷−ヒで30
分間インキュベートする。NaIIL−1複合体は、充
填体積1mlのバイオゲルP6−カラム(バイオラッド
社、カリフォルニア州すッチモンド)で、結合していな
いNa 1251− IL−1を分離する。ドデシル
硫酸すトリウム−ポリアクリルアミド電気泳動(SDS
−PAGE)によって、放射性標識されたIL−1αは
、分子量的17,500ダルトンの、単一の125■ポ
リペプチドを含むことが見いだされた。放射性標識IL
−1αは、また、95%以上TCAで沈殿し、IL−ル
セブター保U細胞に95%以上結合可能であり、1〜5
X 11015CP/dの範囲の比活性を示した。
[実施例 C]
IL−1μ種の放射性標識
IL−1μ種は、ジ−ヨウ素(I) −ポルトン−ハ
ンター試薬(Bolton −11untcr rca
gcnt)にューイングランドニュークリア、マサチュ
ーセッツ州ボストン)で標識した。標識法は、0.2M
ホウ酸ナトリウムとO,15M Na CΩ緩衝液(
pH8,5) 2ftΩ中の200μgのIL−1βを
、5μgの0.1Mホウ酸ナトリウム、0.7MNaC
,11)、f衝液(pH8,5)と混合し、この混合物
を次に、予め1mC1(0,23ナノモル)のポルトン
−ハンター試薬を含む100μgのベンゼンを、乾燥窒
素の緩やかな気流により蒸発させておいたバイヤルに添
加した。氷」−で1時間反応させた後、5μgの1Mグ
リシンエチルエステルを加えて反応を終結させた。30
μgの2%ゼラチンPBS溶液、pl+7.2をキャリ
アとして加え、放射性標識しf:、 I L −1を、
パスツールピペット中に充填したバイオゲルP6(バイ
オラッド)の1ml充填体積カラムによるクロマトグラ
フィーによって、遊離ポルトン−ハンター試薬から分離
した。カラムベツド物質は、ウシ血清アルブミン(“B
SA“)でブロックし、続いて、結合していないBSA
を使用に先立゛ち、20m1のPBSで洗浄した。
ンター試薬(Bolton −11untcr rca
gcnt)にューイングランドニュークリア、マサチュ
ーセッツ州ボストン)で標識した。標識法は、0.2M
ホウ酸ナトリウムとO,15M Na CΩ緩衝液(
pH8,5) 2ftΩ中の200μgのIL−1βを
、5μgの0.1Mホウ酸ナトリウム、0.7MNaC
,11)、f衝液(pH8,5)と混合し、この混合物
を次に、予め1mC1(0,23ナノモル)のポルトン
−ハンター試薬を含む100μgのベンゼンを、乾燥窒
素の緩やかな気流により蒸発させておいたバイヤルに添
加した。氷」−で1時間反応させた後、5μgの1Mグ
リシンエチルエステルを加えて反応を終結させた。30
μgの2%ゼラチンPBS溶液、pl+7.2をキャリ
アとして加え、放射性標識しf:、 I L −1を、
パスツールピペット中に充填したバイオゲルP6(バイ
オラッド)の1ml充填体積カラムによるクロマトグラ
フィーによって、遊離ポルトン−ハンター試薬から分離
した。カラムベツド物質は、ウシ血清アルブミン(“B
SA“)でブロックし、続いて、結合していないBSA
を使用に先立゛ち、20m1のPBSで洗浄した。
100μgずつの分画を集め、タンパク質結合性放射活
性を有するフラクションを保存した。
性を有するフラクションを保存した。
使用したIL−1β量が少ないため、放射性標識法によ
る回収率の直接の算出は不可能であった。
る回収率の直接の算出は不可能であった。
回収率を見積るために、IL−1β(200μg)を1
25I −I L −1(3Xl04cpa+)と混合
し、ヨウ素化法を行うが、ポルトン−ハンター試薬は使
わない、より制御された実験を行った。5回の測定によ
り、ゲルろ過般、54±8%のカウントが回収された。
25I −I L −1(3Xl04cpa+)と混合
し、ヨウ素化法を行うが、ポルトン−ハンター試薬は使
わない、より制御された実験を行った。5回の測定によ
り、ゲルろ過般、54±8%のカウントが回収された。
続くヨウ素化によって、この比率は、IL−1βタンパ
ク質の回収率であると考えられた。この算出法を用いて
、放射性標識IL−1β凋製物の非活性は、IL−1β
ペプチドの分子量が約17 、500ダルトンであると
して、2−5 X 11015CP/mMであった。
ク質の回収率であると考えられた。この算出法を用いて
、放射性標識IL−1β凋製物の非活性は、IL−1β
ペプチドの分子量が約17 、500ダルトンであると
して、2−5 X 11015CP/mMであった。
[実施例 1]
ポリクローナル抗IL−1β抗体の産生若いウサギの背
に、精製天然IL−1βおよび組換えIL−1βを皮下
的あるいは皮肉に注射し、免疫感作を行った。第一の免
疫感作は、完全フロイント補助剤と混合した200μg
について行った。
に、精製天然IL−1βおよび組換えIL−1βを皮下
的あるいは皮肉に注射し、免疫感作を行った。第一の免
疫感作は、完全フロイント補助剤と混合した200μg
について行った。
続く免疫感作は、不完全フロイント補助剤と混合した1
00μgを投与し、毎月1回4カ月間行った。
00μgを投与し、毎月1回4カ月間行った。
1回の免疫感作で、1カ所に全量を投与するのではなく
、各回にウサギの背に、複数の注入を皮下的に行った。
、各回にウサギの背に、複数の注入を皮下的に行った。
免疫潜伏期中に、ウサギの血清試料を採取して前述のE
L I SAアッセイで、抗IL−1応答試験を行った
。ウサギ血清力価が、1 : too以−1−の希釈で
もIL−1との反応で、十分高い値を示した後に、最後
の免疫感作後1カ月口から二カ月おきにウサギから抗血
清を採取し、本発明のアッセイに使用する抗体源として
使用した。
L I SAアッセイで、抗IL−1応答試験を行った
。ウサギ血清力価が、1 : too以−1−の希釈で
もIL−1との反応で、十分高い値を示した後に、最後
の免疫感作後1カ月口から二カ月おきにウサギから抗血
清を採取し、本発明のアッセイに使用する抗体源として
使用した。
[実施例 2]
1’L−1α種に対するポリクローナル抗体の産生
IL−1α種に対するポリクローナル抗体も、以下の変
形を含む、IL−1μ種に対するポリクローナル抗体の
産生に関する実施例1と実質的に同様の方法を用いて、
ウサギで作成した。抗IL−1αのポリクローナル抗体
を生成させるために用いた方法では、ウサギはまず、完
全フロイント補助剤中の250μgのIL−1αで免疫
感作を行った。2力月後、同動物を不完全フロイント補
助剤中の精製IL−1α170μgで追加免疫感作を行
った。ウサギ血清力価が十分な水準に達した(即ち、1
:100以上で反応性を持つ)後に、同動物から2力月
おきに抗血清を取り、本発明のアッセイのだめの抗体源
として使用した。
形を含む、IL−1μ種に対するポリクローナル抗体の
産生に関する実施例1と実質的に同様の方法を用いて、
ウサギで作成した。抗IL−1αのポリクローナル抗体
を生成させるために用いた方法では、ウサギはまず、完
全フロイント補助剤中の250μgのIL−1αで免疫
感作を行った。2力月後、同動物を不完全フロイント補
助剤中の精製IL−1α170μgで追加免疫感作を行
った。ウサギ血清力価が十分な水準に達した(即ち、1
:100以上で反応性を持つ)後に、同動物から2力月
おきに抗血清を取り、本発明のアッセイのだめの抗体源
として使用した。
[実施例 3]
IL−1に対するモノクローナル抗体の産生B A L
B / C7ウスを、150μgのIL−1αペプチ
ドで、皮下的、および、皮肉的に免疫感作を行った。に
記免疫感作のためのペプチドは、マーチ(March)
ら、Nature、前出のアミノ酸25G−271から
なるIL−1α分子のC末端部分からなる。免疫感作に
先立ち、IL−1αペプチドは、0.5mI P B
S 、 0.5ml完全フロイント浦助剤(デイフコ
ラボラトリーズ、ミズーリ州デトロイl−)中150μ
gのIL−1αペプチドのエマルジョンとして調製した
。最初の免疫感作後、不完全70インド補助剤中のIL
−1α75μgを、1力月おきに3力月間追加投与した
。
B / C7ウスを、150μgのIL−1αペプチ
ドで、皮下的、および、皮肉的に免疫感作を行った。に
記免疫感作のためのペプチドは、マーチ(March)
ら、Nature、前出のアミノ酸25G−271から
なるIL−1α分子のC末端部分からなる。免疫感作に
先立ち、IL−1αペプチドは、0.5mI P B
S 、 0.5ml完全フロイント浦助剤(デイフコ
ラボラトリーズ、ミズーリ州デトロイl−)中150μ
gのIL−1αペプチドのエマルジョンとして調製した
。最初の免疫感作後、不完全70インド補助剤中のIL
−1α75μgを、1力月おきに3力月間追加投与した
。
2回目の免疫感作後、および、その後の各感作後、血清
をマウスから集め、前述のように、ELISAアッセイ
により、抗IL−1の抗体応答について試験した。注射
完了後、IL−1αに対して高い血清力価の抗体(1:
100以上)を白゛するマウスを殺し、肺臓を得た。そ
れから単一細胞懸濁液を調製した。肺臓細胞は、クリッ
クの培地(C1ick’s medium) (アルテ
ィックアソシエイツ、ウィスコンシン州ハドソン)中で
培養した。上記培地は、10%(V/V)の加熱不活性
化したウシ胎児血清(Fe2)、300μg / ml
の新鮮なし一グルタミン、50μg / o+Iのゲン
タマイシン、50μg / mlのペニシリン、50
U / o+Iのストレプトマイシン、25mMのHE
PES緩衝液、300μg / mlのピルビン酸ナト
リウム、および、16mMのN a HCOaからなる
(完全クリック培地)。
をマウスから集め、前述のように、ELISAアッセイ
により、抗IL−1の抗体応答について試験した。注射
完了後、IL−1αに対して高い血清力価の抗体(1:
100以上)を白゛するマウスを殺し、肺臓を得た。そ
れから単一細胞懸濁液を調製した。肺臓細胞は、クリッ
クの培地(C1ick’s medium) (アルテ
ィックアソシエイツ、ウィスコンシン州ハドソン)中で
培養した。上記培地は、10%(V/V)の加熱不活性
化したウシ胎児血清(Fe2)、300μg / ml
の新鮮なし一グルタミン、50μg / o+Iのゲン
タマイシン、50μg / mlのペニシリン、50
U / o+Iのストレプトマイシン、25mMのHE
PES緩衝液、300μg / mlのピルビン酸ナト
リウム、および、16mMのN a HCOaからなる
(完全クリック培地)。
単一細胞懸濁液から増殖した肺臓細胞は、NS1マウス
骨髄細胞と融合させた。融合は、15m1円錐形遠心チ
ューブ中で、約20X106の肺臓細胞を約LOXLO
6のNSIマウス肯髄腫細胞と混合することにより行っ
た。細胞混合液は、250Xgで10分間遠心してペレ
ット状にし、ト清を除去した。
骨髄細胞と融合させた。融合は、15m1円錐形遠心チ
ューブ中で、約20X106の肺臓細胞を約LOXLO
6のNSIマウス肯髄腫細胞と混合することにより行っ
た。細胞混合液は、250Xgで10分間遠心してペレ
ット状にし、ト清を除去した。
次に、完全クリック培地で希釈した40%(W/V)P
EG溶液1nnlを1滴ずつ細胞ペレットに加えた。
EG溶液1nnlを1滴ずつ細胞ペレットに加えた。
その後、10m1の完全クリック培地を2分間かけて遠
心チューブに加え、細胞ペレットを穏やかに再懸濁した
。次に、同混合液を250Xgで5分間遠心し、上清を
除き、融合過程を完了した。
心チューブに加え、細胞ペレットを穏やかに再懸濁した
。次に、同混合液を250Xgで5分間遠心し、上清を
除き、融合過程を完了した。
得られた細胞ペレットは、40m1の完全クリック培地
に再懸濁した。非融合骨髄腫ドライバー細胞(NSI)
、重複NSIハイブリッド、非融合肺臓細胞、および、
重複+1’?、 1111細胞ハイブリツドは、培地に
約1.35mg/mlのヒポキサンチン、0.0017
6mg/mlのアミノプテリン、および、0.388m
g/ mlのチミジンを加えることにより(完全クリッ
クHAT培地)、増殖を阻害した。続いて、全懸濁液を
200μρずつのアリコートに分け、平底マイタロタイ
タ−プレートに加えた(No、3596コスタ一社、マ
サチューセッツ州ケンブリッジ)。培養液は、空気中に
7%の002を含む湿潤な大気中で、約37℃に保った
。7日から10日培養後、生きているハイブリッド細胞
を含む、ウェルの上清における抗IL−1抗体の存在を
、ELISAアッセイによって、試験した。試験したハ
イブリッド細1泡のうち陽性のものは、回収し、制限希
釈法により、クローン化した。ハイブリッド細胞が増殖
したクローン化培養液を、ELISAアッセイによっス
クリーニングした。
に再懸濁した。非融合骨髄腫ドライバー細胞(NSI)
、重複NSIハイブリッド、非融合肺臓細胞、および、
重複+1’?、 1111細胞ハイブリツドは、培地に
約1.35mg/mlのヒポキサンチン、0.0017
6mg/mlのアミノプテリン、および、0.388m
g/ mlのチミジンを加えることにより(完全クリッ
クHAT培地)、増殖を阻害した。続いて、全懸濁液を
200μρずつのアリコートに分け、平底マイタロタイ
タ−プレートに加えた(No、3596コスタ一社、マ
サチューセッツ州ケンブリッジ)。培養液は、空気中に
7%の002を含む湿潤な大気中で、約37℃に保った
。7日から10日培養後、生きているハイブリッド細胞
を含む、ウェルの上清における抗IL−1抗体の存在を
、ELISAアッセイによって、試験した。試験したハ
イブリッド細1泡のうち陽性のものは、回収し、制限希
釈法により、クローン化した。ハイブリッド細胞が増殖
したクローン化培養液を、ELISAアッセイによっス
クリーニングした。
−1−2方法により、IL−1αに対する新しい抗体が
得られた。本発明で有効であると示された1一記抗体の
例としては、7G9−C1,7!14−Gl。
得られた。本発明で有効であると示された1一記抗体の
例としては、7G9−C1,7!14−Gl。
131)12−B2. L4Dl−13114,15A
4−3G12.15C2−B6゜および、161111
−1110と呼ばれるものがある。これらのモノクロー
ナル抗体を産生ずるハイブリドーマ細胞系は、同じ表記
で表す。15A4−3C12モノクロ一ナル抗体試料(
ハイブリドーマ)は、受託番号11B9084号として
ATCCに寄託している。
4−3G12.15C2−B6゜および、161111
−1110と呼ばれるものがある。これらのモノクロー
ナル抗体を産生ずるハイブリドーマ細胞系は、同じ表記
で表す。15A4−3C12モノクロ一ナル抗体試料(
ハイブリドーマ)は、受託番号11B9084号として
ATCCに寄託している。
抗IL−1抗体L5A4−3C12は、同抗体を産生ず
る約2×106ハイブリドーマ細胞をB A L B
/ cマウスの腹膜中に注入することにより、in v
iv。
る約2×106ハイブリドーマ細胞をB A L B
/ cマウスの腹膜中に注入することにより、in v
iv。
で増殖させた。ハイブリドーマ細胞注入1週間前に、対
象となるBALB/cマウスに、腹水誘導・ 刺激
剤として、1.0mlのブリスタンを腹腔内にLyえた
。ハイブリドーマ注入後80から140に腹腔的腹水を
集め、1.000Xgテio分間遠心し、15A4−3
012モノクロ一ナル抗体を回収した。
象となるBALB/cマウスに、腹水誘導・ 刺激
剤として、1.0mlのブリスタンを腹腔内にLyえた
。ハイブリドーマ注入後80から140に腹腔的腹水を
集め、1.000Xgテio分間遠心し、15A4−3
012モノクロ一ナル抗体を回収した。
[実施例 4]
IL−1βに対するモノクローナル抗体の産生実施例3
で述べた方法を、ヒトIL−1βと反応するモノクロー
ナル抗体群の生成に使用した。
で述べた方法を、ヒトIL−1βと反応するモノクロー
ナル抗体群の生成に使用した。
IL−1βに対するモノクローナル抗体の精製のための
肺臓細胞源として使用されたマウスは、まず0.5ml
P B Sおよび0.5mlの完全フロイント補助
剤中の200μgのヒトIL−1βで、皮下的および皮
肉的に免疫感作を行った。最初の免疫感作後、同マウス
に、毎月3力月間、不完全フロイント補助剤中の75μ
gのIL−1βを投与した。
肺臓細胞源として使用されたマウスは、まず0.5ml
P B Sおよび0.5mlの完全フロイント補助
剤中の200μgのヒトIL−1βで、皮下的および皮
肉的に免疫感作を行った。最初の免疫感作後、同マウス
に、毎月3力月間、不完全フロイント補助剤中の75μ
gのIL−1βを投与した。
これらのモノクローナル抗体は、3A4−LOG 、
3113−119、4C12−3F 、 5A11−4
3 、 GBII−C1、および。
3113−119、4C12−3F 、 5A11−4
3 、 GBII−C1、および。
7134−2Bと命名した。7134−2Bモノクロ一
ナル抗体のサンプル(ハイブリドーマ)は、受託番5シ
JIB 9085として、ATCCに寄託している。
ナル抗体のサンプル(ハイブリドーマ)は、受託番5シ
JIB 9085として、ATCCに寄託している。
[実施例 5]
7B4−2Bおよび15A4−3C12抗体の解析15
A4−3C12および7B4−213は、双方ともIg
G1抗体である。15A4−3C12抗体は、IL−1
αと特異的に反応するが、IL−1βとは反応せず、よ
り詳しくは、IL−1α分子のC末端15アミノ酸中に
含まれる抗原決定基に対して誘導されたものである。7
B4−2B抗体は、IL−1βと特異的に反応し、IL
−1αとは反応しない。どちらの抗体も、他のリンホカ
イン(IL−2,GM−C8F。
A4−3C12および7B4−213は、双方ともIg
G1抗体である。15A4−3C12抗体は、IL−1
αと特異的に反応するが、IL−1βとは反応せず、よ
り詳しくは、IL−1α分子のC末端15アミノ酸中に
含まれる抗原決定基に対して誘導されたものである。7
B4−2B抗体は、IL−1βと特異的に反応し、IL
−1αとは反応しない。どちらの抗体も、他のリンホカ
イン(IL−2,GM−C8F。
IL−3,インターフェロン等)に対する特異的反応性
は示さなかった。どちらの抗体も、Aタンパク質セファ
ロース(シグマケミカル社)を用いたアフィニティーク
ロマトグラフィー、あるいは、連続的なゲルろ過および
イオン交換クロマトグラフィーによって、腹水から精製
することが出来る。
は示さなかった。どちらの抗体も、Aタンパク質セファ
ロース(シグマケミカル社)を用いたアフィニティーク
ロマトグラフィー、あるいは、連続的なゲルろ過および
イオン交換クロマトグラフィーによって、腹水から精製
することが出来る。
[実施例 6]
IL−1αおよびIL−1βの競合アッセイ競合ラジオ
イムノアッセイ(RI A)は、6004、QRIAチ
ューブ(サルシュチット社、ニューシャーシー州プリン
ストン;カタログ番号73、1055)中で、最終体積
が150μgとなるようにして行った。以下の免疫反応
成分を、各々のRIAチューブに加えた: (1)結合
培地[500mlのロスウェル・パーク・メモリアル・
インスティテユート(“RPMI”) 1840培地、
50m1の0.2M HE P E S (pH7,
2) 、 12.5g B SA(シグマ費ケミカル令
カンパニー)、および、0.5gアジドナトリウム(p
H7,7)]で希釈した、50μΩの、上記実施例1あ
るいは実施例2の免疫血清、50μΩの、上記実施例3
あるいは実施例4のハイブリドーマ上清、実施例3ある
いは実施例4の腹水、あるいは、実施例3あるいは実施
例4で調製したPBS中の精製IL−11gG;(2)
PBSTA (PBS、1%トリトンXl00゜5%B
SA (シグマ・ケミカル・カンパニー)、および、0
.2%アジドナトリウム(pH7,0))中のAタンパ
ク質セファロース20%(V/V)溶液50μg ;(
3)25μΩの、標識IL−1αあるいはIL−1β(
45、000epm)を含む結合培地;および、(4)
25tzρの、非標識IL−1αあるいはIL−1βの
濃度を徐々に増大させて含ませた結合培地。」二足RI
Aチューブを、ミニーオービタルΦシエイカ−(Min
i−Orbital 5haker) (ベリコ・ヴ
インランド、ニューシャーシー州)中に置き、4℃で1
6時間振とうした(シェイカーは、5−172にセット
)。その後、試料を2004zΩのPBSで1回、続い
て、400μgのPBSで2回、96ウエルRIAチユ
ーブホルダー中の試料を5001?PMで10分間遠心
しくソーパルI?T6000冷却遠心機)、1−清を真
空吸引することにより、洗浄した。次に、RIAチュー
ブをディスポ・ポロシリケイト・ガラス培養チューブ(
アメリカン・サイエンティフィック中プロダクツ、イリ
ノイ州マソクゴウパーク、カタログ#T1290−3)
に入れ、免疫複合体の放射活性をパラカード・マルチブ
リアメ4ガンマ線カウンター(ユナイテッド・チクノロ
シーズ、イリノイ州ダウナーズグロウブ)で測定した。
イムノアッセイ(RI A)は、6004、QRIAチ
ューブ(サルシュチット社、ニューシャーシー州プリン
ストン;カタログ番号73、1055)中で、最終体積
が150μgとなるようにして行った。以下の免疫反応
成分を、各々のRIAチューブに加えた: (1)結合
培地[500mlのロスウェル・パーク・メモリアル・
インスティテユート(“RPMI”) 1840培地、
50m1の0.2M HE P E S (pH7,
2) 、 12.5g B SA(シグマ費ケミカル令
カンパニー)、および、0.5gアジドナトリウム(p
H7,7)]で希釈した、50μΩの、上記実施例1あ
るいは実施例2の免疫血清、50μΩの、上記実施例3
あるいは実施例4のハイブリドーマ上清、実施例3ある
いは実施例4の腹水、あるいは、実施例3あるいは実施
例4で調製したPBS中の精製IL−11gG;(2)
PBSTA (PBS、1%トリトンXl00゜5%B
SA (シグマ・ケミカル・カンパニー)、および、0
.2%アジドナトリウム(pH7,0))中のAタンパ
ク質セファロース20%(V/V)溶液50μg ;(
3)25μΩの、標識IL−1αあるいはIL−1β(
45、000epm)を含む結合培地;および、(4)
25tzρの、非標識IL−1αあるいはIL−1βの
濃度を徐々に増大させて含ませた結合培地。」二足RI
Aチューブを、ミニーオービタルΦシエイカ−(Min
i−Orbital 5haker) (ベリコ・ヴ
インランド、ニューシャーシー州)中に置き、4℃で1
6時間振とうした(シェイカーは、5−172にセット
)。その後、試料を2004zΩのPBSで1回、続い
て、400μgのPBSで2回、96ウエルRIAチユ
ーブホルダー中の試料を5001?PMで10分間遠心
しくソーパルI?T6000冷却遠心機)、1−清を真
空吸引することにより、洗浄した。次に、RIAチュー
ブをディスポ・ポロシリケイト・ガラス培養チューブ(
アメリカン・サイエンティフィック中プロダクツ、イリ
ノイ州マソクゴウパーク、カタログ#T1290−3)
に入れ、免疫複合体の放射活性をパラカード・マルチブ
リアメ4ガンマ線カウンター(ユナイテッド・チクノロ
シーズ、イリノイ州ダウナーズグロウブ)で測定した。
放射活性放出水準測定から、様々な量の非標識IL−1
αあるいはIL−1βにより、標識IL−1αあるいは
IL−1βのそれぞれの抗体への結合の阻害の割合につ
いての標準阻害曲線を描いた。抗IL−1α抗体および
抗IL−1β抗体の阻害曲線を、それぞれ第1図、第2
図に示す。
αあるいはIL−1βにより、標識IL−1αあるいは
IL−1βのそれぞれの抗体への結合の阻害の割合につ
いての標準阻害曲線を描いた。抗IL−1α抗体および
抗IL−1β抗体の阻害曲線を、それぞれ第1図、第2
図に示す。
結合の非特異的バックグラウンド水準は、免疫血清を、
結合培地で希釈した50μgの非免疫ウサギ血清と置換
して競合アッセイを行うことにより決定した。モノクロ
ーナル抗体の場合(腹水由来あるいは精製I gGlを
PBSで希釈したもの)、PBSの対照溶液、pH7,
2を、反応性の非特異的バックグラウンド水準を決定す
るための適当な試料として用いた。ここにおいて、未知
量のIL−1αあるいはIL−1βを含む試料について
、放射性標識反応の阻害度を測定することが可能であり
、その測定値と第1図および第2図に示した曲線から、
IL−1αあるいはIL−1βの存在量を決定できる。
結合培地で希釈した50μgの非免疫ウサギ血清と置換
して競合アッセイを行うことにより決定した。モノクロ
ーナル抗体の場合(腹水由来あるいは精製I gGlを
PBSで希釈したもの)、PBSの対照溶液、pH7,
2を、反応性の非特異的バックグラウンド水準を決定す
るための適当な試料として用いた。ここにおいて、未知
量のIL−1αあるいはIL−1βを含む試料について
、放射性標識反応の阻害度を測定することが可能であり
、その測定値と第1図および第2図に示した曲線から、
IL−1αあるいはIL−1βの存在量を決定できる。
試料は、血清、唾液、尿、血しょう、および滑液などの
体液から得られる。針康な提供者からの試料を、炎症が
存在しない場合の試料体液中のIL−1標識水準を決定
するのに用いることができる。これは、アッセイされる
体lfk試料中に検出される、上昇したIL−1水準を
基にして、存在する炎症の程度を定量する際に用いる、
対照水準を与える。
体液から得られる。針康な提供者からの試料を、炎症が
存在しない場合の試料体液中のIL−1標識水準を決定
するのに用いることができる。これは、アッセイされる
体lfk試料中に検出される、上昇したIL−1水準を
基にして、存在する炎症の程度を定量する際に用いる、
対照水準を与える。
[実施例 7]
二重決定アッセイでの炎症の決定
最初のモノクローナル抗体をPBSで約10μg /
mlの濃度に希釈する。この溶液的100μgを、96
ウエル200Az、QニトロセルロースEL I SA
プレー1・からなる反応容器に入れる。
mlの濃度に希釈する。この溶液的100μgを、96
ウエル200Az、QニトロセルロースEL I SA
プレー1・からなる反応容器に入れる。
溶液からの液体は、インキュベーション過程で蒸発させ
、それによって、第一モノクローナル抗体をプレートに
非特異的に付着させる。その後、プレートを、約100
μgのPBSで3回洗浄し、更に、3%(重量)のBS
Aを含むPBSを100μg加え、プレートを32℃で
60分間インキユベートシ、第一モノクローナル抗体の
付着してい・ない、プレートウェル底部の残余部分をブ
ロックする。この再度のインキュベーション後、PBS
溶液を真空により除去するか、あるいは、PBS100
7z、17で3回洗浄しデカンテーションによって除く
。これで、プレートは、二重決定イムノアッセイ法で使
用する準備が出来たことになる。プレートや、チューブ
、プラスチックウェルプレート、などの他の適当な容器
は、臨床用などのためのキットの一部として使用される
ことは、理解されるであろう。
、それによって、第一モノクローナル抗体をプレートに
非特異的に付着させる。その後、プレートを、約100
μgのPBSで3回洗浄し、更に、3%(重量)のBS
Aを含むPBSを100μg加え、プレートを32℃で
60分間インキユベートシ、第一モノクローナル抗体の
付着してい・ない、プレートウェル底部の残余部分をブ
ロックする。この再度のインキュベーション後、PBS
溶液を真空により除去するか、あるいは、PBS100
7z、17で3回洗浄しデカンテーションによって除く
。これで、プレートは、二重決定イムノアッセイ法で使
用する準備が出来たことになる。プレートや、チューブ
、プラスチックウェルプレート、などの他の適当な容器
は、臨床用などのためのキットの一部として使用される
ことは、理解されるであろう。
体積50μgの体液試料を反応プレートに加え、32°
Cで60分間インキュベートする。インキュベーション
後、液体を除き、プレートウェルを100μgのPBS
で繰り返し洗浄する。その後、IL−1に対する第二モ
ノクローナル抗体100μgを、PBSで約100μg
/ mlの濃度に希釈した後、反応ウェルに加える。
Cで60分間インキュベートする。インキュベーション
後、液体を除き、プレートウェルを100μgのPBS
で繰り返し洗浄する。その後、IL−1に対する第二モ
ノクローナル抗体100μgを、PBSで約100μg
/ mlの濃度に希釈した後、反応ウェルに加える。
第二モノクローナル抗体は第一抗体が反応性であるエピ
トープとは異なる、IL−1分子上のエビ!・−ブと反
応する。32℃でおよそ60分間インキュベートシたの
ち、第二抗体溶液を除去し、容器を100μΩのPBS
で繰り返し洗浄し、第二抗体を除く。その後、第二モノ
クローナル抗体に特異的な二次1gG抗体をアルカリホ
スファターゼと結合されたちのおよぞ50−100μg
を反応容器に加える。二次抗体は、およそ3%BSAを
念むPBSで約1 : 5001.:希釈して用いる。
トープとは異なる、IL−1分子上のエビ!・−ブと反
応する。32℃でおよそ60分間インキュベートシたの
ち、第二抗体溶液を除去し、容器を100μΩのPBS
で繰り返し洗浄し、第二抗体を除く。その後、第二モノ
クローナル抗体に特異的な二次1gG抗体をアルカリホ
スファターゼと結合されたちのおよぞ50−100μg
を反応容器に加える。二次抗体は、およそ3%BSAを
念むPBSで約1 : 5001.:希釈して用いる。
32℃で約30分間インキュベーションしたのち、標準
生理食塩水(約0.9%wt/vol)あるいは水道水
に浸し、繰り返し洗浄する。次に、約100μgのバラ
ニトロフェニリン酸基質(シグマ・ケミカル・カンパニ
ー)を容器に加える。基質は約0.1 Mグリシン(p
H10,4) 、 1mM塩化亜鉛、および1mM塩
化マグネシウムとともに、およそ1mg/mlの強度に
調製する。試験される試料中にIL−1が存在する場合
には、有色の産物が形成される。次に、色素の光学的濃
度は、マルチスヵン・プレートφリーダーで405ナノ
メートルでiill定する。測定した光学的濃度の値は
、試料中の■L−1量に直接的に比例し、また、試料源
に存在する炎症状態を示唆する。
生理食塩水(約0.9%wt/vol)あるいは水道水
に浸し、繰り返し洗浄する。次に、約100μgのバラ
ニトロフェニリン酸基質(シグマ・ケミカル・カンパニ
ー)を容器に加える。基質は約0.1 Mグリシン(p
H10,4) 、 1mM塩化亜鉛、および1mM塩
化マグネシウムとともに、およそ1mg/mlの強度に
調製する。試験される試料中にIL−1が存在する場合
には、有色の産物が形成される。次に、色素の光学的濃
度は、マルチスヵン・プレートφリーダーで405ナノ
メートルでiill定する。測定した光学的濃度の値は
、試料中の■L−1量に直接的に比例し、また、試料源
に存在する炎症状態を示唆する。
本発明に関連した分野に熟達した台には明らかなように
、本発明は、その本質あるいは必須の特徴から逸脱する
ことなく、上記のように特異的な形態外の形でも具体化
され得る。上に示した、本発明のひとつの態様は、従っ
て、説明的なものであり、制限を与えるものではない。
、本発明は、その本質あるいは必須の特徴から逸脱する
ことなく、上記のように特異的な形態外の形でも具体化
され得る。上に示した、本発明のひとつの態様は、従っ
て、説明的なものであり、制限を与えるものではない。
本発明の範囲は、特許請求の範囲に述べられており、上
記の本発明の態様に制限されるものではない。
記の本発明の態様に制限されるものではない。
第1図は、競合アッセイ反応において、試料中の様々な
濃度のIL−1が、放射性標識IL−1αと、本発明の
新しい抗IL−1抗体との沈降反応を阻害する能力を示
す、IL−1α種の競合アッセイ阻害曲線を示すグラフ
である;また、第2図は、競合アッセイ反応において、
試料中のIL−1が、放射性標識IL−1βと、本発明
の新しい抗IL−1抗体との沈降反応を阻害する能力を
示す、IL−1β種の競合アッセイ阻害曲線を示すグラ
フである。
濃度のIL−1が、放射性標識IL−1αと、本発明の
新しい抗IL−1抗体との沈降反応を阻害する能力を示
す、IL−1α種の競合アッセイ阻害曲線を示すグラフ
である;また、第2図は、競合アッセイ反応において、
試料中のIL−1が、放射性標識IL−1βと、本発明
の新しい抗IL−1抗体との沈降反応を阻害する能力を
示す、IL−1β種の競合アッセイ阻害曲線を示すグラ
フである。
Claims (10)
- (1)(a)被験者のインターロイキン−1(以下IL
−1という)を含有すると推定される体液試料を、IL
−1の第一抗原部位の特性に特異的な第一抗体と反応さ
せること、及び、(b)この第一抗体と試料中のIL−
1との反応によって、試料を採取した被験者の炎症状態
の存在に関連するIL−1の存在を検出すること、 を含む、被験者のIL−1によって媒介される炎症を検
出する方法。 - (2)上記第一抗体が、15A4−3C12および7B
4−2Bからなる群から選択されたモノクローナル抗体
あるいはそれらと機能的に均等な抗体である、特許請求
の範囲第1項記載の方法。 - (3)第一抗IL−1抗体と反応性の抗原部位とは構造
的に異なる、IL−1上の第二抗原部位に対する第二抗
IL−1抗体と上記試料を接触させること;および、 第二抗体とIL−1第一抗体複合体との反応を測定する
こと; により第一抗体とIL−1との反応の程度を決定する、
特許請求の範囲第1項記載の方法。 - (4)試料を、既知量の標識IL−1とも反応させ;そ
して、第一抗体と標識IL−1との反応性を測定するこ
とによりIL−1と第一抗体との反応を測定する特許請
求の範囲第1項記載の方法。 - (5)(a)被験者由来の血清試料と第一抗体とを、第
一抗体が血清試料中に存在するIL−1に結合する条件
下で接触させること;および、 (b)被験者体内の炎症状態の存在に関連する第一抗体
の免疫複合体の存在を決定すること;を含む、被験者体
内のIL−1の存在により媒介される自己免疫疾患の検
出のための特許請求の範囲第1項記載の方法。 - (6)IL−1に特徴的なタンパク質あるいはペプチド
上の抗原部位に特異的な第一抗体、および/または上記
第一抗体の有用な結合性断片;および、 第一抗体がタンパク質上の対応する抗原部位に結合する
ことに関連して検出可能な信号を生成し得る、信号生成
系; を含む、被験者体内の炎症状態の存在を試験するための
診断用キット。 - (7)IL−1に特徴的なタンパク質上の第二抗原部位
、すなわち、第一抗原部位と構造的に異なる第二抗原部
位に特異的な第二抗体、および/または第二抗体の有用
な結合性断片;および、第二抗体のIL−1に特徴的な
タンパク質への結合に関連した検出可能な信号を生成し
得る標識; を信号生成系に有する、特許請求の範囲第6項記載のキ
ット。 - (8)IL−1に特徴的なタンパク質上の第二抗原部位
、すなわち、第一抗原部位と構造的に異なる第二抗原部
位に特異的な第二抗体、および、第二抗体の有用な結合
断片; 第二抗体に対する特異的結合相手物質;および、 特異的結合相手物質に結合した標識; を信号生成系に有する、特許請求の範囲第6項記載のキ
ット。 - (9)15A4−3C12(ATCC HB 9084
)の同定特性を有するモノクローナル抗体。 - (10)7B4−2B(ATCC HB 9085)の
同定特性を有するモノクローナル抗体。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US85820286A | 1986-05-01 | 1986-05-01 | |
US858202 | 1986-05-01 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS6340858A true JPS6340858A (ja) | 1988-02-22 |
Family
ID=25327736
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP62108771A Pending JPS6340858A (ja) | 1986-05-01 | 1987-05-01 | 炎症の検出とその新しい抗体 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0245052A3 (ja) |
JP (1) | JPS6340858A (ja) |
AU (1) | AU7226587A (ja) |
DK (1) | DK221887A (ja) |
ZA (1) | ZA872784B (ja) |
Families Citing this family (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0569687B1 (en) * | 1984-05-18 | 2002-08-21 | New England Medical Center Hospitals, Inc. | Human IL-1 cDNA sequences encoding biologically-active human IL-1 proteins |
US5998578A (en) * | 1984-05-18 | 1999-12-07 | New England Medical Center Hospitals, Inc. | Biologically active fragments of IL-1β |
EP0364778B1 (en) * | 1988-10-01 | 1996-03-13 | Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. | Antibody against interleukin-1beta |
FR2640146B1 (fr) * | 1988-12-08 | 1993-12-24 | Commissariat A Energie Atomique | Anticorps monoclonaux anti-interleukines 1(alpha) et 1(beta), leur procede de production et applications desdits anticorps a la detection des interleukines 1(alpha) et 1(beta) et en therapeutique |
WO1993002359A1 (en) * | 1991-07-19 | 1993-02-04 | Assay Research, Inc. | Method and kit for measuring endogenous cytokines |
US5965379A (en) * | 1991-07-19 | 1999-10-12 | Cytimmune Sciences Inc. | Method for measuring endogenous cytokines |
US20040072237A1 (en) * | 2001-12-26 | 2004-04-15 | Barry Schweitzer | Use of cytokines secreted by dendritic cells |
WO2011113107A1 (en) | 2010-03-19 | 2011-09-22 | The University Of Melbourne | Kit and method for detecting porous dental hydroxy apatite |
CN115607691B (zh) * | 2022-11-01 | 2024-04-09 | 贵州威门药业股份有限公司 | 具有优良解热作用的热淋清颗粒 |
CN115607692B (zh) * | 2022-11-01 | 2024-04-09 | 贵州威门药业股份有限公司 | 使用热淋清颗粒治疗脓毒症的方法 |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS6291197A (ja) * | 1985-10-17 | 1987-04-25 | Dainippon Pharmaceut Co Ltd | 抗ヒトインタ−ロイキン1抗体,その製法及びその使用法 |
-
1987
- 1987-04-21 ZA ZA872784A patent/ZA872784B/xx unknown
- 1987-04-30 AU AU72265/87A patent/AU7226587A/en not_active Abandoned
- 1987-04-30 DK DK221887A patent/DK221887A/da not_active Application Discontinuation
- 1987-05-01 JP JP62108771A patent/JPS6340858A/ja active Pending
- 1987-05-01 EP EP87303946A patent/EP0245052A3/en not_active Withdrawn
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
ZA872784B (en) | 1987-10-16 |
EP0245052A2 (en) | 1987-11-11 |
DK221887D0 (da) | 1987-04-30 |
AU7226587A (en) | 1987-11-05 |
DK221887A (da) | 1987-11-02 |
EP0245052A3 (en) | 1989-04-26 |
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