JPS62501563A

JPS62501563A - リウマチ性関節炎の特徴である蛋白質

Info

Publication number: JPS62501563A
Application number: JP61501127A
Authority: JP
Inventors: ハ−ウイツツ，チヤ−ルス; ロサノ，カーメン　エル; パルハミ，ヌーロラ; ヘチエミー，カリム
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1985-02-01
Filing date: 1986-01-29
Publication date: 1987-06-25
Also published as: CA1265048A; US4645748A; EP0210257A4; WO1986004588A1; EP0210257A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】慢性関節リウマチ（ＲＡ）は免疫性機能障害および遺伝子感応性が役割を果たしている未解決の全身性の炎症として記述されて来た。初期の段階においてはそれは変動する緩解および悪化を特徴としておシ、また、その後の段階においては組織破壊に至る慢性の肉芽腫反応（パンヌス形成）を特徴としている。ＲＡ中の滑液膜は過剰の免疫学的に刺激されたリンパ系の器官の特徴を多く持っており、Ｔ −抑制子対Ｔ−ヘルパーリンパ球の比率は大きく減少することが示されている。

バクテリア、ビールスおよびマイコプラスマを病因に関係させようと多くの試みがなされてきたが、特定の原因となる因子は明瞭には証明されていない。多分特定の病因となる因子はなく、また、重要な因子または要素は遺伝的な要素と非特異的な炎症状態の生理学的な変化との連携の結果であると思われる。

この疾病の遅い、破壊的な様相について多大の作業が費やされてきた、すなわち、アナフィラキシ−的に導入サレタロイフトリエンおよびプロスタグランジンは好中球および大食細胞（マクロファージ）かりウマテ様滑液内に移って骨および軟骨の破壊を来す上に化学走性の役割を果たすことがあるのが、この疾病である。これらのでき事とりウマチ様の滑液に生じるその後の破壊的様相との間に介入しようとする多くの試みが為されてきた。

ＲＡを他の急性または慢性の炎症性疾患と区別する、あいまいでない試験はないのであるから、ＲＡを他の関節炎疹、例えば組織性円板状エリテマトーデス（ＳＬＥ）、背推炎（Ａｓ　）　、多関節痛風（ＰＡＧ）、乾鮮性関節炎（ＰｓＡ）、等と区別することは困難なことが多い。ＲＡの診断は通常米国リウマチ協全（Ａｍｅｒｉｃａｎ　ＲｈｅｕｍａｔｉｓｍＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ　（Ａ　Ｓ　Ａ　）　）の判定基準に従って行われる。

第１表から判るように、その症候が８つの判定基準のうち少なくとも３つに当っている患者は、５つ以上の症候が陽性になるまでは確実な臨床的診断は通常行なわれないが、多分ＲＡを持っていると考えられる。しかし、更に観察した後に診断を変更することは異例ではない。なぜならば、症候が重複すると診断が複雑になシ、１つの関節炎疹からの症候があっても患者が別の関節炎症も持っているという可能性が除かれるものではないからである。

１、朝の硬直２関節の痛みまたは動いたときの痛み３、関節の軟組織の腫張４、第２関節の軟組織の腫張（３ケ月以内）５、対称的関節の軟組織の腫張（末端の指間関節）６、皮下モジュール７、Ｘ線変化８、リューマチ性因子に対する血清陽性想定Ｒ，Ａ−３または４ポイント確定ＲＡ−５以上ポイントきな助けとなろう。もしそれが治療法に対する応答を査定し、そして病気に係るプロセスの活性化および再活性化を予測出来れば、そのような試験は更に一層重要となろう。そのような試験はその治療法を早期に制定することによってその予防が出来るようになろう。

１つの試験法が現在用いられている。それはＩｇＧＯＦｃ分画に対する抗体（リューマチ性因子）に基づいている。リューマチ性因子（ＲＦ）はＲＡにかかつている人の約６０−７０％に存在する。試験は満足なものではない、何故ならばそれは非常に多数の仮性の陽性または陰性を示すこと、また、それは病気のプロセスの活性化または非活性化を査定しないからである。

発　明ＲＡ患者の血清中には検出できる量の慢性関節リウマチ蛋白（ＲＨＰ）が特徴的に存在し、そして、この蛋白質は正常の人からとった血清中にまたは他の関節炎疹を持った患者の血清には検出できないことが見出された。

この蛋白質はＲＦでもなく、既知の急性期反応物質のいずれでもない。ＲＨＰは分離出来て、Ｒ，Ａを発見するのに用いることができ、また病気の治療の過程をめるために用いることができる、ポリクロナールおよびモノクロナール抗体を作成するために用いることが出来る。これらの抗体は試験キットに入れて提供され、医者の詮療所を含む様々の詮療施設において疑いのあるＲ、Ａ患者について臨床的に血清診断をするのに用いられる。

この蛋白質は下記の特徴的な性質によって他の蛋白質と識別する事が出来る。

１、等電点ｐＨ５，１〜５．３２、ｐｌ−１５，５の０．０２モル酢酸緩衝液（オイグロブリン分画）中でヒト血清か、ら沈殿３、ｐＨ７，５で０．０２６モルのエチレングリコールテトラ酢酸（ＢＧＴＡ　）に可溶４、ヒト血清のオイグロブリン分画に存在５、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｓ　Ｄ　Ｓ　−ＰＡＧＥ　）によって検知される約１３５゜０００の分子量６、放射状免疫拡散法（Ｒ，ＩＤ）におけるＣ１ｑプレシビチン環の大きさを大きくする。

？、Ｃ１ｑの溶血活性を抑制する。

８、ＣＩｑのフィブロネクチンとの結合を抑制する。

９、合計分子量の９０％以上に下記のアミノ酸が係わっているアスパラギン酸、ＡＳＰ　アラニン、ＡＬＡスレオニン、ＴＨＲバリン、ＶＡＬセリン、ＳＥＲフエユヤアラユ＞、ＰＩ−ＩＥグルタミン酸、ＧＬＵ　ヒスチジン、ＨＩＳプロリン、ＰＲＯグリシン、ＧＬＹイソロイシン、ｌ５ＯＬＥＵロイシン、ＬＥＵ　システィン、ＣＹＳアルギニン、ＡＲＧ１０、ヒトＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＭに対する抗体とは反応しない。

本願の以下の項は下記にふくむ。

１、材料および方法の項は一般的にＲＨＰを分離、検出、試験、および特徴づけるために用いられる方法を記述する。

２、分離および精製の項はＲ，ＨＰをヒト血清から取得して精製する方法について記述する。

３、特徴づける項はＲＨＰの特徴づける性質を測定した方法について記述する。

４、区別する項はＲＨＰがＲＡに特徴的に存在すると言われることが多いものを含む他の材料とどのように異なるかを記述する。

５、抗体の項はＲＨＰに対するポリクロナールおよびモノクロナール抗体の製造について記述する。

６、ＲＡ検出の項はＲＨＰに対する抗体がＲＡを検出するため圧用いることができる方法について記述する。

７、試験キットの項はＲＨＰを含む試験キットを記述する。

１、材料および方法の項Ｃ１ｑは精製アガｏ　−ス（Ｂｉｏｒａｄ　、ゼｏ−ｍｒ）を用イタマンチニらＩｎｔ、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ　２　：　２３５．１９６５の単一放射免疫拡散法によって拡散平衡で測定した。抗Ｃ１ｑ（ボート、７％溶液）はアトランチツク、アンチホテイズ、スカルボロ、Ｍｅ、から入手して、１：２５０に希釈して用いた。Ｃ１ｑもロサノら：　Ｊ、　Ｌａｂ、Ｃｌ１ｎ。

Ｍｅｄ、　９４　：　５９３．１９７９、−　Ｃｌ１ｎ、　Ｃｈｅｍ、　２３　：　１３３５．１９７７のヒドロキシプロリン法によって測定した。後者の方法は全Ｃ１ｑを含み他のヒドロキシプロリン含有蛋白質を含まないオイログロブリン分画のヒドロキシプロリン含有量から血清のＣ１ｑ含量を計算することから成る。

Ｃ１ｑの精製と血清の分割Ｃ１ｑはヨネマツおよびストラウド、Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏ１１０６　：　３０４．１９７１　、の方法によって精製され、５ケの血清分を得た。（ａ）無オイグロブリン分画、（ｂ）オイグロブリン分画の０．０２６Ｍ　ＥＧＴＡ溶出液（Ｓ　１　）　、（Ｃ）　０．０６　Ｍ　ＥＧＴＡ溶出液（Ｓ　２　）　、（ｄ）　０．０３５Ｍ　ＥＤＴＡ溶出液（Ｓ３）、および（ｅ）免疫グロブリン（２）として存在する３％未満の不純物を含む精製Ｃ１ｑ、を得た。この方法および収率は第２表に示した。ＲＨＰはＳ１分画から分離した。

第２表Ｃ１ｑの精製食塩水＋８−の０．０２　Ｍ酢酸緩衝液に対して透析した蛋白質０．２’７０ｍ９　蛋白質０．０５３ｍ１；／Ｃ１ｑを除去した血清の作製血清のないＣ１ｑはコルクら：　Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１２２　：２１０３．１９７９の方法によって調製された。この方法は血清の他の血液補足成分に影響を及ぼすことなく全てのＣ１ｑを取除（ＩｇＧに等価的に結合している七ファロ符表昭６２−５０１５６３　（５） −ス４Ｂのカラムを通して血清を通すことから成る。

等電点電気泳動等電点電気泳動を、フラットベッドＬＫＢマルチファーユニット（ＬＫＢ、ワシントンＤＣ）を用いテ行った。

ゲルは５％の洗浄したセファデックスＣ５−７５（スーパーファイン、ファルマシア、ビス力タウェイ、Ｎ、　Ｊ、）に５％アムフォライト（パイオーライト、バイオランド、リッチモンド、カリフォルニア）と、２−７ｍｇのＳ１分画からの蛋白質を結合さ、せた。蛋白質は７ワツトで１８時間露出することによって分離させた。分離した蛋白質をふくむゲルバンドをｐ　Ｈ測定のために蒸留水に懸濁し、ｏ、ｉＭｏ、６ん酸緩箭液（ｐＨ８，０）、１ｏ−で溶出し、次いで水１０−で溶出した。アムフォライトは透析（対通常の食塩水）によシ除去した。

予備等電点電気泳動法も、８１０１型装置（ＬＫＢインスツルメンツ、インコーホレーテッド、ヒックスビル、Ｎ、　Ｙ、　１１８０１　）で、Ｂｒ１ｊ　３５おヨＵ　ｐｉ（４−７ｔＤ　７　ム７オライトを含む０−５０％のグリセロール、グラジェントを用いて行った。グラジェントには５５ｆｎｇの蛋白質溶液を投入し、等電点電気泳動法を約２Ｗを７２時間露出することによって達成した。電圧が８００ボルトでアンペアが２．５ｍＡであった時の平衡は２．５　ｍＡであづた。

グラジェントを重力流によって３．５−で回収した。

カラムクロマトグラフ　− ＤＥＡＥ　−セルｏ−メカ５ム（６，５ｘ　０．８ｃｍ、ＤＢｓ２、ワットマン、Ｎ、Ｊ、　）を、０．００２　Ｍ　ＢＤＴＡを含むｐＨ７，５の０．０４７Ｍ燐酸緩衝液で平衡させた。カラムには蛋白質を投入し、指示されたＮａＣＩグラジェントで溶出シた。

ＨＰＬＣゲルろ過バイオラドＴＳＫ２５０カラムにＤＥ５２クロマトグラフィーによシ単離した蛋白質を投入し、０．１モルの硫酸ナトリウムと０．０２モルの燐酸ナトリウム液（ｐＨ６，８）を２５０　ｐｓｉで１分当り１−の流速にて溶出した。

ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲルＮ気泳動法り且±」ニーい氾且ユ電気泳動法ヲ、ラエムリ、Ｎａｔｕｒｅ　２２７　ｉ　６８０．１９７０に記載されたスラブゲル技法によって行った。

蛋白質測定蛋白質測定ノ方法ハロウリイら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　１９３；２６５．１９５１およびＭ、　Ｂｒａｄｆｏｒｄ　：　Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、７２　：全てのＲＡ患者はＡＲＡ基準の５つまたはそれ以上を満たしている。彼等の病気は２−１０年の長さの活性のものであシ、非ステロイド性抗炎症剤によって部分的に抑制された。ＳＬＢ、ＡｓおよびＰｓＡの患者も非ステロイド系の抗炎症剤での治療を受けていた。痛風の患者は活性の疾患をもっておシ、血液の試料を取るまでは手認められていなかった。

２、単離および精製の項透析した血清１０−（対食塩水）に０．０２　Ｍの酢酸塩緩衝液８Ｏ−１ｐＨ５，５を加えた。これを５℃で一夜静置し、５＋ＯＯＯｒｐｍで３０分遠心分離した。

上澄液を破棄し、沈殿を０．５　Ｍ　ＮａＣｌ　５　ｍｌで溶解した。

溶解した沈殿（オイグロブリン）を０．０２６Ｍ　ＥＧＴＡｐＨ７，５１！Ｊツトルに対して透析を行った。（２０時間以上に２口取シ変え）。。

溶液を遠心分離して、沈殿を捨てた。上澄液は約１１ｍｇの蛋白質（Ｓ１分画）を含んでいた。

これは第２表でのＳ１分画である。以下に示すように、Ｓ１分画中にはＲ，ＨＰが存在するので、几１−Ｉ　Ｐは＝１、ｐＨ７，５での０．０２モル酢酸緩衝液のヒト血清から沈殿したこと、および２、ｐＨ７，５での０．０２６モルＥＧＴＡに可溶であることが明らかである。

８１分画は０．０４　Ｍ　）リスｐＨ７，５＋０．０５Ｍ　Ｎａｃｌに対して透析された。約５−の８１分画を同一の（透析）緩衝液で予め平衡させた（　４０Ｘ０．９ｃｍ）ＤＢ５２カラムに通した。０．０５モル−０，１５モルの塩酸ナトリウムのグラジェントを含む０．０４Ｍ１ｌスｐＨ７，５で蛋白質を溶出した。３−の分画を集めると、チューブ２２の後にＲＨＰが現れ、チューブ３１の後では完全にカラムから除去された。この蛋白質のピークは約６００μｇの蛋白質を含んでおシ、さらに０．１　Ｍ　Ｎａ２５ｏ４−　Ｎａ２ＨＰＯ４緩衝液（ｐＨ６，８）に対する透析によってさらに精製された。

ＲＨＰ蛋白質混合物は、ＴＳＫ−２５０カラムを用いたＨＰＬＣカラムクロマトグラフィーによって更に精製された。蛋白質は０．１　Ｍ　Ｎａ２５ｏ４＋　０．０２　Ｍ　Ｎａ２Ｉ（ＰＯ。

−Ｎａ２ＨＰＯ４１１ｉ％液ｐＨ６，８で溶出された。ＴＩ、ＨＰ蛋白質は１ｔｎｔ／分、３００　［）Ｓｉで７．４分後溶出された。この蛋白質はＨＰ　Ｌ　Ｃのカラム−（ＤＥＡＥ　−ｓ　ＰＷ　）を用いて塩の濃度を段階的に増大させて蛋白質を溶出して更に精製した。平衡緩衝液は０．０４　Ｍ　）す７．　ｐＨ７，５で、塩（ＮａＣＩ）のこの緩衝液にたいする添加はｏ、　０５Ｍ、　０．１　ｏ　Ｍ、　Ｏ，：３ＭＴあった。Ｉｔ、ＨＰは第２段階（０，１Ｍ　Ｎａｃ！　）後に溶出し、回収した蛋白質の量は約１００μｇであった。このピークから得た蛋白質はＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によって分離し、銀染色法によって純粋であるように思われた。

他の単離方法はＲＡ患者の血清を試験したときＣ１ｑプレシピテン環が拡大していることが認められたという観察に基づいている。Ｃ１ｑは補体分画（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｆｒａｃｔｉｏｎ　）である。ロッサーノら：　Ｊ、　Ｌａｂ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｍｅｄ。

１０３　：　３１３．１９８４によって非ＲＡの患者の血清中のＣ１ｑまたは彼等の血清のオイグロブリン中のＣ１ｑは、Ｃ１ｑ放出した血清から基準曲線が作成されれば、ＲＩＤによって正しく見積もることが出来ることが示された。然し、Ｒ’Ａ血清のＣ１ｑ含有量またはＲ，Ａ血清のオイグロブリンの分析試験は一貫してこの方法によって数値が過大に出る（　ｏｖｅｒｅｓｔｉｍａｔｅ　）傾向があった。この過大に数値が出る理由は几Ａ血清のオイグロブリン分画またはＳ１分画中にＲ，ＨＰが存在することにある。

Ｓｌ中のＲＨＰの存在を証明するために、ＲＡの患者の血清から取ったＳ１分画をアムフオライトー七ファデックスＧ−７５、ｐＨ４−８で等電点電気泳動法にかけた。これによって、蛋白、質を約１５の検出できる波長帯に分離し、その各々を拾い出してそのｐＨを測定した。

次に各波長帯中の蛋白質についてそのプレシピチン環の大きさを増大させる能力を試験した。各ウェルは単離した蛋白質０．５μｇおよびＣＩ　ｑ　０．７５μ ｇを含んでいた。

ブレシビテン環の大きさを増大させた唯一つの帯域は等電点ｐＨ，５，１−５，３にある帯域であった。

この研究によってＲ，ＨＰを分離する方法を確立し、また、ＲＨＰは：１）ヒト血清のオイグロブリン分画に存在すること、２）　５．１−５．３の等電点ｐＨ範囲は５．１〜５．３であること、が証明された。

本分離および精製の項に記した分離した分画はいずれも抗Ｒ，ＨＰ抗体を作るのに用いることが出来る。これはＳ１分画自体を含み、また、例えば、ＨＰＬＣによって精製された最初の分画も含む。

Ｓ１分画のｐＨ５，１−５，３帯域にある蛋白質を下記の既知の基準にたいして５ＤＳＰＡＧＥに付した。

ミオシン　−２００、０００ダルトンホスフホリラーゼＢ　−９２，５００ダルトンβ−ガラクトシダーゼ　−　１１６，０００ダルトンウシ血清アルブミン　−６６、０００ダルトンオボアルブミン　−４５，０００ダルトン分子量が約２８　、６００から１８０，０００の範囲に亘る８つの帯域を分離した。この分画の蛋白質の大部分は２つの帯域に見出され、分子量７６　、０００および１３５，０００ダルトンを持っていた。後者はプレシビチン環を拡大するのに最大の活性を表す。

Ｒ，ＨＰＦｉＩ　ｇＧ、Ｉ　ｇＡ、およびＩｇＭに対する抗体と非反応性である本試験においては１１０μｇの蛋白質を含むＲ，ＡＳＩ分［ｕ）０．１ｍ／を免疫ビード（ｉｍｍｕｎｏｂｅａｄ　）試薬２０ｍノにさらした。（免疫ビード兎抗ヒト免疫グロブリンＧ１Ａ、Ｍ、重鎖および軽鎖、バイオ、ランド、ラボラトリーズ）。ピードはそれゆえこれらの免疫グロブリンを血清またはこれらを含む他の材料から取シ除くことができる。本試験に用いた特定のビードは１０μｇＩｇＡ、１３９μｇＩｇＧ、および６１μｇＩｇＭを除去すること示できるように別々に測定された。試験に用いた０、　１１ｎｔの８１は３つの免疫グロブリンのこれらの量よシも少なく含んでいた。試験が終わったときには処理したＳ１分画には免疫グロブリンは検出できず、しかもそれは尚Ｃ１ｑプレシビチン環を拡大することが出来た。ＲＦは免疫グロブリンで、通常はＩｇＧであることを注意されたい。

ｒｔＨＰはＣ１ｑの溶血活性を抑制するＣ１ｑの溶血活性に対する既知の要件はＣ１ｒ−Ｃ１ｓの補体（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ　）成分を結合してＣ１を生成することである。

ｒＬＡの活性な場合のＣ１ｑの高められた血清レベルにはＣｌｒおよびＣ１ｓの、増大したレベルを伴わないことが認められている（ロツサノら、Ｊ、　Ｌａｂ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｍｅｄ。

１０３　：　３１３．１９８４　）。Ｃ１ｑの溶血活性に対するＲＪ廿の影響は上に引用したコルプらの方法を若干改良した方法によって調べられた。この方法では１．６μｇ以下のＲＨＰを、３０μＩのＣ１ｑ−放出血清（Ｃｌ　ｑ　ｄｅｐｉｅｔｅｄｓｅｒｕｍ）の１：１希釈液とベローナル綴防液中活性赤血球１：５希釈液０．２　ｍｌ、ｐＨ７，３にウシ血清アルブミン０．１％を含むものに加えた。溶血は２５分後３７℃で４１２１ｍでの吸収の増加量として測定された。Ｃ１ｑ放出血清３０μｍ中に含まれたＣ１ｒ−Ｃｌｓの存在下、１．６μｇのｒｔＨＰは０．２５　Ｎ　ｇのＣ１ｑの溶血活性を完全に抑制したことが認められた。このように、ＲＨＰは過剰量のＣ１ｒ−Ｃ１ｓの存在下でもＣ１ｑの溶血活性を阻止した。

ＲＨＰはＣ１ｑのフィブロネクチンへの結合を抑促フィブロネクチンは８２ｎＭのＫＤでＣ１ｑに結合し、マタ、結合はＣ１ｑのフラーダン様および球状領域（ｇｌｏｂ　−ｕｌａｒ　ｄｏｍａｉｎｓ　）のヒンジ部において生じることが知らレテイル。ヒンジら：　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ７９　：　４１９８．１９８２およびライドら：　Ａｃｔｕ、　Ｐａｔｈ、　Ｍｉｃ−ｒｂｉｏｌ、　１ｍｍｕｎｏｌ、　５ｃａｎｄ、　Ｓｅｅ、　Ｃ５ｕｐｐ１．２４８、Ｖｏｌ。

９２　：　１１．１９８４参照。ピングらの方法はＲＨＰがＣ１ｑのフィブロネクチンへの結合を阻害することを証明するために利用された。

この方法では、１ｍｌのＰＢＳ中５μｇのフィブロネクチン（ｏ、ｏｉＭｆＩ酸ナトリウム、０．２５　Ｍ　ＮａＣｌ中、ｐＨ７，４）を４℃で１２Ｘ７５１１１ｎのポリスチレン管に吸着させ、余剰分は吸引によって除去した。６管には４０　ｎｇの１２５Ｉ−ＣＩＱを加えた。管１はＣ１ｑを含んでいたがフィブロネクチンを含んでいなかった。管２はフィブロネクチンとＣ１ｑを、そして管３はＣ１ｑ、フィブロネクチン、および３４０りのＲＩ−Ｉ　Ｐを含んでいた。管を３２℃で３０分保温し、ＰＢＳで吸引によってＰＢＳで３回洗浄し、歿留放射能をガンマカウンター（オルチックウェル）で測定した。結、果を第３表に要約する。

第３表１２５Ｉ−ＣＩｑのフィブロネクチンへの結合に対するＲＨＰの効果１分間当シのカウント数（１）フィブロネタチンなし　２±１（２）＋フィブロネクチン　１０８±２（３）＋フィブロネクチン十ＲＨＰ　６０±２この研究のためにＲＡ血清からのＳ１分画を等電点電気泳動にかけ次にＳＤＳ・ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ、ＰＡＧＥ）によシＲＨＰを精製した。電気泳動から得た１３５，０００ダルトンのバンドなＲＨＰのソースとして取り出した。

表中に示されている結果から、フィブリノネクチンの結合した１２５ニーＣｌ　ｑ、は加えられたＲＨＰの存在で４４％減少した。

Ｒ，ＨＰのアミノ酸分析ＲＨＰの精製試料についてそのアミノ酸含量を分析した。分析はデュラムＤ−５００アミノ酸分析器で６ＮＨＣＩで加水分解した１９μｇの試料を用いて行った。

第４表の合計アミノ酸はＳ　Ｄ　Ｓ　−ＰＡＧＥによって測定された分子量の９０％以上を表している。。ＲＨＰは検出できる程度のヒドロキシプロリンを含んでいない。

Ｇｌｕ　２．６３　１５．ＩＡｓｐ　２．２２　１２．８’ Ｔ　ｙ　ｒ　１．５４　Ｂ−９ｏ＋ｙ　１．４５　Ｂ、３Ｐ　ｒ　Ｏ１，３２７，６Ｓ　ｅ　ｒ　１．２　０　６．９Ａ　ｒ　ｇ　１．１　８　６．８Ｌ　ｙ　ｓ　１．１　０　６．３Ｖ　ａ　Ｉ　０．７　６　．４．４Ｐ　ｈ　ｅ　０．７　３　４．２Ｔ　ｈ　ｒ　Ｏ，６４３，７Ｌ　ｅ　ｕ　Ｏ，６２３，６Ｈｉ　ｓ　０．６　１　３．５Ａｌａ　Ｏ，５８３，３Ｉｓｏｌｅｕ　０．５　７　３．３Ｃｙ　ｓ　０．２　５　１．４４、区別する頂上に報告した研究事項およびその他の研究事項から、ＲＨＰはＲＡまたはＣｌｑ分解物と関連のある多数の要因と同一物ではないことが明らかになる。

アミノ酸分析によれば、ＲＨＰの分子量の９０％以上がアミノ酸であることを示し、このことはＲＨＰがコンドロイチン−４−硫酸グロテオグリカンＣ１ｑ阻害剤（シルヘストリら：　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２５６　：　７３８３．１９８１、によって報告された）という可能性を否定するものである、というのは、後者は蛋白質を９％しか含まないからである。その上、（１）セリン、グリシン、およびグルタミン酸はプロテオグリカン阻止剤の全アミノ酸の５０％を構成しているがＲＨＰの場合はこの３種のアミノ酸は、ＲＨＰの２０％未満を構成しているにすぎない。（２）０．１５Ｍ’ＮａＣｌでは、プロテオグリカン阻止剤はＣ１ｑ−抗Ｃ１ｑプレシピチン環のサイズを減少させるが、ＲＨＰはそのサイズを増大させる。

ＲＨＰは炎症性疾患のある患者の血清に通常見られる急性期反応物質の一つではない。この事実を証明するために上記のようなＨＰＬＣによって精製したＲＨＰについてそのそれぞれの単一特異性抗血清に対する免疫電気泳動によってオロソムフイド、ハプトグロビン、α−抗トリプシン、およびＣ３と、の同一性を試験した。これらの試験においては、試験されているＲ、ＨＰの濃度と比較できる急性期反応物質の濃度とするため正常期ｉ’ＬＡヒト血清を１：３に希釈した。各々の場合に、単一特異抗血清はその急性期の蛋白質と明瞭な線を示したが、これらの抗血清と精製した几ＨＰとは反応を示さなかった。

ＲＨＰはリュウマチ性因子でもなく、また免疫グロブリンでもない、というのは、ＲＡ血清のＳ１分画の増大効果はＩｇＡ、ＩｇＧ、およびＩｇＭを全面的に除去しても減少しないからである。

ＲＨＰが証明できる程のヒドロキシプロリンを含んでいない事は、それがＣ１ｑのサブユニットあるいはそのコラーゲン一様ドメインを含んだＣ１ｑのサブユニットの集まシではないことを明らかにするものである。

５、抗体の項多価うさぎ抗−ＲＨＰ血清は、フロイントの完全アジュバント中の精製ＲＨＰを筋肉的注射し、７日後二次免疫注射することによって作成した。うさぎは７日および２０日目処耳から採血し、血清からの合計免疫グロブリンは硫安分画によって得た。うさぎ抗−ＲＨＰＯ力価は精製したＲＨＰで増感した羊のタンニン酸処理赤血球の血球凝集反応によって測定した。７日後の力価は１２８０であり、２０日後には少なくとも２０，４８０　Ｋ増加した。

下記に、（１）うさぎのＲ，ＨＰに対する多価抗体を作成する；（２）うさぎ血清での几ＨＰに対する抗体の存在を検知する；（３）うさぎの血清か、らＲ，ＨＰに対する抗体を分離する；ために利用される特定の方法を述べる。

Ｉｔ　ＨＰに対するうさぎの抗体の製造１．２−３　ｋ）のうさぎを、ＲＨＰに対する抗体の製造のために用いる。

２、接種の１日前に５　ｍｌの血液を採取する。血液を凝固させ、面域から血清を遠心分離デカンテーションによって分離し、血清フントロールを分ける。

３、翌日、食塩水０．２−０．４　ｍｌ、中のＲＨＰ１００μｇを等量の７０インドの完全アジュバントと充分混合する。

４、懸濁液をうさぎに筋肉内投与する。

５、最初の注射から７日後に、血液５−を取って、上記のようにして血清を得る。

６、翌日、食塩水０．２−０．４　ｄ中の６０−１００μｇのＲ，ＨＰを等量の７０インドのアジュバントと充分に混合する。

７、次に懸濁液をうさぎに筋肉内に投与する。

８．２度目の注射から７日後に、１０−２０−の血液を採取して上記のように処理する。

９、必要ならば２週間の間隔で血液を採取する。

うさぎ血清のＲ，ＨＰに対する抗体の定起１、血球凝集反応検定法によってＲＨＰに対する抗体力価を測定した。

２羊の赤血球（ＲＢＣ）は３％に標準化されている。

３、この標準化された３％ＲＢＣ懸濁液に、等量の１：２０　、０００タンニン酸溶液を加える。管を逆にして混合物を混合し、３７℃で１５分インキユキベートする。管を５分の間隔で逆にしてＲＢＣを懸濁状態に保つ。

４、２．００Ｏｒｐｍで１２分遠心分離を行って上澄液を捨てる。ＰＢＳｐＨ７，２，１０ｍ１をＲＢＣペレットに加エテ、混合する。

５、２，０００　ｒｐｍで１２分遠心分離を行って上澄液を捨てる。ＰＢＳｐＨ６，４，５ｄを加える。十分に再懸濁する。

ＰＢＳとｐＨ６，４で懸濁液の量を調節して、タンニン酸処理ＲＢＣの濃度が３％になるようにする。

６、懸濁液を等量の２つの部分に分ける。１つの部分は標識したＲＨＰを増感したもので、もう１つの部分は標識し脂肪酸のない牛アルブミン（ＢＡＦ）で増感したものである。後者の懸濁液は血清学的反応の対照とじての作用をする。

′７．ＲＨＰで増感したＲＢＣは下記のようにして作られるＯａ、ＲＨＰ１５．ｃ＋＋　（３μｇ）をｏ、　ｓ　ｍｅ　Ｐ　Ｂ　Ｓ　ＳｐＨ６，４に加える。

ｂ、　３％のタンニン酸処理ＲＢ　ＣＯ，８ｒｎＩ！を（ａ）７作成り。

たＲＨＰ溶液と混合する。

０．３７℃で１５分インキュ慶ベートする。管を反転して５分毎に混合する。

８、　Ｂ　Ａ　Ｆで増感したＢＡＦは下記のようにして作成する。

ａ、０．０５％ＢＡＦを含ｔｒｐＨ６，４のＰＢＳ　０．８＊を０，８ゴの３％タンニン酸処理ＲＢＣに加える。

ｂ、３７℃で１５分間インキユキベートする。管を反転して５分毎に混合する。

９．１５分のインキュ晋ベーションの後、Ｗ　ヲ２．００Ｏｒｐｍで１２分間遠心分離する。上澄み液を捨てて、容管に０．０５％ＢＡＦを含むＰＢＳｐＨ７，２を１．６ゴ加える。混合し、３７℃で１５分間インキュベートする。管を反転して５分毎に混合する。

１０、管を２．００Ｏｒｐｍで１２分間遠心分離する。上澄左液を捨チル。０．０５％のＢＡＦを含ｂｐＨ７，２０ＰＢＳＩＣＲＢＣを再懸濁して反量の１．４倍にする。これによって約２％の増感されたＲＢＣ懸濁液ができる。これらはＲＨＰに対する抗体の試験に用いられる細胞である。

１１、０．０５％ＢＡＦを含ｔｊ　ｐＨ７，２（Ｄ　Ｐ　Ｂ　Ｓ　ヲ用し／１テウさぎ血清の１＝１０希釈液を作成し、血清を５６℃で３０分間不活性化する。

１２、不活性化した血清を（２５μｍ量）を順次希釈する。

２つのバッチを作成する。

１３、血清の希釈液の１つのバッチ洗い各希釈液に対してＲＨＰで増感したＲＢＣ２５μｍを加える。

１４、血清の希釈液の他のバッチに、各希釈液に対してＢＡＦで増感したＲＢＣ２５μＩを加える。

１５、室温で２時間インキュベートする。

１６、ＲＨＰで増感したＲＢＣでインキュベートしたバッチで最終的な陽性の値、を与える最高の希釈液はタイターである。最終的な陽性の値はＲＢＣのドーナツ型マットによって示される。

１７、対照は全てＢＡＦで増感したドツトマツ）ＲＢＣで陰性のものとする。

うさぎからの抗ＲＨＰ全免疫グロブリンの製造１、つさぎ抗ＲＨＰ血清２５ｍ１を２５−の飽和（ＮＨ，）２Ｓｏ。

で沈殿させ、−夜５℃でインキュ横ベートした。

２翌日、それを８，０００Ｘｇで３分間遠心分離し、ベレットを５０％（ｒ％” ｌ−１，）　２ＳｏＡで遠心分離によって３Ｘ回洗浄した。

３、最終的なペレットを３．５−の食塩水−０，１％アジ化ナトリウムに溶解し、同じ溶液に対して透析した。

うさぎからの抗ＲＨＰＩｇＧの製造１、上記３．から得た溶液を更に０．０５％アジ化ナトリウムを含むｌＱｍＭの燐酸ナトリウム緩衝液ｐＨ８，０で透析する。

２、透析したグロブリン溶液を、０．０５％アジ化ナトリウムを含む３０　ｍＭの燐酸ナトリウム緩衝液ｐＩ（８，０を用いてＤＥＡＥセルロースカラムでクロマトグラフを行う。

３、ＩｇＯピークを含む分画をプールする。

４、ＩｇＧ溶液を、等量の飽和（Ｎｕ（４）２Ｓｏ、溶液で沈殿させることによって濃縮し、遠心分離する。

５、ベレットを約１０ｒｎｔの食塩水に懸濁し、透析して（”（４）　２　ＳＯａを除去する。

知られているように、ＩｇＧは２つの異なった酵素の作用によって２つの異なった分画に分離することができる。酵素ペプシンはＦ（ａｂ’）　２分画を作る。

ノぐパインはＦａｂ分画を作る。

下記の方法を用いてうさぎの抗ＲＨＰＩｇから各分画に分けることもできる。

うさぎＩｇＧからＦ（ａｂ’）２抗ｕ　ＨＰ　ｏ製造ｉ、ＩｇＧ溶液−５ｒｎｌ中１７５　ｍ？２．０．２５％塩酸ナトリウム溶液中０．０５Ｍ酢酸塩緩ｌｉｉ液ｐＨ４，０で透析する。

３．２ｒｎｌ！の酢酸蝮緩衝液に１５ｍ？のペプシンを溶解する０４、ペプシンをナルゲンフィルター０．４５＋＋＋１でろ過する０５、フィルターを２−の酢酸緩田液で洗浄する。３回縁シ返す。

６、ＩｇＧをろ過してペプ°シン溶液にする。

゛７．−夜３７℃でインキュベートスル。

８、冷却してｓ、ｏｏｏ　ｘｇで３０分間遠心分離する。

９、（ＮＩ（、）２Ｓｏ４結Ｊｕｎｋ液に加エテ、６０％溶液をつくる。各上澄イ液１３．５　ｍｌにたいして５，２６２の（Ｎｌ−１４）２Ｓｏ４を含む。

１０、　８，０００　ｘ税で３０分間遠心分離する。

１１、ペレットは２ｄの０．ＩＭＦ４酸ナトジナトリウム緩衝液ｐＨ８溶解する。

１２、この緩笛液にたいして一夜５℃で何度も変更をして透析する。

１３、透析したＦ（ａｂ’）２をバイオゲル５Ｍ（中メツシュ）でクロマトグラフィーにかける。

１４、Ｆ（ａｂ’）２を含ｂ　分画ラフ−ルスル。。

うさぎＩｇＧからのＦａｂ抗ＲＨＰの製造１、ＩｇＧ溶液：５ｄ食塩水中１００ｍ９゜２．０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩唾液（ｐＨ５，５）　：　０．０５％アジドナトリウム中で透析する。

３、　透析り、りＩｇＧ１液ニ、０．０２　Ｍ　ＢＤＴＡ　オｊ　ヒ０．０００５Ｍ　ジチオスレイトール中０．２　ｄラテックスパパインＣｌ８１．９単位／　ｍｙ、３２．７ｍｙ／ｙ）懸濁液を加える。

４、時々振とうしながら、３７℃で８時間インキュベートしてラテックスを懸濁状態に保つ。

５、　３．ｏｏｏ　Ｘｇで室温で３０分間遠心分離する。

６．０．０５％アジドナトリウムを含む０．　ＯＩ　Ｍ酢酸塩緩衝液を種々に変化したものに対して上澄与液を透析する。

７、試料をＣＭ−セルロースのカラムにかける。

８、　Ｆａｂ分画を０．０５　Ｍ酢酸塩緩衝液ｐＨ５，５を用いて溶出する。

９、　Ｆａｂを含む分画をプールする。

７７ゼカスら：　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　３５　：　１．１９８０によって記述された方法を利用してＲＨＰに対するモノクロナール抗体を製造するためにＲＨＰを用いることが出来る。その方法の要点は下記の通りである。

１、動物、好ましくはラットまたはマウスのようなケラ索類動物を、ＲＨＰで免疫する。

２、免疫した動物からＢ　＋）ンパ球、適当には解繊リンパ球を分離する。

３、分離したＢ−リンパ球を動物、好ましくはラットまたはマウスのようなケラ歯動物からとったを髄細胞と融合させる。

４、融合した細胞からＲＨＰと積極的に反応するハイブリドマ細胞ラインを選択する。

５、ハイブリドマ細胞をクローン化して追加のモノクロナール抗体を製造する。

これらの段階の各々を実施する方法は、必要な試薬についても、またそれらを製造または取得する方法についても、当業者には良く知られているものである。

純度の低い抗体をよフ大きい濃度で製造するためには、選定されたハイブリドマをマウス、好ましくは同系統の、または半回系統のマウスに注射すればよい。ハイブリドマは抗体を生成させて適当な潜伏期の後にマウスに腫瘍を生成させ、その結果主マウスの血流および腹膜浸出液（腹水）中に所望の抗体の高濃度（約５ −５−２Ｏ／ｍｇ）を生じる。宿主マウスもまたその血液および腹水中に正常の抗体を持っているが、これらの正常の抗体の濃度はモノクロナール抗体の濃度の約５％に過ぎない。その上、これらの正常の抗体はその特異性において抗ヒトＢ −細胞ではないから、ハーベストの腹水、または血清から得たモノクロナール抗体は本質的に夾雑の抗体のないもの第５表は正常者およびＲＡを含む各種の関節炎その他示した疾患にかかつている者を含む多数の個人から得たＳ１分画を用いたＣ１ｑプレシピチン環の陽性の増大を示す。括弧中の数字は各グループの患者の数を示す。

Ｓ１分画は０．０２６Ｍ　ＥｏＴＡによって透析した血清のオイグロブリン分画から溶出した蛋白質から成っていた。

３．７５μｇの８１蛋白質と０．８５μｇの精製Ｃ１ｑを含む５μｌの溶液を抗Ｃ１ｑを含むアガロース、ゲルの各ウェルに加えた。精製したＣ１ｑの溶液は上に述べたロツサーノらのヒドロキシプロリン法によって測定すると１７０μｇ／ μ！を含んでいた。ウェル当シ加えた量（０，８３μｇ）は加えた蛋白質が無くても１４０ｆｌの直径を持ったプレシビチン環を作った。見かけのＣ１ｑｍ度は標準曲線を設定するためＣ１ｑ除去した血清を用いたＲＩＤ推測値である。増大パーセントはヒドロキシプロリン法ニヨッて測定されたＣ１ｑから計算した平均増加率である。

第５表Ｃ１ｑプレシピチン環のサイズに対するＳ１分画の形響Ｓｌのソース　見かけＣ１ｑ濃度　％増大正常　（１９）　１７４±２２４痛風　（１５）　１８２±６７．２ＳＬＥ　（５）　１７２±６１．ＩＡｓ　（４）　１８３±７６．５ＰｓＡ　（３）　１７８±３３．ＯＲＡ　（４４）　２１６±１４　２７．１これから分かるように、ＲＡ患者の環の直径は１６％から７３％まで変化する。平均は２７．１％であった。正常人および他の関節炎疹を持った患者の平均増加度を表に示す。ＲＡ患者のＲＨＰはＣ１ｑプレシピチン環の大きさを非常に増大させる能力がある点でユニークである。

それゆえ、ＲＨＰの一つの効用はＲＡ患者の診断試験としてである。もう一つはポリクロナールおよびモノクロナールの双方のＲＨＰ抗体の製造用である。

ＲＪ−ＩＰＫ血清レベルもまたＲＡ治療の過程を監視し、また疾患の再発を予測するために用いることが出来る。このことは、その病気が１年以上も鎮静していたＲＡｉ者がこの検査で正常のＣ１ｑレベル（６Ｂ−７２μｇ／ｍ　）であシ、またｒＬ　ＨＰは検知できないことから明らかである。臨床的にはまだ症候は無かったが、Ｃ１ｑレベルは１０２μｇ／ｄに増大して几ＨＰ陽性になった。１ケ月後、彼のＣ１ｑ血清レベルは９８μｇとなシ、彼は尚ＲＨＰ陽性であシ、彼の病気は活性となっていた。

以前の観察に関連して、以下のことを指摘する必要がある：（１）必要な結論に達するに増加したＲＨＰだけを観察することで充分であること、また（２）増加したＣ１ｑの観察はＲ，Ａにとっては満足できる試験ではない、なぜならば複雑な設備のない医院とか診療所では試験を行うことは複雑過ぎ、また、それは正常人の約８％に生じ、血管炎によって面倒になったＲＡＩＣ急速に放出されるからである。

本発明の几ＨＰのもつとも重要な医学的用途はｒＬ　ＨＰに対する抗体の製造のためのものである。これらは次に現在病気にかかっている者、回復期にある者、病気の発生の危険がある者の几）−Ｉ　Ｐを検知するために用いることが出来る。これらの診断の目的には多価のまたはモノクロナール抗体が試験対象の者から取ったＲＨＰ因子と反応して、陽性の者の場合には検知できる生成物を生成する。ＲＨＰの存在を測定することを意図した試験に用いられる抗体組成物はＲＨＰと反応する充分な抗体を含んでいなければならない、この目的のＲＨＰは検知出来る生成物を生成する抗体と考えてよい。このような診断学的に有効な量の抗体は当業に精通する者にとって良く知られた多数の要因によって大きく変化する。

これらは、例えば用いた試験、利用出来る機器設定、および試験されている試料の量の感度および特殊性を含む。

本発明の抗体を利用して多数の臨床試験のいずれでも用いる事が出来る。代表的な試験にはラジオイムノアッセイ、酵素結合イムノアッセイ、沈降、凝集法、直接および間接螢光抗体法、および補体結合法がある。これらの試験はコンペテイテイブアツセイおよびサンドイッチ型アッセイを用いることが出来る。

試験は検知できる標識を用いてもよい。ＲＨＰ（抗原）、抗体、またはボート抗うさぎ血清のような抗抗体を標識してもよい。有用な標識にはフルオレセイン、ローダミン、オーラミンのような螢光標識がある。＋４（２，１３１Ｉ　、１２５１、および３５３のような放射性同位元素を用いることもできる。利用することが出来る酵素標識は、例えばΣエラプッシュパーオキシダーゼ、β−Ｄ−グルフキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトキシダーゼ、ウレアーゼ、グルコース。

オキシダーゼ、プラス、パーオキシダーゼ、および酸性ホスファターゼがある。

細胞、抗体、抗原、および抗血清のような生物学的生成物を標識する方法は良く知られてお（、記述するまでもない。

例えば色度計法、分光光度計法、螢光分光測定法、および胃計測法などのような生物学的生成物を標識する方法を含むこれらの標識を検知する方法、ならびに同位元素を検知する各種の器械計測法などいくつかの最近の方法も利用出来る。

本発明に従って有用に用いられる試験の全ては発明の抗体を含む検知出来る反応生成物の形成およびＲＨＰ因子を含む。勿論、検知出来る生成物には抗−抗体のような他の成分もある。

７、試験キット本発明によって可能となった診断技術の進歩を利用するためには広範囲の試験キットが可能である。そのいくつかをここで述べる。その他は当業者によって適宜工夫されよう。

試験キットにおける主要な反応は血清中のＲＨＰとＦａｂ　４たはＦ（ａｂ’）２とのものである。免疫反応の後、未反応の血清は洗浄によって除去される。全抗ＲＨＰ　ＩｇＧを用いてＦａｂ　ｉたはＦ（ａｂ’）２ＲＨＰの遊離抗原部位と反応させる。第一の抗体としてＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２を用いることはＲＦが全１ｇＧのＦｃ部分に結合する可能性を回避する。

以上に述べた記述はうさぎからの抗ＲＨＰＩｇＧの作成及びパパインの生成物およびこの材料のペプシン消化物の作成に向けられる。試験キットおよび試験方法についての下記の記述はうさぎの製剤に基づいている。事実、うさぎはＩｇＧおよびその分画の好ましいソースである。

当業に知識を有する者はこの記述がうさぎの単なる例示としてのみ利用して居ることを認めるであろう。他の動物を使うこともできるが、その場合、試験にまたキット−に用いた他の試薬をある程度修正することが必要になる。

そのような修正は当業に精通した者には容易に明らかであろう。

種々の吸着剤のいずれも用いることができる。これらは例えば試験管の内面または試験板の表面となるガラスまたはプラスチックの表面を含む。酵素結合したイムノアッセイ法（ＥＬＩＳＡ　）　ｔたはラジオイムノアラ七イ法（ｒ（ＩＡ）に特に有用な平たい面の代表的な例にはガラス、ニトロセルロース紙またはポリスチレン、ポリカーボネートまたは各種のポリビニールのようなプラスチックスがある。反応生成物が視覚で検知できるような巨視的方法たとえば血液凝集反応法に用いることができる生物学的粒子には羊赤血球またはとトＯ型赤血球があり、また、生物学的に不活性な粒子たとえば木炭、ベントナイトまたはラテックスビーズがある。後者はポリスチレン、ポリビニールピロリドンまたは各種のポリビニールで形づくることができる。

リガンドは公知の方法にしたがって直接吸着、強制吸着、およびカップリングによって表面に付着させることができる。赤血球の場合には付着にはタンニン酸処理しまたは塩化第ニクロムでの前処理をおこなうこともできる。

ＥＬ　Ｉ　ＳＡまたはＲＩＡ試験で用いる代表的な試験キットは下記のものを含む：１、吸収したＦａｂ　、　Ｆ（ａｂ’）２抗ＲＨＰ−）：たけその双方。

典型的にはうさぎ抗ＲＨＰＩｇＧからのもの。

２、うさぎ抗ＲＨＰ全ＩｇＧ３、標識したプロティンＡ１または標識したボートまたは羊抗うさぎＩｇＧ、　Ｆｃフラグメント。

キットはまた、ｐＨ７，２で１％−３％のＢＳＡを含むＰＢＳのような適当な緩衝液および適当なＲＨＰ陽性および陰性の対照を含んでもよい。これらの材料はキットにしてもよく、または別に設けるかまたは作成してもよい０ “プレート“の用語は広義に用いて上述のような平たい面を含む。

実際にはそのようなキットは下記のように用いる。

１、試験患者の血清でプレートを適当な時間および温度、例えば２−４時間３７ ℃、インキユキベートする。

２、ＰＢＳ、ＢＳＡで洗浄する。

３、標識していないうさぎ（ｕｎｔａｇｇｅｄ　ｒａｂｂｉｔ　）抗ＲＨＰ全ＩｇＧをインキユキベートし、同じ緩衝液で洗浄する。

４、検知出来る標識（１ａｂｅｌ　）で標識した（　ｔａｇｇｅｄ　）プロティンＡまたは羊またはボート抗うさぎＩｇＧのＦｃフラグメントをインキュ★ベートシ、同じ緩衝液で洗浄する。

５、上記の方法のいずれかによって標識を検知することによって試験が陽性の場合には反応生成物の生成を検知する。

ＥＬＩＳＡまたはＲＩＡに用いる別の代表的なキットは下記のものを含む。

１、代表的にはうさぎ抗−ＲＨＰＩｇＧからの、吸着したＦａｂ　、　Ｆ（ａｂ ’）２抗ＲＨＰ、またはその両方テップレート。

２標識したうさぎ抗ＲＨＰＩｇＧ分画このキットもまた上記のように適当な緩衝液および陽性ならびに陰性の対照物を含む。

このキットの使用法も第３段階及び第４段階が省かれている外は第一のキットの用法と同様である。

粒子または巨視的システムで用いる典型的なキットは、典型的にはうさぎ抗ＲＨＰＩｇＧからの吸着したＦａｂ抗ＲＨＰを持ったラテックスまたは他の粒子を含む。キットはまた適当な緩衝液および陽性及び陰性の対照物を含んでもよい。

実際には吸着した抗体分画をもった粒子は試験されている透析した血清でインキユキペートされる。試験が陽性の場合は目視で検知できる。

粒子または巨視的試験キットのその他の改変したものは下記のものを含む：１、　Ｆ（ａｂ’）　２が粒子に吸着されて溶液にＦ（ａｂ’）　２を含む緩衝液媒体に懸濁されたもの。

２、Ｆ（ａｂ′）２が粒子に吸着されて緩衝液媒体に懸濁されたもの。

３、　Ｆａｂが粒子に吸着されて緩衝液媒体に懸濁されたもの。

４、　Ｆａｂが粒子に吸着されて溶液にＦ（ａｂ’）２を含む緩衝液に懸濁されたもの。

典型的にはＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２はうさぎ抗ＲＨＰＩｇＧからとる。キットはまた陽性及び陰性対照物ならびにＰＢＳ、ＢＳＡまたは他の適当な緩衝液を含んでもよい。

これらのキットの各々で、試験にかける透析した血清をキット試薬をつけたスライド上でインキユキベートし、１そして、試験が陽性の場合には、反応生成物を目視観察する。

国際調査報告１′ｍＲＩ１１６Ｍａｌ　Ａｐ９１１ｅＪｌｌＧＡ　Ｎ°ｐｒＴ／Ｉ＋＜１１６／＋１１’Ｎ　ＱＯ

Claims

【特許請求の範囲】１．ヒトリウマチ性関節炎の患者の血清から単離出来るリウマチ性関節炎因子であつて、下記の特性によつて同定出来るもの：１．等電点ｐＨ５．１−５．３２．ｐＨ５．５での０．０２モル酢酸緩衝液中でヒト血清から沈殿３．ｐＨ７．５で０．０２６モルのエチレングリコールテトラ酢酸（ＥＧＴＡ）に可溶４．ヒト血清のオイログロブリン分画に存在５．ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によつて検知される約１３５，０００の分子量６．放射状免疫拡散法（ＲＩＤ）におけるＣｌｑブレシピチン環の大きさを大きくする。７．Ｃｌｑの溶血活性を抑制する。８．Ｃｌｑのフィブロネクチンとの結合を抑制する。９．合計分子量の９０％以上に下記のアミノ酸が係わつている。アスパラギン酸、ＡＳＰアラニン、ＡＬＡスレオニン、ＴＨＲバリン、ＶＡＬセリン、ＳＥＲフェニルアニン、ＰＨＥグルタミン酸、ＧＬＵヒスチジン、ＨＩＳブロリン、ＰＲＯグリシン、ＧＬＹイソロイシン、ＩＳＯＬＥＵロイシン、ＬＥＵシステイン、ＣＹＳチロシン、ＴＹＲリシン、ＬＹＳアルギニン、ＡＲＧ１０．ヒトＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＭに対する抗体とは反応しない。２．慢性関節リウマチ因子に対する抗体であつて、その因子はヒト慢性関節リウマチ患者の血清から単離出来、かつ下記の特性によつて同定出来るもの：１．等電点ｐＨ５．１−５．３２．ｐＨ５．５での０．０２モル酢酸緩衝液中でヒト血清から沈殿３．ｐＨ７．５で０．０２６モルのエチレングリコールテトラ酢酸（ＥＧＴＡ）に可溶４．ヒト血清のオイログロブリン分画に存在５．ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によつて検知される約１３５，０００の分子量６．放射状免疫拡散法（ＲＩＤ）におけるＣｌｑブレシピチン環の大きさを大きくする。７．Ｃｌｑの溶血活性を抑制する。８．ＣＩｑのフイブロネクチンとの結合を抑制する。９．合計分子量の９０％以上に下記のアミノ酸が係わつている。アスパラギン酸、ＡＳＰアラニン、ＡＬＡスレオニン、ＴＨＲバリン、ＶＡＬセリン、ＳＥＲフェニルアニン、ＰＨＥグルタミン酸、ＧＬＵヒスチジン、ＨＩＳブロリン、ＰＲＯグリシン、ＧＬＹイソロイシン、ＩＳＯＬＥＵロイシン、ＬＥＵシステイン、ＣＹＳチロシン、ＴＹＲリシン、ＬＹＳアルギニン、ＡＲＧ１０．ヒトＩｇＧ、１ｇＡお上びＩｇＭに対する抗体とは反応しない。３．請求の範囲第２項の慢性関節リウマチ因子に対する抗体のＦ（ａｂ′）２分画。４．請求の範囲第２項の慢性関節リウマチ因子に対する抗体のＦａｂ分画。５．慢性関節リウマチ因子に対する抗体のＦ（ａｂ′）２分画を診断上に有効な量含む組成物であつて、その因子はヒト慢性関節リウマチの患者の血清から単離出来、かつ下記の特性によつて識別出来るもの：１．等電点ｐＨ５．１−５．３２．ｐＨ５．５での０．０２モル酢酸緩衝液中でヒト血清から沈殿３．ｐＨ７．５で０．０２６モルのエチレングリコールテトラ酢酸（ＥＧＴＡ）に可溶４．ヒト血清のオイログロブリン分画に存在５．ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によつて検知される約１３５，０００の分子量６．放射状免疫拡散法（ＲＩＤ）におけるＣｌｑブレシピチン環の大きさを大きくする。７．Ｃｌｑの溶血活性を抑制する。８．Ｃｌｑのフイブロネクチンとの結合を抑制する。９．合計分子量の９０％以上に下記のアミノ酸が係わつているアスパラギン酸、ＡＳＰアラニン、ＡＬＡスレオニン、ＴＨＲバリン、ＶＡＬセリン、ＳＥＲフェニルアニン、ＰＨＥグルタミン酸、ＧＬＵヒスチジン、ＨＩＳブロリン、ＰＲＯグリシン、ＧＬＹイソロイシン、ＩＳＯＬＥＵロイシン、ＬＥＵシステイン、ＣＹＳチロシン、ＴＹＲリシン、ＬＹＳアルギニン、ＡＥＧ１０．ヒトＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＭに対する抗体とは反応しない。６．慢性関節リウマチ因子に対する抗体のＦａｂ分画を診断上有効な量含む組成物であつて、その因子はヒト慢性関節リウマチの患者の血清から単離出来、かつ下記の特性によつて同定出来るもの：１．等電点ｐＨ５．１−５．３２．ｐＨ５．５での０．０２モル酢酸緩衝液中でヒト血清から沈殿３．ｐＨ７．５で０．０２６モルのエチレングリコールテトラ酢酸（ＥＧＴＡ）に可溶４．ヒト血清のオイログロブリン分画に存在５．ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によつて検知される約１３５，０００の分子量６．放射状免疫拡散法（ＲＩＤ）におけるＣｌｑブレシピチン環の大きさを大きくする。７．．Ｃｌｑの溶血活性を抑制する。８．Ｃｌｑのフイブロネクチンとの結合を抑制する。９．合計分子量の９０％以上に下記のアミノ酸が係わつているアスパラギン酸、ＡＳＰアラニン、ＡＬＡスレオニン、ＴＨＲバリン、ＶＡＬセリン、ＳＥＲフェニルアニン、ＰＨＥグルタミン酸、ＧＬＵヒスチジン、ＨＩＳブロリン、ＰＲＯグリシン、ＧＬＹイソロイシン、ＩＳＯＬＥＵロイシン、ＬＥＵシステイン、ＣＹＳチロシン、ＴＹＲリシン、ＬＹＳアルギニン、ＡＲＧ１０．ヒトＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＭに対する抗体とは反応しない。７．試験されている者からとった血清に診断上有効な量のＦ（ａｂ′）２分画、Ｆａｂ分画、または慢性関節リウマチ因子に対する抗体のそのような分画の混合物を含む組成物をインキユサべートすることから成る、ヒトの慢性関節リウマチを検知する方法であつて、その因子はヒト慢性関節リウマチの患者の血清から単離出来、かつ下記の特性によつて同定できるもの：１．等電点ｐＨ５．１−５．３２．ｐＨ５．５での０．０２モル酢酸緩衝液中でヒト血清から沈殿３．ｐＨ７．５で０．０２６モルのエチレングリコールテトラ酢酸（ＥＧＴＡ）に可溶４．ヒト血清のオイログロブリン分画に存在５．ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によつて検知される約１３５，０００の分子量６．放射状免疫拡散法（ＲＩＤ）におけるＣｌｑブレシピチン環の大きさを大きくする。７．Ｃｌｑの溶血活性を抑制する。８．Ｃｌｑのフイブロネクチンとの結合を抑制する。９．合計分子量の９０％以上に下記のアミノ酸が係わつているアスパラギン酸、ＡＳＰアラニン、ＡＬＡスレオニン、ＴＨＲバリン、ＶＡＬセリン、ＳＥＲフェニルアニン、ＰＨＥグルタミン酸、ＧＬＵヒスチジン、ＨＩＳブロリン、ＰＲＯグリシン、ＧＬＹイソロイシン、ＩＳＯＬＥＵロイシン、ＬＥＵシステイン、ＣＹＳチロシン、ＴＹＲリシン、ＬＹＳアルギニン、ＡＲＧ１０．ヒトＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＭに対する抗体とは反応しない。かつ、試験が陽性の場合は、少なくともその分画の−つを含む反応生成物の存在を検知するもの。８．慢性関節リウマチにかかつたヒトを検知するための試験キットであつて、そのキットは診断上有効な量のＦ（ａｂ′）２分画、Ｆａｂ分画、または慢性関節リウマチ因子に対する抗体のような分画の混合物を含み、その因子はヒト慢性関節リウマチの患者の血清から単離出来、かつ下記の特性によつて同定出来るもの：１．等電点ｐＨ５．１−５．３２．ｐＨ５．５での０．０２モル酢酸緩衝液中でヒト血清から沈殿３．ｐＨ７．５で０．０２６モルのエチレングリコールテトラ酢酸（ＥＧＴＡ）に可溶４．ヒト血清のオイログロブリン分画に存在５．ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によつて検知される約１３５，０００の分子量６．放射状免疫拡散法（ＲＩＤ）におけるＣｌｑブレシピチン環の大きさを大きくする。７．Ｃｌｑの溶血活性を抑制する。８．Ｃｌｑのフイブロネクチンとの結合を抑制する。９．合計分子量の９０％以上に下記のアミノ酸が係わつているアスパラギン酸、ＡＳＰアラニン、ＡＬＡスレオニン、ＴＨＲバリン、ＶＡＬセリン、ＳＥＲフエニルアこン、ＰＨＥグルタミン酸、ＧＬＵヒスチジン、ＨＩＳブロリン、ＰＲＯグリシン、ＧＬＹイソロイシン、ＩＳＯＬＥＵロイシン、ＬＥＵシステイン、ＣＹＳチロシン、ＴＹＲリシン、ＬＹＳアルギニン、ＡＲＧ１０．ヒトＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＭに対する抗体とは反応しない。