JP2853877B2 - プロタミン反応性ＩｇＭ抗体 - Google Patents

プロタミン反応性ＩｇＭ抗体

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Description

【発明の詳細な説明】 1.序 本発明は、プロタミン反応性のIgM抗体、及び、予
知、診断ならびに治療におけるその使用に関する。特
に、本発明は、６個のアミノ酸残基片内で、トリプレッ
トを含む４個のアルギニル残基を含む配列を認識するこ
とができ、抗原に対して低い結合親和性を示す、プロタ
ミン反応性の血清IgM抗体に関する。プロタミン反応性
の血清IgM抗体のこの低親和性抗体のサブセットは、エ
イズ（AIDS）の予知又は診断のためにアッセイすること
ができる。低親和性のプロタミン反応性血清IgM抗体の
検出及び／又は測定のための方法及び診断用キットが提
供される。
2.発明の背景 2.1.プロタミン プロタミンは、精子細胞及び複数の精子以外の細胞に
は生じないDNAに結合する（associated with）、極めて
塩基性の小さな核蛋白質である。精子完成、即ち、思春
期後の精巣の輸精管の免疫学的に隔離された内腔におい
て生ずる工程であって、ここでは上記蛋白はヒストンを
置換し、そして、精子のDNAに結合されるのであるが、
この精子完成の間に、この蛋白は、新たに合成され、そ
して、精子を形成する細胞の核にとりこまれる（Gilul
a,N.B.,ら,1976,Dev.Biol.50:142）。
プロタミン１（もともとはp15と命名）は、４つの変
異体の中に生ずるヒトのプロタミンである。それは、モ
ノクローナル抗体（HPmAbと命名、後掲）の使用により
同定され、特性化された（Rodman,T.C.,ら,1983,Gamete
Res.8:129−147）。
ヒトプロタミン２は長いこと認識され、そして、２個
の変異体として生ずることが知られており（Kolk,A.H.
及びSamuel,T.,1975,Biochim.Biophys.Acta 393:307−3
19）、後にプロタミン2a及び2bと命名された（Mckay,D.
J.,ら,1986,Eur.J.Biochem.156:5−８）。
マウス精子クロマチンの２個のプロタミンに特異的な
多価ウナギ抗血清が分離されており、これは分布及びDN
A会合（association）についてプロタミンを特性化し、
かつ、哺乳類プロタミンの間の免疫化学的な交差反応性
を認識するために使用されてきた（Rodman,T.C.ら,198
4,Exp.Cell Res.150:269−281）。
ヒトプロタミンに対するポリクローナルウサギ抗血清
が、精子完成の間のプロタミン転移に対するヒストンの
免疫組織化学的研究において使用されてきた（Roux,C
h.,ら、1988,J.Reprod.Fert.82:35−42）。この研究に
おけるイムノアッセイの検出工程は、ウサギIgGに対す
る抗体の使用により実施された。
IgG1及びIgG2のアイソタイプのヒトプロタミンに対す
るマウスのモノクローナル抗体が分離され、そして部分
的に特性化された（Stanker,L.H.,ら,1987,Hybridoma 6
（３）:293−303）。記載さた抗体はいずれもポリアル
ギニンとは反応しなかった。
SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、又は凝集反
応試験により分離された精子抗原と反応性の抗体をアッ
セイするウェスタンブロット法により、精子抗原に対す
る自己抗体が精管切除された雄において検出された（Ha
ld,J.,ら,1987,J.Reprod.Immunol.10:15−26）。プロタ
ミンはSDS−ポリアクリルアミドゲルにおいて移動する
には余りに塩基性が強く、クロマチンが非凝縮（decond
ensed）されなければアクセスできない免疫反応箇所を
有するので、この報告されたアッセイは抗プロタミン抗
体を検出しなかった（Rodman,T.C.,ら,1970,J.Cell Bio
l.80:605−620）。
2.2.自然抗体 まだ、ほとんど理解されていない免疫系の一部分であ
る自然抗体のレパートリーは、初期には、特異的な感染
物質に対する第１次防御を提供すると考えられたが（Mi
chael,J.G.,1969,Curr.Top.Microbiol.Immunol.48:43−
62）、最近では、自己免疫のコントロールにおける可能
な役割（Cohen.i.,ら,1986,Immunol.Today 7:363−36
4）、又は、免疫調節の他の相（Dighiero,G.,ら,1985,
J.Immunol.134:765）に関して、ますます興味のある推
測の主題となっている。自然抗体は、しばしば、誘引さ
れた対応物よりも、より低い親和性を有する対応物とし
て指名されている（例えば、Day.E.D.ら,1986,J.Neuroi
mmunol.13:143−158;Hoch,S.,ら,1986,J.Immunol.136:8
92−897;Tongio,M.M.,ら,1985,Tissue Antigens 26:27
−285）。
2.3.後天性免疫不全症候群 後天性免疫不全症候群（AIDS）は減少した細胞媒介性
免疫反応により第一義的に起こされた重い免疫不全によ
り特徴づけられる病気である（Gottlieb,M.,ら,1981,N.
Engl.J.Med.305:1425;Masur,J.,ら,1981,N.Engl.J.Med.
305;1431）免疫不全の状態は、減少したTH（Ｔ−ヘルパ
ー）リンパ球、通常のCD4(T4)+：CD8(T8)+の細胞比の逆
転、リンパ球減少症、日和見感染の増大した発病率（例
えば、ニューモシスチス カリニフェーモニア（Pneumo
cystis carinii pneumonia）、及び／又は悪性性（例え
ば、リンパ腫又はカポジ肉腫）により特徴づけられる。
症状は、一般に致命的である。
AIDSを引き起こすものは、THリンパ球に感染する、今
日、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）とよばれるレトロウ
イルスである（又、LAV/ARV/HTLVIIIとしても分離され
る）（Gallo,R.C.,ら,1984,Science 224:500;Barre−S
inoussi,F.,ら,1983,Science 220:868;Feorino,P.M.ら,
1984,Science 225:69;Levy,J.A.,ら,1984,Science 225:
840）。CD4 T細胞表面分子はこのウイルスの受容体とし
て同定され、そして、このウイルスのその後の細胞溶解
活性はこの細胞集団を消耗させる（Klatzman,D.,ら,198
5,Nature 312:767;Dalgleish,A.G.,ら,1984,Nature 31
2:763;McDougal,J.S.,ら,1986,Science 231:382;Maddo
n,P.J.,ら,1986,Cell 47:333）。
患者は、（１）HIVの存在試験が陽性で、特別の指示
的な疾病（新生物、日和見感染）の１又はそれ以上が存
在する時、又は（２）HIV感染に対する実験室的証拠が
ない場合、他のすべての免疫不全の原因が除外され、そ
して、低CD4+Ｔリンパ球数（400/mm3以下）であるとと
もに指示的な疾病の１つが存在するとき、この患者はエ
イズ（AIDS）と診断される。エイズ関連複合体（ARC）
は、HIV試験が陽性であり、永続的な一般的なリンパ節
傷害、長期持続性の発熱、体重減少、永続的な下痢、又
は極端な疲労を有するが、成熟したエイズに関連する指
示的疾病の１つを未だ示していない患者に関する。
多くの研究は、エイズの危険のある有意の因子は、受
容的な肛門性交であることを示している（例えば、Goed
ert,J.J.,ら,1984,Lancet ii:711−716;Darrow W.W.,
ら,1987,Am.J.Pub.Health 77:479−483;Kingsley,L.A.,
ら,1987,Lancet ii:345−348）。増大する危険は、一般
には、かかるルートによるウイルスの伝播の効率性に帰
因する。しかしながら、ある考察は、HIV感染の病理学
的な結果において、精子成分のありうる密接な関係につ
いてなされている（Mavligit,G.M.,ら,1984,J.Am.Med.A
ssoci.251:237−241;Ranki A.,ら,1985,Cancer Res.45:
4616S−18S;Ratman,K.V.,ら,1986,Aust.N.Z.J.Med.15:7
57−760）。HIVに感染された血友病の潜伏期間は、他の
HIVが感染したグループの潜伏期間よりも長いという最
近の報告があることも意味があるかもしれない（Ekert,
H.,1987,Nature 329:494）。
アダムら（1988,Clin.Immunol.Immunopathol.45:442
−449）は、ARC又はエイズ患者の血清中の精子及び精子
のプラズマ成分に対する抗体の有意の影響が存在するこ
とを報告した。抗体は、抗体の精子プラズマに対する凝
集反応により、及び固定されたヒト精子上の間接的な免
疫蛍光法により、アッセイされた。プロタミンは核蛋白
であり、それゆえ抗体結合及び凝集反応のための精子プ
ラズマにおいてはアクセスできないであろうこと、及
び、プロタミンの免疫反応箇所は、精子クロマチンが最
初に非凝縮されていなければ、免疫蛍光アッセイにおけ
る抗体結合に対してはアクセスしえないので、使用され
たアッセイ法のいずれもプロタミン−反応性の抗体を検
出することはできなかった（Rodman,T.C.,ら,1970,J.Ce
ll Biol.80:605−620;Rodman,T.C.,ら,1984,Exp.Cell.R
es.150:269−281）。
3.発明の概要 本発明は、プロタミン反応性IgM抗体、及び、予知、
診断ならびに治療におけるその使用に関する。特別の態
様において、本発明は低親和性の結合を有するプロタミ
ン反応性血清IgM抗体に関する。特に、かかる抗体は６
アミノ酸残基配列内で、トリプレットを含む、４個のア
ルギニル（arginyl）残基を有する配列を認識すること
ができる。かかる抗体の自然抗体（非誘引のもの）であ
ろう。
血清のプロタミン反応性のIgM抗体の低親和性サブセ
ットは、エイズの予知又は診断のためにアッセイでき
る。かかる抗体は正常の被検者及びHIVに感染された有
意の潜伏期間を示す者の血清において検出可能である
が、しかし、エイズと診断されたもの、及び、サンプリ
ング時には無症候と考えられたが、比較的に短時間内に
エイズに移行するものの血清には存在しないか、不十分
である。本発明はエイズ及び他の免疫異常の予知及び診
断のためのプロタミン反応性の血清IgM抗体の低親和性
サブセットの検出及び／又はその定量測定のための方
法、及び、診断用キットを提供する。特別の態様におい
て、かかる診断用キットは、（ａ）６個のアミノ酸残基
の配列内にトリプレットを含む４個のアルギニル残基を
もつ配列からなるペプチド；及び（ｂ）IgM抗体のため
の特別の結合パートナーと検出可能なシグナルを発生す
ることができるラベルの接合体（conjugate）とから成
る。
3.1.定義 ここで使用されるとき、次の略号は、以下に示す意味
をもつであろう。
エイズ（AIDS）＝後天性免疫不全症候群 ARC ＝エイズ関連複合体 （AIDS−related complex） BSA ＝牛血清アルブミン ELISA ＝酵素結合イムノソルベントアッセイ Fv ＝抗体分子の可変領域又は抗原結合箇
所。これはFab,F（ab′）2,Fab′等を含む分子（これに
限定されない）のイディオタイプを含有するいかなる断
片でもよい。
HIV ＝ヒト免疫不全ウイルス HPmAb ＝ヒト精子プロタミンに対するモノクロ
ーナル抗体 mAb ＝モノクローナル抗体 P1 ＝精製ヒトプロタミン１ P2 ＝精製ヒトプロタミン２ PAGE ＝ポリアクリルアミドゲル電気泳動法 PBS ＝燐酸緩衝食塩水 4.図面の説明 第１図。ヒト血清中の全IgMに対するプロタミン反応
性のIgMの割合。各々の血清に対する全IgMに関する値
（Ｘ）は参照血清（第6.1.1項参照）のパーセントとし
て導かれており、プロタミン反応性IgMに対する値
（Ｙ）は同じ参照血清のパーセントとして導かれてい
る。プロットされた値は各血清に対するX/Yである。
第２図。A:ヒト精子蛋白の分画（レーン１〜５）SDS
PAGE;レーン（６〜８）酢酸−尿素PAGE。（レーン１）
分子量マーカー:14.4,20,30,43,67,94×103ダルトン；
（レーン２）テイル（尾部）蛋白；（レーン３）頭部膜
のトライトンＸ−100可溶性蛋白；（レーン４）核蛋白
のBioRex−70クロマトグラムの８％GuCl溶出液；（レー
ン５）16％溶出液；（レーン６）23％溶出液（P1）：
（レーン７）25％溶出液（P1及び燐酸化されたP2）；
（レーン８）27％溶出液（P2）。B:各精子の蛋白分画と
のHPmAb反応性のELISA値。（レーン２〜５）・・・・・
・・・・；（レーン６）−・−・−；（レーン７）−；
（レーン８）‐‐‐HPmAbは３つのプロタミン分画との
み反応性である（レーン6,7,及び８）。
第３図。上昇する濃度におけるHPmAbのポリアルギニ
ン（Ａ）及びポリリジン（Ｂ）との反応性。２μg/mlポ
リアルギニン−・−・−;5,10,又は20μg/mlのポリアル
ギニン‥‥‥‥:2,5,10,又は20μg/mlのポリリジン−。
各プロットされた値は、重複して行われた、４つのアッ
セイの平均を表わしている。
第４図。HPmAbの（Ａ）２μg/mlでのP1−・−・−;5
μg/mlでのP1‥‥‥‥;10又は20μg/mlのP1−；（Ｂ）
２μg/mlのP2−・−・−;5μg/ml‥‥‥‥;10μg/ml−;
20μg/ml---との反応性。各プロットされた値は重複し
て行われた５個のアッセイの平均を表わす。P1とP2の等
モル（等しい重量）に関し、HPmAbの反応性はP1の抵抗
原濃度でより大きく、そして、飽和している。
第５図。ヒト血清IgMの（Ａ）P1,（Ｂ）P2,（Ｃ）ポ
リアルギニンとの各抗原の２μg/ml−・−・−;5μg/ml
‥‥‥‥;10μg/ml−;20μg/ml---における反応性。
（左欄）小児（６月）の血清；（中欄）成人男；（右
欄）成人女。
第６図。（Ａ）P1及び（Ｂ）P2に対するHPmAbのヒト
血清IgM反応性との競合。標準ELISAプロトコール（第6.
1.1項参照）は、次のように修正して実施された。抗原
が結合したくぼみ（wells）にヒト血清を加える前に、
希釈度を1:1000−;1:10,000‥‥‥‥；非存在‐‐‐で5
0μｌのHPmAbを各くぼみに１時間置き、次に洗い出し、
そして記載した希釈度のヒト血清を加えた；反応性はペ
ルオキシダーゼ共役の抗ヒトIgMを使用して検出され
た。（Ａ）1:1000の希釈度のHPmAbは、P1に関し、1:100
及び1:500希釈の血清において〜45％の血清の反応性を
阻止した。（Ｂ）1:1000希釈のHPmAbは、P2に関し、血
清が1:100に希釈された時は、〜25％の血清の反応性
を、血清が1:500に希釈された時は、〜45％の反応性を
阻止した。
第７図。プールされたプロタミンに血清を吸着させた
後の、ヒト血清IgMのP1−;P2---及び精子頭部膜蛋白‥
‥‥‥との反応性。（Ａ）非吸着血清；（Ｂ）100μｇ
のプロタミンに吸着された血清；（Ｃ）200μｇのプロ
タミンに吸着された血清。
第８図。ヒストンに吸着された後の、ヒト血清IgMのP
1−・−・−,P2−，精製した牛胸腺ヒストン（等モル量
のH1,H2a,H2b,H3及びH4を含む）‥‥‥‥との反応性。
（Ａ）非吸着血清、（Ｂ）200μｇヒストン上に吸着、
（Ｃ）500μｇのヒストン上の吸着。
第９図。ひと血清IgMのP1−,P2---,ポリアルギニン‐
‐‐及びポリリジン−・−・−との反応性。（Ａ）非吸
着血清；（Ｂ）200μｇのポリリジンに吸着された血
清；（Ｃ）200μｇのポリアルギニンに吸着された血
清。
第10A図。次のように上昇する濃度のプロタミン−２
（P2）:2μg/ml‥‥‥‥,5μg/ml−−−−,10μg/ml−
・−・−,20μg/ml−,50μg/ml---と反応する抗体を検
出するため、３人の正常な（臨床所見なし、HIV陰性）
大人の被検者のそれぞれから得た血清（Rodman,T.C.,
ら,1986,J.Immunol.Meth.94:105−111;Pruslin,F.H.,
ら,1986,J.Immunol.Meth,94:99−103）中におけるELISA
（O.D.490nm）が示されている。高い抗原濃度について
1:100の希釈血清と1:500のものの間の曲線の急激な上昇
は、これらの血清には、プロタミン反応性IgM抗体の２
つのサブポピュレーションが存在することを示唆してい
る。
第10B図。次の濃度:2μg/ml‥‥‥‥,5μg/ml−−−
−,10μg/ml−・−・−、20μg/ml−において、抗原と
してのP2とともに実施された、20人の正常な大人の血清
のIgMアッセイのサマリー曲線は、高い抗原濃度におい
てカーブの増大を示しており、これはプロタミン反応性
のIgM抗体の第２のサブポピュレーションを示唆するも
のであるが、これは、正常の大人の血清の圧倒的な特色
である。
第10C図。第10A図と同一の濃度における、プロタミン
の一定の抗原箇所を含む合成デカペプチド（DP）との第
10A図と同一の血清の反応性。
P2b* G Q S H Y R R R H C S R R R L H R I H R RQ H
R S C R R R K R R S C R H R R R H R RG C R T R K
R T C R R H DP C R R R K R R S C R* McKay,D.J.,ら,1986,Eur.J.Biochem.156:5−8 P2（第1
0A図）について、DPのより高濃度に対するカーブは、1:
100と1:500の希釈の血清の間で増大を示しており、これ
は、高い抗原濃度で表われるプロタミン反応性のIgM抗
体の第二次ポピュレーションは、第一次ポピュレーショ
ンの抗原認識特異性とは異なり、一層低い結合親和性を
有する抗原認識特異性をもつものであることを示してい
る。
第10D図、第10A及び10C図と同じ血清のIgMの第10A図
と同一の濃度のP2bとの反応性であるが、希釈液は0.3M
NaClであった（一方、他のすべてのアッセイでは、血清
希釈液、PBSは0.15M NaClであった。）。増加されたNaC
lモル濃度において、第10A図で見られた高い抗原濃度に
対するカーブの急な増大は消失し、これは、イオン性相
互作用に基づく抗原−抗体結合の相が制御されたことを
示唆している。こうして、イオン性の相互作用はプロタ
ミン反応性IgM抗体の低い親和性のサブセットの結合の
主要成分であるように思われ、そのポピュレーションの
反応性は選択的に抑制された。
第11A図：（第10A図のような）上昇する濃度における
エイズの３人の患者のそれぞれからの血清中のIgM抗体
のP2との反応性。これらの血清の２つにおいて、全反応
性は上昇する抗原濃度ともに増加し続けるが、このカー
ブの形は、この増大が第10A,B,C図のようなプロタミン
反応性IgM抗体の第二次サブポピュレーションのスーパ
ーインポジション（superimposition（重ねあわせ））
の増大というよりは、むしろ、親和性に関して単峰形の
（unimodal）抗体ポピュレーションの増大であることを
示している。
第11B図。（上述の第10B図で述べた）P2との反応性に
対するエイズ患者からの15個の血清のアッセイに対する
サマリーカーブは、プロタミン反応性IgM抗体の第二次
の低親和性サブポピュレーションの欠除は、エイズ患者
からの血清の典型的なものであることを証明している。
第12図。２μg/ml及び20μg/mlにおけるP2とのIgM反
応性のために各血清をアッセイして得られた値をΔ20−
Δ２として計算し、そして第7.2項で後述するように力
価を計算すると、プロタミン反応性のIgM抗体の低親和
性サブセットの力価の分布は、正常者、エイズ患者及び
エイズの恐れのある被検者からの血清における全プロタ
ミン反応性のIgMに比例する。Ｄグループについて、血
液採取から２番目の診断までの詳細な時間間隔は、上か
ら下に、32,24,44,64,48,60,55,29,32,24ヶ月であっ
た。この時間間隔は被検者の最後の臨床試験の時期を反
映しており、それゆえ、最小の潜伏期間をあらわすもの
である。すべての血清は、HIV蛋白の電気泳動グラム（e
leceropherogram）をニトロセルロースに移すことを行
うウェスタンブロットにより、HIV抗体の存在が試験さ
れた:P18,P24,P31,GP41,P51,P55,P65,GP110/120,GP160
（エピトープ,Inc.Beaverton,OR）。血清は２以上の帯
が染色されたとき陽性とされ、帯が染色されなかったと
き陰性とされた。
第13図。（第1A図及び1C図において述べたように）上
昇する濃度における（Ａ）P2及び（Ｂ）DPとの、３人の
小児（28日令,12日令,5ヶ月令，臨床所見なし）の被検
者のそれぞれの血清中のIgM反応性。P2とDPに対するカ
ーブの類似性は抗原箇所の同一性を示している。カーブ
の形は、右箇所と反応性の小児血清IgM抗体は、親和性
に関して均一又は単峰性であることを示している。
5.発明の詳細な説明 本発明は、プロタミン反応性のIgM抗体、及び、予
知、診断及び治療におけるその使用に向けられる。特
に、この発明は、アルギニルクラスター（cluster:同種
類のものの集り）により特徴づけられるエピトープを認
識する、低親和性結合を行うプロタミン反応性血清IgM
抗体に関する。ヒト血清中のそのようなプロタミン−反
応性抗体の検出及び／又は測定は、HIVの血清陽性とエ
イズの臨床的発現への進行の間の潜伏期間を予測するた
めの診断アッセイに使用できる。本発明は、又、エイズ
及び他の障害の予知及び／又は診断のための低親和性結
合のプロタミン反応性IgM抗体の検出及び／又は測定の
ための方法及びキットを提供する。
5.1.プロタミン反応性IgM抗体 本発明は、プロタミン反応性のIgM抗体に関する。こ
のような抗体は、アルギニルクラスター、特に、６個の
アミノ酸残基片内のトリプレットを含む、４個のアルギ
ニル残基によって特徴づけられるプロタミンのエピトー
プを認識することができる。一つの態様において、この
アルギニルクラスターエピトープは線状の配列のもので
ある。他の態様において、このエピトープはコンフォメ
ーション（立体配座）に依存することができ、トリプレ
ットクラスターを含む、４個のアルギニル残基から成る
抗原決定基を形成する立体配置に帰因する。特別の態様
において、IgM抗体は低親和性をもってアルギニルクラ
スターエピトープに結合する。
特別の態様において、本発明は正常なヒトの血清中に
存在する自然抗体（即ち、誘引されたものでない）であ
る、プロタミン反応性のIgM抗体に関する。
後記第６項で詳述するように、本発明者は、12日令以
上のすべての臨床的に正常な人の血清はプロタミンと反
応するIgM抗体を含んでいること、この抗体は高いオー
ダーの特異性を有する、循環しているIgMの決定的なセ
ットであることを確立し、これらの抗体が反応する抗原
箇所を定義した。
後述するように、本発明のプロタミン反応性のIgM抗
体は、正常な成人の男女、及び、正常な小児（７日令か
ら２年）の事実上すべての血清中で、有意の力価をもっ
て検出された。小児と大人の血清のプロタミン反応性Ig
M抗体の間の共通性は、抗原認識及び反応平衡の類似性
を示すことによって確立された。小児の血清中に見い出
されたプロタミン反応性IgM抗体はプロタミンによる免
疫的刺激によるものではない。というのは、プロタミン
は思春期後の精巣において新たに合成されるものであ
り、精子完全系の細胞以外の細胞の核にはとり込まれな
いからである。IgMは胎盤を横切らないので、新生時の
血清中のプロタミン反応性IgM抗体は母由来のものでも
ない。それゆえ、ヒト血清はプロタミンと反応する（プ
ロタミンにより誘導されるのではない）“自然”抗体の
サブセットを含むと推論することの正しい根拠が存在す
る。
プロタミンは、それが合成され、細胞内にとり込まれ
る間、免疫系から隔離されており（Dym,M.及びFawcett,
D.W.,1970,Biol.Reprod.3:308−326）、そして、我々は
プロタミンが非免疫抑制的であること、即ち、それらは
他の精子由来の蛋白がそうであるように、インビトロで
Ｔ細胞を阻害しないことを示した（Rodman,T.C.ら,198
5,Science 228:1211−1215）。それゆえ、思春期後の男
性及び性交した女性の血清は何らかのプロタミン反応性
抗体、これは、プロタミンによる免疫的誘導に帰因する
ものであるが、を含むことができる。このようにして、
本発明者は、成人のヒト血清のプロタミン−反応性IgM
抗体は２つの起源が異なるサブセット、即ち（１）自然
抗体、及び、（２）誘導された抗体、を含むと仮定す
る。
プロタミン反応性の血清IgM抗体により認識される抗
原箇所の主要な特性は、６個の残基片内の、トリプレッ
トを含む、４個のアルギニル残基という明白な最小限の
要件を持つクラスター化されたアルギニル残基であり、
結合反応は電荷吸引に依存しないことである。一連の免
疫吸着（immunoabsorption）法により示されるように
（後記第６項参照）、蛋白反応性の血清IgM抗体は、高
度の特異性をもつ別個のセットである。
本発明の抗体分子は、抗体分子のイディオタイプの領
域を含む、それらの断片を含め、プロタミン反応性IgM
抗体である；これらは、これに限定されるものではない
が、Fab,F（ab′）2,Fab′断片等のような、Fv領域を含
む断片を含有する。分子のイディオタイプを含む抗体断
片は、既知の方法により生成される。例えば、限定され
るものではないが、次のような断片をふくむ： 抗体分子のペプシン消化により製造されるＦ（ab′）
2断片;F（ab′）2断片のジスルフィド結合を還元して生
成しうるFab,断片、及び、抗体分子をパパイン及び還元
剤で処理することにより製造されるFab断片。
5.2.予知及び診断における使用:HIV感染からエイズの発
病までの潜伏の予測 後記の第７項で詳述するように、血清抗プロタミンIg
M抗体の測定は、HIV感染とエイズの発病の開始との間の
潜伏期間の信頼できる診断的な指示を提供する。本発明
のプロタミン反応性IgM抗体の低親和性サブセットの血
清中における存在又は非存在は、HIVに感染した個人が
エイズの病理的な進行を阻止しうる能力の指示となる。
血清中における非存在が比較的短期間のHIV潜伏と相関
する、抗プロタミンIgM抗体のサブセットの特徴的な性
質は、大人の血清に存在する他のIgM抗プロタミン抗体
に比較してプロタミンへの低い結合親和性である。この
低い親和性の抗プロタミンIgM抗体は、アルギニルクラ
スターにより、特に、６個のアミノ酸残基片内の、トリ
プレットを含む、４個のアルギニル残基により特徴づけ
られるエピトープと反応する。このような低親和性の抗
プロタミン抗体は、自然抗体かもしれない。
血清のプロタミン反応性のIgM抗体の低親和性サブセ
ットは、エイズの診断のためにアッセイできる。かかる
抗体は、正常の被検者、及び、HIV感染者であって、引
き続き、有意の潜伏期間を示す者の血清中で検出可能で
あるが、エイズと診断された者及び採血時には無症候で
あるが、比較的短時間内にエイズに進行するHIV感染者
の血清中には存在しないか、又は、不十分である。この
ように、HIVが血清的に陽性である（seropositive）、
人における、かかる抗体の不存在又は不十分さを定量的
に測定することは、エイズの比較的に切迫した始まりの
指示として、信頼しうる。
低親和性の抗プロタミン血清IgMの定量的測定及び／
又は検出は、また、治療処置の効力をモニターし、臨床
的試験のために相応の被検者を選択する際の助けとする
ために、及び、エイズ又はARCの診断の付加的なモダリ
ティー（Modality）を提供するために使用することがで
きる。また、これらの抗プロタミン抗体の検出及び／又
は測定は、他の免疫学的な異常を予知し、診断する際
に、同様に使用しうることも想像される。
使用できる検出及び定量的な決定のための種々のアッ
セイ及び方法を以下に記載する。
5.3.血清のプロタミン反応性IgM抗体のアッセイ エイズを予知及び診断するためのアッセイの本発明の
特別の態様において、プロタミン反応性のIgM血清蛋白
の低親和性サブセットの存在は、以下に記載するいかな
る方法によってもアッセイすることができる。１つの例
として、抗プロタミンIgM抗体の低親和性サブポピュレ
ーションは、一定量の抗体混合物（例えば、血清）を増
加する量の抗原と反応させることにより同定しうる。抗
原の濃度が上昇するにつれて、高い親和性を有する抗体
が飽和し、次に、低い親和性の抗体が抗原と反応するで
あろう。好ましい態様において、後記第5.3.3項及び後
記第７項に記載したELISAが使用できる。
5.3.1.アッセイシステム この分野で既知のアッセイシステムは、本発明の抗プ
ロタミンIgM抗体（又はそれらの抗原結合領域）の定量
的測定、及び／又は検出のために使用しうる。例えば、
かかるアッセイは、これに限定されるものではないが、
競合及び非競合アッセイシステムを含む、次のイムノア
ッセイである：ラジオイムノアッセイ、ELISA（酵素結
合イムノソルベントアッセイ）、“サンドウィッチ”イ
ムノアッセイ、沈降反応、ゲル内拡散沈降反応、免疫拡
散アッセイ、凝集アッセイ、補体−結合アッセイ、イム
ノラジオメトリックアッセイ、螢光イムノアッセイ、プ
ロティンＡイムノアッセイ、及びイムノエレクトロホー
レシスアッセイ、等である。
5.3.2抗原 プロタミン反応性のIgM抗体の定量化のためのアッセ
イシステムにおいて使用しうる抗原は、アルギニルクラ
スター、殊に、６個のアミノ酸残基片内にトリプレット
を含む４個のアルギニル残基を含む配列を有するもの、
又は、上述のものと免疫学的に交差結合性のエピトープ
を含むすべての抗原である。一の態様において、かかる
アルギニルクラスターエピトープは線状の配列のもので
ある。他の態様において、エピトープはコンフォメーシ
ョン的に依存し、トリプレットクラスターを含む４個の
アルギニル残基から成る抗原決定基を生成する立体配置
（configuration）から生成する。特別の態様におい
て、６個のアミノ酸片内においてトリプレットを含む、
４個のアルギニル残基から成るペプチドを抗原として使
用できる。
このため、抗原として使用しうるペプチドは、これに
限定されるものではないが、次の配列を含む。
RRRRRR XRRRRX RRRRRX又は、逆位のもの RRRRXR 〃 〃 RRRXRR 〃 〃 RRRRXX 〃 〃 RRRXRX 〃 〃 RRRXXR 〃 〃 XRRRXR 〃 〃 上記において、Ｒはアルギニンであり、そして、Ｘは
他のすべてのアミノ酸である。
使用できる他の抗原は、限定されるものではないが、
後記の第VII表（第6.2.5項を参照）、即ち、６個のアミ
ノ酸配列内に、トリプレットを含め、４個のアルギニル
残基を有する蛋白が含まれる。加えて、いかなるプロタ
ミンも、例えば、ヒトプロタミン１（P1）、ヒトプロタ
ミン２（P2）が、抗原として使用できる。抽出及び精製
方法においてシステイン残基がジスルフイド交差結合を
形成することを阻止する工程を含む場合は、プロタミン
は抗原として最も満足しうるものである。この阻止は、
例えば、アミノエチル化、Ｓ−メチル化、及びヨードア
セチル化等のいかなる既知の方法によっても実施でき
る。加えて、プロタミンは、システイニル基の間のジス
ルフイド交差結合を阻止するための処理がなされない場
合でも、本発明の方法における抗原として使用できる。
本発明のイムノアッセイにおいて使用できる他の抗原
は、この発明のプロタミン反応性のIgM抗体のエピトー
プに類似又は同一のエピトープを認識する、抗プロタミ
ンモノクローナル抗体HAmAb（ATCC寄託番号、HB9668）
によって結合される能力により同定しうる。
5.3.3.HIV潜伏期間の予測のためのアッセイ方法 ここに記載するアッセイ及び計算方法は、感染した個
人のエイズの発病の前のHIVのありうる潜伏期間を予測
するためのモダリティーを提供する。かかる情報は、個
々の患者の医学的なマネージメント、医療施設に対する
社会の需要の予測及び提案された治療を試みるために適
切な被検者を選択する場合に有用であろう。これは、ま
た、エイズの診断のための付加的な基準を提供する。
ここに記載されるアッセイ及び方法は、エイズの予知
に使用するための定量的なインデックスの派生的なもの
の１つの実施にすぎない。これらの他の実例、及び、こ
こに記載する方法の修正も想定され、それも本発明の範
囲内である。
低親和性結合のプロタミン反応性の血清IgM抗体を検
出できる、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ELIS
A）が実施される。抗原（例えば、プロタミン２）の濃
度を、2,5,10,20及び50μg/mlと増加させつつ、後記の
第７項に記載されるようにしてELISAが実施される（ま
た、前述の第４項第10A図の記載も参照されたい）。簡
単にいうと、この方法は、次の工程から成る： （ｉ）抗原コーティング： マイクロ滴定皿のアッセイくぼみに抗原溶液を加え、
続いて４時間培養することにより、このくぼみは抗原
（50μｌが好ましい）でコーティングされた。抗原とし
てプロタミン２を使用する場合、好ましい抗原濃度は２
μg/ml及び20μg/mlである。
（ii）阻止： 抗体溶液は緩衝液で洗い流され、そして、抗体により
コーティングされていない領域をコーティングするた
め、すべてのくぼみには阻止溶液が一杯に詰められ、そ
のことにより、以後の工程においてくぼみの表面に非特
異的に結合するのを阻止した。
（iii）血清抗体の結合 阻止溶液が洗い流され、そして、希釈された血清（50
μｌが好ましい）が各くぼみに加えられる。各血清試料
は、２個の希釈液のそれぞれにおいて３回試験される。
本発明者は、血清の1:100及び1:500の希釈が、プロタミ
ン２を抗原として使用する際に適当であること、及び、
大部分のヒト血清のために行われる試験結果の妥当な解
釈にとって、十分な低い血清バックグラウンド値をもつ
ことを知った。しかしながら、抗原性箇所をもつ種々の
ペプチドに関しては、非希釈の血清から1:1000の希釈ま
での、種々の血清希釈の他の対が有用であることを知っ
た。
（iv）結合されたIgM抗体の検出： ３時間後に、血清希釈液が洗い流され、50μｌのペル
オキシダーゼ−ラベルの第２の抗体（抗ヒトIgM）が各
くぼみに加えられた。1.5時間後に、この第２の抗体が
洗い流され、そして50μｌのペルオキシダーゼの基質が
加えられた。30分後、50μｌの2.5規定の硫酸が各くぼ
みに加えられ、基質に対する酵素（ペルオキシダーゼ）
の作用を停止させ、こうして、染色（Chromatic）物質
の製造を止めた。
（ｖ）測定： プレートは自動プレート読み取り機中に置かれ、ここ
で、濾過された光線に対して各くぼみの中心をあわせる
ためプレートを移動させ、その後、各くぼみに対して入
射光（例えば490nm）の光学濃度（O.D.）が読みとら
れ、記録された。
（vi）計測： 490nmにおける光学濃度（O.D.490）（Ｙ軸）が、血清
希釈の逆数（Ｘ軸）に対してプロットされた（例えば、
後掲第10及び11図を参照）。高い抗原濃度における反応
性カーブの傾斜の増大は（第10A図参照）、プロタミン
反応性のIgM抗体の第２の（低親和性）サブセットが存
在することを示している。この増大は、エイズと診断さ
れた患者が得た血清のアッセイにおいては、みられない
（第11A図参照）。こうして、抗プロタミンIgM抗体の低
親和性のサブセットを表わす高い抗体濃度における反応
性カーブの傾斜の増大の非存在が観察されると、エイズ
又はARCであると診断するための追加的なモダリティを
提供することができる。
プロタミン反応性のIgM抗体のこの低親和性のサブセ
ットの量を測定するため、即ち、高い抗原濃度での反応
カーブの傾斜の増大により表わされるプロタミン反応性
IgM抗体の第２のサブセットの比例する力価をアセスす
るために、計測システムは次のように工夫されうる:2μ
g/mlと20μg/mlが経験的に適当な試験抗原濃度として選
択される。Ｘ軸の２つの点、血清希釈1:100（x1）と1:5
00（x2）の間のカーブの増大は、これら２つの点に対す
るＹ軸上のO.D.値の差異として表現できる。２μｇの抗
原（プロタミン）カーブのものから20μｇカーブのもの
への増大における増加は、20μg/ml抗原における（O.D.
x1−O.D.x2）マイナス２μg/ml抗原における（O.D.x1−
O.D.x2）であり、そして、Δ20−Δ２として記載され
る。
次に、Δ20−Δ２の値が計測される。“15"という値
は、“正常”なものの低い方の限界値として考えること
ができる（第7.2項参照）。HIV−セロポジティブな血清
に対する正常の範囲内の値は、エイズの発現前に少くと
も２年の、多分もっと長い潜伏期間を予測させるのに対
し、低いΔ20−Δ２値はこの病気の進行が切迫している
ことを予測させる。
示された抗原箇所を有する他のペプチドに対しても、
この方法は、適用されているので（第5.3.2項を参
照）、最善の結果は２つの抗原の濃度比が常に1:10のと
きに得られているが、示された抗原箇所をもつ他の種々
のペプチドを使用する場合には、他の濃度対のときに良
好な結果が得られることが見い出されている点に留意す
べきである。
アッセイ試料として患者の種々の体液、例えば、血
清、血漿等が使用でき、好ましいのは血清であることに
も留意されるべきである。
5.4.治療 本発明の低親和性のプロタミン反応性IgM抗体は、エ
イズ及び他の免疫的な異常の治療において潜在的に使用
可能である。低親和性の抗プロタミン抗体は、HIVに感
染した個人をエイズの発病から保護することに、その役
割を有しているものと想定される。この抗体は、他の状
態の免疫異常に悩んでいる者、又は、それらに疾病素因
をもつ者において同様な保護的効果を有しているかもし
れない。このようにして、本発明の抗体は受動免疫治
療、即ち、予め形成された低親和性の抗プロタミンIgM
の投与によって、宿主に短期間の保護を与えることがで
きることも考えられる。異種免疫グロブリンはその外来
性の免疫性成分に対して免疫応答を引き起こすであろう
から、かかる使用目的に対してはヒト免疫グロブリンが
好ましい。１つの態様において、HIV陽性の個人におい
てエイズへの進行を引き延ばすために、本発明のプロタ
ミン反応性のIgM抗体の低親和性サブセットを、プール
されたヒト血清から受動免疫治療において使用するのに
十分な量で分離しうる。
本発明の低親和性でプロタミン反応性の抗体に関する
分子クローンは既知の方法で製造できる。低親和性のプ
ロタミン反応性の抗体の性質に類似の性質をもつモノク
ローナル抗体分子、又は、これの抗原結合領域をコード
する核酸配列をつくるために、組換えDNA手法（Maniati
s,T.,1982,Molecular Cloning,A Laboratory Manual Co
ld Spring Harbor Laboratory,cold Spring Harbor,New
York）を使用しうる。
いわゆる“キメラ抗体”分子を形成させることによ
り、マウスモノクローナル抗体分子が受動免疫において
有効に使用しうる。キメラな抗体分子は、マウス抗原結
合領域をヒトの定常領域に含ませて、製造しうる（Morr
isonら、1984,Proc Notl Acad Sci,U.S.A.81:6871;Take
daら、1985,Nature 314:452）。
抗体は、既知の方法、例えば、イムノアブソープショ
ン、イムノアフィニティクロマトグラフィー、HPLC（高
性能液体クロマトグラフィー）のようなクロマトグラフ
ィー法、又はそれらの組みあわせにより、精製すること
ができる。
5.5.診断用キット 本発明は、また、上述の方法を実施するための診断用
キットを含む。一の実施態様において、診断用キット
は、（ａ）６個のアミノ酸残基の配列内に、トリプレッ
トを含む、４個のアルギニル残基をもつ配列を有するペ
プチド、又は蛋白（“アルギニル クラスター”）；と
（ｂ）IgM抗体に対する特異的な結合パートナーと検出
しうるシグナルを生成可能なラベルの接合体（conjugat
e）を含む。他の態様において、診断用キットは（ａ）
コンフォメーション依存性のエピトープ、このエピトー
プはトリプレットクラスターを含む、４個のアルギニル
残基をもつエピトープであるが、これから成るペプチド
又は蛋白と、（ｂ）上述の接合体より成る。さらに、他
の態様において、このキットは（ａ）HPmAbとにより結
合される能力によって特徴付けられるペプチド又は蛋
白、及び（ｂ）上述の接合体を含むことができる。この
反応剤は、又、緩衝剤及び例えばポリサッカライド等の
蛋白安定化剤等の補助剤を含むことができる。この診断
キットは、更に、所望に応じて、バックグラウンドの干
渉を減じるための剤を含むシグナル発生系の他の成分、
コントロール反応剤、試験を実行するための装置等を含
んでもよい。
他の態様において、診断用キットは、６個のアミノ酸
残基の配列内に、トリプレットを含む、４個のアルギニ
ル残基をもつ配列を有するペプチド又は蛋白に反応性の
抗体と、検出しうるシグナルを発生するラベルの接合体
を含む。他の態様において、ラベルと、コンフォメーシ
ョン依存性のアルギニルクラスターエピトープを含むペ
プチド又は蛋白に反応性の抗体、又はHPmAbによる認識
によって特徴づけられるペプチド又は蛋白に反応性の抗
体との接合体を使用しうる。
好ましい態様において、ELISAキットが使用され、こ
れは、６個のアミノ酸残基の配列内に、トリプレットを
含む、４個のアルギニル残基が配列したものが固体担体
に固定されたものと、IgM抗体に対する特異的な結合パ
ートナーとセイヨウワサビペルオキシダーゼのような酵
素の検出可能なシグナルを発生しうるラベルとの接合体
より成るものである。
6.実施例：ヒト血清中のプロタミン反応性の自然IgM抗
体 ここに詳述する実施例において、本発明者は、思春期
後の精巣で新たに合成され、精子に特異的である、一群
の低分子量の塩基性核蛋白であるプロタミンに反応す
る、ヒトの精子中の一群の自然IgM抗体の同定を記載す
る。これらの抗体は、正常の成人男性及び女性の100個
の血清中のすべてにおいて、及び７日から２才までの年
齢の正常な小児の28個の血清のうちの26個において、EL
ISAにより、有意の力価で検出された。小児の血清と大
人の血清のプロタミン反応性IgM抗体の間の共通性は、
抗原の認識及び反応動力学における類似性を示すことに
よって確立された。それゆえ、免疫原生刺激又は自然抗
体のそのセットの抗原ターゲットのいずれかとしてのプ
ロタミンの役割は、ありそうではない。
蛋白反応性血清IgM抗体により認識される抗原箇所
は、ヒト精子プロタミンに対するモノクローナル抗体
（HPmAb）による抗原認識のパターンとの比較により特
徴づけられた。テスト抗原として、ヒトプロタミン２の
種々のセグメントのアミノ酸配列を模倣する合成ペプチ
ド及びポリアルギニン、ポリリジン及びヒストンの使用
により、HPmAbと血清IgM抗体の双方により認識される抗
原箇所の主要な特性は、６個の残基片内に、トリプレッ
トを含め、明らかな最小限の必要性として４個のアルギ
ニル残基をもつ、クラスター化されたアルギニル残基と
いう特性のようにみえる。一連の免疫吸着法は、プロタ
ミン反応性の血清IgM抗体が高い特異性をもつ別個のセ
ットであることを示している。蛋白のデータベースのサ
ーチによれば、推測上の最少限のエピトープは、４〜５
個のヒトの自己蛋白、免疫系のすべてモイアティ（moie
ties）、及び多くのウイルス蛋白に存在していることが
示されている（第VII表）。
6.1.材料及び方法 6.1.1.血清抗体のための酵素結合イムノソルベントアッ
セイ 酵素結合イムノソルベントアッセイ（ELISA）法、こ
れにより後記第Ｉ表のデータが集められ、上記方法は本
研究において使用されているが、これは記載されている
（Pruslin,F.H.ら,1986,J.Immunol.Methods,94:99;Rodm
an,T.C.,ら,1986,J.Immunol.Methods,94:105）。簡単に
説明すると、96個のくぼみをもつ平底のマイクロ滴定プ
レートの各くぼみに50μｌの抗原（特定濃度）が置か
れ、カバーがされ、そして、室温で４時間保持された。
このくぼみはリン酸緩衝食塩水（PBS）中の0.01％Tween
−20で20回洗われ、次に、PBS中の５％牛血清アルブミ
ン（BS）をふちまで一杯につめ、カバーをして、１晩５
℃に置いた。このプレートは室温に戻され、20回洗浄さ
れ、50μｌの血清又はモノクローナル抗体（mAb）（１
％のBSAで希釈）が各くぼみに加えられた。室温で２時
間後、各くぼみは20回洗われ、そして、50μｌのペルオ
キシダーゼが接合した第２の抗体〔ヤギF(ab1)2抗ヒトI
gMμ鎖特異性、又はヤギＦ（ab′）2マウスIgA,IgG及び
IgM〕が加えられた。このプレートはカバーされ、室温
で1.5時間保持され、そして、20回洗われた。各くぼみ
に50μｌの基質（オルトフェニレンジアミン）が加えら
れ、30分後に、50μｌの硫酸（2.5規定）を加えて反応
を停止させた。各くぼみの着色溶液の光学濃度が自動プ
レート読み取り機（automated plate reader）において
490nmで読まれた。感受性に最大にし、血清のバックグ
ラウンド及びプレートとプレートの間の結合効率から生
ずるあいまいさを最小限にするために、プロトコールが
展開された。（Rodman,T.C.ら,1986,J.Immunol,Methods
94:105）。
6.1.2.抗原 精製されたプロタミン１（P1）及びプロタミン２（P
2）がRodman,T.C.ら，の方法（1982,J.Cell Sci.53:22
7）を修正して調製された。簡単に述べると、精子が射
出精液のプールから分離され、そして、音波処理により
頭部と尾部が分離された。頭部が集められ、TritonX−1
00の処理により、膜蛋白の分画とDNA−核蛋白分画にわ
けられた。後者を4Mのグアニジニウムクロリド（GuC
l）、１％の２−メルカプトエタノールに溶解し、そし
て、エチレンイミンで処理してプロタミンのシステイニ
ル残基をアミノエチル化し、そのことにより、ジスルフ
ィド結合の形成を防止し、次に、50mMの塩酸に対して透
析し、BioRex70カラム上で、GuClの濃度を増加させた段
階的な溶出液でクロマトグラフを行った。純粋なP1は23
％の溶出液に現われ、また、純粋なP2（ａとｂ）は27％
溶出液に現われ、一方、一連のP2のリン酸化された変異
体は一部のP1とともに中間的なプール（25％溶出液）に
現われた。P1とP2（23及び27％溶出液）は、それぞれ50
mMのHClに対して１晩透析され、続いて、pH7.2のPBSに
対して２〜３時間透析され、それぞれの濃度は染料−結
合アッセイにより測定された（Bradford,M.M.,1976,Ana
l.Biochem,72:248）。合成ペプチドはメリーフィールド
の方法で製造された。（Merrifield,R.B.,1963,J.Am,Ch
em,Soc.85:2149）。そしてこれは、逆相HPLC（高性能液
体クロマトグラフィ）により精製された。
ポリアルギニン（10,000〜20,000ダルトン分子量）
は、ケミカルダイナミクス社（Chemical Dynamics Cor
p.Plainfield,NJ）から入手され、ポリリジン（15,000
〜30,000ダルトンの分子量）はシグマケミカル社（Sigm
a Chemical Co.St.Louis.MO）から入手した。
6.1.3.モノクローナル抗体 ヒト精子プロタミン（HPmAb）に対するmAbは、BALB/c
マウスとヒト精子の核蛋白分画で免疫し、そして、非分
泌マウスミエローマで脾臓細胞を融合させることにより
得られた。ここに記載する研究のための調製において、
ハイブリドーマカルチャーは、単クローン性を保証する
ため、希釈を制限しながら、再クローンされた。HPmAb
は硫酸アンモニウム沈澱により腹水から分離され、PBS
に対して透析され、つぎにDEAE（ジエチルアミノエチ
ル；イオン交換）カラムクロマトグラフィーにより精製
された。
コントロールとしての、ニワトリミオシンに対するmA
bは同様にして腹水から製造された。
6.1.4.ヒト血清 正常のヒト血清は、実験室の人より与えられたか、又
は、生年月日、性及び“所見なし”という点のみが確認
された病院の供試物として得られた。
6.1.5.免疫吸着（immunsabsorptions） 各免疫吸着方法に対して、図（前記４）の説明中で述
べられた量の吸着蛋白が、0.7×10cmのカラムにおい
て、0.5gの臭化シアン−活性化セファロース4B（Pharma
cia Fine Chemicals,Piscataway,NJ）に結合された。１
％BSA/ホウ酸ナトリウム緩衝液pH7.5で希釈された40〜5
0μｌの血清がカラム上に各層をなしておかれ、次に、
４℃で１晩端部をひっくり返しながら混合された。吸着
された血清はカラムから排出され、記載された濃度にお
いて、ELISAにより、指定された抗原との反応性が試験
された。
6.1.6.相同性サーチ ３個のクラスターを含む最少限４個のアルギニル残基
をもつものとして指定された６個の残基の片を生産する
蛋白のサーチが、ナショナルバイオメディカルリサーチ
ファウンデーションの蛋白同定源（Protein Identifica
tion Source）により実施された。
6.2.結果 6.2.1.ヒト血清中に生ずるプロタミン反応性抗体 第１表のデータは、プロタミン反応性抗体は０〜60才
の一群正常の被検者のすべての血清において存在してい
る。
第Ｉ表に示されているように、プロタミン反応性のIg
A抗体はすべての血清中に存在し、そして、IgM抗体は免
疫系がIgMの有意の力価を生産するのに十分なだけ成熟
している被検者の血清中に存在している（de Preval,C.
1982,Immunoloty,Bach,J.F.及びSchwarty,R.S.eds,John
Wiley ＆ Sons,New York,p.230）。全IgMに対するプロ
タミン反応性IgMの割合が各被検者のカテゴリーごとの
血清に対して計算された（第１図）。計算は、類似のア
ッセイプロトコール内で、全IgMの力価に比較して、プ
ロタミン反応性の抗体の力価を定めた。この割合のため
に導かれた値、即ち、全IgMに対するプロタミン反応性I
gMの比は、全集団（population）のサブグループに対し
て比較的狭い範囲内にあり（第１図）、これは、プロタ
ミン反応性の抗体は正常のヒト血清の特異的な成分を表
わすことを示唆している。
6.2.2.ヒト精子プロタミンの同定 ヒト精子の核蛋白は、２個のプロタミン、P1及びP2と
呼ばれるものを含む。アミノ酸配列の決定は、P2が２つ
の変異体P2a及びP2bとして存在することを示しており、
P2aはそのアミノ末端に３個の付加的な残基をもつ点の
みで異なる（第IIA表）（Mckay,D.J.ら,1986,Eur.J.Bio
chem.156:5;Ammer,H.ら,1986,Biol.Chem.Hoppe−Seyler
367:515） 本発明者らは、最近P1,P2a,P2bが、リン酸化されたP2
の変異体のグループから別々に、精製された形態で、高
収率に得られることを知った（Pruslin,F.H.ら,1987,Ga
mete ReS,18:179）。これらP1とP2の製造は固相のアッ
セイにおいて抗原として使用するのに好ましい。という
のは、それぞれがポリスチレン表面上で線状に配向する
のに好適な高い陽電荷をもつ小さな分子であり、そし
て、システイニル基はアミノ−エチル化され（6.1.2参
照）、それゆえジスルフィド結合の生成は阻止されてい
るので、分子内の交差結合の可能性がほとんどないから
である。
6.2.3.プロタミンに対する抗プロタミンモノクローナル
抗体の特異性：エピトープの定義 本発明者は、免疫源としてヒト精子の核蛋白分画を使
用して、P1、及びP2、及びP2のリン酸化された（phosph
orylated）変異体に反応性で、他のヒト精子成分とは反
応しないmAb（HPmAb）を製造した（第２図）。精製され
たP1とP2の異なるバッチを使用してアッセイを繰り返す
と、各々の反応性は同じオーダーの大きさであったが、
等モルのP1とP2に対してアッセイすると、HPmAbはP1に
より大きな反応性を示すことが確認された。これらの分
子の一次構造をみると、２つの間には広範囲に亙るアミ
ノ酸配列の相同性が存在しないことがわかる;6個の残基
片内で４つの残基における位置的な相同性がわずかに３
個の分節で示されている:P1の７〜12のアミノ酸とP2bの
20〜25のもの、P1の29〜34のものとP2bの34〜39のも
の、及びP1の45〜50のものとP2bの49〜54のもの。しか
しながら、P1とP2bのそれぞれに対して、アルギニンは
アミノ酸組成の48％を占めており、そして、アルギニル
残基の多くは集まっている。P2のアルギニン残基の大部
分は２以上の残基のかたまり（クラスター）として集合
しているが、P1は６個のアルギニル残基からの１個のク
ラスターを有する。アミノ酸配列の分析は、HPmAbによ
るプロタミンの認識は、アルギニンの密集（density）
に依存しているのであろうことを示唆している。それゆ
え、異なるアルギニン密集に対して、及び、各種の他の
アミノ酸に対して選択されたP2の分節（segment）を表
わす、３個の合成デカペプチド（第IIB表）、及び、最
大のアルギニン密集を表わすポリアルギニンに対して、
HPmAbがアッセイされた。
この結果は、第III表に示されている。
HPmAbのポリアルギニンとの高い反応性は、認識は集
合したアルギニル残基に依存するという提案を支持し、
そして、他のアミノ酸はエピトープの認識には必須のも
のではないということを示唆している。ペプチド１はHP
mAbとは反応性を示さず、これは、２個のアルギニル残
基のクラスターは認識には不十分であることを示唆して
いるのに対し、適度の、しかし現実のペプチド２の反応
性は、６個の残基からなる片内の、３個のクラスターを
含めて４個のアルギニル残基の密集が認識されることを
示唆している。（第IIIA表）。４個のアルギニル残基が
単独に存在するペプチド３の反応性の表現の不一致は容
易に解決される。合成ペプチドが合成のまま、即ち、シ
ステイン−システインの交差結合を阻止するための処理
がされていないものとして使用される時は、ペプチド３
はHPmAbと反応性を示す。しかしながら、システイニル
残基の間でジスルフィド結合の生成を防止するために、
プロタミンの製造時に３個のペプチドが処理されると
（第6.1.2項参照）、ペプチド３のHPmAbとの反応性は消
失する（第IIIB表）。この観察は、未処理の状態にあっ
ては、ペプチド３の２個のシステイニル基は交差結合し
ており、これが、４個の単独のアルギニル残基を、抗体
の認識を起こさせるのに十分接近させるか、又はそのよ
うに配向することを生じさせるような並列の状態にさせ
ることを示しているものと、我々は解釈している。シス
テイニル残基が阻害されると、そのような構造は引き起
こされず、そして、ペプチド３はHPmAbと反応しない
（第IIIB表）。この観察に一致して、ペプチド２の反応
性は、トリプレットを含む４個のアルギニル残基の密集
に依存していると推測されるが、及びペプチド１の反応
性の非存在は、システイン−システインの交差結合によ
っては変えられない（第IIIB表）。
HPmAbがアルギニントリプレットを含むエピトープを
特に必要とすることは、HPmAbがより有力な塩基性のア
ミノ酸のセットであるヒストンや、殊に、２個のアルギ
ニンタブレットが52と53の残基ならびに128と129の残基
に存在するも、１個のアルギニントリプレットもないよ
うなアルギニンに富んだヒストンH3（DeLange,R.J.ら,1
972,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A,69:882）に対しては反
応性を示さないことにより、さらに、証拠が与えられて
いる。
HPmAbによる３個以上のアルギニル残基のクラスター
の認識は、専ら、又は、主に、濃縮された高いポジティ
ブな電荷に基づくという可能性は、最大の真のポジティ
ブなて電荷及び最大のアルギニン密集を表わすポリアル
ギニンに対するHPmAbの反応性を、高い真のポジティブ
電荷をもつものとして非常に近いポリリジンのそれとを
比較することにより、証明された（第３図）。第３図の
アッセイのデータは、HPmAbの特異性は高ポジティブな
電荷をもつエピトープの認識ではなく、アニギニル残基
のクラスターに固有な特別の性質に関連することを示し
ている。
反応カーブの比較（第３及び４図）は、HPmAbがP1と
ポリアルギニンとの結合動力学において、P1及びP2との
それよりもずっと類似していることを示している。P1と
ポリアルギニンの両方に対して、HPmAbは低い抗原濃度
で飽和しているようにみえる。ポリアルギニンに対して
は、この飽和はエピトープの繰り返しの高いオーダーに
よるものと仮定されるが、P1とP2の双方においては、６
個のアミノ酸の推測の最小のエピトープは、この例では
３個のクラスターを１つ含む４個のアルギニル残基をも
つ６個のアミノ酸片であるが、２であるように思われ
る。それゆえ、HPmAbのP1とのより大きい反応性は（第
４図）P2には存在しないアルギニンの密集である（第II
A表）、６個のアルギニル残基のクラスターによるもの
かもしれない。
上述のデータを概観すると、HPmAbは、アルギニンの
密集と相関する活性の強度をもって、集合したアルギニ
ル残基と反応し、その最小の要件は３個のアルギニル残
基が連続したものを含め、６個の残基のエピトープ内に
４個以上存在するか、特別の配置又は３個のアルギニル
残基のクラスターを与える近接した並べ方にある。
6.2.4.正常ヒト血清内に存在するプロタミン反応性IgM
抗体 ヒトの血清プロタミン反応性のIgM抗体（第１表）の
特性は、HPmAbに対して確立された特性と比較すること
により、そして、その反応性がヒトIgM抗体の特別のサ
ブセットの中にあるかを決定することにより、検討され
た。
典型的なヒト血清のグループ（大人男性、大人女性、
小児）のP1及びP2及びポリアルギニンとの相対的な反応
性がアッセイされた（第５図）。絶対的な力価において
差異が予想されたにもかかわらず、３つの抗原の活性の
順位、血清希釈対反応カーブの傾斜及び上昇する抗原濃
度に対する反応性における血清の間の類似性は、血清の
反応性はすべての正常の血清中に存在するIgM抗体の別
個のセットの反応性であることを示している。第５図の
データは、又、小児のプロタミン反応性IgM抗体のセッ
トは、大人の血清のものと同一の特性を有することを確
立した。
ヒトIgM抗体の免疫認識特性とHPmAbのそれが一致する
ことは競合ELISAにより示された（第６図）。血清抗体
のP1及びP2の双方との反応性のHPmAbによる抑制は、HPm
Abの濃度に比例している。P1との血清の反応性のほぼ50
％抑制は、HPmAbの1:1,000の希釈により達成された。HP
mAbはP2とよりも、P1とより大きい反応性を示すという
観察と一致して（第２図及び４図）、第６図のデータ
は、又、HPmAbは血清抗体のP2反応性よりは、血清抗体
のP1反応性に関して、より大きな競合を示すことを示し
ている。
血清IgMがP1及びP2と反応するのを阻害するのは、HPm
Abによる特異的なエピトープの認識によるものであると
いうことの保証は、ニワトリミオシンに対するマウスmA
b、及び、正常な（非免疫化の）マウス血清によりなさ
れたパレラルアッセイ、このいずれも、ヒト血清IgMのP
1及びP2との反応性を阻害しないが、このアッセイによ
り提供された。
逆競合（converse competition）アッセイ、即ち、ヒ
ト血清によるHPmAbの阻害は、又、HPmAbにより認識され
るエピトープはヒトのプロタミン反応性IgM抗体により
認識されるエピトープと相同性を示す（第IV表）。
本研究において使用された固相遮断アッセイにおいて
示されたヒト血清による最大の抑制はわずか15％までで
あったが（第IV表）、同様な遮断活性は、ヒトの各集団
のクラス、即ち、大人男性、大人女性及び小児のそれぞ
れから得られた典型的な血清により達成された。この観
察は、HPmAbに対するエピトープを定義するために使用
された合成ペプチドに関する大人及び小児の血清の類似
の区別及び活性の表示に一致する。（第III表及び第Ｖ
表の比較） 血清抗体と合成ペプチドの反応性がHPmAbの反応性と
平行していることを示している第Ｖ表は、又、２つのカ
テゴリーの抗体の対するエピトープが類似のものである
と考えるための証拠を与える。エチル化された、又は、
非エチル化された状態（システイン−システイン交差結
合が阻止されたもの、又は、非阻止のもの）のいずれで
も、HPmAbと同様に（第IV表）、３種の血清のすべてのI
gM抗体はペプチド２を認識し、どちらの状態においても
ペプチド１を認識せず、そして、非エチル化の場合にお
いてペプチド３を認識し、エチル化された時は認識しな
かった（第Ｖ表）。
血清のプロタミンとの反応性は、IgM抗体の制限され
たセットに帰するということを保証するために、一連の
アフィニティ吸着法が実施された。最初に、これらの抗
体はプールされたプロタミンの分画と、既に示したよう
に、自然に生ずるヒト血清抗体に反応性の８又は９個の
蛋白を含む精子膜蛋白（Rodman,T.C.ら,1985,Science 2
28:1211）とを区別することが示された。上昇する量の
プールされたプロタミンが結合しているアフィニティカ
ラムに吸着された後は、血清のプロタミンとの反応性は
段々と０に近づいたのに対して、血清の精子膜蛋白分画
との反応性はわずかな減少が観察されただけであった
（第７図）。
HPmAbに対するエピトープの分析におけるように、血
清抗体の反応性は主に電荷依存性の反応の反応性である
という可能性が考えられた。又、正常の、及び、病気を
有するヒトの血清の双方においてヒストンに対する自己
抗体が同定されたので（Shoenfeld,Yら、1987,Arthriti
s Rheum,30:169）、ヒト血清IgM抗体のプロタミンとヒ
ストンを区別する能力についてアセスメントがなされ
た。この方法で使用されたELISA法の高度の感度を肯定
して（Pruslin,F.H.ら,1986,J.Immunol.Methods 94:99;
Rodman, T.C.ら,1986,J.Immunol,Methods 94:105），精
製された子牛胸腺と反応性の高力価のIgM抗体が試験血
清中に検出された（第8A図）。ヒストンが吸着されたア
フィニティカラム上に一定量の血清が吸着された後は、
精製された子牛胸腺との反応性は消失したのに対し、ヒ
ストン吸着血清のプロタミンに対する反応性は実質的に
変わらなかった（第8B図及び第8C図）。
ヒト血清中のIgM抗体のサブセットのプロタミン反応
性は電荷誘引の反応性ではないという他の証拠が、第９
図のデータにより得られた。ポリリジンとともに試験さ
れたとき、ヒト血清のIgM抗体はその抗原に結合した。
しかしながら、血清がポリリジン結合アフィニティカラ
ム上に吸着されたとき、ポリリジンとの反応性はなくな
ったが、一方、プロタミンとの反応性及びポリアルギニ
ンとの反応性は保持されていた（第9B図）。逆に血清が
ポリアルギニンに吸着された時は、プロタミン１、プロ
タミン２及びポリアルギニンとの反応性は消去された
が、ポリリジンとの反応性は維持された（第9C図）。
6.2.5.HPmAb及びヒト血清免疫グロブリン抗体により、
認識される抗原箇所は類似しており、恐らく同一であ
る。
第VI表は、合理的に保証されたモノクローン性（6.1.
3を参照）をもつバイブリドーマにより分泌されるマウ
ス抗−プロタミンIgGのHPmAbの反応性と、ヒト血清中の
IgM抗体の特異的サブセットの反応性の総括的な比較で
ある。
比較（第VI表）は、２つの抗体のセットに対するエピ
トープは高度に相同性を示していることを明らかにして
いる。この研究の実験のプロトコルにより検出される主
要な差異は、３つの抗原、ヒト精子のプロタミン１、ヒ
ト精子プロタミン２及びポリアルギニンとの反応性の明
白なランクオーダー（rank order）の差異である（第３
図、及び第４図を第５図と比較。）この差異の１つの可
能な説明は、プロタミン反応性ヒトIgM抗体の数個のサ
ブセット、即ち、異なった結合アフィニティのサブセッ
トは、アルギニル残基のイントラ（intra）エピトープ
の配列に対する、又は結合パターンに影響を与えるエク
ストラ（extra）エピトープ因子に対する適度に異なっ
た選択性（preference）をもつかもしれないということ
である（Geysen,H.M.ら,1987,Science 235:1184;Dryber
g,T.,及びOldstone,M.B.A.,1986,J.Exp.Med.164:134
4）。しかしながら、HPmAbと血清IgM抗体の双方により
認識されるエピトープの主要で、共通な特質は、集まっ
たアルギニル残基の特質であることは明らかである。
プロタミン反応性のIgM抗体が、精子又はプロタミン
にさらされたことのない小児の各自の血清中に存在して
いるので、この推測上のエピトープに相同の分節をもつ
ヒトに自原的な他の蛋白が起源（免疫原性の刺激）、又
は自然のIgM抗体のそのセットの役割（抗原的認識）の
いずれかに関連するという可能性も考えられる。３個の
クラスターを含む４個のアルギニル残基をもつ６アミノ
酸の分節のために、蛋白配列データベースについてサー
チがなされた。その結果は、第VII表に示されている。
３個のクラスターを含む４個のアルギニル残基を有す
る６個のアミノ酸の配列が、整理されたすべての脊椎動
物と非脊椎動物のプロタミン又は精子特異的ヒストン中
に、主に大腸菌であるが幾つかのバクテリア蛋白中に、
そして、多くのウイルス蛋白の中で確認された（第VII
表）。プロタミン以外の、その配列を示す唯一のヒトの
自原性の蛋白は、２つの補体前駆体である、２個のＴ細
胞グリコ蛋白と１個の（推論された）、クラスII組織適
合抗原のγ鎖の変異体である（第VII表）。
6.3.論考 本発明者は、すべての年令の正常な男性及び女性の血
清中に、精子の塩基性核蛋白であるヒトプロタミンは反
応性のIgM自然抗体のセットを見い出し、そして、最小
の抗原箇所が３個のクラスターを含む４個のアルギニル
残基を有する６個の残基のものであることを同定した。
これらの抗体は、プロタミンにさらされたことのない小
児の血清中にも存在するので、かかる抗体の起源をプロ
タミンによる免疫刺激とすることには反論がある。最近
になってわかった免疫メカニズムの脈絡の中において、
これらの抗体の起源はプロタミンの抗原箇所に相同の配
列をもつ他の自原的な分子によるか、又は、プロタミン
の抗原箇所のイメージを生む他の免疫グロブリンのイデ
ィオタイプによるものであるかもしれない。
これらの抗体が第VII表中のヒトの蛋白のいずれかの
分節により誘因されるという可能性は、興味をそそるも
のである、なぜならば、すべてのものが免疫調節メカニ
ズム中に含まれており、すべてのものが発生期の免疫系
中に存在するかもしれないと信じられるからである。一
方、新生児の胃腸管には、E.coliが存在しているので、
E.coli蛋白（第VII表）がプロタミン反応性の抗体の誘
因にとって最初の刺激を提供するという可能性も考えう
る。自然抗体は胃腸管の最近叢による刺激から生ずるも
のとも考えられる（Boyden,S.V.,1966,Adv,Immunol,5:
1）。
ウイルス蛋白がこれらの抗体の抗原性ターゲットであ
るかもしれないという可能性もある。自然抗体の１つの
役割は、感染する恐れのあるものに対して、防御するこ
とであるという仮説もある（Michael,J.G.,ら,1962,J.E
xp.,Med.115:131）。
これらの研究は、ひと血清のIgM自然抗体のセットが
それにより反応性となる、抗原箇所の定義を提供した。
7.実施例：ヒト血清中に存在する低親和性のプロタミン
反応性IgM抗体は、ヒトの免疫不全ウイルスの潜伏と関
係する ここに詳述する実例において、本発明者は、ヒト血清
中の低親和性の結合力をもつ、抗プロタミンIgM抗体、
その血清中における存在はヒト免疫不全ウイルス（HI
V）感染とエイズの発病の間の潜伏期間に関係するが、
その抗体を記載する。
HIVによる感染とエイズの臨床的な発現の間の潜伏期
間は大いに変動しうるものであるが、この最大の期間は
未だ決定されておらず、HIVに感染した者が病気を進行
させないとうことも可能である。本発明者はHIVに感染
した個人のエイズへの病理的な進行に抵抗する能力の指
標であると思われる因子の同定、及び定量的決定のため
の方法を、ここで報告する。この因子は正常の被検者及
びHIVに感染した者であって、引き続き、有意の潜伏期
間を示している者の血清中では検出しうるが、エイズと
診断されたものの血清中、及び、HIVに感染した者であ
って、血液採取の時点では無症候性であるが、比較的短
期間にエイズへの進行する者の血清中には存在しない
か、不十分である。この因子は、精子プロタミンに特徴
的な抗原箇所に反応するIgM抗体のポピュレーションの
サブセットである。プロタミン反応性のIgM抗体の決定
的なサブセットは自然抗体であるように思われる。ここ
に記載するアッセイ方法は、HIVに感染した者における
可能な潜伏期間の予測のためのモダリティーを与える。
7.1.低親和性プロタミン反応性IgM抗体の正常な者の血
清中における存在及びエイズ患者での非存在 本発明者は、正常な大人の血清が上昇する濃度のプロ
タミンとともにELISAにてアッセイされると、抗原の高
い濃度では、活性（光学濃度、O.D.）対血清希釈カーブ
の傾きにおいて急な増加が生ずることを知った（第10A
図）。20人のランダムに選ばれた正常な大人の血清を同
様にアッセイした時の略式のカーブ（第10B図）は、傾
斜の増大は１又は少数の血清という例外ではなくて、正
常な大人の血清の一致した特性であることを証明してお
り、主要な抗体セットに加えて、プロタミン反応性IgM
抗体の検出しうる第２のサブセットが存在することを示
唆している。我々は、第二のサブセットがプロタミン分
子上の異なったエピトープを認識するものであるか、又
は、主要なセットの同一の認識特異性をもつが、異なっ
た結合親和性をもつだけのものであるのかの可能性につ
いて試験した。血清中のプロタミン反応性IgM抗体（上
述の第６項参照）により認識される抗原箇所の１つのコ
ピーを有する合成デカペプチド（DP）を抗原として使用
して、プロタミンに対して試験されたのと同一の血清に
ついての比較アッセイ（第10C図）は、高抗原濃度の血
清に対する活性カーブの傾斜の増大は、異なった認識特
異性をもつサブセットに起因するものではなく、同じ抗
原箇所と反応するが、明らかに低親和性であるサブセッ
トを示しているものと解釈できた。
同様に、エイズと診断された患者の15の血清から成る
グループがプロタミンの上昇する濃度に対して試験され
たとき、高抗原濃度での反応カーブの傾斜の増大、これ
はプロタミン反応性IgM抗体の第二のサブセットの指標
として解釈されるものであるが、これはいかなるアッセ
イにおいてもみられなかったし（第11図）、高い合計力
価のプロタミン反応性IgM抗体による血清のアッセイ
（第11A図）においてさえもみられなかった。
7.2.HIV潜伏の予測のための抗−プロタミン抗体の定量 特別の因子の正常な血清中における存在とエイズにお
ける非存在は、病気に関連する不全の可能性を示唆して
いるので、この因子を定量化するために、即ち、抗原の
高濃度による反応カーブの傾斜の増大により表わされる
プロタミン反応性IgM抗体の第二のサブセットの比例し
た力価をアセスするために、計算システムが工夫され
た。１対のカーブの検分により（第10A及び10B図）、適
切な試験抗原濃度として、経験的に２μg/mlと20μg/ml
が選択された。Ｘ軸上の２点、即ち血清希釈1:100（x
1）と1:500（x2）の間のカーブの増大は、これら２点に
対するＹ軸上のO.D.値の間の差として表わされうる。２
μｇのプロタミンカーブから20μｇのカーブへの増大の
増加は、20μg/mlプロタミンにおける（O.D.x1−O.D.x
2）−２μg/mlプロタミンにおける（O.D.x1−O.D.x2）
であり、これはΔ20−Δ２として記載される。
一般の集団（ウエスタンブロットにおいてHIV陰性）
の成人男性及び成人女性から成るグループ、及び、エイ
ズと診断された患者のグループ、及び、エイズの恐れの
あるもの（血清陽性でホモセクシュアルの者）、及び、
血液試料を採取した時点で無症候性又は軽い免疫不全
（低いT4カウント又は低い分裂刺激インデックス又はそ
の双方であって、他に異常のないもの）として診断され
たグループに対して、Δ20−Δ２の値が計算された。後
者の幾つかのものにとり、追試の臨床的なアセスメント
が利用できた。結果は第12図に示されている。
第12A図を点検すると、15という値が“正常な”範囲
の下限であると考えられた。これに基づき、正常な範囲
内の血清の各グループのパーセントが決定された（第VI
II表）。
第12図に示されたデータは、HIV陽性血清中の正常範
囲内のΔ20−Δ２の値はエイズが発症する迄に少くとも
２年の、恐らくは、それより長い潜伏期間を予想させる
のに対し、低いΔ20−Δ２値はこの病気への進行が差し
迫っていることを予想させることを示している。
グループＡとＤに対する値とグループＢとＣに対する
値が２つの明らかな分布から成っているのに、グループ
Ｅに対する値は双方の分布を含んでいるという事実（第
12図）は、グループＣとＤの各々に対するHIV血清陽性
とエイズの発病の間の間隔の設定が特徴的であり、適切
であることを示唆している。
7.3.プロタミン反応性抗体の低親和性のサブセットの存
在の確認 Δ20−Δ２で表わされるプロタミン反応性のIgM抗体
のサブセットは、“低親和性”として区別されている。
抗体の親和性は、抗体が認識する抗原に対する抗体の結
合する力の表われである。この結合は、分子内の力、例
えば、水素結合、疎水性、イオン性相互作用、の混合し
た効果である。（Karush,F.,1962,Adv.Immunol.2:1−4
0）。結合力の測定は、均一な抗体のハプテン又は単独
の抗原決定基への結合に対してなされ、そして、質量作
用の法則（Law of Mass Action）の適用により親和性定
数（Affinity Constant）として表わすことができる。
それゆえ、親和性定数は、抗体／抗原複合体の解離に対
する抵抗性に直接関連する。
異なった親和性の一連の抗体が、単一の免疫的誘因に
応答して生ずることが知られているので（Werblin,T.
P.,ら,1972,Immunochem,9:987−1011）、同一の抗原決
定基と反応する抗体の集団の別個の“みかけの（appare
nt）親和性定数を決定するのに関心が向けられ、多くの
方法が工夫された（Steensgaard,J.ら,1980,Mol.Immuno
l.17:689−698;Lew,A.M.,1984,J.I,mmunol,Meth.72;171
−176;Sciutto,E.,ら,1987,Mol.Immunol.24:577−58
5）。これらの方法及びその適用が論駁され、また、防
御された間に、有用な経験的法則が現われた：親和性が
雑多な抗体系においては、高い親和性をもつ抗体が抗原
に結合し、低親和性の抗体よりも、より強く抗原との解
離に抵抗する。それゆえ、同一の抗原に対して異なった
親和性をもつ抗体のサブポピュレーションは、一定量の
抗体混合物（例えば、血清）を上昇する量の抗原と反応
させることにより同定されうる。抗原の濃度が増大する
につれて、高い親和性をもつ抗体は飽和し、そして低い
親和性をもつ抗体が抗原と反応するようになろう。実験
的証拠は、かかる抗体系はしばしば、１又は２つの主要
なサブポピュレーションをもつ、単峰性（unimodal）又
はバイモデル（bimodal）親和性分布をもつことを示し
ている（Gandolfi,A.ら,1981,Theor.Biol.92:57−8
4）。この原則に従って、Δ20−Δ２により表わされる
抗体のサブセット、即ち、抗原の高い濃度で検出される
ものは、抗原の低い濃度において検出される主要ポピュ
レーションより低い親和性をもつポピュレーションを表
わすと考えられる。
Δ20−Δ２の値がプロタミン反応性のIgM抗体の主要
ポピュレーションよりも低い親和性をもつサブセットを
表わすとの推論を肯定する証拠は、イオン性相互作用に
基づく抗体結合相を消失させる、高められたNaClモル濃
度において結合反応を実施することにより得られた。ア
ッセイの血清希釈は0.15M NaClから0.3M NaClに調節さ
れた。この媒質で実施されたアッセイのための反応カー
ブは（第10D図）、高い抗原濃度でのカーブの立ち上が
りの増加が（第10A、10B図）消失しΔ20−Δ２値は驚く
程減少したことを示している。低エネルギーの結合成分
であると考えられる（Karush,F.,1962,Adv.Immunol.2:1
−40）イオン性相互作用による抗体結合相の消失は、抗
体の低親和性のサブセットの結合の選択的消失を生ずる
ようにみられた（第10A,10D図）。
7.4.結合親和性において均質であるプロタミン反応性Ig
M抗体のポピュレーションを含む小児血清 上述の第６項で述べたように、臨床的に正常な小児の
被検者の血清は、大人の血清と同一の抗原認識特異性を
もつプロタミン反応性IgM抗体を含む。小児の血清を上
昇する濃度のP2（第13A図）及びDP（第13B図）とともに
アッセイするとき、そのカーブが平行であることは、正
常な成人の血清とは異なり、小児血清のプロタミン反応
性IgM抗体は結合親和性に関して均一（又は単峰性（uni
modal）であることを示している。
7.5.自然に生ずる抗プロタミン抗体 小児の血清に検出される抗プロタミン抗体は、プロタ
ミンによる免疫刺激に帰因させることはできない、とい
うのは、プロタミンは思春期以後の精巣で新たに合成さ
れるものであり、精子系以外の細胞の核には組み込まれ
ていないからである。12日令以上の新生児の血清中にみ
られるプロタミン反応性IgM抗体（第６項参照）を母体
起源のものとすることもできない、というのは、IgMは
胎盤を通過しないからである。プロタミン反応性抗体に
対する同定された抗原箇所は、プロタミン以外のヒトの
内因性蛋白においては、極めて限られて生ずる（第6.2.
5項参照。それゆえ、小児の血清のプロタミン反応性IgM
抗体は自然抗体であり、そして、その延長として、大人
血清のプロタミン反応性IgM抗体の２個のサブセットの
１つは自然抗体から成ると推測するのが合理的である。
プロタミンは、その合成及び細胞による取り込みの
間、免疫系から隔離されており（Dym,M.及びFawcett,D.
W.,1970,Biol.Reprod.3:308−326）、そして、本発明者
は、プロタミンは非免疫抑制性、即ち、これは他の精子
由来蛋白がそうであるように、Ｔ−細胞のインビトロで
の分裂を抑制しないことを示した（Rodman,T.C.ら,198
5,Science228:1211−1215）。それゆえ、思春期以降の
男性及び性経験のある女性の血清は、プロタミンによる
免疫性誘因に帰することのできるプロタミン反応性の抗
体を含むかもしれない。このようにして、本発明者は、
大人のヒトの血清のプロタミン反応性IgM抗体は起源の
異なる２つのサブセットを含む；（１）自然抗体、及び
（２）誘因された抗体。
上述の議論及び我々の実験結果は、小児血清のプロタ
ミン反応性抗体は自然抗体であることを示しており、小
児血清中の自然のプロタミン反応性抗体は、大人血清の
プロタミン反応性IgM抗体の低親和性サブセットに対応
することを示唆している。
本発明者は、HIV陽性血清中のプロタミン反応性抗体
の低親和性（本来的に自然のもの）のサブセットの不足
は、インデックスとして、又は、貢献因子として、エイ
ズへの病原的進行に関係するであろうということを提案
する。
ここで記述されたアッセイ方法は、HIV感染者に対す
るありうべき潜伏期間を予測するためのモダリティを提
供するものである。かかる情報は、個々の患者の医療管
理、医療施設に対する社会的必要性を予測する際に、及
び、最も緊急には、提案された治療法を試みるための相
応の被検者を選択する際に有用であろう。
8.ハイブリドーマの寄託 抗プロタミンモノクローナル抗体HPmAbを生産するハ
イブリドーマセルラインHPmAbが1988年３月23日にアメ
リカンタイプカルチャーコレクション（Rockville,M
D.）に寄託され、HB9668という受託番号が与えられた。
寄託された態様は本発明の一面の一つの例として意図
されたものであるから、本発明は寄託されたセルライン
の範囲に限定されるべきでなく、機能的に均等ないかな
るセルラインも本発明の範囲内に含まれる。ここで記載
して示したものに加えて、本発明の種々の修飾が上記記
載及び付属の図面から本分野の当業者には明らかであ
る。かかる修飾も本発明の請求の範囲の中に含まれるこ
とが意図される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｈ // Ａ６１Ｋ 39/395 Ａ６１Ｋ 39/395 Ｄ Ｃ１２Ｎ 15/02 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ロドマン・トビー・シー アメリカ合衆国 ニューヨーク州 10028 ニューヨーク イースト 86 ストリート 535 (56)参考文献 Ｊ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅ ｄｉｃｉｎｅ，167［３］（1988年３月 １日）ｐ．1288−1246 Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，６［３ ］（1987）ｐ．293−303 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (31)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】プロタミンと反応し、６個のアミノ酸残基
    の配列内にトリプレットを含む、４個のアルギニル残基
    をもつ配列を有して成るペプチド又は蛋白と反応する、
    IgMアイソタイプの抗体。
  2. 【請求項２】コンフォメーションに依存するエピトープ
    を含むペプチド又は蛋白と反応する抗体であって、前記
    エピトープがトリプレットクラスターを含む、４個のア
    ルギニル残基をもつものである、IgMアイソタイプの抗
    体。
  3. 【請求項３】その抗体が、ATCCに寄託され、受託番号HB
    9668が与えられハイブリドーマによって産生されたモノ
    クローナル抗体HPmAbにより結合される能力によって特
    徴づけられるエピトープと反応する、IgMアイソタイプ
    の抗体。
  4. 【請求項４】それがヒト由来である、請求の範囲第１、
    ２又は３項の抗体。
  5. 【請求項５】それが自然抗体である、請求の範囲第１又
    は２項の抗体。
  6. 【請求項６】20μｇのプロタミンを含む２つの異なる希
    釈度の血清における光強度の差と、２μｇのプロタミン
    を含む同様の差との相違であるΔ20−Δ２によって表さ
    れるプロタミンに対する親和性が15未満である低い親和
    性にてプロタミンと結合する請求の範囲第１項記載の抗
    体。
  7. 【請求項７】20μｇのプロタミンを含む２つの異なる希
    釈度の血清における光強度の差と、２μｇのプロタミン
    を含む同様の差との相違であるΔ20−Δ２によって表さ
    れるプロタミンに対する親和性が15未満である低い親和
    性でペプチド又は蛋白と結合する請求の範囲第２項記載
    の抗体。
  8. 【請求項８】それがポリクローナルである請求項１、２
    又は３項の抗体。
  9. 【請求項９】それがポリクローナルである請求項６又は
    ７項の抗体。
  10. 【請求項１０】それがFv領域を含む、請求の範囲第１、
    ２又は３項の抗体の断片。
  11. 【請求項１１】プロタミンがヒトプロタミンである、請
    求の範囲第１項の抗体。
  12. 【請求項１２】プロタミンがヒトプロタミン１又はヒト
    プロタミン２である、請求の範囲第11項の抗体。
  13. 【請求項１３】体液のサンプル中に存在する20μｇのプ
    ロタミンを含む２つの異なる希釈度の血清における光強
    度の差と、２μｇのプロタミンを含む同様の差との相違
    であるΔ20−Δ２によって表されるプロタミンに対する
    親和性が15未満である低親和性で結合するプロタミン反
    応性のIgM抗体をイムノアッセイによって検出し、又は
    測定することから成る体液の検査方法であって、前記低
    親和性の結合力をもつ抗体が存在しないこと又はその量
    が減少していることを検査する方法。
  14. 【請求項１４】低親和性の結合をする抗体が、体液を、
    ６個のアミノ酸残基配列内にトリプレットを含む、４個
    のアルギニル残基を有して成るペプチド又は蛋白と接触
    させることから成る方法により検出され、又は測定され
    る、請求の範囲第13項記載の方法。
  15. 【請求項１５】低親和性の結合をする抗体が、体液を、
    トリプレットクラスターを含む、４個のアルギニル残基
    をもとエピトープであって、コンフォメーションに依存
    するエピトープであるものを含むペプチド又は蛋白と接
    触させることから成る方法により検出され、又は測定さ
    れる、請求の範囲第13項記載の方法。
  16. 【請求項１６】低親和性の結合をする抗体が、体液を、
    ATCCに寄託され、そして受託番号HB9668が与えられたハ
    イブリドーマによって産生されたモノクローナル抗体HP
    mAbにより結合される能力によって特徴づけられるペプ
    チド又は蛋白と接触させることから成る方法により検出
    され、又は測定される、請求の範囲第13項記載の方法。
  17. 【請求項１７】ラベルされた結合パートナーを抗体に加
    えることによりプロタミン反応性の抗体の免疫特異的結
    合を検出することを、さらに含む、請求の範囲第13、1
    4、15又は16項記載の方法。
  18. 【請求項１８】ペプチド、又は蛋白が固定されている、
    請求の範囲第14、15、又は16項記載の方法。
  19. 【請求項１９】ラベルされた結合パートナーを抗体に加
    え、その結果、免疫特異的な結合が固定されたラベルの
    検出により示されるようにして、プロタミン反応性抗体
    の免疫特異的結合を検出することを含む請求の範囲第18
    項記載の方法。
  20. 【請求項２０】上昇するペプチド又は蛋白濃度で方法を
    繰り返すことにより低親和性の結合をする抗体を検出す
    ることを、さらに含む請求の範囲第14、15又は16項記載
    の方法。
  21. 【請求項２１】上昇するペプチド又は蛋白濃度で方法を
    繰り返すことにより低親和性の結合をする抗体を検出す
    ることを、さらに含む請求の範囲第17項記載の方法。
  22. 【請求項２２】上昇するペプチド又は蛋白濃度で方法を
    繰り返すことにより低親和性の結合をする抗体を検出す
    ることを、さらに含む請求の範囲第18項記載の方法。
  23. 【請求項２３】（ａ）６個のアミノ酸残基配列内にトリ
    プレットを含む、４個のアルギニル残基をもつペプチド
    又は蛋白；と （ｂ）IgM抗体に対する特異的な結合パートナーと検出
    しうるシグナルを生ずることができるラベルの接合体、 を含む診断用キット。
  24. 【請求項２４】（ａ）トリプレットクラスターを含む、
    ４個のアミノ酸残基を含むエピトープであって、コンフ
    ォメーションに依存するエピトープを含むペプチド又は
    蛋白；と （ｂ）IgM抗体に対する特異的な結合パートナーと検出
    しうるシグナルを生ずることのできるラベルの接合体、 を含む診断用キット。
  25. 【請求項２５】（ａ）ATCCに寄託され、受託番号HB9668
    が与えられたハイブリドーマによって産生されたモノク
    ローナル抗体HPmAbにより結合される能力によって特徴
    づけられるペプチド又は蛋白；と （ｂ）IgM抗体に対する特異的な結合パートナーと検出
    しうるシグナルを生ずることのできるラベルの接合体、 を含む診断用キット。
  26. 【請求項２６】蛋白がプロタミンである、請求の範囲第
    23、24又は25項の診断用キット。
  27. 【請求項２７】ペプチド又は蛋白が固定されている、請
    求の範囲第23、24又は25項の診断用キット。
  28. 【請求項２８】特異的な結合パートナーが抗−IgM抗体
    であり、そして、ラベルが酵素である、請求の範囲第27
    項の診断用キット。
  29. 【請求項２９】（ａ）６個のアミノ酸配列内に、トリプ
    レットを含む、４個のアルギニル残基をもつ配列から成
    るペプチド又は蛋白と反応する抗体；及び（ｂ）検出可
    能なシグナルを生ずることのできるラベルの接合体、を
    含む診断用キット。
  30. 【請求項３０】（ａ）トリプレットクラスターを含む、
    ４個のアルギニル残基から成るエピトープで、コンフォ
    メーション依存性のエピトープを含むペプチド又は蛋白
    に反応する抗体；及び（ｂ）検出しうるシグナルを生ず
    ることのできるラベルの接合体、を含む診断用キット。
  31. 【請求項３１】（ａ）ATCCに寄託され、受託番号HB9668
    が与えられたハイブリドーマによって産生されたモノク
    ローナル抗体HPmAbにより結合される能力によって特徴
    づけられるペプチド又は蛋白と反応する抗体；及び
    （ｂ）検出しうるシグナルを生ずることのできるラベル
    の接合体、を含む診断用キット。
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