CN106290899A - 用于定量检测半胱氨酸蛋白酶抑制剂s的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于定量检测半胱氨酸蛋白酶抑制剂S的试剂盒,其包括偶联有链霉亲和素的磁性微粒、生物素标记的半胱氨酸蛋白酶抑制剂S第一单克隆抗体、酶标记的半胱氨酸蛋白酶抑制剂S第二单克隆抗体、半胱氨酸蛋白酶抑制剂S校准品。该试剂盒可用于精确测定生物样品中的半胱氨酸蛋白酶抑制剂S。
Description
技术领域
本发明属于生物检测领域,具体地说,涉及一种用于定量检测半胱氨酸蛋白酶抑制剂S的试剂盒、尤其是通过磁微粒化学发光法定量检测人半胱氨酸蛋白酶抑制剂S的试剂盒。
背景技术
《2015年中国肿瘤登记年报》权威数据显示,2015年中国肿瘤发病数为4249,000例,平均每天就有12000例新诊断的肿瘤患者,而肠癌、胃癌均是发病率最高的五大肿瘤之一。世界卫生组织(WHO)指出,防治癌症关键是“早发现、早诊断、早治疗”。因此,采用有效的方法实现癌症的早期诊断、疗效评估及术后监测对于降低癌症整体死亡率、提高患者生存期起重大作用。
目前,胃肠镜筛查技术、免疫组化切片试验、大便隐血试验、血液CEA指标是医院很常规的检测项目。虽然通过胃肠镜筛查技术、大便隐血试验、血液CEA指标可早期发现肠癌、胃癌,且通过早期治疗,5年生存率提高90%以上,然而这些方法均有不足之处:胃肠镜筛查及免疫组化切片试验是侵入性的,检查痛苦,有出血、穿孔等风险性;大便隐血试验,不易被民众接受;CEA指标,灵敏度低,特异性不高。
胃癌、肠癌的防治仍存在大量亟待解决的问题,包括如何在更早期发现并及时干预,如何实现疗效评估和监测,如何对术后患者做到实时准确的复发监控。半胱氨酸蛋白酶抑制剂S,简称为胱抑素S,英文名Cystatin S,是人类Cystatin家族成员,由CST4基因编码,含141个氨基酸,分子中有两个二硫键分子量为16.4Kda,为典型的分泌蛋白,分布于多种体液和分泌物中,如眼泪、唾液、血清、血浆等。Cystatin S最早由上海良润生物医药科技有限公司发现,其在胃肠癌组织中具有高水平的表达,而在胃肠道正常组织中低表达。胃癌、肠癌患者的血清中Cystatin S的表达量也明显高于正常人血清。表达水平与肿瘤的病变、分化情况呈正相关,这说明其可能在胃肠癌的发生、发展过程中扮演重要角色,因此CystatinS是可以作为诊断和预示胃肠癌的标志物,也是我国拥具有自主知识产权的新型胃肠癌肿瘤标志物,参见CN103901205A、CN103901196A、CN103901207A、CN103913574A、CN103913575A、CN103911426A、CN103926409A、CN104558116A。此外,上海良润生物医药科技有限公司还获得了一对分泌针对人Cystatin S抗原决定簇的特异性抗体5D2F2和5E4G5的杂交瘤细胞,保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心,保藏号分别为CCTCC NO:C201416和CCTCC NO:C201415。
目前,用于人Cystatin S的免疫分析方法只有酶联免疫分析法。酶联免疫法是肿瘤标志物常用的免疫分析方法之一,它具有试剂和仪器成本低、操作的简单优点,但同时存在着灵敏度低、反应时间长、操作步骤繁锁且不易实现全自动化等缺点。随着标记免疫技术的迅速发展,各种新的检测方法不断问世。化学发光免疫分析法是在酶联免疫分析基础上发展起来的更敏感的微量免疫检测技术,然而在实际的免疫检测中,由于待测样品中所含的杂质成分较多,一定程度上影响了检测的灵敏度和准确度。
迄今为止,人半胱氨酸蛋白酶抑制剂S的临床检测中缺乏一种操作过程简单、反应时间短、检测限低、灵敏度高、特异性好、稳定性好的诊断试剂盒。
发明内容
为了克服现有的人半胱氨酸蛋白酶抑制剂S检测技术的上述缺陷,本发明基于磁微粒化学发光法,设计了一种全新的试剂盒,能够对生物样品中半胱氨酸蛋白酶抑制剂S的含量进行精确测量,从而为胃癌、肠癌的早期诊断提供可靠依据。
因此,本发明提供了一种用于定量检测半胱氨酸蛋白酶抑制剂S的试剂盒,其包括:偶联有链霉亲和素的磁性微粒;生物素标记的半胱氨酸蛋白酶抑制剂S第一单克隆抗体;酶标记的半胱氨酸蛋白酶抑制剂S第二单克隆抗体;半胱氨酸蛋白酶抑制剂S校准品和/或半胱氨酸蛋白酶抑制剂S质控品。
在一种实施方式中,上述试剂盒中,所述半胱氨酸蛋白酶抑制剂S第一单克隆抗体和所述半胱氨酸蛋白酶抑制剂S第二单克隆抗体不同,两者之一是单克隆抗体5D2F2或者单克隆抗体5E4G5,其中单克隆抗体5D2F2是保藏号为CCTCC NO:C201416的杂交瘤细胞分泌的人Cystatin S特异性单克隆抗体;单克隆抗体5E4G5是保藏号为CCTCC NO:C201415的杂交瘤细胞分泌的人Cystatin S特异性单克隆抗体。
在一种优选的实施方式中,上述试剂盒中的所述半胱氨酸蛋白酶抑制剂S第一单克隆抗体与所述半胱氨酸蛋白酶抑制剂S第二单克隆抗体不同,分别选自半胱氨酸蛋白酶抑制剂S单克隆抗体5D2F2和半胱氨酸蛋白酶抑制剂S单克隆抗体5E4G5。单克隆抗体5D2F2和单克隆抗体5E4G5的效价达1:107以上,亲和力达10-9Ka以上。
在一种实施方式中,上述试剂盒中的半胱氨酸蛋白酶抑制剂S校准品和半胱氨酸蛋白酶抑制剂S质控品是真核细胞表达的重组半胱氨酸蛋白酶抑制剂S蛋白或大肠杆菌表达的重组半胱氨酸蛋白酶抑制剂S蛋白。比如Cystatin S校准品或Cystatin S质控品可以为通过将重组质粒转染到真核细胞,培养后收集阳性细胞上清,分离出真核表达的Cystatin S蛋白;也可以为通过基因工程的手段及大肠杆菌表达系统获得的原核CystatinS蛋白。
Cystatin S校准品可用于制作标准曲线,从而使得Cystatin S检测定量化。
在一种优选的实施方式中,上述磁性微粒的粒径是0.1-10微米、优选0.2-5微米、优选0.2-3微米、更优选0.3-2微米、更优选0.5-1微米,以便在试剂盒使用时的检测体系形成接近均相的反应体系。
在一种优选的实施方式中,所述磁性微粒是表面带有活性基团、以四氧化三铁为内核的聚合物。所述活性基团可以是氨基、羧基、IDA(亚氨基二乙酸)、环氧基等,优选氨基或羧基。
在一种优选的实施方式中,上述试剂盒中的偶联有链霉亲和素的磁性微粒呈磁珠悬液形式,即链霉亲和素磁珠悬液作为磁分离试剂。
本发明的试剂盒中的半胱氨酸蛋白酶抑制剂S检测体系采用酶催化的底物化学发光法,从而通过进行光电信号检测而确定样品中的半胱氨酸蛋白酶抑制剂S含量。
在一种实施方式中,上述试剂盒中的酶优选是过氧化物酶、碱性磷酸酶、磷酸酯酶或荧光素酶,更优选辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase,简称HRP)或者碱性磷酸酶,更优选辣根过氧化物酶。
作为辣根过氧化物酶的作用底物,可以选自下组:氨基苯二酰一肼(鲁米诺)、异氨基苯二酰一肼、氨基丁基乙基异氨基苯二酰一肼(ABEI)、氨基己基乙基异氨基苯二酰一肼(AHEI)、7-二甲基氨基萘-l,2-二羧酸酰肼、环取代的氨基邻苯二甲酰肼、蒽-2,3-二羧酸酰肼、菲-1,2-二羧酸酰肼、芘二羧酸酰肼、5-羟基-邻苯二甲酰肼、6-羟基邻苯二甲酰肼、2,3-二氮杂萘二酮类似物、9,10-二氢化吖啶类化合物比如9,10-二氢化吖啶酯、9,10-二氢化吖啶酯、9,10-二氢化吖啶硫酯、9,10-二氢化吖啶磺酰胺、9,10-二氢化吖啶二硫缩烯酮化合物。优选是鲁米诺。
酶的作用底物可以单独作为试剂盒的组成部分,即,底物溶液。优选地,所述底物溶液含有鲁米诺。
相对应地,上述试剂盒进一步包含引发剂溶液,该引发剂溶液包含过氧化氢,比如是双氧水溶液。
在一种优选的实施方式中,上述试剂盒用于测定生物样品中的半胱氨酸蛋白酶抑制剂S,所述生物样品来源于受测对象、尤其是有胃癌、肠癌的嫌疑的患者。样本可以包含多种形式,比如全血、血浆、血清、尿液、唾液、眼泪、体液、胃液、粪便。其中优选血清。
本发明将化学发光和磁性微粒结合起来,提供了一种接近均相的反应体系,可以定量检测出半胱氨酸蛋白酶抑制剂S含量。与现有技术相比,本发明的试剂盒具有操作过程简单、反应时间短、检测限低、灵敏度高等诸多优点,在临床检验中可以根据Cystatin S的含量进行胃肠癌辅助诊断、疗效评估及复发监测。
附图说明
图1是Cystatin S检测标准曲线。
图2是本发明实施例中血清Cystatin S检测的ROC曲线。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。应理解,以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
本文中涉及到多种物质的添加量、含量及浓度,其中所述的百分含量,除特别说明外,皆指质量百分含量。
磁微粒免疫检测技术是利用高分子材料合成一定粒度大小的磁性固相微粒,作为载体,以物理吸附、化学偶联等方法包被具有特异性亲和力的抗体或抗原等各种免疫活性物质。磁微粒具有顺磁性,在磁场下具有磁场响应性,将磁微粒应用于免疫检测固相,增加包被表面积,从而增加抗原或抗体吸附量及接触面积,提高反应灵敏度,同时使得抗原-抗体结合物与游离抗体的分离更容易,即清洗更方便;而且磁微粒反应体系更接近于均相反应体系,加快了反应的速度,缩短了反应时间。
本发明的试剂盒的作用原理是基于磁微粒化学发光免疫检测机制。Cystatin S检测体系中,酶标记的Cystatin S第二单克隆抗体和抗原Cystatin S结合形成抗原抗体复合物,并加入生物素标记的Cystatin S第一单克隆抗体,形成生物素标记抗体-抗原-HRP标记抗体的双抗夹心免疫复合物,随后加入偶联有链霉亲和素的磁性微粒,通过链霉亲和素与生物素的亲和性使抗原抗体复合物连接到磁珠上,形成磁珠免疫复合物,然后利用磁场分离出该磁珠免疫复合物,加入酶促反应的化学发光底物液并借助化学发光信号来测定Cystatin S含量,其中的酶用于催化或激活化学发光反应。
在本发明中,术语“磁性微粒”、“磁微粒”、“磁珠”和“磁性颗粒”表示相同的意义,都是指用于将亲和素、生物素、抗原/抗体、酶、核酸/寡核苷酸、小分子药物等固定在其表面的具有超顺磁性的胶态复合材料,可均匀分散于一定基液中,在磁场中富集。
至于磁性微粒,可以使用生物检测领域中常用的磁性微粒。作为一种选择方式,可以根据需要在磁性微粒表面覆盖高分子成分比如PEI(聚醚酰亚胺Polyetherimide)、PVA(聚乙烯醇)、PS(聚苯乙烯)等聚合物,包括硅化物、多聚糖、蛋白、纤维素或树脂等。
磁微粒化学发光免疫检测所使用的磁珠具有超顺磁和相应的磁场响应性,根据磁珠表面基团类型,所述磁珠包括羧基磁珠、氨基磁珠、硅基磁珠、巯基磁珠、IDA(亚氨基二乙酸)磁珠、环氧基磁珠、醛基磁珠、链霉素亲和素磁珠等,本发明所提供试剂盒中优选链霉素亲和素磁珠。
在本发明的一种实施方式中,上述磁性微粒A和磁性微粒B的粒径范围是0.1-10微米。磁性微粒的平均粒径的下限为0.1微米,优选为0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.55、0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、0.95或1微米;其上限为10微米,优选为9.5、9、8.5、8、7.5、7、6.5、6、5.5、5、4.5、4、3.5或3微米。更优选0.2-5微米、优选0.2-3微米、更优选0.3-2微米、更优选0.3-1微米。比如磁性微粒的平均粒径可以为0.2-5微米,优选0.2-3微米、更优选0.3-2微米、更优选0.5-1微米。如果平均粒径小于0.1微米,则价格过高,并可能造成上述免疫复合物的分离困难,可能影响Cystatin S含量的测定精确性;另一方面,如果平均粒径大于10微米,则不利于Cystatin S检测体系形成接近均相的反应体系,进而可能影响到Cystatin S含量的测定精确性。
在本发明中,术语“单克隆抗体”、“单抗”和“抗体”表示相同的意义,尤其是指单克隆抗体5D2F2和单克隆抗体5E4G5。这两种单克隆抗体在中国发明专利申请CN104558116A中有描述。
在本发明中,术语“半胱氨酸蛋白酶抑制剂S”、“胱抑素S”和“Cystatin S”表示相同的意义,可以互换使用。
为了实现化学发光检测,本发明的试剂盒中采用酶作为催化剂来催化底物的化学发光反应,所使用的酶能够催化或者激活化学发光化合物或者荧光染料,从而快速地将无色的底物转变成有色的产物、或者引起光变化,或者将非荧光的荧光染料转变成强烈的荧光产物。
在一种实施方式中,酶选自含有过渡金属的过氧化物酶、碱性磷酸酶、磷酸酯酶和荧光素酶,更尤其优选是过氧化物酶。其中过氧化物酶可以包括:乳过氧化物酶、微小过氧化物酶、髓过氧化物酶、卤素过氧化物酶例如钒溴过氧化物酶、辣根过氧化物酶、真菌的过氧化物酶比如木质素过氧化物酶和在白腐真菌中产生的依赖Mn的过氧化物酶、以及大豆过氧化物酶。其他氧化物酶的模拟化合物并不是酶,而是具有类似过氧化物酶的活性,其包括铁络合物比如亚铁原卟啉和Mn-TPPS4(Y.X.Ci等,Mikrochem.J.,52,257-62(1995)),已知该化合物可以催化底物的化学发光氧化,这种化合物也被包含在本发明所使用的过氧化物酶含义的范围内。考虑到ELISA在蛋白质检测中的普遍适用性,优选酶是过氧化物酶、碱性磷酸酶、磷酸酯酶或荧光素酶,更优选辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase,简称HRP)。
作为酶催化的底物,这些底物是适用于化学发光检测、显色检测或者荧光检测的化合物。因此,在本发明的一个实施方式中,优选酶能够催化或者激活化学发光化合物或者荧光染料,从而快速地将无色的底物转变成有色的产物、或者引起光变化,或者将非荧光的荧光染料转变成强烈的荧光产物。比如,当酶是辣根过氧化物酶时,相应的显色化合物例如是常用的邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)比如3,3′,5,5′-四甲基联苯胺、或2,2′-联氨-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺盐(ABTS);当酶是磷酸酯酶(AP)时,相应的显色化合物例如是常用的对硝基苯磷酸酯(p-NPP)或者相应的荧光底物例如是(磷酸4-甲基伞酮)。优选的化学发光化合物是能够被氧化从而当存在酶和引发剂溶液时产生化学发光,其示例性化合物种类包括氨基苯二酰一肼(鲁米诺)、异氨基苯二酰一肼、氨基丁基乙基异氨基苯二酰一肼(ABEI)、氨基己基乙基异氨基苯二酰一肼(AHEI)、7-二甲基氨基萘-l,2-二羧酸酰肼、环取代的氨基邻苯二甲酰肼、蒽-2,3-二羧酸酰肼、菲-1,2-二羧酸酰肼、芘二羧酸酰肼、5-羟基-邻苯二甲酰肼、6-羟基邻苯二甲酰肼、2,3-二氮杂萘二酮类似物、9,10-二氢化吖啶类化合物比如9,10-二氢化吖啶酯、9,10-二氢化吖啶酯、9,10-二氢化吖啶硫酯、9,10-二氢化吖啶磺酰胺、9,10-二氢化吖啶二硫缩烯酮化合物。一般来讲,任何已知可以在过氧化氢和过氧化物酶的作用下产生化学发光的化合物都可在本发明中被用做化学发光化合物来产生化学发光,这样的化合物包括占辛染料、芳香胺和杂环胺。可在本发明中使用的荧光染料包括可用于蛋白质的荧光免疫测定的化合物,其可共轭于蛋白质比如抗体。优选的荧光染料包括萤火虫荧光素化合物。荧光素是荧光素酶的底物,其在荧光素酶存在的条件下被氧化从而产生氧化荧光素并发光。
在一种实施方式中,酶是辣根过氧化物酶,并且作用底物都是鲁米诺。
上述试剂盒进一步包含引发剂溶液比如双氧水,用于实现酶催化反应。引发剂溶液提供了为产生对于化学发光所需激发态化合物所需要的反应物。该反应物可以是一种对于通过直接与化学发光化合物反应而进行化学发光反应所必需的反应物。例如,当催化剂是过氧化物酶时,将会发生这种情况。在一种优选实施方式中,引发剂溶液包含过氧化物化合物。该过氧化物成分是任何能够与过氧化物酶反应的过氧化物或者烷基氢过氧化物。优选的过氧化物包括过氧化氢(双氧水)、过氧化脲和过硼酸盐。该过氧化物与过氧化物酶反应,估计可能是在酶的活性部位将铁的氧化态变成了不同的氧化态。所述引发剂溶液还可以包含选自下组的过氧化物酶增强子:苯酚化合物、芳香胺、芳基硼酸化合物、芳基硼酸酯化合物、芳基硼酸酸酐化合物。
在优选的实施方式中,上述试剂盒中可进一步包括辅助试剂,比如,显色剂(底物溶液和引发剂溶液)、酶抑制剂、缓冲液、稳定剂、稀释剂、洗涤试剂、以及Cystatin S校准品和/或Cystatin S质控品。比如,所述缓冲液用于增加检测试剂的稳定性、提高检测灵敏度以及检测特异性。所述稀释剂用于稀释样本,是含有BSA的溶液。所述洗涤试剂用于洗涤磁珠,除去没有偶联到磁珠上的物质。洗涤试剂可以是含有磷酸盐、氯化钠以及表面活性剂的缓冲液。
在优选的实施方式中,上述试剂盒还可分别包括下述物品中的至少之一:携带工具,其空间划分为可以收容一种或多种容器、96孔板或板条的限定空间,该容器例如是药瓶、试管、和类似物,每样容器都含有一个单独的用于本发明方法的组分;说明书,其可以写在瓶子、试管和类似物上,或者写在一张单独的纸上,或者在容器的外部或内部;也可以是多媒体的形式,比如CD、电脑光盘、录像等等。
本发明的试剂盒在医学领域的具体应用,主要体现在胃癌、肠癌的鉴别诊断、预后评估、治疗效果监测或病程监测方面。以下以个体的血清为样本进行胃癌鉴别诊断为例,对本发明作进一步详细说明。
实施例
材料和仪器
磁性微粒,为磁微粒悬液,浓度为1mg/mL,磁微粒含羧基活性基团,每毫克(mg)磁微粒羧基含量不低于0.05毫摩尔(mmol)。购自河南惠尔纳米科技(生物)有限公司,型号:HRCZ-04N200。
Cystatin S蛋白冻干粉(Cystatin S蛋白为cos-7细胞表达的真核蛋白,纯度>95%),上海良润生物医药科技有限公司。
Cystatin S单克隆抗体(克隆号:5D2F2,纯度>95%,效价或滴度达1:107,亲和力达10-9Ka,浓度2mg/mL),上海良润生物医药科技有限公司。实施例中用作Cystatin S第一单克隆抗体。
Cystatin S单克隆抗体(克隆号:5E4G5,纯度>95%,效价或滴度达1:107,亲和力达10-9Ka,浓度2mg/mL),上海良润生物医药科技有限公司。实施例中用作Cystatin S第二单克隆抗体。
活化辣根过氧化物酶(HRP)标记试剂盒,购自北京泰天河生物科技有限公司,型号:MD010A。
2-吗啉乙磺酸一水合物(MES):购自上海芃硕生物科技有限公司,货号:PM105074-500g。
碳二亚胺(EDC):购自北京华迈科生物技术有限责任公司,货号:E046101。
吐温-20:购自生工生物工程(上海)股份有限公司,货号:T0777-500ml。
Proclin 300:购自闪晶生物公司,型号:ZB116。
浓缩洗液:0.15%PBST,pH7.4。用前以纯化水作25倍稀释。
化学发光底物液:购自Thermo Scientific,货号:34080,分为A液(作为HRP底物的鲁米诺溶液)和B液(作为引发剂的双氧水)。
其他化学试剂均为分析纯,均购自中国医药(集团)上海化学试剂公司。
为简要起见,实施例中,有时将辣根过氧化物酶称为“酶”或者“HRP”;有时将辣根过氧化物酶标记的Cystatin S单克隆抗体称为“酶标抗体”;有时将“生物素标记的Cystatin S单克隆抗体”称为“生物素标记抗体”;有时将“洗涤缓冲液”称为“洗液”、“浓缩洗液”。
磁力架,购自Corning公司。
化学发光型免疫分析仪,安图生物,型号:LUMO。
全自动磁微粒化学发光仪,江苏泽成生物技术有限公司,型号:CIA600。
实施例1磁分离试剂(链霉亲和素磁珠悬液)制备
链霉亲和素磁珠悬液制备包括如下步骤:
(1)取50mg(1mg/mL)磁微粒悬液,磁分离去上清,用0.05mol/L、pH4.5的MES缓冲液清洗3次;
(2)用5mL的0.1mol/L、pH4.5的MES缓冲液重悬磁微粒,浓度为10mg/mL;
(3)加入5-7.5mg链霉亲和素,室温搅拌30min;
(4)加入20-30μL新鲜配制的10mg/mL的EDC水溶液,4℃下搅拌过夜;
(5)磁分离,去上清,用0.01mol/L PBS洗涤3次;
(6)用含2%BSA的0.01mol/L PBS(pH=7.4)室温封闭2-3小时;
(7)用含0.5%BSA的0.01mol/L PBS(pH=7.4)清洗3次;
(8)用含0.5%BSA的0.01mol/L PBS(pH=7.4)配制成1mg/mL的工作液,用时轻轻摇匀即得,于4℃冰箱保存。
实施例2生物素标记的Cystatin S第一单克隆抗体制备
生物素标记的Cystatin S第一单克隆抗体制备包括如下步骤:
(1)取2mg的5D2F2单克隆抗体,用0.1mol/L、pH9.6碳酸盐缓冲液在2~8℃下搅拌透析6-8小时,中间换一次液;
(2)按照5D2F2抗体分子与生物素分子比为1:20的比例在透析后的抗体溶液中加入生物素溶液,并加入DMSO至终浓度为10%,混匀;
(3)缓慢振荡,37℃避光反应2h;
(4)加入60-80μL的3mol/L乙醇胺溶液,室温避光反应30min;
(5)用0.01mol/L PBS溶液在2~8℃下搅拌透析,5-6小时换一次液,共换液3~4次;
(6)向透析后的抗体溶液加入等体积甘油,混匀、分装,浓度为0.5mg/mL,-20℃保存。
实施例3辣根过氧化物酶标记的Cystatin S第二单克隆抗体制备
辣根过氧化物酶标记的Cystatin S第二单克隆抗体制备包括如下步骤:
(1)称取2.5mg辣根过氧化物酶(HRP冻干粉,纯度为约99%,比活性为约1500U/mg)溶解于1mL双蒸水中;
(2)加入100μL新配的0.1M NaIO4溶液,室温避光搅拌30min;
(3)加入10μL的0.2M、pH 9.6碳酸盐缓冲液,使步骤(2)中醛化的HRP溶液pH升高到9.0-9.5;
(4)加入5mg的5E4G5抗体在1ml 0.01M碳酸盐缓冲液中,室温避光轻搅拌反应2小时;
(5)加入50μL新配的4mg/mL NaBH4溶液,混匀,置于4℃静置反应2小时;
(6)将上述反应液装入透析袋中,置于0.15M、pH值为7.4的PBS缓冲液中,4℃条件下搅拌过夜;
(7)取出透析袋中的液体,在搅拌下逐滴加入等体积的饱和硫酸铵溶液,后置于4℃静置1小时;
(8)将步骤(7)所得溶液于3000离心30min,弃上清。将沉淀物用半饱和硫酸铵洗两次后,将沉淀物溶于少量0.15M、pH7.4的PBS中;
(9)将上述溶液用0.15M、pH7.4的PBS缓冲液透析,以去除铵离子,后将溶液置于10000rpm离心30min,去除沉淀,上清液即为酶结合物;
(10)用蛋白质稳定剂将5E4G5-HRP酶结合物稀释至100X浓度储液,分装,-20℃保存,使用时100倍稀释。
实施例4Cystatin S校准品制备
Cystatin S校准品制备包括如下步骤:
(1)将Cystatin S蛋白用含1%BSA的校准品稀释液配制成校准品浓储液;
(2)用上海良润生物医药科技有限公司的企业参考品为其定值,按企业标准品标定值,用校准品稀释液将校准品浓储液稀释至各工作浓度点,分别为0、25U/mL、50U/mL、100U/mL、200U/mL、400U/mL、800U/mL,再将各工作浓度点用企业参考品标定,储存于-20℃。
实施例5Cystatin S质控品制备
Cystatin S质控品制备包括如下步骤:
(1)将Cystatin S蛋白用含1%BSA的校准品稀释液配制成校准品浓储液;
(2)用上海良润生物医药科技有限公司的企业参考品为其定值,按企业标准品标定值,用校准品稀释液将校准品浓储液稀释至100U/mL,用企业参考品标定,储存于-20℃。
实施例6Cystatin S测定标准曲线绘制
以实施例1-5中所得的试剂、必要的辅助试剂为基础,可组合成试剂盒。按下述步骤绘制Cystatin S测定标准曲线:
(1)将待检试剂盒在室温(18~25℃)下平衡30分钟;
(2)配制洗液:用蒸馏水将浓缩洗液按1:25稀释(1mL洗液加24mL蒸馏水)。若浓缩洗液有结晶,可将浓缩洗液置于室温或37℃,待结晶溶解后再进行稀释;
(3)在反应管中加入25μL待测样本(或校准品及质控品),然后加入50μL生物素标记的Cystatin S抗体、50μL辣根过氧化物酶标记的Cystatin S抗体,混匀,37℃条件下温育20min;加入20μL磁分离试剂,混匀,37℃条件下温育15min;
(4)洗涤:使磁微粒在磁场中沉降,去除上清,加入300μL的清洗液,去除磁场,震荡使磁微粒充分混悬,然后磁分离,去除上清;此步骤重复3-4次;
(5)反应管中加入100μL发光底物A液和B液的混合溶液,震荡,使磁微粒充分混悬,10min内测定各管的光强度。并拟合出标准曲线,进行样本值的计算,标准曲线见图1。
实施例7本发明试剂盒临床应用
一、试剂盒用于胃肠癌辅助诊断:
从北京协和医院收集了术前胃癌血清100例,正常体检人员血清100例,每例血1mL。使用本发明Cystatin S血清检测试剂盒分别检测胃癌及正常人血清中Cystatin S浓度。结果:正常对照组血清Cystatin S范围是92.26-292U/mL,均值为147.02U/mL;胃癌患者血清Cystatin S范围是84.64-950.65U/mL,均值为470.08U/mL;ROC曲线统计结果如图2所示。
然后根据ROC曲线(图2),统计Cystatin S的曲线下面积,结果如表1所示。结果显示,用于区分胃癌与正常人的cutoff值为212U/mL,曲线下面积为0.892,诊断灵敏度为79%,特异性为90%。
表1.ROC曲线下的面积
a.在非参数假设下,
b.零假设:实面积=0.5。
二、试剂盒用于疗效评估
取北京协和医院胃癌患者10例,治疗前检测Cystatin S浓度,疗程结束后再检测Cystatin S浓度。Cystatin S浓度与治疗前相比下降小于50%,判断为治疗无效;CystatinS浓度与治疗前相比下降大于50%,判断为病情改善;Cystatin S浓度与治疗前相比下降大于90%,判断为有效;Cystatin S浓度下降至值以下,判断为治疗效果显著。
表2、评估胃癌疗效结果
患者编号 | 治疗前后浓度变化百分比 | 临床评价 |
01 | 降低25% | 无效 |
02 | 降低23% | 无效 |
03 | 降低53% | 改善 |
04 | 升高37% | 无效 |
05 | 降低72% | 改善 |
06 | 降低56% | 改善 |
07 | 降低96% | 有效 |
08 | 降低56% | 改善 |
09 | 升高28% | 无效 |
10 | 降低81% | 有效 |
由表2可知,Cystatin S磁微粒化学发光定量检测试剂盒的疗效评估结果是,10例患者中,2例患者治疗有效,4例患者治疗后病情得到改善,其余4例患者无治疗效果,与临床判断结果一致。
三、试剂盒用于转移复发监控
北京协和医院早期胃癌患者10例化疗疗程结束后,检测血清Cystatin S浓度,并对患者进行跟踪随访。治疗后六周首次检测血清Cystatin S浓度,以后每三个月检测一次,跟踪九个月,检测四次。
表3、监控胃癌转移复发结果
患者编号 | 6周U/mL | 3个月U/mL | 6个月U/mL | 9个月U/mL | 临床评价 |
01 | 241.03 | 234.09 | 215.19 | 244.09 | 无进展生存 |
02 | 137.14 | 166.27 | 129.34 | 157.95 | 无进展生存 |
03 | 183.56 | 108.60 | 105.61 | 95.93 | 无进展生存 |
04 | 143.95 | 156.80 | 174.94 | 130.34 | 无进展生存 |
05 | 203.15 | 300.29 | 323.47 | 428.24 | 转移复发 |
06 | 175.21 | 196.17 | 140.51 | 120.06 | 无进展生存 |
07 | 251.40 | 279.99 | 224.12 | 219.70 | 无进展生存 |
08 | 145.72 | 195.28 | 161.89 | 172.36 | 无进展生存 |
09 | 120.88 | 320.59 | 398.61 | 549.92 | 转移复发 |
10 | 249.28 | 202.27 | 276.90 | 240.91 | 无进展生存 |
由表3可知,结果显示,通过本发明的试剂盒检测血清Cystatin S浓度变化,可早于临床症状和体征发现胃癌患者是否复发转移,为医生可提前进行干预提供指导。
综上所述,本发明的试剂盒可用于精确测定Cystatin S,为胃癌、肠癌的早期鉴别诊断、疗效评估提供有效的参考。
Claims (10)
1.一种用于定量检测半胱氨酸蛋白酶抑制剂S的试剂盒,其包括:偶联有链霉亲和素的磁性微粒;生物素标记的半胱氨酸蛋白酶抑制剂S第一单克隆抗体;酶标记的半胱氨酸蛋白酶抑制剂S第二单克隆抗体;半胱氨酸蛋白酶抑制剂S校准品。
2.如权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述半胱氨酸蛋白酶抑制剂S第一单克隆抗体和所述半胱氨酸蛋白酶抑制剂S第二单克隆抗体不同,两者之一是单克隆抗体5D2F2或者单克隆抗体5E4G5,其中单克隆抗体5D2F2是保藏号为CCTCC NO:C201416的杂交瘤细胞分泌的人Cystatin S特异性单克隆抗体;单克隆抗体5E4G5是保藏号为CCTCC NO:C201415的杂交瘤细胞分泌的人Cystatin S特异性单克隆抗体。
3.如权利要求2所述的试剂盒,其特征在于,所述半胱氨酸蛋白酶抑制剂S第一单克隆抗体与所述半胱氨酸蛋白酶抑制剂S第二单克隆抗体不同,分别选自单克隆抗体5D2F2和单克隆抗体5E4G5。
4.如权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述半胱氨酸蛋白酶抑制剂S校准品是真核细胞表达的重组半胱氨酸蛋白酶抑制剂S蛋白或大肠杆菌表达的重组半胱氨酸蛋白酶抑制剂S蛋白。
5.如权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述磁性微粒的粒径是0.1-10微米。
6.如权利要求5所述的试剂盒,其特征在于,所述磁性微粒是表面带有氨基或羧基活性基团、以四氧化三铁为内核的聚合物。
7.如权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述酶选自过氧化物酶、碱性磷酸酶、磷酸酯酶或荧光素酶。
8.如权利要求7所述的试剂盒,其特征在于,所述酶是辣根过氧化物酶。
9.如权利要求8所述的试剂盒,其特征在于,还包括作为辣根过氧化物酶底物的鲁米诺溶液和双氧水。
10.如权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,用于测定生物样品中的半胱氨酸蛋白酶抑制剂S,所述生物样品选自全血、血浆、血清、尿液、唾液、眼泪、体液、胃液、粪便。
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