CN106199001A - 变异链球菌的化学发光检测试剂盒及其使用方法 - Google Patents

变异链球菌的化学发光检测试剂盒及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种变异链球菌的化学发光检测试剂盒及其使用方法，该试剂盒包括以下组分：免疫球蛋白G偶联磁珠、酶标万古霉素、酶促化学发光底物、变异链球菌菌悬液标准品、缓冲液以及洗涤液，其使用方法是以简单、低价、稳定的万古霉素作为分子识别试剂，与特异性分子识别试剂免疫球蛋白G联合应用构成双位点分子识别模式，再结合磁珠富集分离技术和高灵敏的酶促化学发光技术，针对变异链球菌全细胞进行检测；该试剂盒具有检测快速、方便、准确、特异、灵敏、稳定、低价的优点，有望应用于变异链球菌的现场检测和快速筛查，能够为临床诊断、食品安全和环境检测等领域检测变异链球菌提供有力的技术支持平台。

Description

变异链球菌的化学发光检测试剂盒及其使用方法
技术领域
本发明属于微生物检测技术领域，涉及一种变异链球菌的检测试剂盒，以及该试剂盒的使用方法。
背景技术
变异链球菌（Streptococcus mutans）是一种生长于口腔的革兰阳性厌氧致病菌，具有分泌酸性物质腐蚀牙釉质的特点，为人类主要致龋齿菌之一。此外，变异链球菌还可以引起亚急性细菌性心内膜炎。因此，建立快速、方便、灵敏的变异链球菌检测方法，对于人体健康有着重要意义。
变异链球菌的现有检测方法中，最为成熟的是基于细菌培养模式的传统方法，应用最广泛的方法是基于细菌核酸的PCR法。基于细菌培养模式的传统方法虽然可靠性好、灵敏度高，但却耗时费力，通常需要数天的时间才能得到结果，同时需要熟练的专业人员和大量的实验器具。基于细菌核酸的PCR法虽然特异性高、可实现多组分检测，但却需要经过提取核酸和合成特异性引物等复杂的过程。另外，用于检测变异链球菌的方法还有基于DNA探针的Southern印迹杂交技术和噻唑蓝比色法等，这些方法虽然特异性强，但灵敏度却非常低，不能实现对变异链球菌的高灵敏检测。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种变异链球菌的检测试剂盒及其使用方法，可以快速、方便、特异、灵敏、稳定地检测变异链球菌。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
1．变异链球菌的化学发光检测试剂盒，包括以下组分：免疫球蛋白G偶联磁珠、酶标万古霉素、酶促化学发光底物、变异链球菌菌悬液标准品、缓冲液以及洗涤液。
优选的，所述免疫球蛋白G偶联磁珠为大鼠免疫球蛋白G2a偶联磁珠。
优选的，所述大鼠免疫球蛋白G2a偶联磁珠由以下方法制得：将羧基化磁珠用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC▪HCl）和 N-羟基丁二酰亚胺（NHS）活化后，与大鼠免疫球蛋白G2a在PBS缓冲液中反应，再用牛血清白蛋白（BSA）封闭，制得大鼠免疫球蛋白G2a偶联磁珠。
优选的，所述酶标万古霉素为碱性磷酸酶标记万古霉素。
优选的，所述碱性磷酸酶标记万古霉素由以下方法制得：将碱性磷酸酶用EDC▪HCl和NHS活化后，与万古霉素在PBS缓冲液中反应，反应混合物经分离纯化，制得碱性磷酸酶标记万古霉素。
优选的，所述酶促化学发光底物为碱性磷酸酶的化学发光底物CSPD与化学发光增强剂Sapphire-II的混合物。
优选的，所述变异链球菌菌悬液标准品由以下方法制得：取变异链球菌单个菌落接种于LB培养液中，37℃振荡培养，离心去除上清液，细菌用水清洗后，用三羟甲基氨基甲烷-盐酸（Tris-HCl）缓冲液重悬并调整细菌浓度。
优选的，所述缓冲液为0.01 mol/L、pH 7.4 的Tris-HCl缓冲液，所述洗涤液为0.01 mol/L、pH 7.4并含0.05vol% 吐温-20的Tris-HCl缓冲液。
2．变异链球菌的化学发光检测试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
(a) 将变异链球菌菌悬液标准品用缓冲液稀释制成变异链球菌工作菌液；向变异链球菌工作菌液中加入免疫球蛋白G偶联磁珠，孵育，磁性分离，获得变异链球菌-免疫球蛋白G偶联磁珠复合物，用洗涤液清洗，再加入酶标万古霉素，孵育，磁性分离，获得酶标万古霉素-变异链球菌-免疫球蛋白G偶联磁珠复合物，用洗涤液清洗，再加入酶促化学发光底物，反应，记录化学发光信号，以化学发光强度对变异链球菌浓度作图，绘制工作曲线；
(b) 向待测样品中加入免疫球蛋白G偶联磁珠，孵育，磁性分离磁珠，用洗涤液清洗，再加入酶标万古霉素，孵育，磁性分离磁珠，用洗涤液清洗，再加入酶促化学发光底物，反应，记录化学发光信号，根据化学发光强度和步骤(a)绘制的工作曲线求得待测样品中变异链球菌的浓度。
优选的，所述变异链球菌的化学发光检测试剂盒的使用方法包括以下步骤：
(a) 将变异链球菌菌悬液标准品用缓冲液稀释制成浓度在24~2.4×105 CFU/mL范围内的变异链球菌工作菌液；向2.0 mL变异链球菌工作菌液中加入终浓度为20 µg/mL的大鼠免疫球蛋白G2a偶联磁珠，37℃孵育1小时，磁性分离，获得变异链球菌-大鼠免疫球蛋白G2a偶联磁珠复合物，用洗涤液清洗，再加入终浓度为2.0 µg/mL的碱性磷酸酶标记万古霉素，37℃孵育1小时，磁性分离，获得碱性磷酸酶标记万古霉素-变异链球菌-大鼠免疫球蛋白G2a偶联磁珠复合物，用洗涤液清洗，再加入20 µL碱性磷酸酶的化学发光底物CSPD与化学发光增强剂Sapphire-II的混合物，反应，记录600s内化学发光信号，以化学发光强度对变异链球菌浓度作图，绘制工作曲线；
(b) 向2.0 mL待测样品中加入终浓度为20 µg/mL的大鼠免疫球蛋白G2a偶联磁珠，37℃孵育1小时，磁性分离磁珠，用洗涤液清洗，再加入终浓度为2.0 µg/mL的碱性磷酸酶标记万古霉素，37℃孵育1小时，磁性分离磁珠，用洗涤液清洗，再加入20 µL碱性磷酸酶的化学发光底物CSPD与化学发光增强剂Sapphire-II的混合物，记录600s内化学发光信号，根据化学发光强度和步骤(a)绘制的工作曲线求得待测样品中变异链球菌的浓度。
万古霉素属于糖肽类抗生素，对革兰氏阳性菌有非常强的抗菌作用，可以与革兰氏阳性菌细胞壁中的D-丙氨酰-D-丙氨酸（D-alanyl-D-alanine）部分结合。将万古霉素用化学发光试剂进行标记后，可同时用于识别革兰氏阳性菌和作为化学发光示踪物。由于万古霉素是结构明确、性质稳定、便宜易得的小分子化合物，用于检测细菌具有成本低、稳定性高的优点。然而，万古霉素同时也是一种广谱抗生素，因此需要引入第二种分子识别试剂来提高检测变异链球菌的特异性。
链球菌G蛋白是链球菌细胞壁中的一种蛋白质，可以与人免疫球蛋白G 4种亚类以及许多哺乳动物的单克隆、多克隆免疫球蛋白G的Fc段结合且结合能力强。使用免疫球蛋白G偶联磁珠，可以实现对变异链球菌的特异性识别和分离富集。
本发明的有益效果在于：本发明提供了一种针对变异链球菌全细胞检测的双位点分子识别模式化学发光检测试剂盒及其使用方法，系选用简单、低价、稳定的万古霉素作为分子识别试剂，与特异性分子识别试剂免疫球蛋白G联合应用，构成双位点分子识别模式以提高检测的特异性，再结合磁珠富集分离技术和高灵敏的酶促化学发光技术，所得检测试剂盒具有检测快速、方便、准确、特异、灵敏、稳定、低价的优点，有望应用于变异链球菌的现场检测和快速筛查，能够为临床诊断、食品安全和环境检测等领域检测变异链球菌提供有力的技术支持平台。
附图说明
图1为变异链球菌的化学发光检测试剂盒的使用流程示意图。
图2为使用变异链球菌的化学发光检测试剂盒检测变异链球菌的工作曲线。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的优选实施例进行详细的描述。
实施例1 变异链球菌的化学发光检测试剂盒的制备
本实施例的变异链球菌的化学发光检测试剂盒，包括以下组分：免疫球蛋白G偶联磁珠、酶标万古霉素、酶促化学发光底物、变异链球菌菌悬液标准品、缓冲液以及洗涤液。
所述免疫球蛋白G偶联磁珠为大鼠免疫球蛋白G2a偶联磁珠，其制备方法为：取1.0mg/mL的羧基化磁珠1.0 mL，用2-(N-吗啡啉)乙磺酸（MES）缓冲液（0.01 mol/L，pH 5.5）洗涤3次后，加入含有40 mg EDC▪HCl和10 mg NHS的MES缓冲液（0.01 mol/L，pH 5.5）1.0 mL，活化反应15分钟；活化的磁珠用PBS缓冲液（0.01 mol/L，pH 7.4）洗涤3次，加入2.0 mg/mL的大鼠免疫球蛋白G2a（溶剂为0.01 mol/L，pH 7.4的PBS缓冲液）1.0 mL，4℃旋转反应12小时后，用含0.05vol%吐温-20的PBS缓冲液（0.01 mol/L，pH 7.4）洗涤3次，再用含1wt% 牛血清白蛋白的PBS缓冲液（0.01 mol/L，pH 7.4）封闭4小时，所得物用含0.05vol%吐温-20的PBS缓冲液（0.01 mol/L，pH 7.4）清洗3次，即得大鼠免疫球蛋白G2a偶联磁珠。
所述酶标万古霉素为碱性磷酸酶标记万古霉素，其制备方法为：将万古霉素8 mg、NHS 10 mg、EDC▪HCl 40 mg和碱性磷酸酶2 mg各溶于1.0 mL PBS缓冲液（0.01 mol/L，pH7.4）中制成溶液；取万古霉素溶液800 µL、碱性磷酸酶溶液1.0 mL与EDC▪HCl溶液100 µL，混合10分钟，再加入NHS溶液100 µL，4℃避光混旋过夜，再在流速0.5mL/min条件下用蛋白纯化仪进行分离纯化，即得碱性磷酸酶标记万古霉素。
所述酶促化学发光底物为碱性磷酸酶的底物CSPD与化学发光增强剂Sapphire-II的混合物（购自厦门市波生生物技术有限公司）。
所述变异链球菌菌悬液标准品的制备方法为：取变异链球菌（从广东省微生物菌种保藏中心获得）单个菌落接种于LB培养液中，37℃振荡培养12小时，离心去除上清液，用无菌水清洗细菌2次后，用Tris-HCl缓冲液（0.01 mol/L，pH 7.4）重悬细菌并调整细菌浓度至2.4×105 CFU/mL。
所述缓冲液为Tris-HCl缓冲液（0.01 mol/L，pH 7.4），其制备方法为：取1.21 g三羟甲基氨基甲烷溶解于1000 mL纯水中，用盐酸调节pH为7.4。
所述洗涤液为含0.05vol% 吐温-20的Tris-HCl缓冲液（0.01 mol/L，pH 7.4），其制备方法为：取1.21 g 三羟甲基氨基甲烷以及500 µL吐温-20溶解于1000 mL纯水中，用盐酸调节pH为7.4。
实施例2 变异链球菌的化学发光检测试剂盒的使用
如图1所示，实施例1制备的变异链球菌的化学发光检测试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
(a) 将变异链球菌菌悬液标准品用缓冲液稀释制成变异链球菌工作菌液；向2.0 mL变异链球菌工作菌液中加入10 µL 2.0 mg/mL的大鼠免疫球蛋白G2a偶联磁珠悬浮液（以缓冲液为溶剂），37℃孵育1小时，用磁铁分离，获得变异链球菌-大鼠免疫球蛋白G2a偶联磁珠复合物，用洗涤液清洗3次，再加入500 µL 4.0 µg/mL的碱性磷酸酶标记万古霉素溶液（以缓冲液为溶剂），37℃孵育1小时，用磁铁分离，获得碱性磷酸酶标记万古霉素-变异链球菌-大鼠免疫球蛋白G2a偶联磁珠复合物，用洗涤液清洗3次，再通过Tecan infinite 200 PRO多功能酶标仪注入20 µL酶促化学发光底物，记录600s内化学发光信号，以化学发光强度对变异链球菌浓度作图，绘制工作曲线；
(b) 向2.0 mL待测样品中，加入10 µL 2.0 mg/mL的大鼠免疫球蛋白G2a偶联磁珠悬浮液（以缓冲液为溶剂），37℃孵育1小时，用磁铁分离磁珠，用洗涤液清洗，再加入500 µL 4.0µg/mL的碱性磷酸酶标记万古霉素溶液（以缓冲液为溶剂），37℃孵育1小时，用磁铁分离磁珠，用洗涤液清洗，再加入20 µL酶促化学发光底物，记录600s内化学发光信号，根据化学发光强度和步骤(a)绘制的工作曲线求得变异链球菌的浓度。
上述步骤(a)中，变异链球菌工作菌液的浓度分别为24、2.4×102、2.4×103、2.4×104和2.4×105 CFU/mL，以化学发光强度对变异链球菌浓度作图，所得工作曲线如图2所示，随着变异链球菌浓度的增加，化学发光强度不断增大，二者在24~2.4×105 CFU/mL范围内呈现良好的线性关系，R2=0.9899，检测限（S/N = 3）为8 CFU/mL，说明使用本发明的检测试剂盒可以灵敏地检测变异链球菌。
上述步骤(a)中，在变异链球菌工作菌液中加入5种模式菌，分别为金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌、蜡样芽孢杆菌、铜绿假单孢杆菌、大肠杆菌和沙门氏菌，然后按上述同样方法进行检测。结果显示，这5种模式菌对变异链球菌的检测均不构成干扰，说明使用本发明的检测试剂盒可以特异地检测变异链球菌。
上述步骤(b)中，分别选取两名健康志愿者的唾液，稀释25倍，高温灭菌后，向其中添加已知浓度的变异链球菌，作为待测样品，按上述方法进行检测。结果如表1所示，待测样品中变异链球菌的加标回收率为70.8%~108.3%，RSD值均低于9.2%，说明使用本发明的检测试剂盒可以准确地检测变异链球菌。
表1 变异链球菌实际样品检测的加标回收率
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

Claims (10)

1.变异链球菌的化学发光检测试剂盒，其特征在于，包括以下组分：免疫球蛋白G偶联磁珠、酶标万古霉素、酶促化学发光底物、变异链球菌菌悬液标准品、缓冲液以及洗涤液。
2.如权利要求1所述的变异链球菌的化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述免疫球蛋白G偶联磁珠为大鼠免疫球蛋白G2a偶联磁珠。
3.如权利要求2所述的变异链球菌的化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述大鼠免疫球蛋白G2a偶联磁珠由以下方法制得：将羧基化磁珠用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和 N-羟基丁二酰亚胺活化后，与大鼠免疫球蛋白G2a在PBS缓冲液中反应，再用牛血清白蛋白封闭，制得大鼠免疫球蛋白G2a偶联磁珠。
4.如权利要求1所述的变异链球菌的化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述酶标万古霉素为碱性磷酸酶标记万古霉素。
5.如权利要求4所述的变异链球菌的化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述碱性磷酸酶标记万古霉素由以下方法制得：将碱性磷酸酶用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和 N-羟基丁二酰亚胺活化后，与万古霉素在PBS缓冲液中反应，反应混合物经分离纯化，制得碱性磷酸酶标记万古霉素。
6.如权利要求4所述的变异链球菌的化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述酶促化学发光底物为碱性磷酸酶的化学发光底物CSPD与化学发光增强剂Sapphire-II的混合物。
7.如权利要求1所述的变异链球菌的化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述变异链球菌菌悬液标准品由以下方法制得：取变异链球菌单个菌落接种于LB培养液中，37℃振荡培养，离心去除上清液，细菌用水清洗后，用三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液重悬并调整细菌浓度。
8.如权利要求1所述的变异链球菌的化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述缓冲液为0.01 mol/L、pH 7.4 的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液，所述洗涤液为0.01 mol/L、pH 7.4并含0.05vol% 吐温-20的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液。
9.权利要求1至8任一项所述的变异链球菌的化学发光检测试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：
(a) 将变异链球菌菌悬液标准品用缓冲液稀释制成变异链球菌工作菌液；向变异链球菌工作菌液中加入免疫球蛋白G偶联磁珠，孵育，磁性分离，获得变异链球菌-免疫球蛋白G偶联磁珠复合物，用洗涤液清洗，再加入酶标万古霉素，孵育，磁性分离，获得酶标万古霉素-变异链球菌-免疫球蛋白G偶联磁珠复合物，用洗涤液清洗，再加入酶促化学发光底物，反应，记录化学发光信号，以化学发光强度对变异链球菌浓度作图，绘制工作曲线；
(b) 向待测样品中加入免疫球蛋白G偶联磁珠，孵育，磁性分离磁珠，用洗涤液清洗，再加入酶标万古霉素，孵育，磁性分离磁珠，用洗涤液清洗，再加入酶促化学发光底物，反应，记录化学发光信号，根据化学发光强度和步骤(a)绘制的工作曲线求得待测样品中变异链球菌的浓度。
10.如权利要求9所述的变异链球菌的化学发光检测试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：
(a) 将变异链球菌菌悬液标准品用缓冲液稀释制成浓度在24~2.4×105 CFU/mL范围内的变异链球菌工作菌液；向2.0 mL变异链球菌工作菌液中加入终浓度为20 µg/mL的大鼠免疫球蛋白G2a偶联磁珠，37℃孵育1小时，磁性分离，获得变异链球菌-大鼠免疫球蛋白G2a偶联磁珠复合物，用洗涤液清洗，再加入终浓度为2.0 µg/mL的碱性磷酸酶标记万古霉素，37℃孵育1小时，磁性分离，获得碱性磷酸酶标记万古霉素-变异链球菌-大鼠免疫球蛋白G2a偶联磁珠复合物，用洗涤液清洗，再加入20 μL碱性磷酸酶的化学发光底物CSPD与化学发光增强剂Sapphire-II的混合物，反应，记录600s内化学发光信号，以化学发光强度对变异链球菌浓度作图，绘制工作曲线；
(b) 向2.0 mL待测样品中加入终浓度为20 µg/mL的大鼠免疫球蛋白G2a偶联磁珠，37℃孵育1小时，磁性分离磁珠，用洗涤液清洗，再加入终浓度为2.0 µg/mL的碱性磷酸酶标记万古霉素，37℃孵育1小时，磁性分离磁珠，用洗涤液清洗，再加入20 μL碱性磷酸酶的化学发光底物CSPD与化学发光增强剂Sapphire-II的混合物，记录600s内化学发光信号，根据化学发光强度和步骤(a)绘制的工作曲线求得待测样品中变异链球菌的浓度。
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