CN109336954B - 一种β-内酰胺类药物受体蛋白及其应用 - Google Patents

一种β-内酰胺类药物受体蛋白及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明实施例公开了一种β‑内酰胺类药物受体蛋白及其应用，该受体蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。本发明上述受体蛋白即能够与青霉素类药物特异性结合也能够与头孢菌素类药物特异性结合，并具有较高的特异性。

Description

一种β-内酰胺类药物受体蛋白及其应用
技术领域
本发明涉及β-内酰胺类药物检测技术领域，具体涉及一种β-内酰胺类药物受体蛋白及其应用。
背景技术
乳及其制品已经成为重要动物源性食品，泌乳动物如奶牛、奶山羊等会因各种原因导致乳房炎的发生。其中由链球菌和金黄色葡萄球菌引起的细菌性乳房炎已成为乳房炎的主要原因之一。兽医临床上常采用青霉素类、头孢菌素类等β-内酰胺类药物治疗，最终在乳汁中产生药物残留，而药物残留超标可能引起潜在健康风险。
目前，对β-内酰胺类药物的检测主要有仪器分析方法和微生物生长抑制法以及免疫检测法等，乳品生产企业、奶站和基层检测实验室采用的是低成本、灵敏快速的免疫学检测方法，其中以胶体金免疫层析检测试纸条和酶联免疫检测试剂盒为主；免疫学方法核心原理是借助能与β-内酰胺类药物的母核结构β-内酰胺环特异性结合的抗体、青霉素结合蛋白或者青霉素类药物受体，对此类药物进行广谱性的检测分析。
由于β-内酰胺类药物发展非常迅速，从最初的青霉素已经发展到第四代头孢类药物，药物分子结构在母核结构的基础上越来越复杂，传统的基于识别母核结构的免疫学检测分析方法已经难以满足目前世界各国MRL的要求。特别是常规的母核结构识别分子(即特异性抗体、结合蛋白或受体蛋白)具有片面性，对青霉素类药物(例如青霉素G、氨苄青霉素、临氯青霉素和阿莫西林)敏感的分子，而对头孢菌素类(例如头孢噻呋、头孢喹肟和头孢洛宁)不敏感；而对头孢类药物敏感的识别性分子，对青霉素类敏感性又较差。
发明内容
本发明实施例的第一目的在于提供一种β-内酰胺类药物受体蛋白，该受体蛋白即能够与青霉素类药物特异性结合也能够与头孢菌素类药物特异性结合，并具有较高的特异性。
本发明实施例的第二目的在于提供一种β-内酰胺类药物受体蛋白在β-内酰胺类药物检测试剂盒以及胶体金检测试纸条中的应用，该应用操作简单，灵敏度高，而且能够快速准确的检测样本中的β-内酰胺类药物；并且实现了对样品的现场检测。
为实现上述目的，本发明实施例提供一种β-内酰胺类药物受体蛋白，所述受体蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
进一步地，所述受体蛋白氨基酸序列选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ IDNO：4中的任意一种。
在本发明中对所述受体蛋白的制备方法不做严格限制，例如，可以通过人工合成的方法制备得到，也可以通过生物信息学手段根据氨基酸序列筛选得到相对应的基因序列，例如，筛选得到与氨基酸序列SEQ ID NO：1相对应的基因序列如SEQ ID NO：5所示；与氨基酸序列SEQ ID NO：2相对应的基因序列如SEQ ID NO：6所示；与氨基酸序列SEQ ID NO：3相对应的基因序列如SEQ ID NO：7所示；与氨基酸序列SEQ ID NO：4相对应的基因序列如SEQ ID NO：8所示；并通过基因序列表达得到对应氨基酸序列的受体蛋白。
本发明另一实施例提供一种β-内酰胺类药物检测试剂盒，所述试剂盒包括盒体、设置在盒体内可拆卸的酶标板和试剂，所述酶标板的每个孔包被有所述受体蛋白；所述试剂包括酶标记的氨苄青霉素、标准溶液、显色液、终止液、洗涤液和样本稀释液。
优选地，所述酶标记的氨苄青霉素为辣根过氧化物酶标记的氨苄青霉素；更优选地，所述辣根过氧化物酶标记的氨苄青霉素通过如下制备方法制备得到：
(1)将氨苄青霉素溶于磷酸盐缓冲液中，随后，将N-羟基琥珀酰亚胺和二环己基碳二亚胺置入氨苄青霉素溶液中进行反应；
(2)将辣根过氧化物酶溶液添加到反应后的溶液中，随后添加碳化二亚胺进行反应，
(3)反应结束后，冷藏过夜，并采用透析袋进行透析，即得辣根过氧化物酶标记的氨苄青霉素。
进一步优选地，所述步骤(1)中，氨苄青霉素、N-羟基琥珀酰亚胺和二环己基碳二亚胺的质量比为40∶(4-6)∶(4-6)；氨苄青霉素与磷酸盐缓冲液的质量体积比为40∶(4-5)mg/ml；磷酸盐缓冲液浓度为0.05M，pH为7.2-7.6；反应温度为室温，反应时间为3.5-4.5h；
进一步优选地，所述步骤(2)中，辣根过氧化物酶溶液的浓度为4-6mg/ml，辣根过氧化物酶溶液添加量与反应后溶液的体积比为1∶(1-1.5)；碳化二亚胺的添加量与氨苄青霉素的质量比为1∶(38-42)；反应温度为室温，反应时间为1.5-2.5h；
进一步优选地，所述步骤(3)中，透析袋的截留分子量为10kDa，透析时间为23-25h。
优选地，所述酶标板通过如下制备方法制备得到：
将所述受体蛋白采用碳酸盐缓冲液稀释至0.5-2μg/ml，并向酶标板的每孔中添加90-110μL所述受体蛋白稀释液，在4℃条件下孵育过夜；随后，将所述受体蛋白稀释液甩干，并以磷酸盐吐温缓冲液洗板2-4次，再将封闭液添加到酶标板中，在35-39℃条件下孵育1.5-2.5h，再将封闭液甩干即得所述酶标板；
进一步地，所述碳酸盐缓冲液的pH为9.5-9.7；
进一步地，所述封闭液为含有0.05％牛血清白蛋白、5％酪蛋白的0.01M pH7.2PBS溶液或1％明胶溶液。
优选地，所述标准溶液选自青霉素G溶液、氨苄青霉素溶液和阿莫西林溶液中的任意一种，优选为青霉素G溶液；更优选地，所述标准溶液浓度分别为0ng/L、5ng/L、10ng/L、20ng/L、40ng/L、60ng/L和80ng/L。
优选地，所述显色液为单组份TMB显色液。
优选地，所述终止液为浓度为0.2-2M硫酸溶液。
优选地，所述洗涤液为含有质量浓度为0.1％吐温-20的0.01M pH7.2的PBS溶液。
优选地，所述样本稀释液为0.1M pH7.2的PBS溶液。
本发明另一实施例提供一种β-内酰胺类药物检测试剂盒，该试剂盒包括盒体、设置在盒体内可拆卸的酶标板和试剂，所述酶标板的每个孔包被有氨苄青霉素偶联抗原；所述试剂包括酶标记的所述受体蛋白、标准溶液、显色液、终止液、洗涤液和样本稀释液。
优选地，所述氨苄青霉素偶联抗原通过氨苄青霉素与载体蛋白偶联得到；更优选地，所述氨苄青霉素偶联抗原通过如下制备方法制备得到：
将载体蛋白溶于磷酸盐缓冲液中得到载体蛋白溶液；将氨苄青霉素溶于去离子水中得到氨苄青霉素溶液；将碳化二亚胺溶于去离子水中得到碳化二亚胺溶液；再将载体蛋白溶液、氨苄青霉素溶液和碳化二亚胺溶液混合，调节pH至5.3-5.7进行反应；随后，将反应后溶液在透析袋中透析得到氨苄青霉素偶联抗原；
进一步优选地，所述载体蛋白溶液浓度为8-12mg/ml，氨苄青霉素溶液浓度为90-110mg/ml，碳化二亚胺溶液浓度为180-220mg/ml；载体蛋白溶液、氨苄青霉素溶液和碳化二亚胺溶液的体积比为2∶(0.8-1.2)∶(1.8-2.2)；磷酸盐缓冲液浓度为0.05mol/L，pH为7.4；反应温度为室温，反应时间为2-3h；透析袋的截留分子量为10kDa，透析时间为11-13h；
进一步优选地，所述载体蛋白选自牛血清白蛋白、卵清蛋白和血蓝蛋白中的任意一种。
优选地，所述酶标板通过如下方法制备得到：
将氨苄青霉素偶联抗原采用碳酸盐缓冲液稀释至0.5-2μg/ml，并向酶标板的每孔中添加90-110μL所述氨苄青霉素偶联抗原稀释液，在4℃条件下孵育过夜，随后，将所述氨苄青霉素偶联抗原稀释液甩干，并以磷酸盐吐温缓冲液洗板2-4次，再将封闭液添加到酶标板中，在35-39℃条件下孵育1.5-2.5h，再将封闭液甩干即得所述酶标板；
进一步优选地，所述封闭液为1％酪蛋白溶液。
优选地，所述酶标记的所述受体蛋白为辣根过氧化物酶标记的所述受体蛋白；更优选地，辣根过氧化物酶标记的所述受体蛋白通过如下制备方法制备得到：
(1)将辣根过氧化物酶溶于1％-1.5％戊二醛溶液中室温静置过夜；
(2)将过夜溶液经Sephadex G-25层析柱，采用生理盐水洗脱，流速为0.8-1.2ml/min，收集棕色洗脱液、浓缩，缓慢搅拌；
(3)将所述受体蛋白稀释至2-3mg/ml，在搅拌条件下，将所述受体蛋白溶液逐滴加入到浓缩液中得到混合溶液；
(4)向混合溶液中添加碳酸缓冲液，并继续搅拌一段时间，随后，添加赖氨酸溶液并静置；
(5)在搅拌条件下，向静置后的混合溶液中逐滴加入等体积饱和硫酸铵进行反应；
(6)反应结束后，离心收集沉淀物并清洗，再将沉淀物溶于PBS缓冲液、透析去除铵离子，离心收集上清液即得辣根过氧化物酶标记的所述受体蛋白；
进一步地优选地，所述步骤(1)中，辣根过氧化物酶与戊二醛溶液质量体积比为1∶(0.08-0.12)mg/ml；
进一步地优选地，所述步骤(2)中，浓缩为采用PEG对收集的洗脱液进行；PEG的截留分子量为5kDa；
进一步地优选地，所述步骤(3)中，所述受体蛋白与辣根过氧化物酶的质量比为(12-13)∶25；
进一步地优选地，所述步骤(4)中，碳酸缓冲液为0.8-1.2M pH9.5碳酸缓冲液，碳酸缓冲液添加量与戊二醛溶液体积比为1∶(9-11)；赖氨酸溶液浓度为0.2M；赖氨酸溶液添加量与戊二醛溶液体积比为1∶(9-11)；
进一步地优选地，所述步骤(5)中，反应温度为4℃，反应时间为0.8-1.2h；
进一步地优选地，所述步骤(6)中，离心速度为3000-10000r/min，离心时间为25-35h；清洗采用的溶液为半饱和硫酸铵；PBS缓冲液浓度为0.15M，pH为7.4；透析袋的截留分子量为10kDa，透析采用的透析液为0.15M PH7.4的PB缓冲盐水。
优选地，所述标准溶液选自青霉素G溶液、氨苄青霉素溶液和阿莫西林溶液中的任意一种，优选为青霉素G溶液；更优选地，所述标准溶液包括浓度分别为0ng/L、5ng/L、10ng/L、20ng/L、40ng/L、60ng/L和80ng/L。
优选地，所述显色液为单组份TMB显色液。
优选地，所述终止液为浓度为0.2-2M硫酸溶液。
优选地，所述洗涤液为含有质量浓度为0.1％吐温-20的0.01M pH7.2的PBS溶液。
优选地，所述样本稀释液为0.1M pH7.2的PBS溶液。
本发明另一实施例提供一种β-内酰胺类药物胶体金检测试纸条，所述检测试纸条包括PVC背板、硝酸纤维素膜、样品垫、吸水垫和微孔试剂，所述微孔试剂为含有胶体金标记的所述受体蛋白的塑料微孔；所述硝酸纤维素膜上的检测线采用氨苄青霉素偶联抗原进行制备，质控线采用鼠抗His标签抗体进行制备。
优选地，所述微孔试剂由包括如下步骤制备得到：
(1)将胶体金标记的所述受体蛋白进行稀释，再将胶体金标记的所述受体蛋白溶液添加到酶标板中进行包被；
(2)弃去酶标板孔中的包被液，并进行洗板、拍干，随后，向酶标板孔中添加明胶溶液进行封闭；
(3)弃去酶标板孔中的明胶溶液，并进行洗板、拍干、真空干燥即得所述微孔试剂。
进一步优选地，所述步骤(1)中，稀释采用的稀释液为浓度为0.4-0.6mol/L的碳酸盐缓冲液；胶体金标记的所述受体蛋白溶液的浓度为4-65μg/mL；体金标记的所述受体蛋白溶液添加量为90-110μL每孔；包被温度为2-8℃，包被时间为14-18h；
进一步优选地，所述步骤(2)中，洗板采用的洗涤液为1×PBS-Tween洗涤液；洗涤液添加量为300μL每孔，洗板次数为3-5次，每次2-4min；明胶溶液浓度为0.8％-1.2％；明胶添加量为180-220μL每孔，封闭温度为36-38℃，封闭时间为1.5-2.5h；
进一步优选地，所述步骤(3)中，洗板采用的洗涤液为1×PBS-Tween洗涤液，洗涤液添加量为250μL每孔；洗板时间为2.5-3.5min；真空干燥的真空度为1000Pa，干燥温度为23-26℃，干燥时间为18-22h。
本实施例中对胶体金的来源不做严格限制，例如，可以通过市场购买得到，也可通柠檬酸钠还原法制备得到；具体地，将0.01％氯金酸水溶液加热至沸腾，在持续搅拌的条件下加入1％柠檬酸三钠水溶液，继续搅拌加热至溶液呈透亮的酒红色，室温冷却，再用去离子水恢复到原体积即得粒径为30-40nm胶体金颗粒溶液；其中，柠檬酸钠水溶液与氯金酸水溶液的体积比为3∶(180-220)。
优选地，所述胶体金标记的所述受体蛋白由包括如下步骤制备得到：
(1)在胶体金溶液中添加碳酸钾溶液；其中，胶体金溶液浓度为1.5％，胶体金溶液与碳酸钾溶液的体积比为(450-550)∶1；
(2)将浓度为0.8-1.2mg/ml所述受体蛋白溶液添加到胶体金溶液中，室温孵育18-22min；随后，向孵育后的溶液中添加牛血清白蛋白，并使得牛血清白蛋白浓度为0.15％-0.25％，充分混匀，在4℃下，以9000-11000r/min离心35-45min收集沉淀物；
(3)采用含有1％蔗糖、1％海藻糖、2％BSA、0.02％叠氮钠的0.02M磷酸盐缓冲液复溶沉淀物，即得胶体金标记的所述受体蛋白。
优选地，所述步骤(2)中，所述受体蛋白溶液添加量与胶体金溶液体积比为(1-1.5)∶100。
本发明另一实施例提供一种所述试剂盒或所述检测试纸条在检测样品中β-内酰胺类药物残留的应用。
本发明实施例具有如下优点：
(1)本发明提供一种β-内酰胺类药物受体蛋白，该受体蛋白即能够与青霉素类药物特异性结合也能够与头孢菌素类药物特异性结合，并具有较高的特异性。
(2)本发明将β-内酰胺类药物受体蛋白应用到β-内酰胺类药物检测试剂盒和胶体金检测试纸条中，能够快速准确的检测样本中的β-内酰胺类药物，灵敏度高、制备容易，成本低廉；并实现了对样品的现场检测，具有广阔的市场前景。
附图说明
图1为本发明实施例9提供的β-内酰胺类药物检测试剂盒的标准曲线图；
图2为本发明实施例11提供的β-内酰胺类药物胶体金检测试纸条的剖面结构示意图。
图中：1-PVC背板；2-硝酸纤维素膜；3-检测线；4-质控线；5-样品垫；6-吸水垫。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购买获得的常规产品。
实施例1
本实施例为一种氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的β-内酰胺类药物受体蛋白的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
根据如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，通过生物信息学手段筛选得到相对应的基因序列如SEQ ID NO：5所示；
将SEQ ID NO：5基因序列进行PCR扩增，具体反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环，然后再延伸5min，4℃终止反应；
将PCR扩增产物和pET28a分别进行双酶切，再将酶切后的产物混合，并添加T4 DNA连接酶在4℃下过夜，随后，将连接产物转化至克隆宿主DH5α感受态细胞中，并将阳性重组质粒命名为pET28a-GABA-sα1，然后再将克隆后的连接产物转化至表达宿主BL21感受态中进行表达；
将表达GABA受体蛋白的pET28a-GABA-sα1甘油菌从-20℃取出，待解冻后按照1:1000的比例加入到LB培养基中，并再按1:1000的比例加入抗生素，随后，在37℃、220rpm条件下，培养18h得到种子液；
将种子液按照1:100的比例转接，并按照1:1000比例加入抗生素，待OD值为0.7时，按照1:1000的比例将IPTG加入到扩培好的培养基中，在18℃、180rpm条件下过夜诱导，随后，将过夜诱导的菌以5000rpm转速离心10min，收集沉淀物，再将沉淀物采用Buffer A悬起，并移入器皿中，在菌体中添加蛋白酶抑制剂并混匀，再超声破碎30min，将破碎后的菌体移入离心管中配平后，在4℃条件下，以15000rpm离心30min；其中，Buffer A为50mM Hepes500mM NaCl pH7.5；
收集离心后的上清液，并通过0.22μm滤器进行过滤除杂，过滤后的上清液经蠕动泵上样到已进行平衡的Ni柱上，用洗脱缓冲液Buffer B梯度洗脱，所述梯度洗脱为0％→10％→100％，所述洗脱缓冲液Buffer B为50mM Hepes 500mM NaCl 500mM咪唑pH7.5，收集分离峰处样本即得氨基酸序列如SED ID No：1所示的受体蛋白。
实施例2
本实施例为辣根过氧化物酶标记的氨苄青霉素的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
(1)将氨苄青霉素40mg溶于4ml 0.05M pH7.4磷酸盐缓冲液中，随后，将N-羟基琥珀酰亚胺5mg和二环己基碳二亚胺5mg置入氨苄青霉素溶液中，在室温、搅拌条件下反应4h；
(2)将4ml浓度为5mg/ml辣根过氧化物酶溶液添加到反应后的溶液中，随后添加1mg碳化二亚胺，在室温、搅拌条件下反应2h；
(3)反应结束后，冷藏过夜，并采用截留分子量为10kDa的透析袋透析24h，即得辣根过氧化物酶标记的氨苄青霉素。
实施例3
本实施例为包被有实施例1制备得到的氨基酸序列为SED ID No：1所示的受体蛋白的酶标板的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
将氨基酸序列为SED ID No：1所示的受体蛋白采用pH9.6碳酸盐缓冲液稀释至0.5μg/ml，并向酶标板的每孔中添加100μL氨基酸序列为SED ID No：1所示的受体蛋白稀释液，在4℃条件下孵育过夜；随后，将氨基酸序列为SED ID No：1所示的受体蛋白稀释液甩干，并以磷酸盐吐温缓冲液洗板3次，再将1％明胶溶液添加到酶标板中，在37℃条件下孵育2h，再将1％明胶溶液甩干即得包被有实施例1制备得到的氨基酸序列为SED ID No：1所示的受体蛋白的酶标板。
实施例4
本实施例为一种氨苄青霉素偶联抗原的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
将牛血清白蛋白溶于0.05M pH7.4磷酸盐缓冲液中得到浓度为10mg/ml牛血清白蛋白溶液；将氨苄青霉素溶于去离子水中得到100mg/ml氨苄青霉素溶液；将碳化二亚胺溶于去离子水中得到200mg/ml碳化二亚胺溶液；再将2ml载体蛋白溶液、1ml氨苄青霉素溶液和1ml碳化二亚胺溶液混合，采用盐酸调节pH至5.5，在室温、搅拌条件下反应2.5h；随后，将反应后溶液在截留分子量为10Kda的透析袋中透析12h得到氨苄青霉素偶联抗原。
实施例5
本实施例为包被有实施例4制备得到的氨苄青霉素偶联抗原的酶标板的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
将氨苄青霉素偶联抗原采用pH9.6碳酸盐缓冲液稀释至1μg/ml，并向酶标板的每孔中添加100μL氨苄青霉素偶联抗原稀释液，在4℃条件下孵育过夜，随后，将氨苄青霉素偶联抗原稀释液甩干，并以磷酸盐吐温缓冲液洗板3次，再将1％酪蛋白溶液添加到酶标板中，在37℃条件下孵育2h，再将1％酪蛋白溶液甩干即得包被有实施例4制备得到的氨苄青霉素偶联抗原的酶标板。
实施例6
本实施例为辣根过氧化物酶标记实施例1制备得到的氨基酸序列如SED ID No：1所示的受体蛋白的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
(1)将辣根过氧化物酶25mg溶于2.5ml 1.25％戊二醛溶液中室温静置过夜；
(2)将过夜溶液经Sephadex G-25层析柱，采用生理盐水洗脱，控制流速为1ml/min，收集棕色洗脱液，采用截留分子量为5kDaPEG进行浓缩至5ml，缓慢搅拌；
(3)将12.5mg受体蛋白采用生理盐水稀释至2.5mg/ml，在搅拌条件下，将受体蛋白溶液逐滴加入到浓缩液中得到混合溶液；
(4)向混合溶液中添加1.0M pH9.5碳酸缓冲液0.25ml，并继续搅拌3h，随后，添加0.2M赖氨酸溶液0.25ml并室温静置2h；
(5)在搅拌条件下，向静置后的混合溶液中逐滴加入等体积饱和硫酸铵在4℃条件下反应1h；
(6)反应结束后，以3000r/min离心30min，收集沉淀物并采用半饱和硫酸铵清洗，再将沉淀物溶于0.15M pH7.2的PBS缓冲液中，采用截留分子量为10kDa的透析袋进行透析去除铵离子，以10000r/min离心30min收集上清液即得辣根过氧化物酶标记的氨基酸序列如SED ID No：1所示的受体蛋白。
实施例7
本实施例为胶体金标记的氨基酸序列如SED ID No：1所示的受体蛋白的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
(1)取10ml 1.5％胶体金溶液，并添加20μl 0.1M碳酸钾溶液；
(2)将浓度为1mg/ml受体蛋白溶液140μl添加到胶体金溶液中，室温孵育20min；随后，向孵育后的溶液中添加牛血清白蛋白，并使得牛血清白蛋白浓度为0.2％，充分混匀，在4℃下，以10000r/min离心40min收集沉淀物；
(3)采用含有1％蔗糖、1％海藻糖、2％BSA、0.02％叠氮钠的0.02M磷酸盐缓冲液复溶沉淀物，即得胶体金标记的氨基酸序列如SED ID No：1所示的受体蛋白。
实施例8
本实施例为一种微孔试剂的制备方法，该制备方法包括如下制备方法制备得到：
(1)将实施例7制备得到的胶体金标记的氨基酸序列如SED ID No：1所示的受体蛋白采用0.05mol/L的碳酸盐缓冲液稀释至5μg/mL，再按照100μL每孔将胶体金标记的氨基酸序列如SED ID No：1所示的受体蛋白溶液添加到酶标板中，在6℃条件下包被16h；
(2)弃去酶标板孔中的包被液，每孔添加300μL 1×PBS-Tween洗涤液进行洗板，洗板4次，每次3min，最后一次拍干，再向酶标板孔中添加200μL 1％明胶溶液在37℃下封闭2h；
(3)弃去酶标板孔中的明胶溶液，每孔添加250μL1×PBS-Tween洗涤液进行洗板3min并拍干，在真空度为1000Pa、25℃条件下干燥20h即得微孔试剂。
实施例9
本实施例为一种β-内酰胺类药物检测试剂盒，该检测试剂盒包括盒体、设置在盒体内可拆卸的实施例3制备得到的酶标板、实施例2制备得到的辣根过氧化物酶标记的氨苄青霉素、标准溶液、显色液、终止液、洗涤液和样本稀释液；其中，
标准溶液包括浓度分别为0ng/L、5ng/L、10ng/L、20ng/L、40ng/L、60ng/L和80ng/L的青霉素G溶液；
显色液为单组份TMB显色液；
终止液为浓度为1M硫酸溶液；
洗涤液为含有质量浓度为0.1％吐温-20的0.01M pH7.2的PBS溶液；
样本稀释液为0.1M pH7.2的PBS溶液。
实施例10
本实施例为一种β-内酰胺类药物检测试剂盒，该检测试剂盒包括盒体、设置在盒体内可拆卸的实施例5制备得到的酶标板、实施例6制备得到的辣根过氧化物酶标记实施例1制备得到的氨基酸序列如SED ID No：1所示的受体蛋白、标准溶液、显色液、终止液、洗涤液和样本稀释液；其中，
标准溶液包括浓度分别为0ng/L、5ng/L、10ng/L、20ng/L、40ng/L、60ng/L和80ng/L的青霉素G溶液；
显色液为单组份TMB显色液；
终止液为浓度为1M硫酸溶液；
洗涤液为含有质量浓度为0.1％吐温-20的0.01M pH7.2的PBS溶液；
样本稀释液为0.1M pH7.2的PBS溶液。
实施例11
本实施例为一种β-内酰胺类药物胶体金检测试纸条，如图2所示，该检测试纸条包括PVC背板1、硝酸纤维素膜2、样品垫5、吸水垫6和实施例8制备得到的微孔试剂(图中未示)，硝酸纤维素膜上2的检测线3采用实施例4制备得到的氨苄青霉素偶联抗原进行制备，质控线4采用鼠抗His标签抗体进行制备；其中，
硝酸纤维素膜2粘贴在PVC背板1上，样品垫5粘贴在靠近检测线3的PVC背板1上，并与硝酸纤维素膜重叠2mm；吸水垫6粘贴在硝靠近质控线4的PVC背板1上，并与硝酸纤维素膜重叠2mm。
实验例1
选取抗生素阴性生鲜乳；将阴性生鲜乳分为29份，其中，选取一份作为空白对照，剩余28份中，分别添加青霉素G、氨苄青霉素、阿莫西林、苯唑西林、氯唑西林、双氯青霉素、萘夫西林、头孢氨苄、头孢喹诺、头孢洛宁、头孢唑林、头孢哌酮、头孢喹肟、头孢匹林、头孢噻呋、氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、四环素、金霉素、恩诺沙星、沙拉沙星、氧氟沙星、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲噁唑、林可霉素、庆大霉素和红霉素，添加后的各药物浓度如表1所示；然后，采用本发明实施例9和实施例11分别制备的β-内酰胺类药物检测试剂盒和β-内酰胺类药物胶体金检测试纸条进行检测，其中
试剂盒检测步骤为：
(1)将冷藏保存的试剂盒放置室温30min；
(2)将待检的样本按照1:10的比例用样本稀释液稀释备用；
(3)将标准品、样品以50μL每孔加入酶标板孔，室温孵育30min；
(4)取出后洗板3次，加入50μL酶标氨苄青霉素，室温孵育15min；
(5)取出后洗板3次，加入TMB显色液100μL，室温孵育10min；
(6)加入终止液50μL，以酶标仪450/630nm读取吸光度值；
(7)以OD值作为纵坐标，相应标准品浓度C为横坐标，绘制标准曲线如图1所示；并得到标准曲线的回归方程为y＝0.0226x+1.8244；相关系数R2＝0.9946。
(7)将样品孔的OD值代入标准曲线的回归方程即可定性定量判定样本中的药物浓度，检测结果参见表1；
胶体金检测试纸条的检测步骤为：
(1)将冷藏保存的试纸条、样本放置室温30min，确保回温；
(2)将样品用移液器吸取100μL加入检测试纸条的试剂微孔试剂中；
(3)将样品与微孔试剂中胶体金标记的抗体混匀，插入试纸条，计时7min，并在10min内观察检测结果，超出15min后结果无效，检测结果如表1所示；
如果试纸条的C线显色、T线显色弱于C线或与C线相当或者不显色，表明阳性；
如果试纸条的C线显色、T线显色强于C线，表明阴性；
如果试纸条的C线不显色，无论T线显色与否，表明检测结果无效，应当更换试纸条重新检测。
表1
Figure GDA0002675969870000151
Figure GDA0002675969870000161
表1中“—”代表没有限量设定；
由表1可知，本发明检测试剂盒和试纸条能够检测至少17种β-内酰胺类药物，以及至少13种无关抗生素无交叉反应；而且，本发明β-内酰胺类药物检测敏感性满足限量标准要求。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
序列表
<110> 北京纳百生物科技有限公司
<120> 一种β-内酰胺类药物受体蛋白及其应用
<130> 2018
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 275
<212> PRT
<213> Artificial(人工序列)
<400> 1
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<213> Artificial(人工序列)
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<213> Artificial(人工序列)
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<212> PRT
<213> Artificial(人工序列)
<400> 4
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<212> DNA
<213> Artificial(人工序列)
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Claims (8)

1.一种β-内酰胺类药物受体蛋白，其特征在于，所述受体蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO：1所示。
2.一种β-内酰胺类药物检测试剂盒，所述试剂盒包括盒体、设置在盒体内可拆卸的酶标板和试剂，其特征在于，所述酶标板的每个孔包被有权利要求1所述的受体蛋白；所述试剂包括酶标记的氨苄青霉素、标准溶液、显色液、终止液、洗涤液和样本稀释液。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述酶标板通过如下制备方法制备得到：
将所述受体蛋白采用碳酸盐缓冲液稀释至0.5-2μg/ml，并向酶标板的每孔中添加90-110μL所述受体蛋白稀释液，在4℃条件下孵育过夜；随后，将所述受体蛋白稀释液甩干，并以磷酸盐吐温缓冲液洗板2-4次，再将封闭液添加到酶标板中，在35-39℃条件下孵育1.5-2.5h，再将封闭液甩干即得所述酶标板。
4.一种β-内酰胺类药物检测试剂盒，所述试剂盒包括盒体、设置在盒体内可拆卸的酶标板和试剂，其特征在于，所述酶标板的每个孔包被有氨苄青霉素偶联抗原；所述试剂包括酶标记的权利要求1所述的受体蛋白、标准溶液、显色液、终止液、洗涤液和样本稀释液。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述酶标记的所述受体蛋白为辣根过氧化物酶标记的所述受体蛋白；所述辣根过氧化物酶标记的所述受体蛋白由包括如下步骤制备得到：
(1)将辣根过氧化物酶溶于1％-1.5％戊二醛溶液中室温静置过夜；
(2)将过夜溶液进行洗脱，收集棕色洗脱液、浓缩，缓慢搅拌；
(3)将所述受体蛋白稀释至2-3mg/ml，在搅拌条件下，将所述受体蛋白溶液逐滴加入到浓缩液中得到混合溶液；
(4)向混合溶液中添加碳酸缓冲液，并继续搅拌一段时间，随后，添加赖氨酸溶液并静置；
(5)在搅拌条件下，向静置后的混合溶液中逐滴加入等体积饱和硫酸铵进行反应；
(6)反应结束后，离心收集沉淀物并清洗，再将沉淀物溶于PBS缓冲液、透析、离心收集上清液即得辣根过氧化物酶标记的所述受体蛋白。
6.一种β-内酰胺类药物胶体金检测试纸条，所述检测试纸条包括PVC背板、硝酸纤维素膜、样品垫和吸水垫，其特征在于，所述检测试纸条还包括微孔试剂，所述微孔试剂为含有胶体金标记的权利要求1所述的受体蛋白的塑料微孔；所述硝酸纤维素膜上的检测线采用氨苄青霉素偶联抗原进行制备，质控线采用鼠抗His标签抗体进行制备。
7.根据权利要求6所述的胶体金检测试纸条，其特征在于，所述微孔试剂由包括如下步骤制备得到：
(1)将胶体金标记的所述受体蛋白进行稀释，再将胶体金标记的所述受体蛋白溶液添加到酶标板中进行包被；
(2)弃去酶标板孔中的包被液，并进行洗板、拍干，随后，向酶标板孔中添加明胶溶液进行封闭；
(3)弃去酶标板孔中的明胶溶液，并进行洗板、拍干、真空干燥即得所述微孔试剂。
8.根据权利要求7所述的胶体金检测试纸条，其特征在于，所述胶体金标记的所述受体蛋白由包括如下步骤制备得到：
(1)在胶体金溶液中添加碳酸钾溶液；
(2)将所述受体蛋白溶液添加到胶体金溶液中，室温孵育；随后，向孵育后的溶液中添加牛血清白蛋白、混匀，离心收集沉淀物；
(3)采用磷酸盐缓冲液复溶沉淀物，即得胶体金标记的所述受体蛋白。
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