JPH05502588A - 腸出血性大腸菌0157:h7及び026:h11への単クローン抗体及びその検出方法 - Google Patents
腸出血性大腸菌0157:h7及び026:h11への単クローン抗体及びその検出方法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
Iii呂血住血性大腸菌0157 H7及び026 : Hl !への単クロー
ン抗体本発明は一般的に単クローン抗体を発生するよう開発されたバイブIJ
トマ細胞系に、特に単クローン抗体を腸内出血性大腸菌0157:H7(E、c
oli 0157:H7)及び大腸菌026 :Hll(E、coli 026
:Hll)に発生する細胞系に係る。
従来技術
E、coli 0157:H7は、両方か特定ノファーストフートチェーンから
の未調理の牛肉を食へたのに関連した出血性大腸炎の2つの地理的に離れた発生
の原因として生体が診断された時、1982年アメリカ合衆国において重要な人
間の病原体として初めに認識されたぐりレイ、リーダブリュ他、1983年、医
療のニューイングランドジャーナル308巻、12号、681〜685頁の「め
ずらしい大腸菌と関連した出血性大腸菌」)。異常な胃腸病のこれらの大発生は
激しい腹けいれん及び熱かないか又は低熱を育するひとい出血性下痢の急な発病
を特徴とする。がかる病気はE、coli 0157:H7及び又はE、col
i 026:Hllに関連する(レーヒン、エム、エム1987年、伝染病のジ
ャーナル、155巻、377−389頁の「下痢を生しる大腸菌 腸毒素原性、
腸病原性、腸侵襲性、腸出血性及び膠着性、」 、レービン、エム、エム、池、
1987年、伝染病のジャーナル、156巻、175〜182頁のro 157
・H7の腸内出血性大腸菌及び出血性大腸炎及び溶血性尿素病症候群を生しる他
の抗原型を識別するDNAプローブj)。これらのバクテリアは腸出血性E、c
oliと呼ばれる。
E、coli生体は、ヘロトキソンとして公知の、人間を含むいくつかの哺乳動
物に多くの腸内出血を生じる毒素を発生する。E。
coli 0157:H7病原菌が関連する病気のスペクトルはアシンブトマチ
イック病原菌から出血性でない下痢、出血性大腸炎、溶血性尿素病症候群及び死
におよぶ(ライアン、キャロリン、エイ他、1986年、伝染病のジャーナル、
154巻、4号、631頁〜638頁の「介護ホームにおける出血性大腸菌01
57:H7下痢:医療的、疫学的及び病理的調査結果」)。溶血性尿毒症候群は
上部気管、胃又は腸に徴候が現われた後、溶血性貧血、血小板減少症及び急性腎
障害の急発病と決められる。溶血性尿素病症候群は一般的に多数の異なる、誘発
的事象及び病原性機構の最終結果である。
病体は肉及びかきん類及び非殺菌ミルクから分離された。種々のレポートは、食
物特に動物性の食物がE、coli 0157:H7病原菌の重要な源であるこ
とを示す(ドイル、マイケル、ビー及びジーン、エル、ジョエニイ、1987年
、応用及び環境微生物学、52巻、10号、2394〜2396頁の「小売新鮮
向及びかきん類からの大腸菌0157:H7の分離J)。
出血性大腸炎のほとんどの大発生が食物関連なので、E、coli 0157:
H7及びE、coli 026:Hllを検出する素速い、感度的特別検定の必
要がある。現在、食物の病原を検出する有用な方法は時間労費か大きいか、ある
いは専用的うではない。
例えば、ウィスコンシン州、マディソン、フードリサーチ インスティチュート
はE、coli 0157:H7病原の検出の為多くの代理店により最近用いら
れた。しかし、フードリサーチ インスティチュートにより用いられた方法はド
イル及びショエニイ(上記)に示す複雑な多くの日の処理を含む。ドイル及びシ
ョエニイは種々の肉を試験し、試験した肉の約I%又は2%の生体を見つけた。
生体はふん、生乳、等から分離されつる。実験的に感染されたニワトリの卵に表
面が汚染される。
生体を検定する為、第1の段階は食物試料の生体を富化することである。食物試
料は生体の小さい量を存しうるので試料は他の形のバクテリアを再圧縮及び所望
の生体の数を増すべき状態にするよう富化媒体に置かれる。富化媒体はE、co
li 0157:H7を含むグラムの陰性菌か選択できる選択剤を有する。媒体
は37°Cで終夜培養される。
定温培養された試料は恐水病膜フィルタ紙(HGMF)を貫通させる。フィルタ
紙は約1400〜1600小方形に細分割される。
ろうはフィルタを圧切るよう用いられる。ろうはコロニーを分離する。フィルタ
は次に除去され、ニトロセルロース紙の一部に置かれる。ニトロセルロース紙は
富化媒体内の々uく同じ選択剤を含む寒天か媒体のいくらかに!かれる。この板
は次に37°Cで終夜定温培養される。これはコロニーかフィルタ紙上て生成す
るのを可能にする。
それらが生成する如く、それらはへドロキシンを作る。毒素はニトロセルロース
紙で集められる。フィルタ紙は次に除去され、セーブされる。ニトロセルロース
紙は除去され、うさぎで生成される抗体を毒素に用いるイノムプロット方法で開
発される。じみが生成された後、点は毒素が存在する紙上に観測される。HGM
F上の点はHGMF上の細菌コロニーと整合し、整合コロニーは生化学及び他の
テストにより目ffE、coli 0157:H7として確認される。
概要にて、生体は選択富化媒体での食物試料で生成される。生体は一連の方法で
分離される。隔離集口は、拡散する毒素を生成するよう増え、下に置かれるフィ
ルタ紙で集められる。毒素は試薬として抗体を毒素に用いて検出される。グリッ
ドを育する上に置かれるフィルタ紙上のm菌コロニーは毒素を存する点を示すフ
ィルタ紙と整合される。毒素を生じたコロニーは標準分類方法で識別される。
方法が低レベルの生体で接種された食物試料からE、coli0157:H7を
効果的に分離するけれど、方法は個人の時間に必要な複雑及び広さの為にルーチ
ンテストには順しない。
福利厚生カナダで開発されたような他のテストが開発された。カナダテストは単
コロニー抗体をE、coli 0157に用いるが、サルモネラ群N及びH7で
はない重要でないE、coli 0157菌株のような他の腸と交差反応するの
で特有のテストではない。
(トッド、イージーディ他、1988年、応用及び環境微生物学、54巻、25
36〜2540頁の「食物における大腸菌0157・H7の識別及び列挙用急速
恐水病膜フィルター酵素ラベル抗体方法J)。
ベロトキシン(レービン、エム、エム、他、上記、1989年)を符号化する結
合DNAを基とする遺伝子プローブベース検定か開発された。従って、全てのベ
ロトキシン発生E、coliは単なる腸出血性E、coli 0157:H7及
びE、coli 026 :HI Iよりむしろこの方法で検出される。
本発明の目的は腸出血性E、coli 0157:H7及びEcoli 026
・Hllに対して非常に特別である単クローン抗体を発生することである。
本発明の更なる池の目的は、方法か使用かできる期間、例えば1日以内に短縮さ
れるE、coli 0157:H7及びE、coll 026・Hllを検定す
るよう単クローン抗体を用いるテストを開発することである。
本発明の更なる他の目的は、食物及び便の試料におけるE、c。
Ii 0157:H7及びE、coli 026:Hllの色検出用免疫検定を
開発することである。
本発明の他の目的は、食物及び他の試料からE、coli 0157:H7及び
E、coli 026・Hllを分離及び試料ての病原の有症率を決定する方法
を開発することである。
本発明の他の目的は腸出血性E、coliの菌株を識別するマーカーとして腸出
血性E、coli 0157:H7及びE、C0Ii 026:Hllの特有外
膜プロティンを用いることである。このマーカーに特有の単クローン抗体を基に
したELISAを含む検定は食物、環境及び医療試料から分離した腸出血性E、
coliを検出及び圧側するよう用いられる。
本発明の更なる目的は例えば腸出血性E、coli 0157:H7及びE、c
oli 026:Hllの存在を検定するテストキッドで役立つ抗体検定用生試
薬の合成を提供することである。
本発明は、腸出血性E、coli 0157:H7及びE、c。
Ii 026:Hllに特有の単クローン抗体がマウスミエローマラインからの
細胞及びE、coli 0157:H7の「粗J菌株で前に免疫化されたマウス
からの肺臓細胞の融合で形成されるハイブリドマで発生されることを要約する。
この粗菌株は、その細胞面上に0157抗原の発現を含む滑らかりボ多糖か欠乏
するよう変更される。単クローン抗体は、略5000〜6000ダルトンの分子
重量を有するプロティンと反応することを特徴とする。このプロティンは腸出血
性E、coli 0157:H7及びE、coli026・Hllに対する明ら
かな特有を有する。単クローン抗体は更に、サブクラス免疫グロブリン02 m
の要素であり、カッパ光チェーンを有することを特徴とする。
本発明は、E、coli 0157の入った基質ユニットに抗体を発生するよう
吸着基質ユニットにE、coli 0157〜多クロ一ン抗体を結合し、反応か
知られていない試料を発生するようテスト材にあるかかるE、coli 015
7:H7生体に抗体を結合するよう抗体E、coli 0157の入った基質ユ
ニットに公知の量のテスト材を露比し、反応制御試料を生成するようE、c。
1i 0157の入った基質ユニットへ抗体への公知の量のE、coli 01
57:H7を有するE、coli 0157:H7病原の選択量の標準準備を露
出し、結合E、coli 0157:H7と反応するよう反応した公知でない、
制御試料を単クローン抗体(4E8C12)からE、coli 0157:H7
に露出し、E。
coli 0157の入った基質ユニットへ抗体の結合E、coli 0157
:H7と反応しない単クローン抗体を除去し、E、coli 0157の入った
基質ユニットへtgl及び第2の抗体の反応単クローン抗体の存在を比較的に、
量的に検定する段階からなるテスト試料でのE、coli 0157:H7の存
在を検定する方法に係る。
本発明は単クローン抗体を腸出血性E、coli 0157:H7及びE、’c
oli 026:Hllに対して発生し、抗体をミエローマ細胞を存する腸出血
性E、c○It 0157・H7及びEcoli 026:Hllに対して発生
しうる細胞を融合することで形成されるハイブリドマを増殖し、ハイブリドマで
発生される抗体を収集することからなる方法に係る。
本発明は腸出血性E、colj 0157・H7及びE、coli 026:H
llに特有の単クローン抗体からなる腸出血性Ecoli 0157:H7及び
/又はE、coli 026:Hllの存在を検定する医療キット及びその使用
に係る。
本発明は約5000〜6000ダルトンの分子重量を有する実質的な純プロティ
ンからなる抗体検定用生試薬に係る。プロティンはE、coli 0+57:H
7又はE、coli 026:Hllの外膜て見つかり、E、coli 015
7:H7及びE、coli 026:Hllに単クローン抗体で特に反応できる
。
本発明は約5000〜6000ダルトンの分子重量を有するE。
coli 0157:H7又はE、coli 026の外膜て見つかる実質的な
純プロティンに係り、E、coli 0157:H7及びE、coli 026
・Hllへ単クローン抗体で特に反応できる。
その高特異性の為、単クローン抗体は食物及び医療試料における腸出血性E、c
oli 0157:H7及び/又はE、coli026 :HI Iの色検出用
有効試薬である。更にテスト方法は一日又はそれ以内に減少さるべきである。テ
スト方法は、先ず選択生成媒体で生体を生成し、例えば酸素リンク免疫吸収検定
(下記エリザELISAs)及び他の免疫検定でその存在のテストを含む。
本発明は食物のような基質におけるE、coli 0157:H7を検出する特
有、感度方法に係る。方法は富化培養を形成するようアクリフラビン(又 スペ
ル アクリフラビン)を含む選択富化媒体に基質の富化を含む。富化培養はEL
ISA検定のような検定に用いられる。高い特有及び感度であるのに加え、方
法は実行するのに素速く、容易であり、ルーテン微生物テストを実行する実験室
での使用に順する。基質におけるE、coli 0157:H7の仮定識別は2
0時間以内になされうる。病原は仮定検出の後、2日以内に分離され、E、co
li 0157:H7として確認されうる。
本発明の他の目的及び利点は本発明の望ましい実施例を示す下記の詳細な説明及
び図から明らかである。
図1の(A)はE、coli 0157:H7菌株932(レーン3)、E、c
oli HAT (レーン4)、E、coli 026 :Hl 1菌株94−
381(レーン5)、E、coli 026 :Hl 1菌株89−326、E
、coli 0157:H16(レーン7)及びE、coli 0157:H4
5(レーン8)の外膜プロティン(OMP)のトリシン−3DS−PAGE形状
を示す図である。OMFの5μg試料は各レーン当たりに用いられる。
(左に千で示される)低分子重量標準はレーンl及び2で示される。
ゲル化は銀着色される。
図1の(B)はMA6 4E8C12で処理されたウェスタンプロット法の5D
S−PAGE分離O分離0示P図である。レーン番号は図1の(A)に示す○M
P準備に対応する。
図2は例2に示す如<E、coli 0157:H7、菌株932を検出する直
ELISAにおいて単クローン抗体4E8C12の感度を示すグラフである。
図3は攪拌を存するmTSBにおいて成長した純粋培養のE、coJi 015
7:H77菌932を検出するサンドイッチELISAの感度を示すグラフであ
る。
図4はサンドイッチELISAによりE、coli 0157:H77菌932
の検出の成長温度の効果を示すグラフである。細胞は攪拌存り又は無しのmTS
Bで成長される。凡例:ム=攪拌を有する37°C1△=攪拌を有する30’C
:■=37°Cで静止:口=30℃で静止。
図5はELISAにより決められる如<Mab4ESCI2と反応するE、co
li 0157:H7抗原の発現の強化の濃度媒体のアクリフラビンHCL (
I Omg/L)及び/又はカサミノ酸の効果を示すグラフである。E、col
i 0157:H7抗原932の培養は攪拌により37°Cで成長される。凡例
○=mTSB;■=MTSB+カサミノ酸、ローmTSB+アクリフラビン−
HCL:・=mTSB+アクリフラビンーHCL十カサミノ酸。
腸出血性E、coli 0157・Hl及びE、coli 026 :Hl 1
は重要な人間病原として識別された。それらは人間を含むいくつかの哨乳類に大
きな腸出血を生じる1つ又はそれ以上の毒素(ベロトキシン)を生成する。それ
は牛乳、生スーパマーケット内等で見つかり、便汚染で思うに導かれる。ライア
ン他(上記、1988年)に示す如<E、coli 0157:Hlのいくつか
の特徴と下記の如くである。E、coli 0157:Hlは熱安定又は熱不安
定性腸毒素を発生しない。それは侵襲的てなく、ヒータ細胞に付着しない。それ
はツガ毒素と同様になる高レベルのベロ細胞毒を発生する。E、coliはバド
ヒー、ピッカス ビー 他、1989年、医学微生物のジャーナル、30巻、2
19〜226頁の「抗原型0157:Hlの大腸菌からのへドロキノン1及び2
への単クローン抗体の製造及び特@Jに示す々D<1つ又はそれ以上の異なるベ
ロ細胞毒の発生か示される。
E、coli 026:Hllは、両方かベロトキシンを発生し、溶血性尿毒症
候群及び出血性大腸炎を生じる腸出血性E、co11であるE、coli 01
57:Hlに同様である(ポツプ、シー、エイ他、1987年、医療微生物のジ
ャーナル、25巻、1486〜1489頁の出血性大腸炎と関連した異常なベロ
トキンン発生犬腸菌;カーユリ、エム、エイ他、1983年、ランヒツト、i巻
、619〜620頁の「便器で大腸菌を発生する便細胞毒及び細胞毒に関連した
溶血性尿毒症候群の散発例) 、シービン、エム、エム、上記、1987年)。
一般概説において、E、coli 0157:Hl及びE、c。
1i 026:Hllか特有である4E8C12で示される単クローン抗体は0
157抗原の不足のE、coli 0157:Hlの「粗」菌株でBALBl
cマウスを免疫して生成される。そう免疫されたマウスからの肺臓細胞はマウス
ミエローマ細胞で融合され、融合は公知の方法によりポリエチレングリコールの
処理かなされる。
得られるハイブリドマは培養され、抗体活動が選択される。E、coli 01
57:87及びE、coli 026:Hllに特有の抗体を生成する。細胞は
公知の技術の方法で、ELTSAにより検出される。抗体は従来の方法で腹水液
から浄化される。そう生成され、選択されたクローンされた細胞系は従来の細胞
培養技術により保全される。
この方法で発生したハイブリドマは1990年5月lO日のアメリカンタイプ培
養コレクシロンで析出され名称HB 10452が割当てられる。この特有のハ
イブリドマ及びそれにより発生された抗体は下記に示されるハイブリドマ及び単
クローン抗体であり、さもなければ他で述べられる。ハイブリドマの製造の詳細
説明は下記に含まれる。ハイブリドマの更なる参照は下記の如くである ATC
CHB 10482゜
この析出は特許の方法及びその下の規制(ブタベスト条約)の目的用微生体の析
出の国際識別のブタベスト条約を用いて作られる。
これは析出の日付から30年の生存できる培養の維持を確実にする。
生体はブタベスト条約の用路下のATCCで入手でき、適用者とATCCの間の
合意を受けなければならなく、適用米国特許の発行に又はかかる米国又は外国の
特許適用の公共への公開の際公共に培養の後代の永久及び制限なしに入手できる
のを確実にし、どれか初めに生じても、35USCff122によりそれに題さ
るべき特許及び商標の米国委員に及び特に880 QC; 638を参照して3
7CFR,I’J’1.14を含むそれに従かう委員ルールで決定されたものへ
の後代の入手出来るのを確実にする。析出の培養が適切な状態下で栽培される時
死ぬ又は失われる又は破壊される場合、同じ培養の生存できる試料の通告て素速
く置換えられることを本願の譲受人は合意する。析出の菌株の入手はその特許法
によりいかなる政府の権力下で認められた権利に違反して本発明を実行するライ
センスとして解釈されない。
E、coli 0157:Hlに反応するが、体細胞0157抗原に結合し、血
清グループ0157に属する全てのE、coliと反応する単クローン流体を開
示する以前に公報された参考に反して、(べIJ−、エム、ビ仏他、1988年
、医療微生物のジャーナル、27巻1973〜1978頁の[単クローン抗体を
用いることで大腸菌抗原型 0157菌株の識別J)本発明の単クローン抗体は
0157抗原に反応せず、E、coliの他の抗原型を除いてE、coli 0
157・Hlに非常に特有である。他の抗原型は、E。
coli 026・Hllである。ここで用いられる如く、rE。
coli 0157:Hll:及びE、coli 026:Hllに特有」なフ
レーズは本発明の単クローン抗体が例1の下記の表2にリストされる。E、co
liの菌株と反応しないことを意味することを目的とする。
抗体はELISA及び種々の腸のイムノプロット法て特異性がテストされる。こ
れらの方法により、単クローン抗体かE、coliO157・Hlの36菌株及
びE、colt 026:Hllの5菌株の夫々で直ELISAにより強い反応
を形成することが決められる。しかし、例えば、サルモネラ、エルジニア イン
トロコリティ力(entrocolitica)、赤痢菌病、プロテウス、クレ
ブシェラ属、キャンビロバクタ ジエジュ一二(Campylobacter
jejuni)、セラティア5errat ia、エーロモナス属 ハイドロフ
イラ(hydrophi la)、ノトロバクター菌(Citrobacter
) 、腸内細菌 /%フェア属、エンエリヒア属 ハーマニイ(hermaH)
及び(Hlではないか抗原型1057の菌株を含む)抗原型0157:Hl及び
026・H1l以外のE、coliの全ての他の菌株のような他の腸の菌株と交
差反応しない。
E、coli 0157:Hl及び026:Hllへの単クローン抗体の研究は
単クローン抗体(Mab)が下記の特徴を育することを示す:
(11それはサブクラスIgGx−の要素であり:(2)それはカッツク光チェ
ーンを育し:(3)それはウェスタンプロット分析が続く異なる抗原室のE、c
oliの外膜プロティンのSDSポリアクリルアシドゲル電気流動法で決められ
る如く略5000〜6000ダルトンの分子重量を育する腸出血性E、coli
0157:Hl及びE、coli 026:Hllの外膜プロティンと特に反
応する。
初めに、腸出血性E、coli 0157:Hl及びE、coli 026:H
llの外膜プロティンは約E30QOダルトンの分子重量を育すると考えられる
。分子重量決定はプロティンを分解するよう15%ドデシル硫酸ナトリウムをポ
リアクリルアシドゲル電気流動法(SDS−PAGE)装置に用いることで作ら
れる。プロティンはダブレット、即ち2つの近接関係のバンドになる。ダブレッ
トは略13000ダルトンの分子重量を有する微生物の外膜の1つのプロティン
を表わすと考えられる。
上記の装置は低分子重量プロティンを分解する効果かない確証を示す(パドヒー
、エム、ビイ、及びエム、ビイ、ドイル、1991年1月、医療微生物のジャー
ナル、29fll:99〜103)。最も外膜プロティンは略5000〜600
0ダルトンの明白な分子重量を存するらしい。
Mab4E8CI2と反応するE、coli 0157:H7及び026 :H
l lの細胞成分はウェスタンイノムブロソト分析が続くトリノン−5DS−P
AGE (シャガー、エイチ及びシイ、ジャボウ、肛生化学、166:368〜
379)て決定される。
E、coli 0157:H7菌株932、E、coliHAl、E、coli
0157:Hl6、E、coli 0157H45及びE、coli 026
:Hllからの外膜プロティン(OMP)は、高溶解を有する低分子重量プロテ
ィンを分離する必要性の為特有トリノン−5DS−PAC;E方法で分離される
。参照は図1の(A)でなされる。第2のゲルから分離したプロティンはポリビ
ニールディフルオライド膜に送られ、Mab 4E8C12により認識される抗
原の位置はウェスタンプロット分析で決定される。Mabは図1の(B)に示す
如<E、coli 0157:H7菌株932、E、coli F(AI及びE
、coli 026:Hllの2つの5000〜6000分子重量OMPと反応
する。交差反応はE、coli 0157:Hl6又はE、coli 0145
:H45のいずれても観測されない。
分子重量の決定はバンドのアミノ酸組成の追加テストで確証される。浄化プロテ
ィンと同様バンド両方のアミノ酸組成は表1に示す如く単にあるわずかな変化で
ほとんど等しい。
表1
目標外膜プロティンのアミノ酸組成5oアミノ酸をベースの残留の数
アミノ酸 丁バンド 上バンド
アスパラギシ酸 45
グルタミン酸 76
加水分解して、あるアミノ酸が毎回異なる数の残留を生しる可変範囲に酸化され
るので、あるパーセントの矛盾か予想される。しかし、チロシン、ファニルアラ
ンン、ヒスチジン、リジン及びアルギニンのような安定アミノ酸の数が全ての3
つのプロティンで一定である。
従って、目標外膜プロティンが略5000〜6000の明白な分子重量を有する
少なくとも1つのプロティンであることか考えられる。外膜プロティンのアミノ
酸組成を除いて、外膜プロティンか略5000〜6000の分子重量を有する1
つのプロティンであることを支持する他の確証は共通等電点;基クローン抗体4
ESC12で認識されるプロティンバンドの両方の共通エピトープを含む。
ELISAはテスト材の試料の抗原の存在を検出する従来の方法である。本発明
のサンドイッチELTSAはテスト材の試料において腸比血性E、coji 0
157:H7の存在を決定するよう用いられ、下記の段階を含む。第1に、E、
coli 0157への公知の抗体は適切な吸収基質に結合される。望ましくは
、96ウエル ポリスチレン培養板(コスタ−、ケリブリノチ、マサチューセッ
ト、モデル番号 35’96)のようなプラスチック培養板か用いられる。E、
coli 0157への抗体の溶体化はウェルの夫々に置かれ、E、coli
0157への抗体がウェルの面に吸収されるような状態下のままでいるのを可能
にする。吸収されない抗体溶液は洗浄され、抗体を「吸着基質ユニット」の如く
示されるウェルの吸収壁に結合されるE、colf 0157にする。それに吸
収されたE、coli 0157への抗体で、それらはrE、coli 015
7の入った基質ユニットへの抗体」として示される。E、coli 0157の
入った基質ユニットへの抗体は非特育結合部位を阻止するよう脱脂粉乳のような
適切阻止試薬で処理される。適切な定温培養の後、この試薬は除去される。
次に、公知の量のテスト材は適切な期間E、coli 0157の入った基質ユ
ニットに抗体を露出され、洗浄で除去される。テスト材のかかるE、coli
0157:H7は抗体をE、coliの入った基質ユニットに結合する。
同様に、E、coli 0+57:87の標準準備は制御として役立つようE、
coli 0157の入った基質ユニットへの他のセントの抗体に露出される。
上記に示される基クローン抗体はかかる結合E、coli 0157:H7と結
合するようE、coli 0157の入った基質ユニットへの抗体に加えられる
。適切な定温培養の後、結合してない基クローン抗体は洗浄で除去される。
テスト試料と反応したE、coli 0+57の入った基質ユニット又はE、c
oli 0157:H7への抗体は基クローン抗体の存在が検定される。
望ましくは、これはテスト試料に反応したE、coli 0157の入った基質
ユニット又はE、colt 0157:H7及びマーカー結合抗体をかかる単コ
ロニー抗体に結合することを可能にするようマーカー結合抗マウス抗体へのそこ
への基クローン抗体へ抗体を露出することてなされる。非結合マーカー結合抗体
は除去され、E、coli 0157の入った基質ユニットへの抗体に残るマー
カーの量が測定される。マーカーは選択試薬、蛍光材、放射線材又は当業者にな
じみの他のマーカーのその効果で酵素測定されつる。単クローン抗体自体がマー
カーで直接に結合され、そこでマーカー結合抗マウス抗体の反応の段階が無視さ
れうることは明白である。
基クローン抗体と又他の従来のELISAで用いられる。例えばテスト材の試料
は吸着基質に結合され、上記記述の基クローン抗体に露出される。抗体はテスト
材においであるかかるE、coli0157:H7又はE、coli 026:
Hllに結合する。基クローン抗体の結合されてない部分が除去される。次に、
上記記述に比較できる検査は結合重クローン抗体の存在の為なされる。
本発明の単クローン抗体は細胞又は組織試料のような実質的に結合力のある液体
でないテスト材を検査する免疫組織技術でのかかる抗体と用いるいくつかの一般
的に公知の方法でも用いられうる。望ましくは、試料は便試料の食物である。テ
スト材はテスト材にあるE、coli 0157:H7又はE、coli 02
6:Hllに抗体を結合するよう単クローン抗体で定温培養される。テスト材
は単クローン抗体の結合していない部分を除去するよう洗浄される。抗体はその
存在を明らかに目にみえるようにするような方法で反応されつる。典型的にこれ
に含まれるE、coli 0157:H7又はE、coli 026:Hllに
結合される単り ローン抗体に関係するテスト材は上記記述と比較できるマーカ
ーレベル抗マウス抗体で定温培養される。マーカーレベル抗体は単クローン抗体
に結合する。マーカーは明らかに目にみえるように選択される。蛍光及び酵素マ
ーカーは典型的に用いられる。
テスト材は次にマーカーが目視て認識できる条件のもとてlff1fi鏡により
観察される。E、 coli 0157:H7及び E、 coli 026:
Hllへの単クローン抗体は食物や医療試料中のE、 coli 0157:
H7及びE、 coli 026: Hllの迅速な検出のための試薬として特
に宵月である。
テスト材中の抗原の存在を検定するだめの方法は、検定に先立ってテスト材を富
化するために選択富化媒体を使用することにより高度になる。富化媒体はドイル
とショエニにより調合された改良されたトリブティケース大豆汁(mTSB)で
あり、さらにアクリフラビン−Hcl及びカサミノ酸(casamino ac
ids)を含有するように改良されている。我々はアクリフラビン−Hcl及び
カサミノ酸(casamino acids)の両者かE、 coli 015
7:H7による抗原の発現を助長することを発見した。加えて、カサミノ酸(c
asamino acids)はE、 coli 0157:H7の成長を増大
させ、そしてアクリフラビン−Hclはグラム陽性バクテリアの成長を抑制する
。アクリフラビン−HClがE、 coli 0157・H7による抗原の発現
を助長する正確なメカニズムは知られていないが、細胞壁のりポポリサッカライ
ドの形成の抑制の結果であり、そのために単クローン抗体により認識される抗原
がより良好に発現するものと考えられる。
上述の検定技術の多様性は、富化媒体を収容するために使用されることもあるか
、好適な検定技術はこの分野で知られているサンドインチELrSA法である。
この特許申請の目的で、ここに説明する検定技術を“富化−サンドイッチELI
SA法′と称する。この方法は、食品を選択富化媒体内て撹拌しながら(150
rpm)37°Cで約16〜18時間置く試料又は基質の富化を含む。富化培養
は、捕捉抗体としての特にE、 coli 0157:H7抗原に対する多クロ
ーン抗体及び、特に検出抗体としての抗原型0157:H7及び026H1lの
腸内出血性E、 coliに対する単クローン抗体を存したサンドイッチELI
SA、に応用される。ELISAは3時間以内で完了することかできる。
ここに説明するE、 coli 0157H7の検出のための富化−サントイッ
チELISA法は迅速で感度か良く、且つ簡単に行える。この方法は牛挽き肉の
僅か0. 2E、 coli 0157・H7/gを検出することかてきる。E
、 coli 0157:H7は富化を含めて20時間以内で検出することがで
きる。従って、この方法は食品試料の日常的な適合審査に非常に宵月である。
本発明は、例えば診断検定キットのような、E、 coli 0157:H7お
よびE、 coli 026: Hltに単クローン抗体を利用し上記に開示し
た方法をおこなうためのキットも含んでいる。一実施例においては、診断キット
は従来のように、−または−以上の容器に入ったE、c。
1i 0157:H7及びE、 coli 026: Hllへの単クローン抗
体と、単クローン抗体のための特定な結合相手の配合体と、検出可能な信号を生
成するラベルと、その使用説明書を含むであろう。キットは同分野で良く知られ
ているようにラベルに配合することもできる。多様なラベルは酵素、放射性同位
元素、粉体よりなるラベル、色原体、蛍光発光体、化学発光体、補酵素、自由結
合族及びバクテリオファージを含む。更に単クローン抗体は支持体に結合される
。
特定の診断キットは浸漬棒状とすることもできる。これは疎水性のポリビニリデ
ンジフロライド(pVDF)基盤の膜に吸着された多クローンE、 coli
0157免疫グロブリンを含むであろう。PVDF膜は非特定結合部位を塞ぐた
めに、5%牛血清アルブミンで処理される。PVDF膜はE、 coli 01
57:H7を含むであろう食品の富化培養に30分間浸漬される。洗浄後に、P
VDF膜は単クローン抗体4 ESCI2により処理される。この抗体はPVD
F膜に結合したE、 coli 0157:H7細胞に結合する。結合した単ク
ローン抗体4E8C12は、ニトロブルーテトラゾリウム15−ブロモ−4−ク
ロロ−3−インドリル燐酸塩(Nitro blue tetrazo1ium
u15−bromo−4−chLorO−3−indolYiphO3phat
e)と反応して陽性反応として素点を生成スルアルカリ性燐酸酵素結合山羊抗マ
ウス免疫グロブリンにより検出される。
E、 coli 0157:H7及びE、 coli 026: Hllの外膜
に見いだされるおよそ5.000〜6.000ダルトン分子量を有するプロティ
ンは、生体試薬として分離され、試料内のE、 coli 0157:H7及び
E、 coli026: Hllの検出のための単クローン抗体を生成するため
に使用される。単クローン抗体はE、 coli 0157:H7及びE、 c
oli 026: Hllによる汚染が疑わしい場合の診断として使用される試
験キットに供給することもできる。
以下の例はここに開示された発明の具体例である。
興−士
バクチリア菌株 単クローン抗体の特異性を確認するために使用するバクテリア
培養二 以下のバクテリアの菌株は下記の例により調査された: E、 col
i 0+57:H7菌株932. E、 coli HAI(E、 coli
0157:H7932から抽出した粗菌株)、以下の表2に挙げたE、 col
i 0157:F(7の他の34種の菌株、E、 coli 026: E(I
Iの5種の菌株、及び以下の表2に挙げたE、 coli 0+57・H7又は
Ecoli 026: H11以外の37種の菌株:表2
E、coli抗原型0157:87
菌株番号
936〜86
RPS 386−I
EC−12
SL−19808
A8187 M3
EC−14
+093−83
SL−20069
NX 0+57・H7
RPS−779
AI
30898−I NUG
C−600933W
33−J
ECPB40
ECGV50B
ECPB−200
ECPB−175
に88
に99
R3F 1030
E、coli RI
P4
E、coli K−12
88−1947(0157・H16)
A2 (0157:819)
84−1097 (0157・H25)624−83 (0157:H45)
OPHD (0157: H−)
88−573 (02:87)
肺炎桿菌 272−6
FI82−5(1)
FI82−5(2)
F182−6(1)
F184〜5(4)
F1134−5(5)
F184−6(1)
F188−5(4)
F189−5(2)
F189−5(3)
F]89−6(1)
F190−6(3)
FI90−7(5)
クレブシェラ オキシドh(Kiebsiella oxytoca) 1 1
6 9 6ノト0バクター フルエッチ4(Citrobacter fru
endii) Y6+ l OR3FI
ノド0バクター 了うマンティhス(Citrobacter amalant
icus) 2 8 4 2 2ノトロバクター フロインティ(Citrob
acter freundii) MA T −8ノド0バクター ノベルすス
(Citrobacter diversus) MA+ S −9エルノニ了
エッチ[+コリテイカ(Yersinia enterocolitica)
I P −f 8 3P−162
2635−NT
A
エンテロバクタ−りa7カエ(Enterobacter cloacae)
2 7 4 − 6ハフニア アルベイ(Hafnia alvei) CB
−7エー0モチス ハイドロフィリ了(Aeromoras hydrophi
la) ?全てのバクテリアは、37°CのTRYPTICASE犬豆汁(TS
B)(BBLマイクロバイオロジー、コツケイスピル、メリーランド州)内で攪
拌(100rpm)されながら16〜18時間成長させられれた。
毒素: E、 coli 0+57:87菌株932からのベロトキソンー1(
VT−1)及びベロトキノン−2(VT−2)はバブイー他(スーブラ)により
説明された方法により浄化された。
接種のための抗原の準備 E、 coli HAI細胞はTSB内で378Cで
16時間攪拌(]00rpm)されながら成長された。
細胞は遠心分離(3500rpmで10分間)により採集され、001燐酸塩緩
衝塩(pH7,2)により3回洗浄された。E、 coliHAI細胞は2%ホ
ルマリンで処理され37°Cで1週間保持された。
10匹のマウス(雄、生後6〜8週間)はホルマリン処理E、c。
1i HAIの2X 10”個の細胞の腹腔内注射により免疫化された。
その後、そのマウスは、4週間ごとにマウスの定期的な採血により得られた血清
が1:400以上の力価(titers)を有するまで、腹腔内に同し数のE、
coli HAIのホルマリン処理細胞を受容した。
これは一般的には3回の接種を必要とする。細胞融合の4日前に、そのマウスに
はlXl0”個のE、 coli HAIのホルマリン処理細胞の最終静脈内増
強性注射が施された。最初の注射から4から5か列後にマウスは殺され、その膵
臓細胞は骨髄腫細胞と融合された。
融合及びクローニング:融合及びクローニング処理は、ガルフレ、シイ、198
1年の方法「単クローン抗体の準備、わずかな変更を育する酵素学の方法、73
巻、1−46頁の戦略及び方法により実行される。簡単に、免疫マウスからの膵
臓細胞は40%ポリエチレングリコールを用いるSP210−Ag−14ミエロ
ーマ細胞(分子重量、1300−1600)(ジエ、ティ、ベニカー ケミカル
社、フィリップスバーブ、エヌジェ)で融合され、0.3%マウス赤血球を有す
るヒボキサンチン、アミノプテリン及びチミジスを含む選択媒質で成長される。
ハイブリドマ成長を育するウェルからの上澄み液は下記に示す如く直接ELIS
AでE、coli0157・H7に対する抗体の製造の為濾過される。問題の/
’tイブリドマスは20%の胎児牛血清を含む媒質(ジブコ、グラード島、ニュ
ーヨーク)において0.5及び0.1細胞/ウエルでの希釈を制限することでコ
ーラ−及びミルスティンの方法、(1975年)自然、256巻、495−49
7頁で2度サブクローン化され、抗体製造の為再検定された。
直接ELISA:抗体製造は96ウエルスチレンELTSA板(ギブコ、グラン
ド島、ニューヨーク)で実行されるELJSAで決定される。各ウェルは50m
M炭酸緩衝剤、pH9,6の細菌細胞(E、coli 0157:H7菌株93
2、E、coli0157:HI3.E、coli 02:kl:H7、又はE
、c。
1ik−12(頁の制御)又は107細胞、640nmでの0゜5の光密度)の
100ミクロリツトル(μm)で被覆され、室温で起動シェカーで終夜回転され
る。50mM)リスHcl、pH7゜5プラス150mM NaCl (TSB
)で4回細胞を洗浄した後、残る結合サイトはTBSにおいて5%BSAで阻止
される。37°Cでの定温培養の1時間の後、阻止緩衝剤は除去され1,100
μmの単クローン抗体(ハイブリドマ上澄み液)がウェルに加算される。
板は37°Cで1時間定温培養され、ウェルはTBSプラス0.05%トウィー
ンー20 (TBS−T)で4回洗浄される。ホースラディツシュペルオキシダ
ーゼ共役やぎ抗マウスIgG(100μl/ウェル;TBSにおける1:140
0)(カーケガード及びベリーラボラトリン社、ガイシャースバーグ、エムディ
)か加算され、37゛Cで1時間定温培養される。ウェルをTBS−Tで4回洗
浄した後、100μJのABTSペルオキシダーゼ基質(カーケガード及びベリ
ーラボラトリ−、ガイシャースバーグ、エムディ)はlウエル−当たりに加算さ
れる。酸素反応は室温で15分の定温培養の後、lウェル当たりTBSに50μ
mの1%ドデシル硫酸ナトリウムで止められる。各ウェルの反応物の光密度は4
10nmでのダイナチック(MR300)マイクロプレートリーダーで測定され
る。
検定の再製造は二重テストされる。
腹水液: 10BALB/Cvウスは0.5mlの2. 6. 10゜14テト
ラメチルペンタデカン(プリスティン)(ンガケミカル社、セントルイス、エム
オー)の腹腔注射で注入される。10回後、マウスは2XlO”ハイドロニ細胞
か注射される。マウス腹水液は注射の後10から20日間収集される。細胞デブ
リ及びフィブリン凝血は遠心分離で(10分間8000Xg)除去され、液体を
含む抗体は一20°Cで蓄積される。
単クローン抗体の純粋化 腹水液からの単クローン抗体はプロティンAカラム(
イム)ピュアプラスIgG純粋化キット、ピアース、ロツクフす一ド、アイエル
)を用いる製造命令の変更により純粋化される。簡単に、腹水液はioooox
gで20分間遠心分離され、IgG結合緩衝剤は上澄み液に(3: l)で加え
られる。この溶液(4ml)はカラムに印加され、単りクーン抗体はIgG溶離
緩衝剤で8離される。1ml留分が集められ、プロティンレベルは(280nm
での光密度を)測定することでモニタされる。プロティンを有する留分は、組合
され、20mMリン酸緩衝剤、pH7゜0.4°Cで終夜透析される。最後に、
プロティン濃度はスミス他、1985年、分析生化学、150巻き、70−85
頁の[バイソンコニニック酸を用いるプロティンの測定)、ピアスBCAプロテ
ィン試薬(ピアスケミカル社、ロックフォード、アイエル)及び標準としての牛
血清アルブミンを用いる方法により決定される。純粋抗体の活動は直接ELIS
Aで決められ、純粋化は5DS−PAGEで決められる。
免疫グロブリン副基準 免疫グロブリン副基準はクラス特有抗血清を用いるEL
ISAでなされる。EIA板のウェルは50mM炭酸緩衝剤(pH9,6)にお
いてE、coli 0157:H7菌株932(1,07細胞/m1)で被覆さ
れる。TBSでの4回の洗浄の後、非特有結合サイトはTBS(w/v)におい
て牛血清アルブミンで阻止される。37°Cでの1時間の定温培養の後、単クロ
ーン抗体4E8C12を含む0.1mlの上澄みは各ウェルに加算され、定温培
養か37°Cで更なる時間続けられる。ウェルをTBS−Tで4回洗浄した後、
マウスI gG、I gGt、、I gGt*、r gG1+ IgM、IgA
、 カッパ又はラムダ光点(マウスタイプ副基準キット、バイオ−ラッドラボラ
トリ−、リッチモンド、シイエイ)に個々に特有であるうさぎ抗血清は加算され
、37°Cで1時間保たれる。ウェルはTBS−Tで4回洗浄され、アルカリフ
ォスファターゼラベルやぎ抗うさぎTgG (0,1ml ;TBSにおいて1
800希釈され)は、37°Cで1時間定温培養した後、各ウェルに加算される
。ウェルをTBS−Tで4回洗浄したあと、1. 0M2アミノ−2−メチル−
1−プロパツール、I)H9,9でのフォスファターゼ基質(p−ニトロフェノ
ールリン酸)(1,0mg/ml)が加算され、410nmの光密度は37°C
で1時間の定温培養の後に決定される。
外膜プロティンの準備:外膜プロティン(OMP)はハンコック及びナイカイド
ーで記述の方法(ハンコック、アール、イー、ダブリュ、及びエイチ、ナイカイ
ドー、1987年、細菌学のジャーナル、36巻、381−390頁のrグラム
陰性菌の外膜」)にわずかな変更で分離されるE、coli 0157:H7菌
株932、E、coli HAl、E、coli 0157:H2S、E、co
li 0157二H45及びE、coli CL−5026:に−60二H11
は攪拌(150rpm)で37℃で18時間の2リツトルのTSBで個々に成長
される。細胞は遠心分離(4°Cで10分間1010000Xにより採取し、次
の動作が4°Cて実行される。細胞は遠心分離で沈澱されたI 70mMNaC
] (PBS)を含むO,OMIJン酸緩衝剤、pH7,2で洗浄され、ペレッ
トは640nmでの40の計算光密度まで同じ緩衝剤で再浮遊される。細胞はフ
レンチプレス(1400lb/in’)(アメリカン、インスツルメント、カン
パニ、シルバースプリング、エムディ)で分類され、細胞デブリは遠心分離(5
分間で5000Xg)除去される。OMPは1時間で200000Xgを遠心分
離で上澄み液から沈澱される。ペレットは20mg/mlの適切なプロティン濃
度を0、OIM HEPES (N−2ヒドロキシエチル ピペラジン−N’−
2エタン スルホン酸)緩衝剤、pH7,4再浮遊される。
プロティン溶液は0.OIM HEPES 緩衝剤で準備された35−55%(
W/V)サツ力ロースグランジエントか層になり、OMPは36時間13100
0Xgを遠心分離でペレットされる。OMPはI M m M g C] tを
含む0.OIM HEPES 緩衝剤で再浮遊され、遠心分離(1時間で2oo
oooxg)沈澱される。
ペレットは同じ緩衝剤で再浮遊され、−20°Cで保管される。プロティン濃度
は上記方法により測定される。
イムノプロット法、○MP’(50ug)及び純粋VT−1及びVT−2(3−
5ug)はドデシル硫酸ナトリウム(SDS)−ポリアクリル アミドゲル電気
泳動法で個々のプロティンバンドに分離される。ゲルはブロモフェノールダイが
ゲルの底から1cmになるまで200Vの一定電圧で二重スラブ電気泳動細胞(
プロティン、パイオーラッド ラボラトリ−、リッチモンド、シーエイ)でなさ
れる。電気泳動の後、プロティンバンドは30Vで18時間トランスプロット(
transblot)装置(バイオ−レット ラボラトリ−、リッチモンド、ブ
イエイ)を用いる25mM)リス192mMグリシン及び20%メタノール(W
/V)を含む緩衝剤のPVDF膜(イモービリム、ミリポー、ベッドフォード、
エムエイ)に送られる。膜は下記の如く免疫化学的に着色される。非特有結合サ
イトは37°Cで1時間TBSの5%BSAで定温培養され阻止される。TBS
の1%BSAでゲルをリンスした後、PVDF膜は単クローン抗体4 E 8
C12,、(T B Sで希釈腹水液1:6000)で定温培養される(膜はT
BSプラス0.05%トウィーンー20(TBS−T)で3回洗浄され、37°
Cで30分間アルカリリン酸ラベルやぎ抗マウス(TBSで希釈1gG1 +
2000)で定温培養される。膜はTBS−T (+0.05%5DS)で全体
が洗浄され、プロティンバンドを検出するようBCIP/NBTリン酸基質(カ
ークガード及びベリーラボラトリ−社、ガイケースバーブ、エムディ)で処理さ
れる。低分子重量標準(電気泳動校正キット、ファーロシア、ビスキャラタウエ
イ、エムジエ)は、各ゲルでなされ、夫々はプロティンの移送を文書化するよう
移送の前及び後に0.25%5%コマラン−ブリリアンドブルー250(インペ
リアル ケミカル、ロンドン)で着色される。
例■
単クローン抗体の感度の決定
単クローン抗体の感度はE、coli 0157:H7の8の事なる菌株の種々
のレベルを有する直接ELISAを用いて決められる。検出制限は10’から1
0’細胞/mlの範囲である。E、Co11 0157:H7、菌株932を検
出する直接ELTSAにおける単クローン抗体4E8C12の感度を示す図2が
例で示される。
例■
単クローン抗体の特異性
単クローン抗体の特異性は異なる腸内菌を有する交反応を検査することで決定さ
れる。例Iの表2でリストされる下記の菌は例1の方法によりテストされる。
以下の表3に結果を示す。
表3
MAb4E812とE、coli 1057:H7及び他のバクテリアとの反応
性
細菌
陽性a 試験菌株数 数
0157又は026:Hll
以外の抗原型 23 0
エノエリヒア へルマニイ(Escherichia hermanii) 1
0プロプウス 5pp(Proteus spp、) 3 0肺炎埠菌 13
0
りしブノエラ オキシト力(Klebsiella oxytoca) 1 0
ノド0バククー 5pp(Citrobacter spp、) l l O霊
菌 10
赤痢菌 2G
サルモネラ spit(Salmone[la spp、) I 7 0カムピ
ロバクター ノエへ二(Campylobacter jejuni) 5 0
エルノニア エンテロコリティ力(Yersinia enterocoljt
ica)1 2 0エンデaバクター り口γカニ(Enterobacter
cloacae) 2 0ハフニア アルベイ (Hafnia alvei
) 1 0エーロモナス ハイドロフィリア (Aeromonas hydr
ophia) 4 0a、ODa+。値が背景値から0.2高いものは陽性とす
る:全での陽性菌株はOD値か背景値から10より高い値を示した。
b、E、coli 026:Hllは溶血性尿毒症候群又は出血性大腸炎の患者
から分離された。
結果の検討:MAbは、全てのテストされた菌株に対し〉1.0の0.D5 を
有するELISAで決定される如<E、coli 0157:H7の36全ての
菌株で大きく反応する。Ma b 4 E 8 C12の特異性は抗原型015
7・H7以外のE、coli菌株及びエルジニア エンテロコリティ力、サルモ
ネラ spp、、エンテロセバクター クロアカニ、カンピロバクタ−、ジエジ
エニ、赤痢菌、プロテウス spp、、エーロモナス ハイドロフィリア、ハフ
ニア アルベイ、肺発棹菌、クレブシェラ オキシト力、霊菌及びシトロバクタ
−8ppのいくつかの菌株を用いるELrSAで決定される。抗原型0157:
H7以外の5つの菌株、即ち全てのE。
coli 026:HllはMab(表2)で反応する。これらの菌株は溶血性
尿毒症候群又は出血性大腸炎で患者から分離され、E、coli 0157:H
7で発生されるのと同一なベロトキシンを発生する。
開示の例から、当業者は上記の単クローン抗体が特有であるよう示される抗原に
関して種々の方法で用いられうることが分かる。
従って、開示の種類のサンドイッチELISA以外のELISAのE、coli
0157:H7及び026 :Hl 1を検定するよう用いられる。検定及び
他の目的用抗体を用い、一方蛍光抗体法、ノムノペルオキシダーゼ反応又は他の
かかる技術を用いることで他の従来の方法と同様に用いられつる。
例■
E、coli 0157:H7を検出及び分離するよう高速及び感度方法の開発
バクテリア菌株:E、coti 0157:H7菌株933,505B、932
.CL−8及び32381は富化EL rsA方法の感度を決定するよう定温培
養研究用に用いられる。菌株933及び505Bは牛肉から分離され、一方、菌
株932.CL−8及び32381は人間から分離される。E、coli 01
57:H7、抗原型0157:H16,0157:H19,0157:H25゜
0157:H45のE、coli及びE、coli k−12のこれらプラス2
0の他の菌株はELISA方法の評価のみに用いられる。
単りローン抗体製造、腸出血性E、coli 0157:H7及び026 :H
l 1に特有である単クローン抗体4E8C12IgG2aの腹水液は10′ハ
イブリドマ(4E8C12)細胞が注射されたBALB/Cマウスから得られる
。
腹水液は用いられるまで一20℃で保管される。
MAb JE8CI2で理解される抗原のE、colf 0157による発現の
強化:E、co1ヱ 0157:H7菌株932は、(1リツトル当たり)トリ
ブチケース大豆汁(TSB ; 30 g)CBBL 微生物学システム、コツ
キースビラ、エムディ、〕、胆汁酸塩3番(1,5g)、に2HPO4(1,5
g)及びノボビオシン(20mg)を37°Cで16時間攪拌(150rpm)
からなる変形トリブチケース大豆汁(mTSB)で成長される。複数の異なる成
長因子はELISAの感度を増すよう個々に加算又はmTSBと組合わされる。
評価された成長因子は、1%グルーコース、ラムノース、マンノース、乳糖又は
サッカロース、0.5−5%半赤血球のような鉄分の補足、5−50mg Fe
Cl3/L、0.5FeSO4/L又は50mg Fe (NG4)2 (SO
4)2/L。
5gシエレックス100/L(バイオラット、リッチモンド、シーエイ)又は0
.Ol及び0. 05%EDTA、0. 5. 2. 5. 8及び10mgア
クリフラビン−HCL/L、及び0. 5及び196カサミノ(casamfn
o)酸が含まれる。加えて、TSBSmTSB及び抗生物質媒体3番(PAB)
のような異なる成長媒体は異なる成長温度(30°C137°C及び42℃)で
攪拌(150rprn)lrり又は無しで評価される。下記の成長細胞は、遠心
分離(1500xg、10分)で沈澱され、50mM炭酸緩衝剤で、I)H9゜
6再浮遊され、0.5 (ca、10”細胞/m1)の640の光密度(OD)
まで調整される。細胞浮遊は炭酸緩衝剤でca、IQ’細胞/mlまで逐次(1
:10)希釈され、1.00μlの各連続希釈は96ウエルボリスチレンEIA
−RIA板(、GI BCO,グランド島、ニューヨーク)のウェルに二倍で用
いられる。これらの細胞準備はMAb 4E8CI2と反応するE、coli
0157:H7抗原の発現の範囲を決めるよう直接ELISA方法で用いられる
。抗原のより強い発現は、ELISAの検出限界を低下させる(より高い感度)
結果となった。全ての実験は2回繰り返された。
媒体の準備: ノボビンオンを含まないrnTSBにカサミノ酸(10g/L)
及びアクリフラビン−Hclを加えた富化媒体(dmTSB−CA)は、カサミ
ノ酸を加えて1219Cで15分間最初のオートクレーブにより準備された。こ
れは室温まで冷却され、次にフィルタ殺菌されたアクリフラビン水溶液か加えら
れた。乳製品中のE、 coli 0+57:H7には、1リツトル当たり1.
35gのに82PO4と12gのNa 2HPO4からなる緩衝剤を加えたdm
TSB−CAが、1リツトル当たり1.5gのに2HPO4に代えて使用された
。
4−メチルウンベリフロンーβ−D−グルクロン酸化合物(0゜Ig/L)を加
えたマツコンケイ−ソルビトールかんでん培養基(ディフコラボラトリイズ、デ
トロイト、ミシガン州)か、E、c。
1i 0157:H7を富化培養から分離するのに用いられた。
接種の調査: 新鮮な市販の牛挽き肉、牛乳、殺菌さnた全乳及び脱脂乳、そし
てチェダー、スイス、コルビー及びブリックチーズに検出方法の感度を決定する
ために異なったレベルのE、 coli 0157:H7が接種された。プレー
トカウントかんでん培養基を使用する前に、好気性菌の発生したプレートカウン
ト及び30°Cて48時間の定温培養かそれぞれの製品に対して行われた。E、
coli 0157H7の接種物は、TSB内で37°Cで16時間で5つの
菌株を個々に成長させることにより準備された。細胞は10分間1500×gの
遠心分離により沈殿され、0.5のOD、、。までpH7,2の0.01M燐酸
塩緩衝塩(P B S)に浸漬された(ca、10’css CFU/ml)。
細胞は、300μm当たり5〜22.5のE、 coli 0+57・H7を得
るために適度に希釈され、25gの製品に接種された。実際の接種物のレベルは
37°CI6時間でTSAプレート上の接種物の希釈液を培養することにより決
定された。それぞれのE、 coli 0157・H7は個々に試験された。そ
れぞれの製品の接種を受けていない試料は対照標準としてそれぞれの調査に加え
られた。
牛挽き肉試料(それぞれ25g)には個々に225m1のdmTSB−CAブロ
スか加えられ、1リツトルのエルレンメイヤ−(Erlenmayer)フラス
コに入れられた、そして、乳製品(それぞれ25g)にはE、 coli 01
57:H7の富化のために225m1のdmTSB−CA−bufが加えられた
。全ての試料は、攪拌(150rpm)されながら37°Cて16〜18時間定
温培養された。定温培養後、E、 coli 0157:H7はサンドイッチM
ELrSA法により富化培養内で検出された。
ELISAは96個のウェルを有するポリスチレンE IA−RIAプレー)(
GIBCO)内で行われた。それぞれのウェルは100μmの親和性浄化された
山羊のE、 coli 0157・H7への抗体(50mM炭酸塩緩衝剤、pH
9,6,中10μg/ml)[キルケガードアンドペリーラボラトリーズ、ゲイ
ザーバーグ、メリーラント州]により被膜され、室温で1時間又は終夜定温培養
された。抗体溶液は吸引により除去され、残りの結合部位は室温で15分間乳希
釈/閉塞溶液[キルケガードアンドペリーラボラトリーズ]で閉塞された。閉塞
剤は除去され、そして300m1の富化培養がそれぞれのウェルみに加えられ3
7°Cで45分間定温培養された。
ウェルを150mMのNaC]と0005%のTween−20(TBS−T)
を含んだpH7,5の50mMのTrisで3回洗浄した後、100μmのMA
b−4E8C12(TBS内で11600に希釈された腹水症液)が加えられ3
7″で45分間定温培養されたウェルはTBS−Tで3回洗浄され、次にホース
ラディツシュ(horseradish)過酸化酵素(TBS内で1:1400
)[キルケガードアンドベリーラボラトリーズコに結合された100m1の山羊
抗−マウスTgGが加えられ、37°Cで45分間定温培養された。ウェルはT
BS−Tで4回洗浄された後、loOmlの2゜2° −アジノージ[3−エチ
ルベンズチアゾリン(ethylbenzthiazol 1ne)硫酸塩]−
過酸化酵素基盤がそれぞれのウェルに加えられ、室温で20分間保持された。そ
れぞれのウェルの反応は50μlのTBS内の1%ナトリウム硫酸トンデルによ
り停止され、それぞれのウェルのODはダイナチックMR600マイクロプレー
トリーダーによって410nmで測定された。背景値より0. 2高いODは陽
性とされた。それぞれの検定において、E、 coli 0157:H7が接種
されていない食品試料の富化培養が対照標準として含まれており、これらは背景
値を得る為に使用された。
サンドイッチELISAにより陽性の試料はE、 coli 0157:H7に
対する仮の陽性とされた。E、 coli 0157・H7は次に培養法により
富化培養から分離された。富化培養のデンマル(decimal)希釈液はOl
ペプトン水内で10−6に作られた。10−5及び10−6の希釈液(0,1m
1)はMSA−MUGの表面上に置かれ、37°Cで16〜18時間定温培養さ
れた。ソルビトール陰性(白色)でMUG−陰性(UV光線下で蛍光を発つしな
い)のコロニーの数が記録された。ソルビトール−陰性でMUG−陰性の5つの
コロニーが無作為に抽出され、0I57及びH7抗血清での血清学(ディフコ、
E、 coliリファレンスセンター、ペンシルバニア州立大学、ユニバージテ
ィーバーク、ペンシルバニア州)、及びベロ(Vero)細胞の細胞毒素性検定
により、API20E小型診断キット(アナリタブブロダクツ、プレインビュー
、ニューヨーク)ヲ用いた生物化学特性にしたがって、E、 coli 015
7:H7として確認された。
サンドイチELISAの感度はl 02〜I O’ CFU/mlの範囲のレベ
ルのE、 coli 0157:H7の5つの菌株の純粋培養を使用することに
より決定された。類似した調査か、異なったレベルのE。
coli 0157:H7の同種の5つのそれぞれの菌株の富化の後にスパイク
された牛挽き肉と乳製品の富化培養で行われた。接種をされていない富化培養か
対照標準として使用された。 市販の牛挽き肉と農場からの生牛乳からのE、
coli 0157:H7の検出と分離。合計107の新鮮な牛挽き肉の試料が
、ライスコンシン州のマディソン地区の生鮮食料品詞から、5週間の期間(90
年12月から91年1月まで)にわたって入手された。同様に69の異なった農
場からのバルクタンクから115の生牛乳の試料が入手された。試料は氷と共に
クーラーに入れられ、研究所に運ばれてから1〜2時間以内に上述の方法により
自然に発生したE、 coli 0157:H7の検定が行われた。E、 co
li 0157:H7は陽性の試料から分離され、分離物は上述の方法によりE
、 coli 0157:H7と確認された。3−チューブ最適数法(most
probable number procedure)が、陽性の牛挽き肉
試料内のE、 coli 0157・H7の数を定量するのに使用された。牛挽
き肉試料(25g、2.5g、0.25g)は、225m1,247゜5ml、
250m1のdmTSB−CAにそれぞれ加えられ、ストマツカー(S tom
acher)バッグに入れられ、ストマツカーにより5分間浸軟された。試料は
消毒されたエルレンメイヤーフラスコに移され攪拌(150rpm)されながら
37°Cで18時間定温培養された。陽性培養(フラスコ)内のE、 coli
0157:H7の存在は、富化培養のループフル(Ioopful)をMSA
−MUGプレート上に筋状に筐ることにより確認された。プレートは37°Cで
16〜18時間定温培養され、白色(ソルビトール−陰性)でMUG−陰性のコ
口二一は選別され上述の確認検定によりE、 coli 0+57:87として
実証された。
結果: サンドイッチELrSAは食品の富化培養内のE、c。
1i 0157:H7を検出するために開発された。ELISAの特殊性はE、
colj 0157:H7及びE、 coN 0157:non−H7の数種
類の菌株を使用して決定された。E、 coli 0157:H16,0157
: H19,0157: H25、0+57: H45は全て陰性であったのに
対して、E、 coli 0+57:H7の25菌株全てはELISAにより強
く反応した。検定の感度は純粋培養と食品の富化培養内のE、 co[i 01
57:H7(5つの異なった菌株が傭々に試験された)により決定された。純粋
培養内で検出可能な細胞の最小数は、図3に示すように、104〜105CFU
/mlの範囲であっった、そして富化後の異なったレベルのE。
coli 0157・H7のスパイクされた食品の富化培養は、10’〜10″
E、 coli 0157:H7/m 1であった。
検定の感度を増すために、MAbにより認識されるバクテリア表面上の抗原の表
示を増大させるへく研究か行われた。食品からのEcoli 0157:H7の
分離のための標準富化条件は、mTSB内て攪拌しながら37°Cで培養されて
きた。したかって、これらの条件による研究の結果が、比較基準として用いられ
た。図4に、2種類の成長温度(306及び37°C)及び富化培養の攪拌のこ
れらの抗原の発現への効果を示す。これらの変数は、富化の漂準条件と比較した
時に、ELISAの感度において大きな減少はないということから、関係した抗
原の発現を強調する実質的な効果を有していなかった。420CのmTSB内の
E、 coli 0157:H7の成長は遅いことから、ELISAによる検出
のために十分な量の細胞を入手することは困難であった。
mTSB内のアクリフラビン−HCl及びカサミノ酸の両者は、図5に示すよう
にELISAの感度を増大させる大きな効果を有している。l0mg/Lのアク
リフラビン−HClは検出限界を、10 ’ 〜l O’ E、 coli 0
157:H7/m lから10’セル/mlへと低下させる。低濃度のアクリフ
ラビン−HClは検出限界を低下させる十分な効果は有していなかった。o 5
又は1%のカサミノ酸は同じELTSAの感度を増大させるが、アクリフラビン
はどではなかった。しかし、mTSBへのカサミノ酸の添加は、E、 coli
0157:H7の成長速度を増大させるという特別な利点かあった。
他の数種類の基質あるいは成長の要素についても、ELISAの感度を増大させ
る効果について評価された。これらはTSB内での成長や抗生物媒体No、3
(PAB)対mTSBを含んでいた。mTSBはE、 coli 0157:H
7の成長及びELISAの最高の感度の両者にとって最良であった。1%のグル
コース、ラムノース、マンノース、ラクトース又はサクロースをmTSBに加え
ることでは、ELISAの感度を増大させる効果は少なかった。同じように、羊
の赤血球(0,5〜5%)、FeCl3 (5〜50mg/L)、Fe5O4(
0,5g/L)又はFe (NH4)2 (SO4)2 (50m g / L
)のような鉄分の補足を添加することは、検出できるような効果はなかった。
食品中のE、 coli 0157:H7の低レベルを検出する富化サンドイッ
チELISA法の効果を決定するための研究が、牛挽き肉と多様な乳製品内の0
.2〜0.9セル/グラムの接種により個々に試験されたE、 coli 01
57:H7の5つの異なった菌株について行われた。以下の表4及び5にその結
果を示す。
接種−回復の研究により、牛挽き肉(表4)又は乳製品(表5)の1グラム当た
り0.2から0.9の間のE、 coli 0157・H7を検出できる方法が
明らかになった。これらの研究に使用された全ての製品は、自然に発生するE、
coli 0157:H7は育していなかった。
接種前の牛挽き肉試料の好気性菌プレートカウントは、1.1XIO” 〜l
Xl 0’ CFU/gの範囲であった。0.2〜0.9CFU/gのレベルの
接種を受けたE、 coli 0157:H7の菌株の全ては10個の牛挽き肉
富化試料のうち9個に検出された。一つの牛挽き肉試料において5つの接種菌株
のうち一つだけが検出されたが、この牛肉は異常に高いAPC(IXIO” C
FU/g)を有していた。
このレベルのAPCを有した牛挽き肉は通常は腐敗している。この試料において
は多数の腐敗バクテリアか富化の際にE、 coli 0+57H7の成長を抑
制したと考えられる。
牛肉又は乳製品内に接種された0、2〜0.9CFU/gのE。
coli 0157:H7は、富化培養内で3.8XIO’〜3.7XIO’に
成長した。富化媒体dmTSB−CAの初期pH値は、dmTSB−CA−bu
f(乳製品に使用された)の値が7.4であったのに対し、70であった。富化
後にはpH値は6.5〜68の範囲となった。
E、 coli 0+57:H7はライスコンシン州マディソン地区の生鮮食料
品床からの107の牛挽き肉試料の内3つから検出された。富化前のこれらの試
料のAPCは4.5XIO’〜7.8X107CFU/gの範囲であった。陽性
試料の富化培養内のE、 coli 0157:H7の数は2.5XIO’〜8
゜6x10’ CFU/mlであり、陽性富化培養のELISAの0D41゜は
0.53から1.10であった。ELISAによりE、 coli 0157:
H7−陽性の宵機体は、培養法により3つの試料の全てから分離された。MPN
決定により3つの試料内のE、 coli 0157:H7の分布数は0.4〜
1.5セル/gであることか明らかになった。
69の異なった農場からの115の生牛乳試料の調査により、13の試料中にE
、 coli 0157:H7が検出され、11の試料が培養で確認れたことか
明らかになった。これらの11の試料は7の異なった農場からのものであった。
富化前の全ての牛乳試料のA、 P Cは、2.8x1.O!〜2.6XIO’
CFU/mlの範囲であった。E。
coli 0157:H7−陽性富化培養のELISAのOD、、oは0.55
から1.08であった。
本発明はここに開示された特定の試薬、手順又は方法に限定されないことは理解
される。代わりに本発明は、以下の請求範囲ににより規定されるものとして、全
てのそのような変更された型を包含する。
F!GLIRE 1
FIGURE 2
toglo H,coLi 0157:H7/m1FTGURE 5
要約書
腸内出血性大腸菌0157:H7及び026 :HI lの特効のある単クロー
ン抗体は大腸菌0157:H7の菌株でBALBl’cマウスを免疫化すること
で発生される。単クローン抗体は、略5000〜6000ダルトンの分子重量を
有する酵素リンク免疫吸収検定で腸内出血性大腸菌0157:F(7及び026
:HI 1の菌株の外膜プロティンに強く反応する。これらの有機体を検出す
る素速い、感度的検定も示される。
国際調査報告
PrT、/U!+941053]O
Attachment tc+ PCT/ISA/2]0. par4 II。
丁1. Fields 5earched/5earch termg:ali
026・)Il+
mar+uclonh1
0】57
Claims (19)
- 1.E.coli0157:H7及びE.coli026:H11に特有である 単クローン抗体。
- 2.明細書の表2にリストされたE.co1i0157:H7及びE.coli 026:H11の菌称に結合することを特徴とする請求項1記載の単口ーン抗体 。
- 3.ハイブリドマATCCHB10452から製法される請求項1記載の単クロ ーン抗体。
- 4.E.coli0157:H7又はE.coli026:H11細胞から採取 でき、ハイブリドマATCCHB10452から製法された単クローン抗体と特 に反応しうる外膜ブロテインに特有である単クローン抗体。
- 5.サブクラスイムノグロブリンG2aの要素であることを特徴とする請求項4 記載の単クローン抗体。
- 6.カッパ光チェーンを有することを特徴とする請求項4記載の単クローン抗体 。
- 7.ハイブリドマATCCHB10452。
- 8.単クローン抗体をE.coli0157:H7及びE.coli026:H 11に対して発生し、(a)単クローン抗体をE.coli0157:H7及び E.coli026:H11に対して発生しうる細胞を融合して形成されるハイ ブリドマと、 (b)ミエローマ細胞からなる連続細胞系。
- 9.1つ又はそれ以上の容器内に請求項1の単クローン抗体からなるE.col i0157:H7及びE.coli026:H11の存在を検定する診断キット 及びその使用法。
- 10.単クローン抗体はラベルに共役する請求項9記載の診断キット。
- 11.ラベルは酸素、放射線同位元素、特定ラベル、染色体遺伝子、発光体、化 学発光体、補酸素、遊離基及び、バクテリオファージからなる群から選択される 請求項10記載の診断キット。
- 12.単クローン抗体は保持体に結合される請求項9記載の診断キット。
- 13.腸出血性E.coli0157:H7及び/又は026:H11を他のE .coli及び請求項1の単クローン抗体からなる腸出血性E.coli015 7:H7及びE.coli026:H11に独特の外膜ブロテイン(OMP)を 基にした腸病原から区別する診断キット及びその使用法。
- 14.単クローン抗体はハイブリドマATCCHB10452で製造される請求 項13記載の診断キット。
- 15.E.coii0157:H7又はE.coli026:H11の検出用免 疫特定方法であって、(a)免疫複合体を形成するようE.coli0157: H7及びE.coli026:H11に特有である単クローン抗体と、E.co li0157:H7及びE.coli026:H11を含む疑いある試料に接触 し、 (b)試料でE.coli0157:H7又はE.coli026:H11を検 出する為複合体の存在を決めることからなる免疫検定方法。
- 16.単クローン抗体はハイブリドマATCCHB10452から製法される請 求項15記載の方法。
- 17.単クローン抗体はラベルに共役である請求項15記載の方法。
- 18.E.coli0157:H7又はE.coli026:H11の外膜内に あり、E.coli0157:H7及びE.coli026:H11に単クロー ン抗体を特に反応しうる実質的に純粋ブロテインからなる抗体検定用生試薬。
- 19.E.coli0157:H7又はE.coli026:H11から採取可 能で、ハイブリドマATCCHB10452から製法された単クローン抗体と特 に反応しうる実質的に純粋外腹ブロテイン。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US07/559,867 US5168063A (en) | 1990-07-27 | 1990-07-27 | Monoclonal antibody to enterohemorrhagic escherichia coli 0157:h7 and 026:h11 |
US559,867 | 1990-07-27 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH05502588A true JPH05502588A (ja) | 1993-05-13 |
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ID=24235380
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