JPH05502588A

JPH05502588A - 腸出血性大腸菌０１５７：ｈ７及び０２６：ｈ１１への単クローン抗体及びその検出方法

Info

Publication number: JPH05502588A
Application number: JP3513388A
Authority: JP
Inventors: ドイル，マイケル　ピー; パダイ，ニーシャ
Original assignee: ウィスコンシン　アルムニ　リサーチ　ファウンデイション
Priority date: 1990-07-27
Filing date: 1991-07-26
Publication date: 1993-05-13
Also published as: ATE161288T1; AU652172B2; AU8306291A; US5354661A; DE69128463D1; EP0494293A4; DE69128463T2; EP0494293A1; US5168063A; KR0165691B1; CA2066777A1; CA2066777C; WO1992002820A1; EP0494293B1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】Ｉｉｉ呂血住血性大腸菌０１５７　Ｈ７及び０２６　：　Ｈｌ　！への単クローン抗体本発明は一般的に単クローン抗体を発生するよう開発されたバイブＩＪ　トマ細胞系に、特に単クローン抗体を腸内出血性大腸菌０１５７：Ｈ７（Ｅ、ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈ７）及び大腸菌０２６　：Ｈｌｌ（Ｅ、ｃｏｌｉ　０２６：Ｈｌｌ）に発生する細胞系に係る。

従来技術Ｅ、ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈ７は、両方か特定ノファーストフートチェーンからの未調理の牛肉を食へたのに関連した出血性大腸炎の２つの地理的に離れた発生の原因として生体が診断された時、１９８２年アメリカ合衆国において重要な人間の病原体として初めに認識されたぐりレイ、リーダブリュ他、１９８３年、医療のニューイングランドジャーナル３０８巻、１２号、６８１〜６８５頁の「めずらしい大腸菌と関連した出血性大腸菌」）。異常な胃腸病のこれらの大発生は激しい腹けいれん及び熱かないか又は低熱を育するひとい出血性下痢の急な発病を特徴とする。がかる病気はＥ、ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈ７及び又はＥ、ｃｏｌｉ　０２６：Ｈｌｌに関連する（レーヒン、エム、エム１９８７年、伝染病のジャーナル、１５５巻、３７７−３８９頁の「下痢を生しる大腸菌　腸毒素原性、腸病原性、腸侵襲性、腸出血性及び膠着性、」　、レービン、エム、エム、池、１９８７年、伝染病のジャーナル、１５６巻、１７５〜１８２頁のｒｏ　１５７・Ｈ７の腸内出血性大腸菌及び出血性大腸炎及び溶血性尿素病症候群を生しる他の抗原型を識別するＤＮＡプローブｊ）。これらのバクテリアは腸出血性Ｅ、ｃｏｌｉと呼ばれる。

Ｅ、ｃｏｌｉ生体は、ヘロトキソンとして公知の、人間を含むいくつかの哺乳動物に多くの腸内出血を生じる毒素を発生する。Ｅ。

ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈ７病原菌が関連する病気のスペクトルはアシンブトマチイック病原菌から出血性でない下痢、出血性大腸炎、溶血性尿素病症候群及び死におよぶ（ライアン、キャロリン、エイ他、１９８６年、伝染病のジャーナル、１５４巻、４号、６３１頁〜６３８頁の「介護ホームにおける出血性大腸菌０１５７：Ｈ７下痢：医療的、疫学的及び病理的調査結果」）。溶血性尿毒症候群は上部気管、胃又は腸に徴候が現われた後、溶血性貧血、血小板減少症及び急性腎障害の急発病と決められる。溶血性尿素病症候群は一般的に多数の異なる、誘発的事象及び病原性機構の最終結果である。

病体は肉及びかきん類及び非殺菌ミルクから分離された。種々のレポートは、食物特に動物性の食物がＥ、ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈ７病原菌の重要な源であることを示す（ドイル、マイケル、ビー及びジーン、エル、ジョエニイ、１９８７年、応用及び環境微生物学、５２巻、１０号、２３９４〜２３９６頁の「小売新鮮向及びかきん類からの大腸菌０１５７：Ｈ７の分離Ｊ）。

出血性大腸炎のほとんどの大発生が食物関連なので、Ｅ、ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈ７及びＥ、ｃｏｌｉ　０２６：Ｈｌｌを検出する素速い、感度的特別検定の必要がある。現在、食物の病原を検出する有用な方法は時間労費か大きいか、あるいは専用的うではない。

例えば、ウィスコンシン州、マディソン、フードリサーチ　インスティチュートはＥ、ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈ７病原の検出の為多くの代理店により最近用いられた。しかし、フードリサーチ　インスティチュートにより用いられた方法はドイル及びショエニイ（上記）に示す複雑な多くの日の処理を含む。ドイル及びショエニイは種々の肉を試験し、試験した肉の約Ｉ％又は２％の生体を見つけた。

生体はふん、生乳、等から分離されつる。実験的に感染されたニワトリの卵に表面が汚染される。

生体を検定する為、第１の段階は食物試料の生体を富化することである。食物試料は生体の小さい量を存しうるので試料は他の形のバクテリアを再圧縮及び所望の生体の数を増すべき状態にするよう富化媒体に置かれる。富化媒体はＥ、ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈ７を含むグラムの陰性菌か選択できる選択剤を有する。媒体は３７°Ｃで終夜培養される。

定温培養された試料は恐水病膜フィルタ紙（ＨＧＭＦ）を貫通させる。フィルタ紙は約１４００〜１６００小方形に細分割される。

ろうはフィルタを圧切るよう用いられる。ろうはコロニーを分離する。フィルタは次に除去され、ニトロセルロース紙の一部に置かれる。ニトロセルロース紙は富化媒体内の々ｕく同じ選択剤を含む寒天か媒体のいくらかに！かれる。この板は次に３７°Ｃで終夜定温培養される。これはコロニーかフィルタ紙上て生成するのを可能にする。

それらが生成する如く、それらはへドロキシンを作る。毒素はニトロセルロース紙で集められる。フィルタ紙は次に除去され、セーブされる。ニトロセルロース紙は除去され、うさぎで生成される抗体を毒素に用いるイノムプロット方法で開発される。じみが生成された後、点は毒素が存在する紙上に観測される。ＨＧＭＦ上の点はＨＧＭＦ上の細菌コロニーと整合し、整合コロニーは生化学及び他のテストにより目ｆｆＥ、ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈ７として確認される。

概要にて、生体は選択富化媒体での食物試料で生成される。生体は一連の方法で分離される。隔離集口は、拡散する毒素を生成するよう増え、下に置かれるフィルタ紙で集められる。毒素は試薬として抗体を毒素に用いて検出される。グリッドを育する上に置かれるフィルタ紙上のｍ菌コロニーは毒素を存する点を示すフィルタ紙と整合される。毒素を生じたコロニーは標準分類方法で識別される。

方法が低レベルの生体で接種された食物試料からＥ、ｃｏｌｉ０１５７：Ｈ７を効果的に分離するけれど、方法は個人の時間に必要な複雑及び広さの為にルーチンテストには順しない。

福利厚生カナダで開発されたような他のテストが開発された。カナダテストは単コロニー抗体をＥ、ｃｏｌｉ　０１５７に用いるが、サルモネラ群Ｎ及びＨ７ではない重要でないＥ、ｃｏｌｉ　０１５７菌株のような他の腸と交差反応するので特有のテストではない。

（トッド、イージーディ他、１９８８年、応用及び環境微生物学、５４巻、２５３６〜２５４０頁の「食物における大腸菌０１５７・Ｈ７の識別及び列挙用急速恐水病膜フィルター酵素ラベル抗体方法Ｊ）。

ベロトキシン（レービン、エム、エム、他、上記、１９８９年）を符号化する結合ＤＮＡを基とする遺伝子プローブベース検定か開発された。従って、全てのベロトキシン発生Ｅ、ｃｏｌｉは単なる腸出血性Ｅ、ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈ７及びＥ、ｃｏｌｉ　０２６　：ＨＩ　Ｉよりむしろこの方法で検出される。

本発明の目的は腸出血性Ｅ、ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈ７及びＥｃｏｌｉ　０２６・Ｈｌｌに対して非常に特別である単クローン抗体を発生することである。

本発明の更なる池の目的は、方法か使用かできる期間、例えば１日以内に短縮されるＥ、ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈ７及びＥ、ｃｏｌｌ　０２６・Ｈｌｌを検定するよう単クローン抗体を用いるテストを開発することである。

本発明の更なる他の目的は、食物及び便の試料におけるＥ、ｃ。

Ｉｉ　０１５７：Ｈ７及びＥ、ｃｏｌｉ　０２６：Ｈｌｌの色検出用免疫検定を開発することである。

本発明の他の目的は、食物及び他の試料からＥ、ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈ７及びＥ、ｃｏｌｉ　０２６・Ｈｌｌを分離及び試料ての病原の有症率を決定する方法を開発することである。

本発明の他の目的は腸出血性Ｅ、ｃｏｌｉの菌株を識別するマーカーとして腸出血性Ｅ、ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈ７及びＥ、Ｃ０Ｉｉ　０２６：Ｈｌｌの特有外膜プロティンを用いることである。このマーカーに特有の単クローン抗体を基にしたＥＬＩＳＡを含む検定は食物、環境及び医療試料から分離した腸出血性Ｅ、ｃｏｌｉを検出及び圧側するよう用いられる。

本発明の更なる目的は例えば腸出血性Ｅ、ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈ７及びＥ、ｃｏｌｉ　０２６：Ｈｌｌの存在を検定するテストキッドで役立つ抗体検定用生試薬の合成を提供することである。

本発明は、腸出血性Ｅ、ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈ７及びＥ、ｃ。

Ｉｉ　０２６：Ｈｌｌに特有の単クローン抗体がマウスミエローマラインからの細胞及びＥ、ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈ７の「粗Ｊ菌株で前に免疫化されたマウスからの肺臓細胞の融合で形成されるハイブリドマで発生されることを要約する。

この粗菌株は、その細胞面上に０１５７抗原の発現を含む滑らかりボ多糖か欠乏するよう変更される。単クローン抗体は、略５０００〜６０００ダルトンの分子重量を有するプロティンと反応することを特徴とする。このプロティンは腸出血性Ｅ、ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈ７及びＥ、ｃｏｌｉ０２６・Ｈｌｌに対する明らかな特有を有する。単クローン抗体は更に、サブクラス免疫グロブリン０２　ｍの要素であり、カッパ光チェーンを有することを特徴とする。

本発明は、Ｅ、ｃｏｌｉ　０１５７の入った基質ユニットに抗体を発生するよう吸着基質ユニットにＥ、ｃｏｌｉ　０１５７〜多クロ一ン抗体を結合し、反応か知られていない試料を発生するようテスト材にあるかかるＥ、ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈ７生体に抗体を結合するよう抗体Ｅ、ｃｏｌｉ　０１５７の入った基質ユニットに公知の量のテスト材を露比し、反応制御試料を生成するようＥ、ｃ。

１ｉ　０１５７の入った基質ユニットへ抗体への公知の量のＥ、ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈ７を有するＥ、ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈ７病原の選択量の標準準備を露出し、結合Ｅ、ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈ７と反応するよう反応した公知でない、制御試料を単クローン抗体（４Ｅ８Ｃ１２）からＥ、ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈ７に露出し、Ｅ。

ｃｏｌｉ　０１５７の入った基質ユニットへ抗体の結合Ｅ、ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈ７と反応しない単クローン抗体を除去し、Ｅ、ｃｏｌｉ　０１５７の入った基質ユニットへｔｇｌ及び第２の抗体の反応単クローン抗体の存在を比較的に、量的に検定する段階からなるテスト試料でのＥ、ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈ７の存在を検定する方法に係る。

本発明は単クローン抗体を腸出血性Ｅ、ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈ７及びＥ、’ｃｏｌｉ　０２６：Ｈｌｌに対して発生し、抗体をミエローマ細胞を存する腸出血性Ｅ、ｃ○Ｉｔ　０１５７・Ｈ７及びＥｃｏｌｉ　０２６：Ｈｌｌに対して発生しうる細胞を融合することで形成されるハイブリドマを増殖し、ハイブリドマで発生される抗体を収集することからなる方法に係る。

本発明は腸出血性Ｅ、ｃｏｌｊ　０１５７・Ｈ７及びＥ、ｃｏｌｉ　０２６：Ｈｌｌに特有の単クローン抗体からなる腸出血性Ｅｃｏｌｉ　０１５７：Ｈ７及び／又はＥ、ｃｏｌｉ　０２６：Ｈｌｌの存在を検定する医療キット及びその使用に係る。

本発明は約５０００〜６０００ダルトンの分子重量を有する実質的な純プロティンからなる抗体検定用生試薬に係る。プロティンはＥ、ｃｏｌｉ　０＋５７：Ｈ７又はＥ、ｃｏｌｉ　０２６：Ｈｌｌの外膜て見つかり、Ｅ、ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈ７及びＥ、ｃｏｌｉ　０２６：Ｈｌｌに単クローン抗体で特に反応できる。

本発明は約５０００〜６０００ダルトンの分子重量を有するＥ。

ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈ７又はＥ、ｃｏｌｉ　０２６の外膜て見つかる実質的な純プロティンに係り、Ｅ、ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈ７及びＥ、ｃｏｌｉ　０２６・Ｈｌｌへ単クローン抗体で特に反応できる。

その高特異性の為、単クローン抗体は食物及び医療試料における腸出血性Ｅ、ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈ７及び／又はＥ、ｃｏｌｉ０２６　：ＨＩ　Ｉの色検出用有効試薬である。更にテスト方法は一日又はそれ以内に減少さるべきである。テスト方法は、先ず選択生成媒体で生体を生成し、例えば酸素リンク免疫吸収検定（下記エリザＥＬＩＳＡｓ）及び他の免疫検定でその存在のテストを含む。

本発明は食物のような基質におけるＥ、ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈ７を検出する特有、感度方法に係る。方法は富化培養を形成するようアクリフラビン（又　スペル　アクリフラビン）を含む選択富化媒体に基質の富化を含む。富化培養はＥＬ　ＩＳＡ検定のような検定に用いられる。高い特有及び感度であるのに加え、方法は実行するのに素速く、容易であり、ルーテン微生物テストを実行する実験室での使用に順する。基質におけるＥ、ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈ７の仮定識別は２０時間以内になされうる。病原は仮定検出の後、２日以内に分離され、Ｅ、ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈ７として確認されうる。

本発明の他の目的及び利点は本発明の望ましい実施例を示す下記の詳細な説明及び図から明らかである。

図１の（Ａ）はＥ、ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈ７菌株９３２（レーン３）、Ｅ、ｃｏｌｉ　ＨＡＴ　（レーン４）、Ｅ、ｃｏｌｉ　０２６　：Ｈｌ　１菌株９４− ３８１（レーン５）、Ｅ、ｃｏｌｉ　０２６　：Ｈｌ　１菌株８９−３２６、Ｅ、ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈ１６（レーン７）及びＥ、ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈ４５（レーン８）の外膜プロティン（ＯＭＰ）のトリシン−３ＤＳ−ＰＡＧＥ形状を示す図である。ＯＭＦの５μｇ試料は各レーン当たりに用いられる。

（左に千で示される）低分子重量標準はレーンｌ及び２で示される。

ゲル化は銀着色される。

図１の（Ｂ）はＭＡ６　４Ｅ８Ｃ１２で処理されたウェスタンプロット法の５ＤＳ−ＰＡＧＥ分離Ｏ分離０示Ｐ図である。レーン番号は図１の（Ａ）に示す○ＭＰ準備に対応する。

図２は例２に示す如＜Ｅ、ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈ７、菌株９３２を検出する直ＥＬＩＳＡにおいて単クローン抗体４Ｅ８Ｃ１２の感度を示すグラフである。

図３は攪拌を存するｍＴＳＢにおいて成長した純粋培養のＥ、ｃｏＪｉ　０１５７：Ｈ７７菌９３２を検出するサンドイッチＥＬＩＳＡの感度を示すグラフである。

図４はサンドイッチＥＬＩＳＡによりＥ、ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈ７７菌９３２の検出の成長温度の効果を示すグラフである。細胞は攪拌存り又は無しのｍＴＳＢで成長される。凡例：ム＝攪拌を有する３７°Ｃ１△＝攪拌を有する３０’Ｃ：■＝３７°Ｃで静止：口＝３０℃で静止。

図５はＥＬＩＳＡにより決められる如＜Ｍａｂ４ＥＳＣＩ２と反応するＥ、ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈ７抗原の発現の強化の濃度媒体のアクリフラビンＨＣＬ　（Ｉ　Ｏｍｇ／Ｌ）及び／又はカサミノ酸の効果を示すグラフである。Ｅ、ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈ７抗原９３２の培養は攪拌により３７°Ｃで成長される。凡例　○＝ｍＴＳＢ；■＝ＭＴＳＢ＋カサミノ酸、ローｍＴＳＢ＋アクリフラビン− ＨＣＬ：・＝ｍＴＳＢ＋アクリフラビンーＨＣＬ十カサミノ酸。

腸出血性Ｅ、ｃｏｌｉ　０１５７・Ｈｌ及びＥ、ｃｏｌｉ　０２６　：Ｈｌ　１は重要な人間病原として識別された。それらは人間を含むいくつかの哨乳類に大きな腸出血を生じる１つ又はそれ以上の毒素（ベロトキシン）を生成する。それは牛乳、生スーパマーケット内等で見つかり、便汚染で思うに導かれる。ライアン他（上記、１９８８年）に示す如＜Ｅ、ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈｌのいくつかの特徴と下記の如くである。Ｅ、ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈｌは熱安定又は熱不安定性腸毒素を発生しない。それは侵襲的てなく、ヒータ細胞に付着しない。それはツガ毒素と同様になる高レベルのベロ細胞毒を発生する。Ｅ、ｃｏｌｉはバドヒー、ピッカス　ビー　他、１９８９年、医学微生物のジャーナル、３０巻、２１９〜２２６頁の「抗原型０１５７：Ｈｌの大腸菌からのへドロキノン１及び２への単クローン抗体の製造及び特＠Ｊに示す々Ｄ＜１つ又はそれ以上の異なるベロ細胞毒の発生か示される。

Ｅ、ｃｏｌｉ　０２６：Ｈｌｌは、両方かベロトキシンを発生し、溶血性尿毒症候群及び出血性大腸炎を生じる腸出血性Ｅ、ｃｏ１１であるＥ、ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈｌに同様である（ポツプ、シー、エイ他、１９８７年、医療微生物のジャーナル、２５巻、１４８６〜１４８９頁の出血性大腸炎と関連した異常なベロトキンン発生犬腸菌；カーユリ、エム、エイ他、１９８３年、ランヒツト、ｉ巻、６１９〜６２０頁の「便器で大腸菌を発生する便細胞毒及び細胞毒に関連した溶血性尿毒症候群の散発例）　、シービン、エム、エム、上記、１９８７年）。

一般概説において、Ｅ、ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈｌ及びＥ、ｃ。

１ｉ　０２６：Ｈｌｌか特有である４Ｅ８Ｃ１２で示される単クローン抗体は０１５７抗原の不足のＥ、ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈｌの「粗」菌株でＢＡＬＢｌ　ｃマウスを免疫して生成される。そう免疫されたマウスからの肺臓細胞はマウスミエローマ細胞で融合され、融合は公知の方法によりポリエチレングリコールの処理かなされる。

得られるハイブリドマは培養され、抗体活動が選択される。Ｅ、ｃｏｌｉ　０１５７：８７及びＥ、ｃｏｌｉ　０２６：Ｈｌｌに特有の抗体を生成する。細胞は公知の技術の方法で、ＥＬＴＳＡにより検出される。抗体は従来の方法で腹水液から浄化される。そう生成され、選択されたクローンされた細胞系は従来の細胞培養技術により保全される。

この方法で発生したハイブリドマは１９９０年５月ｌＯ日のアメリカンタイプ培養コレクシロンで析出され名称ＨＢ　１０４５２が割当てられる。この特有のハイブリドマ及びそれにより発生された抗体は下記に示されるハイブリドマ及び単クローン抗体であり、さもなければ他で述べられる。ハイブリドマの製造の詳細説明は下記に含まれる。ハイブリドマの更なる参照は下記の如くである　ＡＴＣＣＨＢ　１０４８２゜この析出は特許の方法及びその下の規制（ブタベスト条約）の目的用微生体の析出の国際識別のブタベスト条約を用いて作られる。

これは析出の日付から３０年の生存できる培養の維持を確実にする。

生体はブタベスト条約の用路下のＡＴＣＣで入手でき、適用者とＡＴＣＣの間の合意を受けなければならなく、適用米国特許の発行に又はかかる米国又は外国の特許適用の公共への公開の際公共に培養の後代の永久及び制限なしに入手できるのを確実にし、どれか初めに生じても、３５ＵＳＣｆｆ１２２によりそれに題さるべき特許及び商標の米国委員に及び特に８８０　ＱＣ；　６３８を参照して３７ＣＦＲ，Ｉ’Ｊ’１．１４を含むそれに従かう委員ルールで決定されたものへの後代の入手出来るのを確実にする。析出の培養が適切な状態下で栽培される時死ぬ又は失われる又は破壊される場合、同じ培養の生存できる試料の通告て素速く置換えられることを本願の譲受人は合意する。析出の菌株の入手はその特許法によりいかなる政府の権力下で認められた権利に違反して本発明を実行するライセンスとして解釈されない。

Ｅ、ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈｌに反応するが、体細胞０１５７抗原に結合し、血清グループ０１５７に属する全てのＥ、ｃｏｌｉと反応する単クローン流体を開示する以前に公報された参考に反して、（べＩＪ−、エム、ビ仏他、１９８８年、医療微生物のジャーナル、２７巻１９７３〜１９７８頁の［単クローン抗体を用いることで大腸菌抗原型　０１５７菌株の識別Ｊ）本発明の単クローン抗体は０１５７抗原に反応せず、Ｅ、ｃｏｌｉの他の抗原型を除いてＥ、ｃｏｌｉ　０１５７・Ｈｌに非常に特有である。他の抗原型は、Ｅ。

ｃｏｌｉ　０２６・Ｈｌｌである。ここで用いられる如く、ｒＥ。

ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈｌｌ：及びＥ、ｃｏｌｉ　０２６：Ｈｌｌに特有」なフレーズは本発明の単クローン抗体が例１の下記の表２にリストされる。Ｅ、ｃｏｌｉの菌株と反応しないことを意味することを目的とする。

抗体はＥＬＩＳＡ及び種々の腸のイムノプロット法て特異性がテストされる。これらの方法により、単クローン抗体かＥ、ｃｏｌｉＯ１５７・Ｈｌの３６菌株及びＥ、ｃｏｌｔ　０２６：Ｈｌｌの５菌株の夫々で直ＥＬＩＳＡにより強い反応を形成することが決められる。しかし、例えば、サルモネラ、エルジニア　イントロコリティ力（ｅｎｔｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）、赤痢菌病、プロテウス、クレブシェラ属、キャンビロバクタ　ジエジュ一二（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｊｅｊｕｎｉ）、セラティア５ｅｒｒａｔ　ｉａ、エーロモナス属　ハイドロフイラ（ｈｙｄｒｏｐｈｉ　ｌａ）、ノトロバクター菌（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）　、腸内細菌　／％フェア属、エンエリヒア属　ハーマニイ（ｈｅｒｍａＨ）及び（Ｈｌではないか抗原型１０５７の菌株を含む）抗原型０１５７：Ｈｌ及び０２６・Ｈ１ｌ以外のＥ、ｃｏｌｉの全ての他の菌株のような他の腸の菌株と交差反応しない。

Ｅ、ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈｌ及び０２６：Ｈｌｌへの単クローン抗体の研究は単クローン抗体（Ｍａｂ）が下記の特徴を育することを示す：（１１それはサブクラスＩｇＧｘ−の要素であり：（２）それはカッツク光チェーンを育し：（３）それはウェスタンプロット分析が続く異なる抗原室のＥ、ｃｏｌｉの外膜プロティンのＳＤＳポリアクリルアシドゲル電気流動法で決められる如く略５０００〜６０００ダルトンの分子重量を育する腸出血性Ｅ、ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈｌ及びＥ、ｃｏｌｉ　０２６：Ｈｌｌの外膜プロティンと特に反応する。

初めに、腸出血性Ｅ、ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈｌ及びＥ、ｃｏｌｉ　０２６：Ｈｌｌの外膜プロティンは約Ｅ３０ＱＯダルトンの分子重量を育すると考えられる。分子重量決定はプロティンを分解するよう１５％ドデシル硫酸ナトリウムをポリアクリルアシドゲル電気流動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）装置に用いることで作られる。プロティンはダブレット、即ち２つの近接関係のバンドになる。ダブレットは略１３０００ダルトンの分子重量を有する微生物の外膜の１つのプロティンを表わすと考えられる。

上記の装置は低分子重量プロティンを分解する効果かない確証を示す（パドヒー、エム、ビイ、及びエム、ビイ、ドイル、１９９１年１月、医療微生物のジャーナル、２９ｆｌｌ：９９〜１０３）。最も外膜プロティンは略５０００〜６０００ダルトンの明白な分子重量を存するらしい。

Ｍａｂ４Ｅ８ＣＩ２と反応するＥ、ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈ７及び０２６　：Ｈｌ　ｌの細胞成分はウェスタンイノムブロソト分析が続くトリノン−５ＤＳ−ＰＡＧＥ　（シャガー、エイチ及びシイ、ジャボウ、肛生化学、１６６：３６８〜３７９）て決定される。

Ｅ、ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈ７菌株９３２、Ｅ、ｃｏｌｉＨＡｌ、Ｅ、ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈｌ６、Ｅ、ｃｏｌｉ　０１５７Ｈ４５及びＥ、ｃｏｌｉ　０２６：Ｈｌｌからの外膜プロティン（ＯＭＰ）は、高溶解を有する低分子重量プロティンを分離する必要性の為特有トリノン−５ＤＳ−ＰＡＣ；Ｅ方法で分離される。参照は図１の（Ａ）でなされる。第２のゲルから分離したプロティンはポリビニールディフルオライド膜に送られ、Ｍａｂ　４Ｅ８Ｃ１２により認識される抗原の位置はウェスタンプロット分析で決定される。Ｍａｂは図１の（Ｂ）に示す如＜Ｅ、ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈ７菌株９３２、Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｆ（ＡＩ及びＥ、ｃｏｌｉ　０２６：Ｈｌｌの２つの５０００〜６０００分子重量ＯＭＰと反応する。交差反応はＥ、ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈｌ６又はＥ、ｃｏｌｉ　０１４５：Ｈ４５のいずれても観測されない。

分子重量の決定はバンドのアミノ酸組成の追加テストで確証される。浄化プロティンと同様バンド両方のアミノ酸組成は表１に示す如く単にあるわずかな変化でほとんど等しい。

表１目標外膜プロティンのアミノ酸組成５ｏアミノ酸をベースの残留の数アミノ酸　丁バンド　上バンドアスパラギシ酸　４５グルタミン酸　７６加水分解して、あるアミノ酸が毎回異なる数の残留を生しる可変範囲に酸化されるので、あるパーセントの矛盾か予想される。しかし、チロシン、ファニルアランン、ヒスチジン、リジン及びアルギニンのような安定アミノ酸の数が全ての３つのプロティンで一定である。

従って、目標外膜プロティンが略５０００〜６０００の明白な分子重量を有する少なくとも１つのプロティンであることか考えられる。外膜プロティンのアミノ酸組成を除いて、外膜プロティンか略５０００〜６０００の分子重量を有する１つのプロティンであることを支持する他の確証は共通等電点；基クローン抗体４ＥＳＣ１２で認識されるプロティンバンドの両方の共通エピトープを含む。

ＥＬＩＳＡはテスト材の試料の抗原の存在を検出する従来の方法である。本発明のサンドイッチＥＬＴＳＡはテスト材の試料において腸比血性Ｅ、ｃｏｊｉ　０１５７：Ｈ７の存在を決定するよう用いられ、下記の段階を含む。第１に、Ｅ、ｃｏｌｉ　０１５７への公知の抗体は適切な吸収基質に結合される。望ましくは、９６ウエル　ポリスチレン培養板（コスタ−、ケリブリノチ、マサチューセット、モデル番号　３５’９６）のようなプラスチック培養板か用いられる。Ｅ、ｃｏｌｉ　０１５７への抗体の溶体化はウェルの夫々に置かれ、Ｅ、ｃｏｌｉ　０１５７への抗体がウェルの面に吸収されるような状態下のままでいるのを可能にする。吸収されない抗体溶液は洗浄され、抗体を「吸着基質ユニット」の如く示されるウェルの吸収壁に結合されるＥ、ｃｏｌｆ　０１５７にする。それに吸収されたＥ、ｃｏｌｉ　０１５７への抗体で、それらはｒＥ、ｃｏｌｉ　０１５７の入った基質ユニットへの抗体」として示される。Ｅ、ｃｏｌｉ　０１５７の入った基質ユニットへの抗体は非特育結合部位を阻止するよう脱脂粉乳のような適切阻止試薬で処理される。適切な定温培養の後、この試薬は除去される。

次に、公知の量のテスト材は適切な期間Ｅ、ｃｏｌｉ　０１５７の入った基質ユニットに抗体を露出され、洗浄で除去される。テスト材のかかるＥ、ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈ７は抗体をＥ、ｃｏｌｉの入った基質ユニットに結合する。

同様に、Ｅ、ｃｏｌｉ　０＋５７：８７の標準準備は制御として役立つようＥ、ｃｏｌｉ　０１５７の入った基質ユニットへの他のセントの抗体に露出される。

上記に示される基クローン抗体はかかる結合Ｅ、ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈ７と結合するようＥ、ｃｏｌｉ　０１５７の入った基質ユニットへの抗体に加えられる。適切な定温培養の後、結合してない基クローン抗体は洗浄で除去される。

テスト試料と反応したＥ、ｃｏｌｉ　０＋５７の入った基質ユニット又はＥ、ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈ７への抗体は基クローン抗体の存在が検定される。

望ましくは、これはテスト試料に反応したＥ、ｃｏｌｉ　０１５７の入った基質ユニット又はＥ、ｃｏｌｔ　０１５７：Ｈ７及びマーカー結合抗体をかかる単コロニー抗体に結合することを可能にするようマーカー結合抗マウス抗体へのそこへの基クローン抗体へ抗体を露出することてなされる。非結合マーカー結合抗体は除去され、Ｅ、ｃｏｌｉ　０１５７の入った基質ユニットへの抗体に残るマーカーの量が測定される。マーカーは選択試薬、蛍光材、放射線材又は当業者になじみの他のマーカーのその効果で酵素測定されつる。単クローン抗体自体がマーカーで直接に結合され、そこでマーカー結合抗マウス抗体の反応の段階が無視されうることは明白である。

基クローン抗体と又他の従来のＥＬＩＳＡで用いられる。例えばテスト材の試料は吸着基質に結合され、上記記述の基クローン抗体に露出される。抗体はテスト材においであるかかるＥ、ｃｏｌｉ０１５７：Ｈ７又はＥ、ｃｏｌｉ　０２６：Ｈｌｌに結合する。基クローン抗体の結合されてない部分が除去される。次に、上記記述に比較できる検査は結合重クローン抗体の存在の為なされる。

本発明の単クローン抗体は細胞又は組織試料のような実質的に結合力のある液体でないテスト材を検査する免疫組織技術でのかかる抗体と用いるいくつかの一般的に公知の方法でも用いられうる。望ましくは、試料は便試料の食物である。テスト材はテスト材にあるＥ、ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈ７又はＥ、ｃｏｌｉ　０２　６：Ｈｌｌに抗体を結合するよう単クローン抗体で定温培養される。テスト材は単クローン抗体の結合していない部分を除去するよう洗浄される。抗体はその存在を明らかに目にみえるようにするような方法で反応されつる。典型的にこれに含まれるＥ、ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈ７又はＥ、ｃｏｌｉ　０２６：Ｈｌｌに結合される単り　ローン抗体に関係するテスト材は上記記述と比較できるマーカーレベル抗マウス抗体で定温培養される。マーカーレベル抗体は単クローン抗体に結合する。マーカーは明らかに目にみえるように選択される。蛍光及び酵素マーカーは典型的に用いられる。

テスト材は次にマーカーが目視て認識できる条件のもとてｌｆｆ１ｆｉ鏡により観察される。Ｅ、　ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈ７及び　Ｅ、　ｃｏｌｉ　０２６：　Ｈｌｌへの単クローン抗体は食物や医療試料中のＥ、　ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈ７及びＥ、　ｃｏｌｉ　０２６：　Ｈｌｌの迅速な検出のための試薬として特に宵月である。

テスト材中の抗原の存在を検定するだめの方法は、検定に先立ってテスト材を富化するために選択富化媒体を使用することにより高度になる。富化媒体はドイルとショエニにより調合された改良されたトリブティケース大豆汁（ｍＴＳＢ）であり、さらにアクリフラビン−Ｈｃｌ及びカサミノ酸（ｃａｓａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ）を含有するように改良されている。我々はアクリフラビン−Ｈｃｌ及びカサミノ酸（ｃａｓａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ）の両者かＥ、　ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈ７による抗原の発現を助長することを発見した。加えて、カサミノ酸（ｃａｓａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ）はＥ、　ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈ７の成長を増大させ、そしてアクリフラビン−Ｈｃｌはグラム陽性バクテリアの成長を抑制する。アクリフラビン−ＨＣｌがＥ、　ｃｏｌｉ　０１５７・Ｈ７による抗原の発現を助長する正確なメカニズムは知られていないが、細胞壁のりポポリサッカライドの形成の抑制の結果であり、そのために単クローン抗体により認識される抗原がより良好に発現するものと考えられる。

上述の検定技術の多様性は、富化媒体を収容するために使用されることもあるか、好適な検定技術はこの分野で知られているサンドインチＥＬｒＳＡ法である。

この特許申請の目的で、ここに説明する検定技術を“富化−サンドイッチＥＬＩＳＡ法′と称する。この方法は、食品を選択富化媒体内て撹拌しながら（１５０ｒｐｍ）３７°Ｃで約１６〜１８時間置く試料又は基質の富化を含む。富化培養は、捕捉抗体としての特にＥ、　ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈ７抗原に対する多クローン抗体及び、特に検出抗体としての抗原型０１５７：Ｈ７及び０２６Ｈ１ｌの腸内出血性Ｅ、　ｃｏｌｉに対する単クローン抗体を存したサンドイッチＥＬＩＳＡ、に応用される。ＥＬＩＳＡは３時間以内で完了することかできる。

ここに説明するＥ、　ｃｏｌｉ　０１５７Ｈ７の検出のための富化−サントイッチＥＬＩＳＡ法は迅速で感度か良く、且つ簡単に行える。この方法は牛挽き肉の僅か０．　２Ｅ、　ｃｏｌｉ　０１５７・Ｈ７／ｇを検出することかてきる。Ｅ、　ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈ７は富化を含めて２０時間以内で検出することができる。従って、この方法は食品試料の日常的な適合審査に非常に宵月である。

本発明は、例えば診断検定キットのような、Ｅ、　ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈ７およびＥ、　ｃｏｌｉ　０２６：　Ｈｌｔに単クローン抗体を利用し上記に開示した方法をおこなうためのキットも含んでいる。一実施例においては、診断キットは従来のように、−または−以上の容器に入ったＥ、ｃ。

１ｉ　０１５７：Ｈ７及びＥ、　ｃｏｌｉ　０２６：　Ｈｌｌへの単クローン抗体と、単クローン抗体のための特定な結合相手の配合体と、検出可能な信号を生成するラベルと、その使用説明書を含むであろう。キットは同分野で良く知られているようにラベルに配合することもできる。多様なラベルは酵素、放射性同位元素、粉体よりなるラベル、色原体、蛍光発光体、化学発光体、補酵素、自由結合族及びバクテリオファージを含む。更に単クローン抗体は支持体に結合される。

特定の診断キットは浸漬棒状とすることもできる。これは疎水性のポリビニリデンジフロライド（ｐＶＤＦ）基盤の膜に吸着された多クローンＥ、　ｃｏｌｉ　０１５７免疫グロブリンを含むであろう。ＰＶＤＦ膜は非特定結合部位を塞ぐために、５％牛血清アルブミンで処理される。ＰＶＤＦ膜はＥ、　ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈ７を含むであろう食品の富化培養に３０分間浸漬される。洗浄後に、ＰＶＤＦ膜は単クローン抗体４　ＥＳＣＩ２により処理される。この抗体はＰＶＤＦ膜に結合したＥ、　ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈ７細胞に結合する。結合した単クローン抗体４Ｅ８Ｃ１２は、ニトロブルーテトラゾリウム１５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル燐酸塩（Ｎｉｔｒｏ　ｂｌｕｅ　ｔｅｔｒａｚｏ１ｉｕｍｕ１５−ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈＬｏｒＯ−３−ｉｎｄｏｌＹｉｐｈＯ３ｐｈａｔｅ）と反応して陽性反応として素点を生成スルアルカリ性燐酸酵素結合山羊抗マウス免疫グロブリンにより検出される。

Ｅ、　ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈ７及びＥ、　ｃｏｌｉ　０２６：　Ｈｌｌの外膜に見いだされるおよそ５．０００〜６．０００ダルトン分子量を有するプロティンは、生体試薬として分離され、試料内のＥ、　ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈ７及びＥ、　ｃｏｌｉ０２６：　Ｈｌｌの検出のための単クローン抗体を生成するために使用される。単クローン抗体はＥ、　ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈ７及びＥ、　ｃｏｌｉ　０２６：　Ｈｌｌによる汚染が疑わしい場合の診断として使用される試験キットに供給することもできる。

以下の例はここに開示された発明の具体例である。

興−士バクチリア菌株　単クローン抗体の特異性を確認するために使用するバクテリア培養二　以下のバクテリアの菌株は下記の例により調査された：　Ｅ、　ｃｏｌｉ　０＋５７：Ｈ７菌株９３２．　Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＨＡＩ（Ｅ、　ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈ７９３２から抽出した粗菌株）、以下の表２に挙げたＥ、　ｃｏｌｉ　０１５７：Ｆ（７の他の３４種の菌株、Ｅ、　ｃｏｌｉ　０２６：　Ｅ（ＩＩの５種の菌株、及び以下の表２に挙げたＥ、　ｃｏｌｉ　０＋５７・Ｈ７又はＥｃｏｌｉ　０２６：　Ｈ１１以外の３７種の菌株：表２Ｅ、ｃｏｌｉ抗原型０１５７：８７菌株番号９３６〜８６ＲＰＳ　３８６−ＩＥＣ−１２ＳＬ−１９８０８Ａ８１８７　Ｍ３ＥＣ−１４＋０９３−８３ＳＬ−２００６９ＮＸ　０＋５７・Ｈ７ＲＰＳ−７７９ＡＩ３０８９８−Ｉ　ＮＵＧＣ−６００９３３Ｗ３３−ＪＥＣＰＢ４０ＥＣＧＶ５０ＢＥＣＰＢ−２００ＥＣＰＢ−１７５に８８に９９Ｒ３Ｆ　１０３０Ｅ、ｃｏｌｉ　ＲＩＰ４Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ−１２８８−１９４７（０１５７・Ｈ１６）Ａ２　（０１５７：８１９）８４−１０９７　（０１５７・Ｈ２５）６２４−８３　（０１５７：Ｈ４５）ＯＰＨＤ　（０１５７：　Ｈ−）８８−５７３　（０２：８７）肺炎桿菌　２７２−６ＦＩ８２−５（１）ＦＩ８２−５（２）Ｆ１８２−６（１）Ｆ１８４〜５（４）Ｆ１１３４−５（５）Ｆ１８４−６（１）Ｆ１８８−５（４）Ｆ１８９−５（２）Ｆ１８９−５（３）Ｆ］８９−６（１）Ｆ１９０−６（３）ＦＩ９０−７（５）クレブシェラ　オキシドｈ（Ｋｉｅｂｓｉｅｌｌａ　ｏｘｙｔｏｃａ）　１　１　６　９　６ノト０バクター　フルエッチ４（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ　ｆｒｕｅｎｄｉｉ）　Ｙ６＋　ｌ　ＯＲ３ＦＩノド０バクター　了うマンティｈス（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ　ａｍａｌａｎｔｉｃｕｓ）　２　８　４　２　２ノトロバクター　フロインティ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ　ｆｒｅｕｎｄｉｉ）　ＭＡ　Ｔ　−８ノド０バクター　ノベルすス（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ　ｄｉｖｅｒｓｕｓ）　ＭＡ＋　Ｓ　−９エルノニ了　エッチ［＋コリテイカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ　ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）　Ｉ　Ｐ　−ｆ　８　３Ｐ−１６２２６３５−ＮＴＡエンテロバクタ−りａ７カエ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ｃｌｏａｃａｅ）　２　７　４　−　６ハフニア　アルベイ（Ｈａｆｎｉａ　ａｌｖｅｉ）　ＣＢ　 −７エー０モチス　ハイドロフィリ了（Ａｅｒｏｍｏｒａｓ　ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）　？全てのバクテリアは、３７°ＣのＴＲＹＰＴＩＣＡＳＥ犬豆汁（ＴＳＢ）（ＢＢＬマイクロバイオロジー、コツケイスピル、メリーランド州）内で攪拌（１００ｒｐｍ）されながら１６〜１８時間成長させられれた。

毒素：　Ｅ、　ｃｏｌｉ　０＋５７：８７菌株９３２からのベロトキソンー１（ＶＴ−１）及びベロトキノン−２（ＶＴ−２）はバブイー他（スーブラ）により説明された方法により浄化された。

接種のための抗原の準備　Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＨＡＩ細胞はＴＳＢ内で３７８Ｃで１６時間攪拌（］００ｒｐｍ）されながら成長された。

細胞は遠心分離（３５００ｒｐｍで１０分間）により採集され、００１燐酸塩緩衝塩（ｐＨ７，２）により３回洗浄された。Ｅ、　ｃｏｌｉＨＡＩ細胞は２％ホルマリンで処理され３７°Ｃで１週間保持された。

１０匹のマウス（雄、生後６〜８週間）はホルマリン処理Ｅ、ｃ。

１ｉ　ＨＡＩの２Ｘ　１０”個の細胞の腹腔内注射により免疫化された。

その後、そのマウスは、４週間ごとにマウスの定期的な採血により得られた血清が１：４００以上の力価（ｔｉｔｅｒｓ）を有するまで、腹腔内に同し数のＥ、　ｃｏｌｉ　ＨＡＩのホルマリン処理細胞を受容した。

これは一般的には３回の接種を必要とする。細胞融合の４日前に、そのマウスにはｌＸｌ０”個のＥ、　ｃｏｌｉ　ＨＡＩのホルマリン処理細胞の最終静脈内増強性注射が施された。最初の注射から４から５か列後にマウスは殺され、その膵臓細胞は骨髄腫細胞と融合された。

融合及びクローニング：融合及びクローニング処理は、ガルフレ、シイ、１９８１年の方法「単クローン抗体の準備、わずかな変更を育する酵素学の方法、７３巻、１−４６頁の戦略及び方法により実行される。簡単に、免疫マウスからの膵臓細胞は４０％ポリエチレングリコールを用いるＳＰ２１０−Ａｇ−１４ミエローマ細胞（分子重量、１３００−１６００）（ジエ、ティ、ベニカー　ケミカル社、フィリップスバーブ、エヌジェ）で融合され、０．３％マウス赤血球を有するヒボキサンチン、アミノプテリン及びチミジスを含む選択媒質で成長される。

ハイブリドマ成長を育するウェルからの上澄み液は下記に示す如く直接ＥＬＩＳＡでＥ、ｃｏｌｉ０１５７・Ｈ７に対する抗体の製造の為濾過される。問題の／ ’ｔイブリドマスは２０％の胎児牛血清を含む媒質（ジブコ、グラード島、ニューヨーク）において０．５及び０．１細胞／ウエルでの希釈を制限することでコーラ−及びミルスティンの方法、（１９７５年）自然、２５６巻、４９５−４９７頁で２度サブクローン化され、抗体製造の為再検定された。

直接ＥＬＩＳＡ：抗体製造は９６ウエルスチレンＥＬＴＳＡ板（ギブコ、グランド島、ニューヨーク）で実行されるＥＬＪＳＡで決定される。各ウェルは５０ｍＭ炭酸緩衝剤、ｐＨ９，６の細菌細胞（Ｅ、ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈ７菌株９３２、Ｅ、ｃｏｌｉ０１５７：ＨＩ３．Ｅ、ｃｏｌｉ　０２：ｋｌ：Ｈ７、又はＥ、ｃ。

１ｉｋ−１２（頁の制御）又は１０７細胞、６４０ｎｍでの０゜５の光密度）の１００ミクロリツトル（μｍ）で被覆され、室温で起動シェカーで終夜回転される。５０ｍＭ）リスＨｃｌ、ｐＨ７゜５プラス１５０ｍＭ　ＮａＣｌ　（ＴＳＢ）で４回細胞を洗浄した後、残る結合サイトはＴＢＳにおいて５％ＢＳＡで阻止される。３７°Ｃでの定温培養の１時間の後、阻止緩衝剤は除去され１，１００ μｍの単クローン抗体（ハイブリドマ上澄み液）がウェルに加算される。

板は３７°Ｃで１時間定温培養され、ウェルはＴＢＳプラス０．０５％トウィーンー２０　（ＴＢＳ−Ｔ）で４回洗浄される。ホースラディツシュペルオキシダーゼ共役やぎ抗マウスＩｇＧ（１００μｌ／ウェル；ＴＢＳにおける１：１４００）（カーケガード及びベリーラボラトリン社、ガイシャースバーグ、エムディ）か加算され、３７゛Ｃで１時間定温培養される。ウェルをＴＢＳ−Ｔで４回洗浄した後、１００μＪのＡＢＴＳペルオキシダーゼ基質（カーケガード及びベリーラボラトリ−、ガイシャースバーグ、エムディ）はｌウエル−当たりに加算される。酸素反応は室温で１５分の定温培養の後、ｌウェル当たりＴＢＳに５０μ ｍの１％ドデシル硫酸ナトリウムで止められる。各ウェルの反応物の光密度は４１０ｎｍでのダイナチック（ＭＲ３００）マイクロプレートリーダーで測定される。

検定の再製造は二重テストされる。

腹水液：　１０ＢＡＬＢ／Ｃｖウスは０．５ｍｌの２．　６．　１０゜１４テトラメチルペンタデカン（プリスティン）（ンガケミカル社、セントルイス、エムオー）の腹腔注射で注入される。１０回後、マウスは２ＸｌＯ”ハイドロニ細胞か注射される。マウス腹水液は注射の後１０から２０日間収集される。細胞デブリ及びフィブリン凝血は遠心分離で（１０分間８０００Ｘｇ）除去され、液体を含む抗体は一２０°Ｃで蓄積される。

単クローン抗体の純粋化　腹水液からの単クローン抗体はプロティンＡカラム（イム）ピュアプラスＩｇＧ純粋化キット、ピアース、ロツクフす一ド、アイエル）を用いる製造命令の変更により純粋化される。簡単に、腹水液はｉｏｏｏｏｘｇで２０分間遠心分離され、ＩｇＧ結合緩衝剤は上澄み液に（３：　ｌ）で加えられる。この溶液（４ｍｌ）はカラムに印加され、単りクーン抗体はＩｇＧ溶離緩衝剤で８離される。１ｍｌ留分が集められ、プロティンレベルは（２８０ｎｍでの光密度を）測定することでモニタされる。プロティンを有する留分は、組合され、２０ｍＭリン酸緩衝剤、ｐＨ７゜０．４°Ｃで終夜透析される。最後に、プロティン濃度はスミス他、１９８５年、分析生化学、１５０巻き、７０−８５頁の［バイソンコニニック酸を用いるプロティンの測定）、ピアスＢＣＡプロティン試薬（ピアスケミカル社、ロックフォード、アイエル）及び標準としての牛血清アルブミンを用いる方法により決定される。純粋抗体の活動は直接ＥＬＩＳＡで決められ、純粋化は５ＤＳ−ＰＡＧＥで決められる。

免疫グロブリン副基準　免疫グロブリン副基準はクラス特有抗血清を用いるＥＬＩＳＡでなされる。ＥＩＡ板のウェルは５０ｍＭ炭酸緩衝剤（ｐＨ９，６）においてＥ、ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈ７菌株９３２（１，０７細胞／ｍ１）で被覆される。ＴＢＳでの４回の洗浄の後、非特有結合サイトはＴＢＳ（ｗ／ｖ）において牛血清アルブミンで阻止される。３７°Ｃでの１時間の定温培養の後、単クローン抗体４Ｅ８Ｃ１２を含む０．１ｍｌの上澄みは各ウェルに加算され、定温培養か３７°Ｃで更なる時間続けられる。ウェルをＴＢＳ−Ｔで４回洗浄した後、マウスＩ　ｇＧ、Ｉ　ｇＧｔ、、Ｉ　ｇＧｔ＊、ｒ　ｇＧ１＋　ＩｇＭ、ＩｇＡ、　カッパ又はラムダ光点（マウスタイプ副基準キット、バイオ−ラッドラボラトリ−、リッチモンド、シイエイ）に個々に特有であるうさぎ抗血清は加算され、３７°Ｃで１時間保たれる。ウェルはＴＢＳ−Ｔで４回洗浄され、アルカリフォスファターゼラベルやぎ抗うさぎＴｇＧ　（０，１ｍｌ　；ＴＢＳにおいて１８００希釈され）は、３７°Ｃで１時間定温培養した後、各ウェルに加算される。ウェルをＴＢＳ−Ｔで４回洗浄したあと、１．　０Ｍ２アミノ−２−メチル− １−プロパツール、Ｉ）Ｈ９，９でのフォスファターゼ基質（ｐ−ニトロフェノールリン酸）（１，０ｍｇ／ｍｌ）が加算され、４１０ｎｍの光密度は３７°Ｃで１時間の定温培養の後に決定される。

外膜プロティンの準備：外膜プロティン（ＯＭＰ）はハンコック及びナイカイドーで記述の方法（ハンコック、アール、イー、ダブリュ、及びエイチ、ナイカイドー、１９８７年、細菌学のジャーナル、３６巻、３８１−３９０頁のｒグラム陰性菌の外膜」）にわずかな変更で分離されるＥ、ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈ７菌株９３２、Ｅ、ｃｏｌｉ　ＨＡｌ、Ｅ、ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈ２Ｓ、Ｅ、ｃｏｌｉ　０１５７二Ｈ４５及びＥ、ｃｏｌｉ　ＣＬ−５０２６：に−６０二Ｈ１１は攪拌（１５０ｒｐｍ）で３７℃で１８時間の２リツトルのＴＳＢで個々に成長される。細胞は遠心分離（４°Ｃで１０分間１０１００００Ｘにより採取し、次の動作が４°Ｃて実行される。細胞は遠心分離で沈澱されたＩ　７０ｍＭＮａＣ］　（ＰＢＳ）を含むＯ，ＯＭＩＪン酸緩衝剤、ｐＨ７，２で洗浄され、ペレットは６４０ｎｍでの４０の計算光密度まで同じ緩衝剤で再浮遊される。細胞はフレンチプレス（１４００ｌｂ／ｉｎ’）（アメリカン、インスツルメント、カンパニ、シルバースプリング、エムディ）で分類され、細胞デブリは遠心分離（５分間で５０００Ｘｇ）除去される。ＯＭＰは１時間で２０００００Ｘｇを遠心分離で上澄み液から沈澱される。ペレットは２０ｍｇ／ｍｌの適切なプロティン濃度を０、ＯＩＭ　ＨＥＰＥＳ　（Ｎ−２ヒドロキシエチル　ピペラジン−Ｎ’− ２エタン　スルホン酸）緩衝剤、ｐＨ７，４再浮遊される。

プロティン溶液は０．ＯＩＭ　ＨＥＰＥＳ　緩衝剤で準備された３５−５５％（Ｗ／Ｖ）サツ力ロースグランジエントか層になり、ＯＭＰは３６時間１３１０００Ｘｇを遠心分離でペレットされる。ＯＭＰはＩ　Ｍ　ｍ　Ｍ　ｇ　Ｃ］　ｔを含む０．ＯＩＭ　ＨＥＰＥＳ　緩衝剤で再浮遊され、遠心分離（１時間で２ｏｏｏｏｏｘｇ）沈澱される。

ペレットは同じ緩衝剤で再浮遊され、−２０°Ｃで保管される。プロティン濃度は上記方法により測定される。

イムノプロット法、○ＭＰ’（５０ｕｇ）及び純粋ＶＴ−１及びＶＴ−２（３− ５ｕｇ）はドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリル　アミドゲル電気泳動法で個々のプロティンバンドに分離される。ゲルはブロモフェノールダイがゲルの底から１ｃｍになるまで２００Ｖの一定電圧で二重スラブ電気泳動細胞（プロティン、パイオーラッド　ラボラトリ−、リッチモンド、シーエイ）でなされる。電気泳動の後、プロティンバンドは３０Ｖで１８時間トランスプロット（ｔｒａｎｓｂｌｏｔ）装置（バイオ−レット　ラボラトリ−、リッチモンド、ブイエイ）を用いる２５ｍＭ）リス１９２ｍＭグリシン及び２０％メタノール（Ｗ／Ｖ）を含む緩衝剤のＰＶＤＦ膜（イモービリム、ミリポー、ベッドフォード、エムエイ）に送られる。膜は下記の如く免疫化学的に着色される。非特有結合サイトは３７°Ｃで１時間ＴＢＳの５％ＢＳＡで定温培養され阻止される。ＴＢＳの１％ＢＳＡでゲルをリンスした後、ＰＶＤＦ膜は単クローン抗体４　Ｅ　８　Ｃ１２，、（Ｔ　Ｂ　Ｓで希釈腹水液１：６０００）で定温培養される（膜はＴＢＳプラス０．０５％トウィーンー２０（ＴＢＳ−Ｔ）で３回洗浄され、３７° Ｃで３０分間アルカリリン酸ラベルやぎ抗マウス（ＴＢＳで希釈１ｇＧ１　＋　２０００）で定温培養される。膜はＴＢＳ−Ｔ　（＋０．０５％５ＤＳ）で全体が洗浄され、プロティンバンドを検出するようＢＣＩＰ／ＮＢＴリン酸基質（カークガード及びベリーラボラトリ−社、ガイケースバーブ、エムディ）で処理される。低分子重量標準（電気泳動校正キット、ファーロシア、ビスキャラタウエイ、エムジエ）は、各ゲルでなされ、夫々はプロティンの移送を文書化するよう移送の前及び後に０．２５％５％コマラン−ブリリアンドブルー２５０（インペリアル　ケミカル、ロンドン）で着色される。

例■ 単クローン抗体の感度の決定単クローン抗体の感度はＥ、ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈ７の８の事なる菌株の種々のレベルを有する直接ＥＬＩＳＡを用いて決められる。検出制限は１０’から１０’細胞／ｍｌの範囲である。Ｅ、Ｃｏ１１　０１５７：Ｈ７、菌株９３２を検出する直接ＥＬＴＳＡにおける単クローン抗体４Ｅ８Ｃ１２の感度を示す図２が例で示される。

例■ 単クローン抗体の特異性単クローン抗体の特異性は異なる腸内菌を有する交反応を検査することで決定される。例Ｉの表２でリストされる下記の菌は例１の方法によりテストされる。

以下の表３に結果を示す。

表３ＭＡｂ４Ｅ８１２とＥ、ｃｏｌｉ　１０５７：Ｈ７及び他のバクテリアとの反応性細菌陽性ａ　試験菌株数　数０１５７又は０２６：Ｈｌｌ以外の抗原型　２３　０エノエリヒア　へルマニイ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｈｅｒｍａｎｉｉ）　１　０プロプウス　５ｐｐ（Ｐｒｏｔｅｕｓ　ｓｐｐ、）　３　０肺炎埠菌　１３　０りしブノエラ　オキシト力（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｏｘｙｔｏｃａ）　１　０ノド０バククー　５ｐｐ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ　ｓｐｐ、）　ｌ　ｌ　Ｏ霊菌　１０赤痢菌　２Ｇサルモネラ　ｓｐｉｔ（Ｓａｌｍｏｎｅ［ｌａ　ｓｐｐ、）　Ｉ　７　０カムピロバクター　ノエへ二（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｊｅｊｕｎｉ）　５　０エルノニア　エンテロコリティ力（Ｙｅｒｓｉｎｉａ　ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｊｔｉｃａ）１　２　０エンデａバクター　り口γカニ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ｃｌｏａｃａｅ）　２　０ハフニア　アルベイ　（Ｈａｆｎｉａ　ａｌｖｅｉ）　１　０エーロモナス　ハイドロフィリア　（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ　ｈｙｄｒｏｐｈｉａ）　４　０ａ、ＯＤａ＋。値が背景値から０．２高いものは陽性とする：全での陽性菌株はＯＤ値か背景値から１０より高い値を示した。

ｂ、Ｅ、ｃｏｌｉ　０２６：Ｈｌｌは溶血性尿毒症候群又は出血性大腸炎の患者から分離された。

結果の検討：ＭＡｂは、全てのテストされた菌株に対し〉１．０の０．Ｄ５　を有するＥＬＩＳＡで決定される如＜Ｅ、ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈ７の３６全ての菌株で大きく反応する。Ｍａ　ｂ　４　Ｅ　８　Ｃ１２の特異性は抗原型０１５７・Ｈ７以外のＥ、ｃｏｌｉ菌株及びエルジニア　エンテロコリティ力、サルモネラ　ｓｐｐ、、エンテロセバクター　クロアカニ、カンピロバクタ−、ジエジエニ、赤痢菌、プロテウス　ｓｐｐ、、エーロモナス　ハイドロフィリア、ハフニア　アルベイ、肺発棹菌、クレブシェラ　オキシト力、霊菌及びシトロバクタ −８ｐｐのいくつかの菌株を用いるＥＬｒＳＡで決定される。抗原型０１５７：Ｈ７以外の５つの菌株、即ち全てのＥ。

ｃｏｌｉ　０２６：ＨｌｌはＭａｂ（表２）で反応する。これらの菌株は溶血性尿毒症候群又は出血性大腸炎で患者から分離され、Ｅ、ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈ７で発生されるのと同一なベロトキシンを発生する。

開示の例から、当業者は上記の単クローン抗体が特有であるよう示される抗原に関して種々の方法で用いられうることが分かる。

従って、開示の種類のサンドイッチＥＬＩＳＡ以外のＥＬＩＳＡのＥ、ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈ７及び０２６　：Ｈｌ　１を検定するよう用いられる。検定及び他の目的用抗体を用い、一方蛍光抗体法、ノムノペルオキシダーゼ反応又は他のかかる技術を用いることで他の従来の方法と同様に用いられつる。

例■ Ｅ、ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈ７を検出及び分離するよう高速及び感度方法の開発バクテリア菌株：Ｅ、ｃｏｔｉ　０１５７：Ｈ７菌株９３３，５０５Ｂ、９３２．ＣＬ−８及び３２３８１は富化ＥＬ　ｒｓＡ方法の感度を決定するよう定温培養研究用に用いられる。菌株９３３及び５０５Ｂは牛肉から分離され、一方、菌株９３２．ＣＬ−８及び３２３８１は人間から分離される。Ｅ、ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈ７、抗原型０１５７：Ｈ１６，０１５７：Ｈ１９，０１５７：Ｈ２５゜０１５７：Ｈ４５のＥ、ｃｏｌｉ及びＥ、ｃｏｌｉ　ｋ−１２のこれらプラス２０の他の菌株はＥＬＩＳＡ方法の評価のみに用いられる。

単りローン抗体製造、腸出血性Ｅ、ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈ７及び０２６　：Ｈｌ　１に特有である単クローン抗体４Ｅ８Ｃ１２ＩｇＧ２ａの腹水液は１０′ハイブリドマ（４Ｅ８Ｃ１２）細胞が注射されたＢＡＬＢ／Ｃマウスから得られる。

腹水液は用いられるまで一２０℃で保管される。

ＭＡｂ　ＪＥ８ＣＩ２で理解される抗原のＥ、ｃｏｌｆ　０１５７による発現の強化：Ｅ、ｃｏ１ヱ　０１５７：Ｈ７菌株９３２は、（１リツトル当たり）トリブチケース大豆汁（ＴＳＢ　；　３０　ｇ）ＣＢＢＬ　微生物学システム、コツキースビラ、エムディ、〕、胆汁酸塩３番（１，５ｇ）、に２ＨＰＯ４（１，５ｇ）及びノボビオシン（２０ｍｇ）を３７°Ｃで１６時間攪拌（１５０ｒｐｍ）からなる変形トリブチケース大豆汁（ｍＴＳＢ）で成長される。複数の異なる成長因子はＥＬＩＳＡの感度を増すよう個々に加算又はｍＴＳＢと組合わされる。

評価された成長因子は、１％グルーコース、ラムノース、マンノース、乳糖又はサッカロース、０．５−５％半赤血球のような鉄分の補足、５−５０ｍｇ　ＦｅＣｌ３／Ｌ、０．５ＦｅＳＯ４／Ｌ又は５０ｍｇ　Ｆｅ　（ＮＧ４）２　（ＳＯ４）２／Ｌ。

５ｇシエレックス１００／Ｌ（バイオラット、リッチモンド、シーエイ）又は０．Ｏｌ及び０．　０５％ＥＤＴＡ、０．　５．　２．　５．　８及び１０ｍｇアクリフラビン−ＨＣＬ／Ｌ、及び０．　５及び１９６カサミノ（ｃａｓａｍｆｎｏ）酸が含まれる。加えて、ＴＳＢＳｍＴＳＢ及び抗生物質媒体３番（ＰＡＢ）のような異なる成長媒体は異なる成長温度（３０°Ｃ１３７°Ｃ及び４２℃）で攪拌（１５０ｒｐｒｎ）ｌｒり又は無しで評価される。下記の成長細胞は、遠心分離（１５００ｘｇ、１０分）で沈澱され、５０ｍＭ炭酸緩衝剤で、Ｉ）Ｈ９゜６再浮遊され、０．５　（ｃａ、１０”細胞／ｍ１）の６４０の光密度（ＯＤ）まで調整される。細胞浮遊は炭酸緩衝剤でｃａ、ＩＱ’細胞／ｍｌまで逐次（１：１０）希釈され、１．００μｌの各連続希釈は９６ウエルボリスチレンＥＩＡ −ＲＩＡ板（、ＧＩ　ＢＣＯ，グランド島、ニューヨーク）のウェルに二倍で用いられる。これらの細胞準備はＭＡｂ　４Ｅ８ＣＩ２と反応するＥ、ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈ７抗原の発現の範囲を決めるよう直接ＥＬＩＳＡ方法で用いられる。抗原のより強い発現は、ＥＬＩＳＡの検出限界を低下させる（より高い感度）結果となった。全ての実験は２回繰り返された。

媒体の準備：　ノボビンオンを含まないｒｎＴＳＢにカサミノ酸（１０ｇ／Ｌ）及びアクリフラビン−Ｈｃｌを加えた富化媒体（ｄｍＴＳＢ−ＣＡ）は、カサミノ酸を加えて１２１９Ｃで１５分間最初のオートクレーブにより準備された。これは室温まで冷却され、次にフィルタ殺菌されたアクリフラビン水溶液か加えられた。乳製品中のＥ、　ｃｏｌｉ　０＋５７：Ｈ７には、１リツトル当たり１．３５ｇのに８２ＰＯ４と１２ｇのＮａ　２ＨＰＯ４からなる緩衝剤を加えたｄｍＴＳＢ−ＣＡが、１リツトル当たり１．５ｇのに２ＨＰＯ４に代えて使用された。

４−メチルウンベリフロンーβ−Ｄ−グルクロン酸化合物（０゜Ｉｇ／Ｌ）を加えたマツコンケイ−ソルビトールかんでん培養基（ディフコラボラトリイズ、デトロイト、ミシガン州）か、Ｅ、ｃ。

１ｉ　０１５７：Ｈ７を富化培養から分離するのに用いられた。

接種の調査：　新鮮な市販の牛挽き肉、牛乳、殺菌さｎた全乳及び脱脂乳、そしてチェダー、スイス、コルビー及びブリックチーズに検出方法の感度を決定するために異なったレベルのＥ、　ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈ７が接種された。プレートカウントかんでん培養基を使用する前に、好気性菌の発生したプレートカウント及び３０°Ｃて４８時間の定温培養かそれぞれの製品に対して行われた。Ｅ、　ｃｏｌｉ　０１５７Ｈ７の接種物は、ＴＳＢ内で３７°Ｃで１６時間で５つの菌株を個々に成長させることにより準備された。細胞は１０分間１５００×ｇの遠心分離により沈殿され、０．５のＯＤ、、。までｐＨ７，２の０．０１Ｍ燐酸塩緩衝塩（Ｐ　Ｂ　Ｓ）に浸漬された（ｃａ、１０’ｃｓｓ　ＣＦＵ／ｍｌ）。

細胞は、３００μｍ当たり５〜２２．５のＥ、　ｃｏｌｉ　０＋５７・Ｈ７を得るために適度に希釈され、２５ｇの製品に接種された。実際の接種物のレベルは３７°ＣＩ６時間でＴＳＡプレート上の接種物の希釈液を培養することにより決定された。それぞれのＥ、　ｃｏｌｉ　０１５７・Ｈ７は個々に試験された。それぞれの製品の接種を受けていない試料は対照標準としてそれぞれの調査に加えられた。

牛挽き肉試料（それぞれ２５ｇ）には個々に２２５ｍ１のｄｍＴＳＢ−ＣＡブロスか加えられ、１リツトルのエルレンメイヤ−（Ｅｒｌｅｎｍａｙｅｒ）フラスコに入れられた、そして、乳製品（それぞれ２５ｇ）にはＥ、　ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈ７の富化のために２２５ｍ１のｄｍＴＳＢ−ＣＡ−ｂｕｆが加えられた。全ての試料は、攪拌（１５０ｒｐｍ）されながら３７°Ｃて１６〜１８時間定温培養された。定温培養後、Ｅ、　ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈ７はサンドイッチＭＥＬｒＳＡ法により富化培養内で検出された。

ＥＬＩＳＡは９６個のウェルを有するポリスチレンＥ　ＩＡ−ＲＩＡプレー）（ＧＩＢＣＯ）内で行われた。それぞれのウェルは１００μｍの親和性浄化された山羊のＥ、　ｃｏｌｉ　０１５７・Ｈ７への抗体（５０ｍＭ炭酸塩緩衝剤、ｐＨ９，６，中１０μｇ／ｍｌ）［キルケガードアンドペリーラボラトリーズ、ゲイザーバーグ、メリーラント州］により被膜され、室温で１時間又は終夜定温培養された。抗体溶液は吸引により除去され、残りの結合部位は室温で１５分間乳希釈／閉塞溶液［キルケガードアンドペリーラボラトリーズ］で閉塞された。閉塞剤は除去され、そして３００ｍ１の富化培養がそれぞれのウェルみに加えられ３７°Ｃで４５分間定温培養された。

ウェルを１５０ｍＭのＮａＣ］と０００５％のＴｗｅｅｎ−２０（ＴＢＳ−Ｔ）を含んだｐＨ７，５の５０ｍＭのＴｒｉｓで３回洗浄した後、１００μｍのＭＡｂ−４Ｅ８Ｃ１２（ＴＢＳ内で１１６００に希釈された腹水症液）が加えられ３７″で４５分間定温培養されたウェルはＴＢＳ−Ｔで３回洗浄され、次にホースラディツシュ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ）過酸化酵素（ＴＢＳ内で１：１４００）［キルケガードアンドベリーラボラトリーズコに結合された１００ｍ１の山羊抗−マウスＴｇＧが加えられ、３７°Ｃで４５分間定温培養された。ウェルはＴＢＳ−Ｔで４回洗浄された後、ｌｏＯｍｌの２゜２°　−アジノージ［３−エチルベンズチアゾリン（ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｔｈｉａｚｏｌ　１ｎｅ）硫酸塩］− 過酸化酵素基盤がそれぞれのウェルに加えられ、室温で２０分間保持された。それぞれのウェルの反応は５０μｌのＴＢＳ内の１％ナトリウム硫酸トンデルにより停止され、それぞれのウェルのＯＤはダイナチックＭＲ６００マイクロプレートリーダーによって４１０ｎｍで測定された。背景値より０．　２高いＯＤは陽性とされた。それぞれの検定において、Ｅ、　ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈ７が接種されていない食品試料の富化培養が対照標準として含まれており、これらは背景値を得る為に使用された。

サンドイッチＥＬＩＳＡにより陽性の試料はＥ、　ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈ７に対する仮の陽性とされた。Ｅ、　ｃｏｌｉ　０１５７・Ｈ７は次に培養法により富化培養から分離された。富化培養のデンマル（ｄｅｃｉｍａｌ）希釈液はＯｌペプトン水内で１０−６に作られた。１０−５及び１０−６の希釈液（０，１ｍ１）はＭＳＡ−ＭＵＧの表面上に置かれ、３７°Ｃで１６〜１８時間定温培養された。ソルビトール陰性（白色）でＭＵＧ−陰性（ＵＶ光線下で蛍光を発つしない）のコロニーの数が記録された。ソルビトール−陰性でＭＵＧ−陰性の５つのコロニーが無作為に抽出され、０Ｉ５７及びＨ７抗血清での血清学（ディフコ、Ｅ、　ｃｏｌｉリファレンスセンター、ペンシルバニア州立大学、ユニバージティーバーク、ペンシルバニア州）、及びベロ（Ｖｅｒｏ）細胞の細胞毒素性検定により、ＡＰＩ２０Ｅ小型診断キット（アナリタブブロダクツ、プレインビュー、ニューヨーク）ヲ用いた生物化学特性にしたがって、Ｅ、　ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈ７として確認された。

サンドイチＥＬＩＳＡの感度はｌ　０２〜Ｉ　Ｏ’　ＣＦＵ／ｍｌの範囲のレベルのＥ、　ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈ７の５つの菌株の純粋培養を使用することにより決定された。類似した調査か、異なったレベルのＥ。

ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈ７の同種の５つのそれぞれの菌株の富化の後にスパイクされた牛挽き肉と乳製品の富化培養で行われた。接種をされていない富化培養か対照標準として使用された。　市販の牛挽き肉と農場からの生牛乳からのＥ、　ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈ７の検出と分離。合計１０７の新鮮な牛挽き肉の試料が、ライスコンシン州のマディソン地区の生鮮食料品詞から、５週間の期間（９０年１２月から９１年１月まで）にわたって入手された。同様に６９の異なった農場からのバルクタンクから１１５の生牛乳の試料が入手された。試料は氷と共にクーラーに入れられ、研究所に運ばれてから１〜２時間以内に上述の方法により自然に発生したＥ、　ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈ７の検定が行われた。Ｅ、　ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈ７は陽性の試料から分離され、分離物は上述の方法によりＥ、　ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈ７と確認された。３−チューブ最適数法（ｍｏｓｔ　ｐｒｏｂａｂｌｅ　ｎｕｍｂｅｒ　ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）が、陽性の牛挽き肉試料内のＥ、　ｃｏｌｉ　０１５７・Ｈ７の数を定量するのに使用された。牛挽き肉試料（２５ｇ、２．５ｇ、０．２５ｇ）は、２２５ｍ１，２４７゜５ｍｌ、２５０ｍ１のｄｍＴＳＢ−ＣＡにそれぞれ加えられ、ストマツカー（Ｓ　ｔｏｍａｃｈｅｒ）バッグに入れられ、ストマツカーにより５分間浸軟された。試料は消毒されたエルレンメイヤーフラスコに移され攪拌（１５０ｒｐｍ）されながら３７°Ｃで１８時間定温培養された。陽性培養（フラスコ）内のＥ、　ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈ７の存在は、富化培養のループフル（Ｉｏｏｐｆｕｌ）をＭＳＡ −ＭＵＧプレート上に筋状に筐ることにより確認された。プレートは３７°Ｃで１６〜１８時間定温培養され、白色（ソルビトール−陰性）でＭＵＧ−陰性のコ口二一は選別され上述の確認検定によりＥ、　ｃｏｌｉ　０＋５７：８７として実証された。

結果：　サンドイッチＥＬｒＳＡは食品の富化培養内のＥ、ｃ。

１ｉ　０１５７：Ｈ７を検出するために開発された。ＥＬＩＳＡの特殊性はＥ、　ｃｏｌｊ　０１５７：Ｈ７及びＥ、　ｃｏＮ　０１５７：ｎｏｎ−Ｈ７の数種類の菌株を使用して決定された。Ｅ、　ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈ１６，０１５７：　Ｈ１９，０１５７：　Ｈ２５、０＋５７：　Ｈ４５は全て陰性であったのに対して、Ｅ、　ｃｏｌｉ　０＋５７：Ｈ７の２５菌株全てはＥＬＩＳＡにより強く反応した。検定の感度は純粋培養と食品の富化培養内のＥ、　ｃｏ［ｉ　０１５７：Ｈ７（５つの異なった菌株が傭々に試験された）により決定された。純粋培養内で検出可能な細胞の最小数は、図３に示すように、１０４〜１０５ＣＦＵ／ｍｌの範囲であっった、そして富化後の異なったレベルのＥ。

ｃｏｌｉ　０１５７・Ｈ７のスパイクされた食品の富化培養は、１０’〜１０″ Ｅ、　ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈ７／ｍ　１であった。

検定の感度を増すために、ＭＡｂにより認識されるバクテリア表面上の抗原の表示を増大させるへく研究か行われた。食品からのＥｃｏｌｉ　０１５７：Ｈ７の分離のための標準富化条件は、ｍＴＳＢ内て攪拌しながら３７°Ｃで培養されてきた。したかって、これらの条件による研究の結果が、比較基準として用いられた。図４に、２種類の成長温度（３０６及び３７°Ｃ）及び富化培養の攪拌のこれらの抗原の発現への効果を示す。これらの変数は、富化の漂準条件と比較した時に、ＥＬＩＳＡの感度において大きな減少はないということから、関係した抗原の発現を強調する実質的な効果を有していなかった。４２０ＣのｍＴＳＢ内のＥ、　ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈ７の成長は遅いことから、ＥＬＩＳＡによる検出のために十分な量の細胞を入手することは困難であった。

ｍＴＳＢ内のアクリフラビン−ＨＣｌ及びカサミノ酸の両者は、図５に示すようにＥＬＩＳＡの感度を増大させる大きな効果を有している。ｌ０ｍｇ／Ｌのアクリフラビン−ＨＣｌは検出限界を、１０　’　〜ｌ　Ｏ’　Ｅ、　ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈ７／ｍ　ｌから１０’セル／ｍｌへと低下させる。低濃度のアクリフラビン−ＨＣｌは検出限界を低下させる十分な効果は有していなかった。ｏ　５又は１％のカサミノ酸は同じＥＬＴＳＡの感度を増大させるが、アクリフラビンはどではなかった。しかし、ｍＴＳＢへのカサミノ酸の添加は、Ｅ、　ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈ７の成長速度を増大させるという特別な利点かあった。

他の数種類の基質あるいは成長の要素についても、ＥＬＩＳＡの感度を増大させる効果について評価された。これらはＴＳＢ内での成長や抗生物媒体Ｎｏ、３　（ＰＡＢ）対ｍＴＳＢを含んでいた。ｍＴＳＢはＥ、　ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈ７の成長及びＥＬＩＳＡの最高の感度の両者にとって最良であった。１％のグルコース、ラムノース、マンノース、ラクトース又はサクロースをｍＴＳＢに加えることでは、ＥＬＩＳＡの感度を増大させる効果は少なかった。同じように、羊の赤血球（０，５〜５％）、ＦｅＣｌ３　（５〜５０ｍｇ／Ｌ）、Ｆｅ５Ｏ４（０，５ｇ／Ｌ）又はＦｅ　（ＮＨ４）２　（ＳＯ４）２　（５０ｍ　ｇ　／　Ｌ　）のような鉄分の補足を添加することは、検出できるような効果はなかった。

食品中のＥ、　ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈ７の低レベルを検出する富化サンドイッチＥＬＩＳＡ法の効果を決定するための研究が、牛挽き肉と多様な乳製品内の０．２〜０．９セル／グラムの接種により個々に試験されたＥ、　ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈ７の５つの異なった菌株について行われた。以下の表４及び５にその結果を示す。

接種−回復の研究により、牛挽き肉（表４）又は乳製品（表５）の１グラム当たり０．２から０．９の間のＥ、　ｃｏｌｉ　０１５７・Ｈ７を検出できる方法が明らかになった。これらの研究に使用された全ての製品は、自然に発生するＥ、　ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈ７は育していなかった。

接種前の牛挽き肉試料の好気性菌プレートカウントは、１．１ＸＩＯ”　〜ｌ　Ｘｌ　０’　ＣＦＵ／ｇの範囲であった。０．２〜０．９ＣＦＵ／ｇのレベルの接種を受けたＥ、　ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈ７の菌株の全ては１０個の牛挽き肉富化試料のうち９個に検出された。一つの牛挽き肉試料において５つの接種菌株のうち一つだけが検出されたが、この牛肉は異常に高いＡＰＣ（ＩＸＩＯ”　ＣＦＵ／ｇ）を有していた。

このレベルのＡＰＣを有した牛挽き肉は通常は腐敗している。この試料においては多数の腐敗バクテリアか富化の際にＥ、　ｃｏｌｉ　０＋５７Ｈ７の成長を抑制したと考えられる。

牛肉又は乳製品内に接種された０、２〜０．９ＣＦＵ／ｇのＥ。

ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈ７は、富化培養内で３．８ＸＩＯ’〜３．７ＸＩＯ’に成長した。富化媒体ｄｍＴＳＢ−ＣＡの初期ｐＨ値は、ｄｍＴＳＢ−ＣＡ−ｂｕｆ（乳製品に使用された）の値が７．４であったのに対し、７０であった。富化後にはｐＨ値は６．５〜６８の範囲となった。

Ｅ、　ｃｏｌｉ　０＋５７：Ｈ７はライスコンシン州マディソン地区の生鮮食料品床からの１０７の牛挽き肉試料の内３つから検出された。富化前のこれらの試料のＡＰＣは４．５ＸＩＯ’〜７．８Ｘ１０７ＣＦＵ／ｇの範囲であった。陽性試料の富化培養内のＥ、　ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈ７の数は２．５ＸＩＯ’〜８゜６ｘ１０’　ＣＦＵ／ｍｌであり、陽性富化培養のＥＬＩＳＡの０Ｄ４１゜は０．５３から１．１０であった。ＥＬＩＳＡによりＥ、　ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈ７−陽性の宵機体は、培養法により３つの試料の全てから分離された。ＭＰＮ決定により３つの試料内のＥ、　ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈ７の分布数は０．４〜１．５セル／ｇであることか明らかになった。

６９の異なった農場からの１１５の生牛乳試料の調査により、１３の試料中にＥ、　ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈ７が検出され、１１の試料が培養で確認れたことか明らかになった。これらの１１の試料は７の異なった農場からのものであった。

富化前の全ての牛乳試料のＡ、　Ｐ　Ｃは、２．８ｘ１．Ｏ！〜２．６ＸＩＯ’ 　ＣＦＵ／ｍｌの範囲であった。Ｅ。

ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈ７−陽性富化培養のＥＬＩＳＡのＯＤ、、ｏは０．５５から１．０８であった。

本発明はここに開示された特定の試薬、手順又は方法に限定されないことは理解される。代わりに本発明は、以下の請求範囲ににより規定されるものとして、全てのそのような変更された型を包含する。

Ｆ！ＧＬＩＲＥ　１ＦＩＧＵＲＥ　２ｔｏｇｌｏ　Ｈ，ｃｏＬｉ　０１５７：Ｈ７／ｍ１ＦＴＧＵＲＥ　５要約書腸内出血性大腸菌０１５７：Ｈ７及び０２６　：ＨＩ　ｌの特効のある単クローン抗体は大腸菌０１５７：Ｈ７の菌株でＢＡＬＢｌ’ｃマウスを免疫化することで発生される。単クローン抗体は、略５０００〜６０００ダルトンの分子重量を有する酵素リンク免疫吸収検定で腸内出血性大腸菌０１５７：Ｆ（７及び０２６　：ＨＩ　１の菌株の外膜プロティンに強く反応する。これらの有機体を検出する素速い、感度的検定も示される。

国際調査報告ＰｒＴ、／Ｕ！＋９４１０５３］ＯＡｔｔａｃｈｍｅｎｔ　ｔｃ＋　ＰＣＴ／ＩＳＡ／２］０．　ｐａｒ４　ＩＩ。

丁１．　Ｆｉｅｌｄｓ　５ｅａｒｃｈｅｄ／５ｅａｒｃｈ　ｔｅｒｍｇ：ａｌｉ０２６・）Ｉｌ＋ｍａｒ＋ｕｃｌｏｎｈ１０】５７

Claims

【特許請求の範囲】

１．Ｅ．ｃｏｌｉ０１５７：Ｈ７及びＥ．ｃｏｌｉ０２６：Ｈ１１に特有である単クローン抗体。
２．明細書の表２にリストされたＥ．ｃｏ１ｉ０１５７：Ｈ７及びＥ．ｃｏｌｉ０２６：Ｈ１１の菌称に結合することを特徴とする請求項１記載の単口ーン抗体。
３．ハイブリドマＡＴＣＣＨＢ１０４５２から製法される請求項１記載の単クローン抗体。
４．Ｅ．ｃｏｌｉ０１５７：Ｈ７又はＥ．ｃｏｌｉ０２６：Ｈ１１細胞から採取でき、ハイブリドマＡＴＣＣＨＢ１０４５２から製法された単クローン抗体と特に反応しうる外膜ブロテインに特有である単クローン抗体。
５．サブクラスイムノグロブリンＧ２ａの要素であることを特徴とする請求項４記載の単クローン抗体。
６．カッパ光チェーンを有することを特徴とする請求項４記載の単クローン抗体。
７．ハイブリドマＡＴＣＣＨＢ１０４５２。
８．単クローン抗体をＥ．ｃｏｌｉ０１５７：Ｈ７及びＥ．ｃｏｌｉ０２６：Ｈ１１に対して発生し、（ａ）単クローン抗体をＥ．ｃｏｌｉ０１５７：Ｈ７及びＥ．ｃｏｌｉ０２６：Ｈ１１に対して発生しうる細胞を融合して形成されるハイブリドマと、（ｂ）ミエローマ細胞からなる連続細胞系。
９．１つ又はそれ以上の容器内に請求項１の単クローン抗体からなるＥ．ｃｏｌｉ０１５７：Ｈ７及びＥ．ｃｏｌｉ０２６：Ｈ１１の存在を検定する診断キット及びその使用法。
１０．単クローン抗体はラベルに共役する請求項９記載の診断キット。
１１．ラベルは酸素、放射線同位元素、特定ラベル、染色体遺伝子、発光体、化学発光体、補酸素、遊離基及び、バクテリオファージからなる群から選択される請求項１０記載の診断キット。
１２．単クローン抗体は保持体に結合される請求項９記載の診断キット。
１３．腸出血性Ｅ．ｃｏｌｉ０１５７：Ｈ７及び／又は０２６：Ｈ１１を他のＥ．ｃｏｌｉ及び請求項１の単クローン抗体からなる腸出血性Ｅ．ｃｏｌｉ０１５７：Ｈ７及びＥ．ｃｏｌｉ０２６：Ｈ１１に独特の外膜ブロテイン（ＯＭＰ）を基にした腸病原から区別する診断キット及びその使用法。
１４．単クローン抗体はハイブリドマＡＴＣＣＨＢ１０４５２で製造される請求項１３記載の診断キット。
１５．Ｅ．ｃｏｉｉ０１５７：Ｈ７又はＥ．ｃｏｌｉ０２６：Ｈ１１の検出用免疫特定方法であって、（ａ）免疫複合体を形成するようＥ．ｃｏｌｉ０１５７：Ｈ７及びＥ．ｃｏｌｉ０２６：Ｈ１１に特有である単クローン抗体と、Ｅ．ｃｏｌｉ０１５７：Ｈ７及びＥ．ｃｏｌｉ０２６：Ｈ１１を含む疑いある試料に接触し、（ｂ）試料でＥ．ｃｏｌｉ０１５７：Ｈ７又はＥ．ｃｏｌｉ０２６：Ｈ１１を検出する為複合体の存在を決めることからなる免疫検定方法。
１６．単クローン抗体はハイブリドマＡＴＣＣＨＢ１０４５２から製法される請求項１５記載の方法。
１７．単クローン抗体はラベルに共役である請求項１５記載の方法。
１８．Ｅ．ｃｏｌｉ０１５７：Ｈ７又はＥ．ｃｏｌｉ０２６：Ｈ１１の外膜内にあり、Ｅ．ｃｏｌｉ０１５７：Ｈ７及びＥ．ｃｏｌｉ０２６：Ｈ１１に単クローン抗体を特に反応しうる実質的に純粋ブロテインからなる抗体検定用生試薬。
１９．Ｅ．ｃｏｌｉ０１５７：Ｈ７又はＥ．ｃｏｌｉ０２６：Ｈ１１から採取可能で、ハイブリドマＡＴＣＣＨＢ１０４５２から製法された単クローン抗体と特に反応しうる実質的に純粋外腹ブロテイン。