CN111948397B - 一种快速检测大肠杆菌o157:h7的双抗体夹心elisa方法 - Google Patents

一种快速检测大肠杆菌o157:h7的双抗体夹心elisa方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种快速检测大肠杆菌O157：H7的双抗体夹心ELISA方法，以特异性识别大肠杆菌O157外膜蛋白OmpC特异性表位的单抗2G12作为包被抗体，特异性识别O157脂多糖O抗原的单抗12B1为检测抗体建立大肠杆菌O157：H7双抗体夹心ELISA方法，对测试的8株大肠杆菌O157：H7均有交叉反应，对测试的60株非O157细菌包括6大致病性大肠杆菌均无交叉反应；本发明制备了独特性的单克隆抗体，并建立了大肠杆菌O157：H7特异性双抗体夹心ELISA法，为食品中大肠杆菌O157：H7的检测提供了准确、可靠、快速的分析手段；本发明灵敏度和特异性，同时稳定性好、成本低，能同时检测大量样品，适合食品和临床样本大规模、高通量的快速检测要求，具有很高的经济价值和社会价值，值得推广和应用。

Description

一种快速检测大肠杆菌O157：H7的双抗体夹心ELISA方法
技术领域
本发明涉及一种快速检测大肠杆菌O157：H7的双抗体夹心ELISA方法，属于免疫分析领域，具体是一种快速检测大肠杆菌O157：H7的双抗体夹心ELISA方法。
背景技术
大肠杆菌O157：H7(Escherichia coli O157:H7)是大肠杆菌O157:H7是肠出血性大肠杆菌中的典型代表，对人类致病而对反刍动物如牛等无致病性，因此牛和牧场都是该致病菌的天然储藏容器。该致病菌在环境中分布广泛，容易由水、土壤、动物粪便等传播到食物链，进而进入人体并导致疾病爆发，典型症状包括肠胃炎甚至出血性腹泻和溶血性尿毒症。目前，我国对于食品中大肠杆菌O157:H7限量规定为25g样品中不得检出。大肠杆菌O157:H7等食源性致病菌的标准检测方法是传统的培养法，费时费力、成本高、专业性强，检测效率难以满足需求。免疫分析和DNA聚合酶链式反应(PCR)方法是目前主要的快速检测技术。PCR方法检测大肠杆菌O157:H7需要同时扩增多种目标片段来保证准确性，要求比较专业的操作技术避免假阳性、假阴性和气溶胶污染，依赖于贵重仪器和耗材，更适合于实验室确证和研究。
但目前致病菌包括大肠杆菌O157：H7免疫检测方法主要问题之一是研究中所用抗体识别的菌体表面抗原、表位及抗体的特异性并不明确，而细菌抗原同源性复杂，从而影响方法的可靠性和实用性。本发明通过菌体免疫制备了大肠杆菌O157:H7单克隆抗体并发现单抗SM6E8和RCD配对建立双抗体夹心ELISA方法对大肠杆菌O157:H7的特异性较好，并通过蛋白质组、免疫亲和层析、生物质谱等技术手段鉴定了2个抗体分别识别大肠杆菌O157:H7外膜蛋白OmpC的膜外特异性loop结构和O157脂多糖的O特异性侧链，测试表明该方法对8株大肠杆菌O157:H7具有较高的灵敏度(4.57×104CFU/mL)，对测试的60株其它菌株如23株非O157大肠杆菌、沙门氏菌、柠檬酸杆菌、阴沟肠杆菌、志贺氏菌、阪崎肠杆菌、空肠弯曲杆菌、结肠弯曲杆菌、变形杆菌、副溶血性弧菌、气单胞菌、单增李斯特菌等无交叉反应，可以用于在食品和临床分析中大肠杆菌O157：H7的初筛检验。
发明内容
针对上述缺陷，本发明提供了一种识别表位和检测特异性清楚的大肠杆菌O157：H7的双抗体夹心ELISA检测方法，用于食品和临床中大肠杆菌O157：H7的批量、快速检测；为实现上述目的，本发明对制备的配对抗体SM6E8和RCD进行了抗原和表位鉴定，在分析抗原同源性、测定抗体和方法特异性的基础上，建立了一种基于单克隆抗体的检测人畜共患病原菌大肠杆菌O157：H7的特异性双抗体夹心法，具体技术方案如下：
一种快速检测大肠杆菌O157：H7的双抗体夹心ELISA方法，其特征在于：以两株单克隆细胞株分别分泌的单克隆抗体2G12和单克隆抗体12B1作为配对抗体，分别用于特异性识别大肠杆菌O157：H7外膜蛋白OmpC膜外特异性多肽表位和大肠杆菌O157：H7脂多糖O特异性侧链，建立大肠杆菌O157：H7双抗体夹心ELISA方法，所述单克隆细胞株包括大肠杆菌O157：H7特异性细胞株SM6E8和大肠杆菌O157：H7特异性细胞株RCD，其分泌的单克隆抗体分别对应2G12和12B1。
进一步的，所述大肠杆菌O157：H7特异性细胞株SM6E8于2019年11月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号CGMCC No.19164，分类命名为单克隆细胞株，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；所述大肠杆菌O157：H7特异性细胞株RCD于2019年11月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号CGMCC No.19163，分类命名为单克隆细胞株，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
进一步的，所述单克隆抗体2G12用于识别大肠杆菌O157：H7外膜蛋白OmpC膜外两条相邻loop结构，分别为OmpC蛋白第296-311个氨基酸，第256-268个氨基酸，关键识别表位为第302-307个氨基酸，用于特异性捕获大肠杆菌O157：H7细菌，该识别大肠杆菌O157：H7蛋白的膜外特异性片段已申请发明专利保护，其专利号202010490007.1，专利名称为一种菌体抗体的抗原表位鉴定方法。
进一步的，ELISA方法包括如下步骤：
(一)制备特异性大肠杆菌O157：H7单克隆抗体：以大肠杆菌O157：H7煮沸抗原为免疫原，免疫6-8周龄的BALB/c小鼠，经免疫、融合，筛选对大肠杆菌O157：H7强阳性的细胞进行亚克隆，获取大肠杆菌O157：H7特异性单克隆抗体；
(二)筛选配对单克隆抗体：纯化步骤(1)中获取的大肠杆菌O157：H7特异性单克隆抗体，并分别标记辣根过氧化物酶HRP，鉴定标记成功后进行夹心法配对；
(三)建立大肠杆菌O157：H7特异性夹心ELISA方法：将步骤(二)中获取的配对单克隆抗体，以2G12用作包被抗体，12B1用作检测抗体，酶标板上包被单克隆抗体2G12用于特异性捕获大肠杆菌O157：H7，并以酶标板上酶标抗体12B1-HRP与捕获的大肠杆菌O157：H7结合，底物加入后被HRP酶催化并在450nm产生吸收值，根据P/N值判定结果，其中：若大肠杆菌O157：H7被包被抗体2G12捕获并与酶标抗体12B1-HRP结合，并催化底物在450nm产生吸收值(P/N≥2.1)，判定为阳性；若大肠杆菌O157：H7浓度过低(P/N＜2.1)被判定为阴性。
进一步的，所述步骤(三)具体检测步骤如下：
(1)包被：用4μg/mL的2G12包被酶标板，用量100μL/孔，并于37℃温育2h；
(2)洗涤：用PBST洗板三次，每次3min，用量200μL/孔，然后甩干反应板；
(3)封闭：用含0.2％明胶的CBS封闭板孔，用量200μL/孔，于37℃封闭2h；
(4)洗涤：同步骤(2)；
(5)样品：用PBST将大肠杆菌O157：H7菌液按3倍梯度从109CFU/mL连续稀释至5645CFU/mL，另设一个PBST空白对照，每孔加入100μL样品，于37℃温育lh；
(6)洗涤：同步骤(2)；
(7)加2μg/mL酶标抗体12B1-HRP，用量100μL/孔，并于37℃反应1h；
(8)洗涤：洗板四次；
(9)显色：按照TMB与底物液比例为1:5加显色液，用量100μL/孔，显色12min；
(10)终止：加终止液50μL/孔；
(11)测定：用酶标仪检测OD450nm。
进一步的，所述步骤(二)配对参数包括4μg/mL包被抗体2G12，包被液为pH9.6、0.01M的碳酸盐缓冲液，标品浓度10^7CFU/mL和10^6CFU/mL，标品稀释液pH7.2、0.01M的PBST，酶标抗体稀释1000倍使用。
进一步的，所述步骤(三)中包被液为pH9.6、0.01M碳酸盐缓冲液，标品稀释液为pH7.2、0.01M的PBST，酶标抗体12B1-HRP浓度为2μg/mL。
进一步的，所述标品包括ATCC 700728、CICC 21530、ATCC 35150三株大肠杆菌O157：H7标准株。
本发明与现有技术相比，有如下优点：
本发明提供的大肠杆菌O157：H7双抗体夹心检测方法基于两株识别不同抗原和表位的单克隆抗体，单克隆细胞株，即SM6E8识别大肠杆菌O157：H7外膜蛋白OmpC膜外特异性多肽表位，单克隆细胞株，即RCD识别脂多糖O157的O特异性侧链，建立的夹心法对大肠杆菌O157：H7检测具有较好的灵敏度和特异性，同时稳定性好、成本低，该ELISA对测试的大肠杆菌O157：H7三株标准株ATCC 700728、CICC 21530、ATCC 35150，五株食物中毒分离株的检测限约为4.57×104CFU/mL。对测试的60株其它菌株如23株非O157大肠杆菌、10株沙门氏菌、弗氏柠檬酸杆菌、无丙二酸柠檬酸杆菌、阴沟肠杆菌、福氏志贺氏菌、鲍氏志贺氏菌、宋内志贺氏菌、阪崎肠杆菌、空肠弯曲杆菌、结肠弯曲杆菌、变形杆菌、副溶血性弧菌、气单胞菌、迟缓爱德华氏菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、芽孢杆菌等无交叉反应，因此本发明能同时检测大量样品，适合食品和临床样本大规模、高通量的快速检测要求，具有很高的经济价值和社会价值，值得推广和应用。
附图说明
图1大肠杆菌O157：H7单克隆抗体2G12和12B1的免疫印迹。
图2大肠杆菌O157：H7单克隆抗体2G12的交叉反应。
图3大肠杆菌O157：H7单克隆抗体12B1的交叉反应。
图4大肠杆菌O157：H7单克隆抗体2G12的识别表位。
图5大肠杆菌O157：H7双抗体夹心法对8株大肠杆菌O157：H7菌株的标准曲线。
图6大肠杆菌O157：H7特异性双抗体夹心法对60株非O157菌株的交叉反应。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做详细说明，如图1-6所示：一种快速检测大肠杆菌O157：H7的双抗体夹心ELISA方法，包括如下实施方式：
一、制备特异性大肠杆菌O157：H7单克隆抗体：
(1)实验动物：选择6只6-8周龄的BALB/c小鼠进行免疫；
(2)抗原配置：将营养肉汤过夜培养的大肠杆菌O157：H7菌液计数后煮沸状态下保持15min，冷却离心后用无菌生理盐水重悬，冻存冰箱保存；
(3)乳化：将上述溶液与等量完全或不完全弗氏佐剂进行乳化，乳化完全后皮下多点注射小鼠；
(4)免疫：按照特定免疫流程免疫小鼠，3免后用间接竞争法测定效价，效价达到要求后，进行冲刺免疫；冲免3天后眼眶采血后进行融合；
(5)采血：第三次免疫后1周进行断尾采血，采用间接非竞争酶联免疫法测定抗血清效价；
(6)融合、筛选：采用杂交瘤技术进行融合，采用间接ELISA筛选阳性细胞孔，采用有限稀释法对阳性孔进行亚克隆；
(7)抗体的纯化和保存：采用辛酸-饱和硫酸铵法纯化腹水，透析后得到单克隆抗体，采用微量紫外方法测定其浓度后分装后放入-20℃保存。
二、抗体效价测定步骤：
(1)将包被原用包被缓冲液作系列稀释包被96孔酶标板，100μL/孔，于37℃温育箱内温育2h，取出酶标板后将板甩干，每孔注入200μL PBST溶液，摇床上振荡3min，用力甩掉洗涤液，在吸水纸上拍干，继续洗涤2次，以下洗涤方法相同；
(2)充分洗涤后，用封闭缓冲液封闭酶标板，200μL/孔，于37℃温育箱内温育2h后取出烘干待用；
(3)将阳性血清系列稀释对应加入到酶标板的前7行列，第8行加入阴性血清，100μL/孔，37℃孵育35min后洗涤、拍干；
(4)每孔加入100μL，1:3000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG，37℃孵育35min后洗涤四次、拍干；
(5)每孔加入100μL显色液(TMB与底物液比例为1:5)，暗处37℃反应15min，取出后每孔加入50μL终止液(2mol/L的硫酸)，用酶标仪测定吸光值A450；
三、单克隆抗体2G12免疫印迹步骤：
(1)通过冰预超声破碎制备细菌蛋白质并跑蛋白电泳；
(2)将聚丙烯酰胺凝胶用TE-70半干转印系统在30mA下转移至PVDF膜上，持续40min；
(3)将转印后的PVDF膜用封闭液(5％脱脂乳粉、0.01MPBS)于4℃封闭过夜；
(4)将在抗体稀释缓冲液中稀释2000倍的大肠杆菌O157：H7的mAb SM6E8与PVDF膜一起温育，室温，震荡反应1h，PBST洗涤3次；
(5)洗涤后，加入在抗体稀释缓冲液中稀释2000倍的HRP缀合的羊抗鼠二抗，并在室温下孵育1h，洗涤5次；
(6)加入TMB液体底物，在室温下反应10-15min后，拍摄图片。
四、大肠杆菌O157：H7特异性双抗体夹心法测定步骤：
a、包被：用4μg/mL的2G12包被酶标板，100μL/孔，37℃温育2h；
b、洗涤：用PBST洗板三次，每次3min，200μL/孔，然后甩干反应板；
c、封闭：含0.2％明胶的CBS，200μL/孔，37℃封闭2h；
d、洗涤：用PBST洗板三次，每次3min，200μL/孔，然后甩干反应板；
e、样品：用PBST将大肠杆菌O157：H7菌液按3倍梯度从109CFU/mL连续稀释至5645CFU/mL，另设一个PBST空白对照。每孔加入100μL样品，于37℃温育lh；
f、洗涤：用PBST洗板三次，每次3min，200μL/孔，然后甩干反应板；
g、加酶标抗体(12B1-HRP，2μg/mL)，100μL/孔，37℃反应1h；
h、洗涤：洗板四次；
i、显色：加显色液(TMB与底物液比例为1:5)100μL/孔，显色12min；
j、终止：加终止液50μL/孔；
k、测定：用酶标仪检测OD450nm。
交叉率的测定：将其它测试菌株的培养液按3倍梯度从6.0×109CFU/mL连续稀释至2.2×108CFU/mL系列浓度并采用双抗体夹心法进行检测，并设空白孔，每个浓度做6次测定平均值，做3次重复实验，试验结果如下：
1、标准曲线：本发明建立的大肠杆菌O157：H7双抗体夹心ELISA方法对8株大肠杆菌O157：H7测试菌株的检测范围约为3×104～108CFU/mL，具体请见说明书附图。
2、检测限：空白的平均吸收值的2.1倍对应的抗原浓度，该大肠杆菌O157：H7双抗体夹心ELISA方法对8株大肠杆菌O157：H7测试菌株的检测限为1.5×104～4.5×104CFU/mL。
3、交叉反应：在60株测试菌株种，仅对108CFU/mL以上浓度的弗氏柠檬酸杆菌、无丙二酸柠檬酸杆菌、阴沟肠杆菌、金黄色葡萄球菌煮沸菌有交叉反应，对所有60株测试菌不同浓度的活菌菌液测试均无交叉反应，说明建立的双抗体夹心ELISA方法具有较好的大肠杆菌O157：H7特异性。
五、食品样品检测
从当地超市购买牛腱肉3份，经国标(GB 4789.36-2016大肠埃希氏菌O157:H7/NM检验)和本发明建立的ELISA方法鉴定为阴性。
(1)牛肉样品中大肠杆菌O157：H7直接检测：将过夜培养并计数的大肠杆菌O157培养液用灭菌的10mM PBS10倍稀释为108CFU/mL，107CFU/mL，106CFU/mL，105CFU/mL，104CFU/mL，103CFU/mL，102CFU/mL，101CFU/mL；将2.5mL的以上菌液分别加入无菌均质袋中的25g阴性牛肉样品，阴性牛肉样品作对照，随后用手按压牛肉1分钟以使细菌在牛肉表面均匀分布；加入225mL的丙酮酸改性缓冲蛋白胨水(mBPWp)并在无菌均质器均质2分钟，随后不增菌直接采用ELISA方法进行检测，并采用选择性平板进行确认。
(2)牛肉样品中低浓度大肠杆菌O157：H7的增菌检测。采用同样方法污染阴性牛肉，使得大肠杆菌O157污染水平分别为1CFU/mL，103CFU/mL，105CFU/mL；以上牛肉样品采样mBPWp静止5h，随后加入阿昔洛-韦头孢呋定-万古霉素(ACV)添加物静置增菌12h和24h，增菌后采用ELISA方法进行检测，并采用选择性平板进行确认。
试验结果如下：大肠杆菌O157双抗体夹心ELISA方法对牛肉中大肠杆菌O157：H7的直接检测限为106CFU/mL(不增菌)，增菌12h后对对牛肉中大肠杆菌O157：H7的直接检测限为1CFU/mL(强阳性)，检测结果与国标方法选择性平板检测结果一致，检测结果如表1所示：
Figure GDA0002693921180000071
表1大肠杆菌O157：H7鲜牛肉添加样品双抗体夹心免疫检测和选择性平板检测结果其中：/,在“/”前的数据表示样品未煮沸(15min)的检测结果,在“/”之后的结果表明样品煮沸(15min)后的检测结果；-,OD450nm＜0.210；+,0.210≤OD450nm≤0.5；++,0.5＜OD450nm≤1.2；+++,1.5＜OD450nm≤1.9；mBPWp增菌液背景值为0.098±0.011；N,CT-SMAC和ECO157显色平板均阴性.P,CT-SMAC和ECO157显色平板均阴性均阳性。
本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所做的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims (7)

1.一种快速检测大肠杆菌O157：H7的双抗体夹心ELISA方法，其特征在于：以两株单克隆细胞株分别分泌的单克隆抗体2G12和单克隆抗体12B1作为配对抗体，分别用于特异性识别大肠杆菌O157：H7外膜蛋白OmpC膜外特异性多肽表位和大肠杆菌O157：H7脂多糖O特异性侧链，建立大肠杆菌O157：H7双抗体夹心ELISA方法，所述单克隆细胞株包括大肠杆菌O157：H7特异性细胞株SM6E8和大肠杆菌O157：H7特异性细胞株RCD，其分泌的单克隆抗体分别对应2G12和12B1；
所述大肠杆菌O157：H7特异性细胞株SM6E8于2019年12月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号CGMCC No.19164；所述大肠杆菌O157：H7特异性细胞株RCD于2019年12月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号CGMCC No.19163。
2.根据权利要求1所述的一种快速检测大肠杆菌O157：H7的双抗体夹心ELISA方法，其特征在于：所述单克隆抗体2G12用于识别大肠杆菌O157：H7外膜蛋白OmpC膜外两条相邻loop结构，分别为OmpC蛋白第296-311个氨基酸，第256-268个氨基酸，关键识别表位为第302-307个氨基酸，用于特异性捕获大肠杆菌O157：H7细菌。
3.根据权利要求1所述的一种快速检测大肠杆菌O157：H7的双抗体夹心ELISA方法，其特征在于：包括如下步骤：
（一）制备特异性大肠杆菌O157：H7单克隆抗体：以大肠杆菌O157：H7煮沸抗原为免疫原，免疫6-8周龄的BALB/c小鼠，经免疫、融合，筛选对大肠杆菌O157：H7强阳性的细胞进行亚克隆，获取大肠杆菌O157：H7特异性单克隆抗体；
（二）筛选配对单克隆抗体：纯化步骤（一）中获取的大肠杆菌O157：H7特异性单克隆抗体，并分别标记辣根过氧化物酶HRP，鉴定标记成功后进行夹心法配对；
（三）建立大肠杆菌O157：H7特异性夹心ELISA方法：将步骤（二）中获取的配对单克隆抗体，以2G12用作包被抗体，12B1用作检测抗体，酶标板上包被单克隆抗体2G12用于特异性捕获大肠杆菌O157：H7，并以酶标板上酶标抗体12B1-HRP与捕获的大肠杆菌O157：H7结合，底物加入后被HRP酶催化并在450nm产生吸收值，根据P/N值判定结果，其中：若大肠杆菌O157：H7被包被抗体2G12捕获并与酶标抗体12B1-HRP结合，并催化底物在450 nm产生吸收值P/N≥2.1，判定为阳性；若大肠杆菌O157：H7浓度过低P/N＜2.1被判定为阴性。
4.根据权利要求3所述的一种快速检测大肠杆菌0157：H7的双抗体夹心ELISA方法，其特征在于：所述步骤（三）具体检测步骤如下：
（1）包被：用4μg/mL的2G12包被酶标板，用量100μL/孔，并于37℃温育2h；
（2）洗涤：用PBST洗板三次，每次3min，用量200μL/孔，然后甩干反应板；
（3）封闭：用含0.2%明胶的CBS封闭板孔，用量200μL/孔，于37℃封闭2h；
（4）洗涤：同步骤（2）；
（5）样品：用PBST将大肠杆菌O157：H7菌液按3倍梯度从109 CFU/mL连续稀释至5645CFU/mL，另设一个PBST空白对照，每孔加入100μL样品，于37℃温育lh；
（6）洗涤：同步骤（2）；
（7）加2μg/mL酶标抗体12B1-HRP，用量100μL/孔，并于37℃反应1h；
（8）洗涤：洗板四次；
（9）显色：按照TMB与底物液比例为1:5加显色液，用量100μL/孔，显色12min；
（10）终止：加终止液50μL/孔；
（11）测定：用酶标仪检测OD450nm。
5. 根据权利要求3所述的一种快速检测大肠杆菌O157：H7的双抗体夹心ELISA方法，其特征在于：所述步骤（二）配对参数包括4μg/mL包被抗体2G12，包被液为pH9.6、0.01M的碳酸盐缓冲液，标品浓度10^7 CFU/mL和10^6 CFU/mL，标品稀释液pH7.2、0.01M的PBST，酶标抗体稀释1000倍使用。
6.根据权利要求4所述的一种快速检测大肠杆菌O157：H7的双抗体夹心ELISA方法，其特征在于：所述步骤（三）中包被液为pH9.6、0.01M碳酸盐缓冲液，标品稀释液为pH7.2、0.01M的PBST，酶标抗体12B1-HRP浓度为2μg/mL。
7. 根据权利要求5所述的一种快速检测大肠杆菌O157：H7的双抗体夹心ELISA方法，其特征在于：所述标品包括ATCC 700728、CICC 21530、ATCC 35150三株大肠杆菌O157：H7 标准株。
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