CN104655842B - 一种盐单胞菌菌株的间接酶联免疫定量检测方法 - Google Patents
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Abstract
一种盐单胞菌菌株的间接酶联免疫定量检测方法,包括1)盐单胞菌O抗原的制备；2)盐单胞菌多克隆抗体的制备:以盐单胞菌O抗原为免疫抗原，免疫新西兰大白兔并利用现有的多克隆抗体制备与纯化技术获得盐单胞菌多克隆抗体；3)间接ELISA操作方法:将抗原包被酶标板,4℃过夜；洗板，加封闭液；洗板，加抗体；洗板，加二抗；洗板，进行显色反应；用酶标仪测定450nm波长下的吸光值即OD450。本发明建立了一种盐单胞菌菌株的间接酶联免疫定量检测方法，其操作流程简便，易于操作，检测灵敏度能够达到105cfu/mL，抗血清与其他细菌无交叉反应，是一种快速、高效、灵敏性高、特异性强的检测方法为有益菌在水产上的应用起到推动作用，具有一定的实际应用意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种盐单胞菌含量的检测方法，更具体的说是一种盐单胞菌菌株的间接酶联免疫定量检测方法，属于免疫检测技术领域。
背景技术
在应用益生菌改善水质的过程中，为了判断不同浓度有益菌对水质改善的情况，以及了解益生菌在水体中数量的变动情况，常常需要对其定量检测。因而建立准确的定量检测技术非常必要。
盐单胞菌(Halomonas)对温度、盐度和氧气的适应范围广，具有很强的适应能力，在水产养殖水体净化、污水处理与生物修复方面具有重要的应用价值。目前盐单胞菌的检测主要通过传统的检测技术，如平板计数法、显微镜直接计数法，其缺点是随机性大、耗时长，费时又费力，难以用于大量的样品检测。
发明内容
本发明目的是提供一种盐单胞菌菌株的间接酶联免疫定量检测方法，以克服现有技术的不足。
本发明的技术方案如下：
1)抗原的制备：首先将盐单胞菌接至2216E液体培养基作增殖培养；然后将所述的盐单胞菌制备成菌体O抗原；
2)盐单胞菌多克隆抗体的制备：
以盐单胞菌O抗原为免疫抗原，免疫新西兰大白兔并利用现有的多克隆抗体制备与纯化技术获得盐单胞菌多克隆抗体，该抗体可与盐单胞菌特异性结合；
3)间接ELISA操作方法
利用棋盘滴定法对包被抗原和抗体工作浓度进行筛选，选择包被抗原浓度为107cfu/mL，多克隆抗体稀释度为1:500，酶标二抗(辣根过氧物酶标记的羊抗兔IgG(RAM-HRP))稀释度为1:1000；优化抗原抗体最佳反应时间和二抗最佳反应时间分别为30min、60min。
3.1)以碳酸盐(CBS)缓冲液稀释步骤1得到的抗原至107cfu/mL，将稀释后的包被抗原加入酶标板中，每孔100μL，置于4℃冰箱内孵育过夜；将孵育过夜后的酶标板甩干液体，然后每孔加入300μL洗涤液洗涤3次后，加入封闭液，37℃封闭60min后以PBST洗涤3次；
3.2)用抗体稀释液以1:500的比例稀释步骤2得到的多克隆抗体，再加入到上述酶标板中，每孔100μL；37℃孵育30min后以PBST洗涤3次；
3.3)以PBST 1:1000的比例稀释辣根过氧物酶标记的羊抗兔IgG-HRP，然后加入到上述酶标板中，每孔100μL，37℃孵育60min后以PBST洗涤3次；
3.4)将四甲基联苯胺显色液A液和B液1:1混合后加入到上述酶标板中，每孔100μL，37℃显色20min；将2M硫酸溶液加入到上述酶标板中终止反应，每孔50μL；用酶标仪在450nm波长下测吸光值OD450，得到盐单胞菌标准品溶液的标准曲线，以及待测样品的吸光值，将所得的待测样品的吸光值与所做标准曲线对比可比算出待测样品的盐单胞菌含量。
上述步骤1)盐单胞菌O抗原的制备具体如下：将盐单胞菌接种于2216E液体培养基，放入摇床(25℃，200r/min)活化增菌培养，24h后，离心(8000r/min,15min)收集菌体，将沉淀悬浮于0.5％石碳酸生理盐水，再加入等量的无水酒精混合，放入冰箱过夜后用生理盐水稀释至108cfu/mL，放入4℃或-20℃备用，即得到盐单胞菌O抗原。
上述步骤2)盐单胞菌多克隆抗体的制备具体如下：选取6个月以上，体重在2-3kg的雄性新西兰大白兔作为实验动物，实验前暂养一周；将用生理盐水稀释至108cfu/mL的盐单胞菌O抗原作为免疫原,然后与等量的弗氏佐剂混合用搅拌法使其乳化；初次免疫将乳化好的抗原溶液于兔子背部皮下多点注射，每只注射1.2mL，两周后进行第一次加强免疫，用不完全弗氏佐剂乳化，注射部位和剂量与初次免疫相同，一周后进行第二次加强免疫，注射0.3mL稀释后的抗原溶液进行免疫，免疫部位为耳静脉，一周后进行最后一次加强免疫，操作与第二次加强免疫相同，从耳缘静脉采血，采用间接ELISA法测定抗体效价，确定抗体效价可用后采用耳动脉取血获得抗血清，收集于灭菌离心管中；将此抗血清高速离心并过滤纯化后于-20℃保存，即得到盐单胞菌多克隆抗体。
上述采用直接ELISA法测定抗体效价具体如下：
1)将盐单胞菌O抗原用CBS稀释至108cfu/mL，100μL/孔加入酶标孔中，置于4℃冰箱内过夜,次日取出酶标板，将孵育后的酶标板中的液体扣掉，每孔加入PBST洗涤液300μL，洗涤3min，甩去洗涤液，在吸水纸上拍干，重复此洗涤过程3次；以下洗涤方法相同；
2)加封闭缓冲液200μL/孔封闭酶标板，37℃孵育60min；
3)将封闭缓冲液扣掉，洗涤3次；
4)将抗血清稀释液、阴性血清、阳性血清稀释成系列浓度加入酶标孔，100μL/孔，37℃孵育60min后洗涤3次；
5)每孔加入100μL 1:3000稀释的酶标羊抗兔IgG-HRP，37℃孵育60min后洗涤3次；
6)加入100μL TMB显色液(A液:B液的混合比例为1:1)，暗处静置显色反应20min后每孔加入50μL 2M浓硫酸终止反应，用酶标仪测定450nm的吸光值(OD450)；以P/N值(阳性血清OD450值-空白对照OD450/阴性血清OD450-空白对照OD450)大于2.1对应的最大的抗血清稀释度为抗血清效价。
所需的试剂为：
1)配制0.01M磷酸盐(PBS)缓冲液(pH＝7.4)
加超纯水定容至1000mL；
2)配制0.05M碳酸盐(CBS)缓冲液(pH＝9.6)
Na2CO3 1.59g
NaHCO3 2.93g
加超纯水定容至1000mL
3)配制PBST洗涤液：含0.05％Tween-20的PBS溶液；
4)配制封闭液：含0.5％脱脂奶粉的PBS溶液；
5)配制抗体稀释液：含1％脱脂奶粉的PBS溶液；
6)四甲基联苯胺显色液购自北京翰谱医药生物研究所；
A液为过氧化脲，B液为四甲基联苯胺(TMB)，使用前将A液和B液等体积混合；
7)终止液：2M的H2SO4。
发明优点
本发明涉及的盐单胞菌菌株具有很强的亚硝酸盐降解能力；在改善养殖水体水质方面具有潜在的应用价值；因此本发明建立的盐单胞菌株定量检测技术可为单位水体盐单胞菌株的数量在改善水质的应用效果进行准确评估，从而为优化该益生菌的应用方案提供必要的检测手段。本发明建立的盐单胞菌菌株的间接酶联免疫定量检测方法，其操作流程简便，易于操作，检测灵敏度能够达到105cfu/mL，该检测方法与溶藻弧菌、假交替单胞菌、鞘氨醇单胞菌及海杆菌的交叉反应均呈阴性，是一种快速、高效、灵敏性高、特异性强的检测方法。本研究可以为养殖水体中盐单胞菌的定量检测提供快速准确的检测方法，为该有益菌在水产上的应用起到推动作用，具有一定的实际应用意义。
附图说明
图1盐单胞菌抗血清效价的测定。
图2盐单胞菌的检测的标准曲线。
具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明
一、实验动物：
5只健壮雄性家兔(6个月以上，体重在2-3kg，饲喂颗粒混合饲料，温度16-28℃，暂养一周)
二、主要仪器：
RO15型纯水机，上海力申科学仪器有限公司
Neofuge 15R型台式离心机，上海力申科学仪器有限公司
TS-1型摇床，江苏海门市麒麟医用仪器厂
SPECTRA MAX 190型酶标仪，Molecular Devices公司
可调式移液器，Effendorf公司
三、试剂
辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG-HRP，北京翰谱医药生物研究所
四苯基联苯氨(TMB)显色液，北京翰谱医药生物研究所
其他试剂均为分析纯试剂
四、步骤：
1、盐单胞菌O抗原的制备：将盐单胞菌接种于2216E液体培养基，放入摇床(25℃，200r/min)活化增菌培养，24h后，离心(8000r/min,15min)收集菌体，将沉淀悬浮于0.5％石碳酸生理盐水，再加入等量的无水酒精混合，放入冰箱过夜后用生理盐水稀释至108cfu/mL，放入4℃或-20℃备用。
2、盐单胞菌多克隆抗体的制备：选取6个月以上，体重在2-3kg的雄性新西兰大白兔作为实验动物，实验前暂养一周。将用生理盐水稀释至108cfu/mL的盐单胞菌O抗原作为免疫原,然后与等量的弗氏佐剂混合用搅拌法使其乳化。初次免疫将乳化好的抗原溶液于兔子背部皮下多点注射，每只注射1.2mL。两周后进行第一次加强免疫，用不完全弗氏佐剂乳化，注射部位和剂量与初次免疫相同。一周后进行第二次加强免疫，注射0.3mL稀释后的抗原溶液进行免疫，免疫部位为耳静脉。一周后进行最后一次加强免疫，操作与第二次加强免疫相同。从耳缘静脉采血，采用直接ELISA法测定抗体效价，确定抗体效价可用后采用耳动脉取血获得抗血清，收集于灭菌离心管中。将此抗血清高速离心并过滤纯化后于-20℃保存。
3、抗体效价的测定步骤：
1)将盐单胞菌O抗原用CBS稀释至108cfu/mL，100μL/孔加入酶标孔中，置于4℃冰箱内过夜。次日取出酶标板，将孵育后的酶标板中的液体扣掉，每孔加入PBST洗涤液300μL，洗涤3min，甩去洗涤液，在吸水纸上拍干，重复此洗涤过程3次；以下洗涤方法相同；
2)加封闭缓冲液200μL/孔封闭酶标板，37℃孵育60min；
3)将封闭缓冲液扣掉，洗涤3次；
4)将抗体稀释液、阴性血清、阳性血清稀释成系列浓度加入酶标孔，100μL/孔，37℃孵育60min后洗涤3次；
5)每孔加入100μL 1：3000稀释的酶标羊抗兔IgG-HRP，37℃孵育60min后洗涤3次；
6)加入100μL TMB显色液(A液:B液的混合比例为1:1)，暗处静置显色反应20min后每孔加入50μL 2M浓硫酸终止反应，用酶标仪测定450nm的吸光值(OD450)，反应曲线如图1；以P/N值(阳性血清OD450值-空白对照OD450/阴性血清OD450-空白对照OD450)大于2.1对应的最大的抗血清稀释度为抗血清效价，本发明中制备的抗血清效价为1:32000，满足实验要求。
4、抗原最适包被浓度和抗血清最佳稀释比的确定
1)利用棋盘滴定法对包被抗原和抗体工作浓度进行筛选。
2)包被:将盐单胞菌O抗原用CBS倍比稀释为108cfu/mL、107cfu/mL、106cfu/mL、105cfu/mL，100μL/孔加入酶标孔中，置于4℃冰箱内孵育过夜；
3)洗板:将酶标板中的液体扣掉，洗涤3次；
4)封闭：加入封闭缓冲液，200μL/孔，37℃封闭60min；
5)洗板：将孵育后的酶标板中的液体扣掉，洗涤3次；
6)加抗体：分别加入100μL抗体稀释液、阴性血清至酶标板，以抗体稀释液按不同稀释度1:50、1:500、1:1000、1:5000、1:10000稀释阳性血清，分别加入酶标板，每孔100μL，充分混匀后37℃孵育60min；
7)洗板：将孵育后的酶标板中的液体扣掉，洗涤3次；
8)加二抗：加入HRP标记的二抗100μL/孔，37℃孵育60min；
9)洗板：将孵育后的酶标板中的液体扣掉，洗涤3次；
10)显色：加入TMB显色液100μL/孔，避光静置显色反应20min，然后加入2M的浓硫酸50μL/孔终止反应；
11)测定：酶标仪测定450nm的吸光值(OD450)，结果见表1。当OD450值在1.0左右时，抗血清稀释比为1:500，抗原的最佳浓度为107cfu/mL。
表1抗原最适包被浓度和抗血清最佳稀释比的确定
5、酶标二抗最佳稀释度的确定
1)选择包被抗原浓度为107cfu/mL，多克隆抗体稀释度为1:500。
2)包被:将盐单胞菌O抗原用CBS稀释至107cfu/mL，100μL/孔加入酶标孔中，置于4℃冰箱内孵育过夜；
3)洗板:将酶标板中的液体扣掉，洗涤3次；
4)封闭：加入封闭缓冲液，200μL/孔，37℃封闭60min；
5)洗板：将孵育后的酶标板中的液体扣掉，洗涤3次；
6)加抗体：加入100μL抗体稀释液、阴性血清、抗体稀释液以1:500比例稀释的阳性血清至酶标板，充分混匀后，分别在37℃孵育60min；
7)洗板：将孵育后的酶标板中的液体扣掉，洗涤3次；
8)加二抗：加入不同稀释度1:1000、1:3000、1:6000、1:10000、1:20000的HRP标记的二抗100μL/孔，37℃孵育60min；
9)洗板：将孵育后的酶标板中的液体扣掉，洗涤3次；
10)显色：加入TMB显色液100μL/孔，避光静置显色反应20min，然后加入2M的浓硫酸50μL/孔终止反应；
11)测定：酶标仪测定450nm的吸光值(OD450)，结果见表2。在本发明中，OD450值在1.0左右，且P/N值最大的二抗稀释度为1:1000，故本发明采用稀释度为1:1000的二抗。
表2酶标二抗最佳稀释度的确定
6、抗原抗体最适反应时间
1)选择包被抗原浓度为107cfu/mL，多克隆抗体稀释度为1:500，酶标二抗稀释度为1:1000。
2)包被:将4块酶标板包被抗原即用CBS稀释至107cfu/mL的盐单胞菌O抗原，100μL/孔加入酶标孔中，置于4℃冰箱内孵育过夜；
3)洗板:将酶标板中的液体扣掉，每孔加入PBST洗涤液200μL，洗涤3次；
4)封闭：加入封闭缓冲液，200μL/孔，37℃封闭60min；
5)洗板：将孵育后的酶标板中的液体扣掉，洗涤3次；
6)加抗体：加入100μL抗体稀释液、阴性血清、抗体稀释液以1:500比例稀释的阳性血清至酶标板，充分混匀后，分别在37℃孵育15min、30min、60min、90min；
7)洗板：将孵育后的酶标板中的液体扣掉，洗涤3次；
8)加二抗：加入以1:1000比例稀释的HRP标记二抗100μL/孔，37℃孵育60min；
9)洗板：将孵育后的酶标板中的液体扣掉，洗涤3次；
10)显色：加入TMB显色液100μL/孔，避光静置显色反应20min，然后加入2M的浓硫酸50μL/孔终止反应；
11)测定：酶标仪测定450nm的吸光值(OD450)，结果见表3。在本发明中，加入抗体孵育30min的OD450值在1.0左右，故本发明采用37℃，30min作为抗原抗体最适反应时间。
表3抗原抗体最适反应时间的测定
7、二抗最适反应时间
1)选择包被抗原浓度为107cfu/mL，多克隆抗体稀释度为1:500，酶标二抗稀释度为1:1000，抗原抗体最适反应时间30min。
2)包被:将4块酶标板包被抗原即用CBS稀释至107cfu/mL的盐单胞菌O抗原，100μL/孔加入酶标孔中，置于4℃冰箱内孵育过夜；
3)洗板:将酶标板中的液体扣掉，洗涤3次；
4)封闭：加入封闭缓冲液，200μL/孔，37℃封闭60min；
5)洗板：将孵育后的酶标板中的液体扣掉，洗涤3次；
6)加抗体：分别加入100μL抗体稀释液、阴性血清、抗体稀释液以1:500比例稀释的阳性血清至酶标板，充分混匀后，37℃孵育30min；
7)洗板：将孵育后的酶标板中的液体扣掉，洗涤3次；
8)加二抗：加入以1:1000比例稀释的HRP标记二抗100μL/孔，分别在37℃孵育15min、30min、60min、90min；
9)洗板：即将孵育后的酶标板中的液体扣掉，洗涤3次；
10)显色：加入TMB显色液100μL/孔，避光静置显色反应20min，然后加入2M的浓硫酸50μL/孔终止反应；
11)测定：酶标仪测定450nm的吸光值(OD450)，结果见表4。在本发明中，加入抗体孵育60min的OD450值在1.0左右，故本发明采用37℃，60min作为二抗最适反应时间。
表4二抗最适反应时间的测定
8、间接ELISA反应过程
1)选择包被抗原浓度为107cfu/mL，多克隆抗体稀释度为1:500，酶标二抗稀释度为1:1000，抗原抗体最适反应时间30min，二抗最适反应时间60min。
2)包被:将盐单胞菌O抗原用CBS稀释至107cfu/mL，100μL/孔加入酶标孔中，置于4℃冰箱内孵育过夜；
3)洗板:将酶标板中的液体扣掉，洗涤3次；
4)封闭：加入封闭缓冲液，200μL/孔，37℃封闭60min；
5)洗板：将孵育后的酶标板中的液体扣掉，洗涤3次；
6)加抗体：分别加入100μL抗体稀释液、阴性血清、抗体稀释液以1:500比例稀释的阳性血清至酶标板，充分混匀后37℃孵育30min；
7)洗板：将孵育后的酶标板中的液体扣掉，洗涤3次；
8)加二抗：加入以1:1000比例稀释的HRP标记二抗100μL/孔，37℃孵育60min；
9)洗板：将孵育后的酶标板中的液体扣掉，洗涤3次；
10)显色：加入TMB显色液100μL/孔，避光静置显色反应20min，然后加入2M的浓硫酸50μL/孔终止反应；
11)测定：酶标仪测定450nm的吸光值(OD450)。根据标准品OD450和标准品浓度制作标准曲线(见图2，图中1-9分别表示109cfu/mL、108cfu/mL、107cfu/mL、106cfu/mL、105cfu/mL、104cfu/mL、103cfu/mL、102cfu/mL、10cfu/mL)，以标准曲线对待测样品进行定量分析。标准曲线见图2。从图2可见本实验所获得的抗体的线性检测范围为105-108cfu/mL。
9、交叉反应过程
1)选择包被抗原浓度为107cfu/mL，多克隆抗体稀释度为1:500，酶标二抗稀释度为1:1000，抗原抗体最适反应时间30min，二抗最适反应时间60min。
2)包被:将盐单胞菌、溶藻弧菌、假交替单胞菌、鞘氨醇单胞菌、海杆菌的O抗原用CBS稀释至107cfu/mL，100μL/孔加入酶标孔中，置于4℃冰箱内孵育过夜；
3)洗板:将酶标板中的液体扣掉，洗涤3次；
4)封闭：加入封闭缓冲液，200μL/孔，37℃封闭60min；
5)洗板：将孵育后的酶标板中的液体扣掉，洗涤3次；
6)加抗体：分别加入100μL抗体稀释液、阴性血清、抗体稀释液以1:500比例稀释的阳性血清至酶标板，充分混匀后37℃孵育30min；
7)洗板：将孵育后的酶标板中的液体扣掉，洗涤3次；
8)加二抗：加入以1:1000比例稀释的HRP标记二抗100μL/孔，37℃孵育60min；
9)洗板：将孵育后的酶标板中的液体扣掉，洗涤3次；
10)显色：加入TMB显色液100μL/孔，避光静置显色反应20min，然后加入2M的浓硫酸50μL/孔终止反应；
11)测定：酶标仪测定450nm的吸光值(OD450)。结果见表5。本发明建立的盐单胞菌菌株的间接酶联免疫定量检测方法与溶藻弧菌、假交替单胞菌、鞘氨醇单胞菌及海杆菌的交叉反应均不显著，结果表明该间接酶联免疫检测方法有较高的特异性。
表5免疫血清交叉实验测定
Claims (4)
1.一种盐单胞菌菌株的间接酶联免疫定量检测方法，其特征在于包括以下步骤：
1)盐单胞菌O抗原的制备：首先将盐单胞菌接至2216E液体培养基作增殖培养；然后将所述的盐单胞菌制备成菌体O抗原；
2)盐单胞菌多克隆抗体的制备：
以盐单胞菌O抗原为免疫抗原，免疫新西兰大白兔并利用现有的多克隆抗体制备与纯化技术获得盐单胞菌多克隆抗体，该抗体可与盐单胞菌特异性结合；
3)间接ELISA操作方法
3.1)以碳酸盐缓冲液稀释步骤1得到的抗原至107cfu/mL，将稀释后的包被抗原加入酶标板中，每孔100μL，置于4℃冰箱内孵育过夜；将孵育过夜后的酶标板甩干液体，然后每孔加入300μL洗涤液洗涤3次后，加入封闭液，37℃封闭60min后以PBST洗涤3次；
3.2)用抗体稀释液以1:500的比例稀释步骤2得到的多克隆抗体，再加入到上述酶标板中，每孔100μL；37℃孵育30min后以PBST洗涤3次；
3.3)以PBST 1:1000的比例稀释辣根过氧物酶标记的羊抗兔IgG-HRP，然后加入到上述酶标板中，每孔100μL，37℃孵育60min后以PBST洗涤3次；
3.4)将四甲基联苯胺显色液A液和B液1:1混合后加入到上述酶标板中，每孔100μL，37℃显色20min；将2M硫酸溶液加入到上述酶标板中终止反应，每孔50μL；用酶标仪在450nm波长下测吸光值OD450，得到盐单胞菌标准品溶液的标准曲线，以及待测样品的吸光值，将所得的待测样品的吸光值与所做标准曲线对比可比算出待测样品的盐单胞菌含量。
2.如权利要求1所述的盐单胞菌菌株的间接酶联免疫定量检测方法，其特征在于上述步骤1)盐单胞菌O抗原的制备具体如下：将盐单胞菌接种于2216E液体培养基，25℃、200r/min下放入摇床活化增菌培养，24h后，8000r/min离心15min收集菌体，将沉淀悬浮于0.5％石碳酸生理盐水，再加入等量的无水酒精混合，放入冰箱过夜后用生理盐水稀释至108cfu/mL，放入4℃或-20℃备用，即得到盐单胞菌O抗原。
3.如权利要求1所述的盐单胞菌菌株的间接酶联免疫定量检测方法，其特征在于上述步骤2)盐单胞菌多克隆抗体的制备具体如下：选取6个月以上，体重在2-3kg的雄性新西兰大白兔作为实验动物，实验前暂养一周；将用生理盐水稀释至108cfu/mL的盐单胞菌O抗原作为免疫原,然后与等量的弗氏佐剂混合用搅拌法使其乳化；初次免疫将乳化好的抗原溶液于兔子背部皮下多点注射，每只注射1.2mL，两周后进行第一次加强免疫，用不完全弗氏佐剂乳化，注射部位和剂量与初次免疫相同，一周后进行第二次加强免疫，注射0.3mL稀释后的抗原溶液进行免疫，免疫部位为耳静脉，一周后进行最后一次加强免疫，操作与第二次加强免疫相同，从耳缘静脉采血，采用直接ELISA法测定抗体效价，确定抗体效价可用后采用耳动脉取血获得抗血清，收集于灭菌离心管中；将此抗血清高速离心并过滤纯化后于-20℃保存，即得到盐单胞菌多克隆抗体。
4.如权利要求3所述的盐单胞菌菌株的间接酶联免疫定量检测方法，其特征在于上述采用直接ELISA法测定抗体效价具体如下：
1)将盐单胞菌O抗原用CBS稀释至108cfu/mL，100μL/孔加入酶标孔中，置于4℃冰箱内过夜,次日取出酶标板，将孵育后的酶标板中的液体扣掉，每孔加入PBST洗涤液300μL，洗涤3min，甩去洗涤液，在吸水纸上拍干，重复此洗涤过程3次；以下洗涤方法相同；
2)加封闭缓冲液200μL/孔封闭酶标板，37℃孵育60min；
3)将封闭缓冲液扣掉，洗涤3次；
4)将抗血清稀释液、阴性血清、阳性血清稀释成系列浓度加入酶标孔，100μL/孔，37℃孵育60min后洗涤3次；
5)每孔加入100μL 1：3000稀释的酶标羊抗兔IgG-HRP，37℃孵育60min后洗涤3次；
6)加入100μL TMB显色液，其中A液:B液的混合比例为1:1，暗处静置显色反应20min后每孔加入50μL 2M浓硫酸终止反应，用酶标仪测定450nm的吸光值；以P/N值大于2.1对应的最大的抗血清稀释度为抗血清效价。
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| C06 | Publication | ||
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| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
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Granted publication date: 20170510 |