CN101712971A - 一种山羊支原体山羊肺炎亚种抗原及其制备方法 - Google Patents

Abstract

一种山羊支原体山羊肺炎亚种多糖抗原，从山羊支原体山羊肺炎亚种培养物上清中提取菌体分泌多糖，经过：a支原体培养；b支原体多糖抗原的提取等工艺步骤制备而成。本发明的优越性包括以下方面：(1)本发明中抗原为从山羊支原体山羊肺炎亚种培养物上清中提取的多糖抗原，为菌体分泌多糖，具有很强的特异性，能真实地检测山羊支原体山羊肺炎亚种抗体；(2)用多糖致敏醛化-鞣酸化绵羊红细胞，避免了新鲜绵羊红细胞保存时间短、致敏效价低的缺点，易于长时间保存，血凝效价高。(3)操作简单、方便快速，无需特殊设备和仪器，适合在基层推广应用；(4)本发明是目前国内唯一的检测山羊支原体山羊肺炎抗体的诊断试剂。

Description

一种山羊支原体山羊肺炎亚种抗原及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，具体说是一种山羊支原体山羊肺炎亚种抗原的制备方法，本发明还包括采用上述山羊支原体山羊肺炎亚种多糖抗原致敏醛化-鞣酸化绵羊红细胞制备用于检测山羊支原体山羊肺炎亚种抗体的间接血凝诊断试剂的方法。

背景技术

山羊支原体山羊肺炎亚种是山羊传染性胸膜肺炎的病原，山羊传染性胸膜肺炎是世界动物卫生组织(OIE)所列需要上报和监控的重要疾病之一，主要流行于非洲、亚洲和地中海沿岸各养羊国家和地区，每年给这些地区的养羊业带来严重经济损失。本病在我国发生的最早文字记载可追溯到1922年的新疆伊犁地区，此后甘肃、宁夏、青海、四川、贵州、广西、河北、辽宁、内蒙、江苏、湖南、河南等十余省市均有临床诊断报道，危害严重。但遗憾的是，迄今这些报道大多为根据临床表现和剖检变化做出的临诊报告，鲜见应用准确的实验室诊断技术。因此，本病在我国的实际流行情况和准确的流行病学信息仍较为匮乏，造成这种现象的原因，主要是我国目前缺乏有效的检测山羊支原体山羊肺炎亚种的相关技术。

发明内容

本发明的目的是为了解决当前我国缺乏山羊支原体山羊肺炎亚种抗体检测技术难题，提供一种山羊支原体山羊肺炎亚种多糖抗原及其制备方法，本发明同时提供用这种抗原制备间接血凝诊断试剂的方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种山羊支原体山羊肺炎亚种多糖抗原，从山羊支原体山羊肺炎亚种培养物上清中提取菌体分泌多糖，采用以下步骤制备：

a支原体培养

将山羊支原体山羊肺炎亚种接种支原体培养基，37℃培养，当培养基颜色变为黄色时，pH值下降至6.8～7.0，按1∶20的体积比连续扩大培养3次，取培养物12000rpm离心30min，收获上清备用；

b支原体多糖抗原的提取

b.1用冰醋酸调节培养物上清pH值到5.0，煮沸60min，等冷却后用滤纸过滤，去除杂质，得到滤液；

b.2将无水乙醇按2∶1的体积比加入到上一部所得滤液中混匀，置于4℃条件下过夜后，5000rpm离心20min，去上清，将沉淀物溶解于灭菌水中；加入等体积的60％苯酚，混匀，68℃水浴1h，取出置4℃条件下过夜后，6000rpm离心30min，将上清装入透析袋中，用自来水透析48h；

b.3将无水乙醇按2∶1的体积比加入到透析液中混匀，置4℃条件下过夜后，7000rpm离心30min，弃上清，收集沉淀物；将沉淀物溶于灭菌水，装入透析袋中，用双蒸水透析48h，每4h换一次水；

b.4取出透析袋，用电吹风或37℃温箱中通过蒸发将透析液进行10～20倍浓缩，浓缩液即为多糖抗原；用苯酚-浓硫酸法测定多糖的含量。

一种采用上述山羊支原体山羊肺炎亚种多糖抗原致敏醛化-鞣酸化绵羊红细胞制备检测山羊支原体山羊肺炎亚种抗体的间接血凝诊断试剂的方法，其抗原的最佳致敏浓度为10μg/ml～20μg/ml，按下述步骤制备：

取1份多糖抗原与1份10％醛化-鞣酸化绵羊红细胞混合均匀，在37℃水浴中作用50min，其间不断搅拌；离心沉积红细胞，用含1％健康兔血清的0.15mol/L pH7.2PBS洗涤三次后，配成1％致敏红细胞悬液，即为间接血凝诊断抗原，与配套试剂组装成检测山羊支原体山羊肺炎亚种抗体的间接血凝诊断试剂，包括：抗原1瓶，10ml/瓶；标准阳性血清1瓶，1ml/瓶；标准阴性血清1瓶，1ml/瓶；稀释液3瓶，10ml/瓶。

检测时，先在96孔“∨”型聚苯乙烯滴定板8行12列上每孔滴加稀释液25μL；然后在1～9列每列第1孔分别加入被检血清25μL，每份被检血清用1列，第10、11列第1孔分别加入标准阳性血清、标准阴性血清各25μL，第12列为空白对照。用排枪将1～11列第1孔充分混匀后吸取25μL加入第2孔，依次连续稀释至第8孔，混匀后从第8孔弃去25μL；最后每孔滴加1％致敏红细胞悬液(诊断抗原)25μL，加样完毕将∨型滴定板放在微量震荡器上震荡1min，置37℃温箱2h，判定结果。

判定标准：红细胞全部凝集(++++)；75％红细胞凝集(+++)；50％红细胞凝集(++)；25％红细胞凝集(+)；无凝集(-)。阳性血清对照1～8孔应呈现“++++～++”凝集；阴性血清和空白对照应呈现“-”。在对照孔合格的前提下，观察待检血清各孔。以呈现“++”凝集的最大稀释倍数作为该份血清的抗体效价。效价≥1∶8(++)判为阳性，效价≤1∶4(++)判为阴性。效价介于两者之间判为可疑，需重新测定，仍为可疑判为阳性。

本发明的优越性包括以下方面：(1)本发明中抗原为从山羊支原体山羊肺炎亚种培养物上清中提取的多糖抗原，为菌体分泌多糖，具有很强的特异性，能真实地检测山羊支原体山羊肺炎亚种抗体；(2)用多糖致敏醛化-鞣酸化绵羊红细胞，避免了新鲜绵羊红细胞保存时间短、致敏效价低的缺点，易于长时间保存，血凝效价高。(3)操作简单、方便快速，无需特殊设备和仪器，全程在2～3小时内完成，适合在基层推广应用；(4)本发明是目前国内唯一的检测山羊支原体山羊肺炎抗体的诊断试剂，且价格低廉，安全稳定，无毒性，无环境污染。

具体实施方式

实施例1、

1培养支原体

1.1培养基配制

配制改良KM2培养基1200ml。将1.7％水解乳蛋白Hank’s缓冲液420ml，25％酵母浸液24ml，1％醋酸铊溶液12ml，0.4％酚红12ml，混合后经10磅20分钟高压灭菌，冷却后加入用0.22μm微孔滤膜滤过除菌的最低要素培养基(MEM)600ml，健康马血清120ml，2万IU青霉素12ml，用1mol/L氢氧化钠溶液调整pH值至pH值为7.4，8℃保存备用。

1.2支原体培养

将山羊支原体山羊肺炎亚种接种改良KM2培养基5ml，置37℃培养6天，培养基颜色变为黄色，pH值为6.8，按体积比1∶20连续扩大培养3次，获得培养物1000ml，12000rpm离心30min，收获上清950ml备用；

2支原体多糖抗原的提取

2.1用冰醋酸调节培养物上清pH值到5.0，煮沸60min，冷却后用滤纸过滤，去除杂质，得到滤液900ml；

2.2将1800ml无水乙醇加入到滤液中混匀，4℃条件下过夜后，5000rpm离心20min，去上清，将沉淀物溶解在50ml灭菌水中；加入等体积的60％苯酚，混匀，68℃水浴1h，取出置4℃条件下过夜后，6000rpm离心30min，将上清装入透析袋中，用自来水透析48h；

2.3将120ml无水乙醇加入到透析液中混匀，置4℃过夜后，7000rpm离心30min，弃上清，收集沉淀物；将沉淀物溶于50ml灭菌水，装入透析袋中，用双蒸水透析48h，每4h换一次水；

2.4取出透析袋，用电吹风将透析液进行20倍浓缩，得到2.5ml浓缩液，用苯酚-浓硫酸法测定多糖的含量为8.4mg/ml。

3多糖抗原致敏醛化-鞣酸化绵羊红细胞

将多糖抗原稀释成200μg/ml，取1份多糖抗原与1份10％醛化-鞣酸化绵羊红细胞混合均匀，致敏浓度为10μg/ml，在37℃水浴中作用50min，其间不断搅拌；离心沉积红细胞，用含1％健康兔血清的0.15mol/L pH7.2PBS洗涤三次后，配制成1％致敏红细胞悬液，作为间接血凝诊断抗原，与配套试剂组装成检测山羊支原体山羊肺炎亚种抗体的间接血凝诊断试剂，包括：抗原1瓶，10ml/瓶；标准阳性血清1瓶，1ml/瓶；标准阴性血清1瓶，1ml/瓶；稀释液3瓶，10ml/瓶。

4特异性试验

用本发明中的山羊支原体山羊肺炎亚种抗体检测间接血凝诊断试剂，对健康山羊血清、丝状支原体山羊亚种阳性血清、绵羊肺炎支原体阳性血清、溶血曼氏杆菌阳性血清、猪肺炎支原体阳性血清进行检测，结果均为阴性(参见表1)，说明该抗原具有极高的特异性。

表1山羊支原体山羊肺炎亚种间接血凝诊断试剂特异性试验结果(1)

5田间样品检测

对采自青海、甘肃不同羊场的167份田间血清，其中临床表现症状病羊血清28份，发病后剖检表现典型病变的羊血清19份，临床健康羊血清120份，用本发明的间接血凝诊断试剂进行检测。结果28份发病羊血清和19份剖检表现典型病变羊血清均为阳性，符合率为100％，而120临床健康羊血清中有116份阴性，另有4份阳性，符合率为96.7％。这也表明本发明的诊断试剂可从临床诊断健康山羊血清中检测出山羊支原体山羊肺炎亚种抗体，证实本发明的间接血凝诊断试剂可用于山羊支原体山羊肺炎亚种的早期诊断和流行病学调查。

实施例2、

1培养支原体

1.1培养基配制

配制改良KM2培养基1500ml。将1.7％水解乳蛋白Hank’s缓冲液525ml，25％酵母浸液30ml，1％醋酸铊溶液15ml，0.4％酚红15ml，混合后经10磅20分钟高压灭菌，冷却后加入用0.22μm微孔滤膜滤过除菌的最低要素培养基(MEM)750ml，健康马血清150ml，2万IU青霉素15ml，用1mol/L氢氧化钠溶液调整pH值至pH值为7.8，2℃保存备用。

1.2支原体培养

将山羊支原体山羊肺炎亚种接种改良KM2培养基5ml，置37℃培养5天，培养基颜色变为黄色，pH值为7.0，按1∶20(体积比)连续扩大培养3次，获得取培养物1200ml，12000rpm离心30min，收获上清1180ml备用；

2支原体多糖抗原的提取

2.1用冰醋酸调节培养物上清pH值到5.0，煮沸60min，冷却后用滤纸过滤，去除杂质，得到滤液1000ml；

2.2将2000ml无水乙醇加入到滤液中混匀，4℃过夜后，5000rpm离心20min，去上清，将沉淀物溶解在50ml灭菌水中；加入等体积的60％苯酚，混匀，68℃水浴1h，取出置4℃过夜后，6000rpm离心30min，将上清装入透析袋中，用自来水透析48h；

2.3将120ml无水乙醇加入到透析液中混匀，置4℃过夜后，7000rpm离心30min，弃上清，收集沉淀物；将沉淀物溶于50ml灭菌水，装入透析袋中，用双蒸水透析48h，每4h换一次水；

2.4取出透析袋，在37℃温箱中蒸发，将透析液进行10倍浓缩，得到5ml浓缩液，用苯酚-浓硫酸法测定多糖的含量为4.0mg/ml。

3多糖抗原致敏醛化-鞣酸化绵羊红细胞

将多糖抗原稀释成400μg/ml，取1份多糖抗原与1份10％醛化-鞣酸化绵羊红细胞混合均匀(致敏浓度为20μg/ml)，在37℃水浴中作用50min，其间不断搅拌；离心沉积红细胞，用含1％健康兔血清的0.15mol/LpH7.2PBS洗涤三次后，配制成1％致敏红细胞悬液，作为间接血凝诊断抗原，与配套试剂组装成检测山羊支原体山羊肺炎亚种抗体的间接血凝诊断试剂，包括：抗原1瓶，10ml/瓶；标准阳性血清1瓶，1ml/瓶；标准阴性血清1瓶，1ml/瓶；稀释液3瓶，10ml/瓶。

4特异性试验

用本发明中的山羊支原体山羊肺炎亚种抗体检测间接血凝诊断试剂，对健康山羊血清、丝状支原体山羊亚种阳性血清、绵羊肺炎支原体阳性血清、溶血曼氏杆菌阳性血清、猪肺炎支原体阳性血清进行检测，结果均为阴性(参见表2)，说明该抗原具有极高的特异性。

表2山羊支原体山羊肺炎亚种间接血凝诊断试剂特异性试验结果(2)

5田间样品检测

对采自青海、甘肃不同羊场的167份田间血清，其中临床表现症状病羊血清28份，发病后剖检表现典型病变的羊血清19份，临床健康羊血清120份，用本发明的间接血凝诊断试剂进行检测。结果28份发病羊血清和19份剖检表现典型病变羊血清均为阳性，符合率为100％，而120临床健康羊血清中有115份阴性，另有5份阳性，符合率为95.8％。这也表明本发明的诊断试剂可从临床诊断健康山羊血清中检测出山羊支原体山羊肺炎亚种抗体，证实本发明的间接血凝诊断试剂可用于山羊支原体山羊肺炎亚种的早期诊断和流行病学调查。

Claims (2)

1.一种山羊支原体山羊肺炎亚种多糖抗原，其特征在于从山羊支原体山羊肺炎亚种培养物上清中提取菌体分泌多糖，采用以下方法和步骤制备而成：

a支原体培养

将山羊支原体山羊肺炎亚种接种支原体培养基，37℃培养，当培养基颜色变为黄色时，pH值下降至6.8～7.0，按1∶20的体积比连续扩大培养3次，取培养物12000rpm离心30min，收获上清备用；

b支原体多糖抗原的提取

b.1用冰醋酸调节培养物上清pH值到5.0，煮沸60min，等冷却后用滤纸过滤，去除杂质，得到滤液；

b.2将无水乙醇按2∶1的体积比加入到上一部所得滤液中混匀，置于4℃条件下过夜后，5000rpm离心20min，去上清，将沉淀物溶解于灭菌水中；加入等体积的60％苯酚，混匀，68℃水浴1h，取出置4℃条件下过夜后，6000rpm离心30min，将上清装入透析袋中，用自来水透析48h；

b.3将无水乙醇按2∶1的体积比加入到透析液中混匀，置4℃条件下过夜后，7000rpm离心30min，弃上清，收集沉淀物；将沉淀物溶于灭菌水，装入透析袋中，用双蒸水透析48h，每4h换一次水；

b.4取出透析袋，用电吹风或37℃温箱中通过蒸发将透析液进行10～20倍浓缩，浓缩液即为多糖抗原；用苯酚-浓硫酸法测定多糖的含量。

2.一种采用权利要求1所述山羊支原体山羊肺炎亚种多糖抗原致敏醛化-鞣酸化绵羊红细胞制备检测山羊支原体山羊肺炎亚种抗体的间接血凝诊断试剂的方法，其特征在于抗原的最佳致敏浓度为10μg/ml～20μg/ml，按下述步骤制备：

取1份多糖抗原与1份10％醛化-鞣酸化绵羊红细胞混合均匀，在37℃水浴中作用50min，其间不断搅拌；离心沉积红细胞，用含1％健康兔血清的0.15mol/L pH7.2PBS洗涤三次后，配成1％致敏红细胞悬液，即为间接血凝诊断抗原，与配套试剂组装成检测山羊支原体山羊肺炎亚种抗体的间接血凝诊断试剂，包括：抗原1瓶，10ml/瓶；标准阳性血清1瓶，1ml/瓶；标准阴性血清1瓶，1ml/瓶；稀释液3瓶，10ml/瓶。