CN104833800A - 检测山羊支原体山羊肺炎亚种的试纸条及其制备方法 - Google Patents

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CN104833800A CN201510282069.2A CN201510282069A CN104833800A CN 104833800 A CN104833800 A CN 104833800A CN 201510282069 A CN201510282069 A CN 201510282069A CN 104833800 A CN104833800 A CN 104833800A
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赵萍
高鹏程
逯忠新
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Abstract

本发明公开一种检测山羊支原体山羊肺炎亚种的胶体金试纸条及制备方法。本发明的检测山羊支原体山羊肺炎亚种的试纸条，其中：胶体金垫包被的抗原为经超声波破碎处理后得到的山羊支原体山羊肺炎亚种全菌抗原，检测线包被的是山羊支原体山羊肺炎亚种多糖抗原，质控线为山羊支原体山羊肺炎亚种全菌的多抗IgG。本发明能真实地检测山羊支原体山羊肺炎亚种产生的抗体，具有：不与其它任何相似支原体发生交叉反应的特异性；成本低，操作简单，可长期贮存，对人体无毒害的优点。

Description

检测山羊支原体山羊肺炎亚种的试纸条及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种畜牧业使用的家畜疾病检测用试纸条及制备方法，特别是一种检测山羊支原体山羊肺炎亚种的胶体金试纸条，和该试纸条的制备方法。
背景技术
山羊支原体山羊肺炎亚种是引起山羊传染性胸膜肺炎的主要病原，山羊传染性胸膜肺炎给山羊的养殖业带来了很大危害，由于该病原极易与丝状支原体山羊肺炎亚种发生混合感染，而且山羊支原体山羊肺炎亚种很难分离，故而早期的血清学诊断就成了非常重要的途径。进几年针对该病原建立了几种方法，包括血清学检测方法间接血凝和病原学检测方法PCR，其中间接血凝需要专业的技术人员操作检测，试验条件要求相对严格；而病原学检测方法PCR需要得到病羊的病变生物标本，相对较困难，而且对试验条件要求更为严格。
发明内容
本发明提供一种可克服现有技术不足，能简捷、方便且快速地进行山羊支原体山羊肺炎亚种抗体检测的试纸条及其制备方法。
本发明所述的检测山羊支原体山羊肺炎亚种的试纸条，包括：底板、设置于底板上依次线性排列的样品吸收垫、包被有抗原的胶体金垫、硝酸纤维膜和吸水垫组成，在硝酸纤维素膜上包被有质控线与检测线，其中：胶体金垫包被的抗原为经超声波破碎处理后得到的山羊支原体山羊肺炎亚种全菌抗原，检测线包被的是山羊支原体山羊肺炎亚种多糖抗原，质控线为山羊支原体山羊肺炎亚种全菌的多抗IgG。
进一步，本发明所述的检测山羊支原体山羊肺炎亚种的试纸条的胶体金垫包被的抗原为山羊支原体山羊肺炎亚种M1601菌株经超声波破碎处理后得到全菌抗原。
本发明所述的检测山羊支原体山羊肺炎亚种的试纸条制备方法是：
a.在胶体金中加入山羊支原体山羊肺炎亚种全菌抗原，得到金标山羊支原体山羊肺炎亚种全菌抗原；
b.在不透水材料的底板上依次固定吸水材料制成的样品垫、玻璃纤维材料构成的连接垫、硝酸纤维膜和固定吸水材料制成的样品垫，并确保：样品垫与连接垫间、连接垫与硝酸纤维膜间和硝酸纤维素膜和吸收垫间相互重叠；
c.将金标山羊支原体山羊肺炎亚种全菌抗原喷涂于连接垫上，形成金标垫，在硝酸纤维膜上以横向线状分别喷涂山羊支原体山羊肺炎亚种多糖抗原和山羊支原体山羊肺炎亚种全菌的多抗IgG，形成检测线和质控线，其中检测线与质控线间以间隙相隔，再用含BSA的PBS封闭硝酸纤维膜；
e．经洗脱，干燥处理后按需裁剪成适当宽度，得到试纸条。
本发明所述的方法中涉及的山羊支原体山羊肺炎亚种全菌抗原制备方法是：取种子接种于MTB培养基，中，置37℃培养2～5日，将培养物离心处理后弃上清，将沉淀用用磷酸缓冲液清洗超声破碎处理后离心处理，取上清得到所需的山羊支原体山羊肺炎亚种全菌抗原，其中所用的MTB培养基制备方法如下：
培养基成分
不含结晶紫的P PLO肉汤                 21g/L
25%鲜酵母浸液                       100mL/L
灭活马血清                           200mL/L
5%醋酸铊溶液                        4mL/L
青霉素                               20万IU/L
葡萄糖                               2 g/L
0.4%酚红                             0.18mL
丙酮酸钠                             2 g/L
将21 g PPLO肉汤溶于700 ml无离子水中，121℃高压灭菌20 分钟，其余成分混合溶解后用0.22μm滤膜过滤，无菌加入冷却的PPLO肉汤中，用灭菌的1M NaOH调pH至7.6~7.8，分装试管或三角瓶等，2~8℃保存备用。
本发明的山羊支原体山羊肺炎亚种的试纸条制备方法中，抗原结合金标垫的pH值为7.0，且在抗原结合的过程中加入20% BSA 50ul/ml、1%PEG 20000 50ul/ml进行封闭，封闭时间为30分钟，离心后的重悬液其配方为：0.02M四硼酸钠、0.5% BSA、5%蔗糖、0.05%吐温20，重悬后铺金，37℃干燥1小时，然后再进行试纸条的组装。
本发明所述的方法中涉及的山羊支原体山羊肺炎亚种多糖抗原制备方法是：取山羊支原体山羊肺炎亚种种子接种于MTB培养基中，置37℃培养2～5日，将培养物离心处理后取上清，用冰醋酸调节培养物上清pH为5.0，煮沸1小时，冷却后用Whatman滤纸过滤，除去杂质，收集滤液，用酚-醇法提取多糖抗原后纯化处理，得到目标抗原。
本发明所述的方法中涉及的山羊支原体山羊肺炎亚种全菌的多抗IgG制备方法是：在1.2mg/ml山羊支原体山羊肺炎亚种M1601株浓缩全菌液3mL中加入弗氏完全佐剂3mL，经充分混合乳化；在1.2mg/ml山羊支原体山羊肺炎亚种M1601株浓缩全菌液3mL中加入弗氏不完全佐剂3mL，经充分混合乳化；选用健康雄性家兔在兔两后腿足部皮下，腘淋巴结处及背部皮下多点接种弗氏完全佐剂抗原，接种总量为1.5mL；14日后仍以弗氏完全佐剂抗原1.5ml由背部皮下多点接种，进行第二次免疫；隔14日后，以弗氏不完全佐剂抗原，在每只兔脚掌两点，背部皮下多点接种，接种总量为3mL，为其第三次免疫；隔14日后由耳缘静脉采血分离血清，以IHA试验试血，免疫兔血清IHA效价达1:512，正式采血，采用37℃温箱放置1小时，4℃冰箱放置2小时，自然析出后3000rpm离心5min分离血清，再用饱和硫酸铵沉淀法将分离到的血清纯化获得山羊支原体山羊肺炎亚种多抗IgG。
胶体金试纸条是是一种检测时间短、方法简单易操作、且灵敏度高，且对试验条件无严格要求的检测系统。本发明的胶体金抗体检测试纸条采用的是双抗原夹心法，利用山羊支原体山羊肺炎亚种特有的多糖抗原以及全菌超破抗原两种抗原以及针对多抗提纯IgG建立检测方法，便于快速对是否感染山羊支原体山羊肺炎亚种做出判断，做到早防早治，也同时也可以对免疫后早期出现抗体进行检测。
本发明有如下优点：
（1）本发明中包被胶体金的抗原为山羊支原体山羊肺炎亚种全菌超破抗原，该抗原包括了该支原体的全部特异性表位，能真实地检测山羊支原体山羊肺炎亚种产生的抗体；
（2）本发明中的检测线为山羊支原体山羊肺炎亚种多糖抗原，该多糖抗原为山羊支原体山羊肺炎亚种所特有的抗原，经间接血凝检测不与其它任何相似支原体发生交叉反应，从而更增加了该试纸条的特异性；
（3）成本低，操作简单、方便快速，无需特殊设备和仪器，全程在15min内完成，比间接血凝试验以及ELISA试验节约成本，测试结果呈现肉眼可见的颜色反应，无需特殊仪器，无需特定的操作人员，可方便用于山羊支原体山羊肺炎亚种流行病学调查以及在基层推广使用；
（4）标记物稳定，标记样品在4℃贮存两年以上，无信号衰减现象；
（5）胶体金本身为红色，不需要加入发色试剂，省却了ELISA检测方法中酶标的致癌性底物及终止液的步骤，对人体无毒害。
附图说明
图1：为本发明的试纸条示意图，图中：1样品吸收垫，2胶体金垫，3检测线T，4质控线C，5吸水垫，6底板，7硝酸纤维膜。
图2：为本发明的试纸条对标准阳性血清和阴性血清检测结果图，在实际的使用中：阳性显示检测线和质控线均为红色，阴性检测线不显色，质控线为红色。
图3：本发明试纸条检测的特异性检测结果图。本试纸条对绵羊肺炎支原体和丝状支原体山羊亚种阳性血清进行检测，结果均为阴性，特异性良好。
图4：本发明试纸条敏感性检测结果图。山羊支原体山羊肺炎亚种阳性血清，稀释至1:1024仍能检测到为阳性，表明敏感性好。
具体实施方式
本发明以下结合实施例解说。
本发明的山羊支原体山羊肺炎亚种抗体检测试纸条制备方法是：
一、山羊支原体山羊肺炎亚种全菌抗原制备
多抗抗原制备方法如下：（1）全菌抗原的制备：取山羊支原体山羊肺炎亚种M1601株种子按培养基总量的5％，接种MTB培养基中，置37℃培养2～5日。将培养物12000r/min离心30min。弃上清，将沉淀用0.15M pH7.2的PBS洗2次，超声破碎3次，5000r/min离心20min，取上清得到所需的山羊支原体山羊肺炎亚种全菌抗原。测定浓度，备用；
其中所用的MTB培养基制备方法如下：
成分
不含结晶紫的P PLO肉汤                 21g/L
25%鲜酵母浸液                       100mL/L
灭活马血清                           200mL/L
5%醋酸铊溶液                        4mL/L
青霉素                               20万IU/L
葡萄糖                               2 g/L
0.4%酚红                             0.18mL
丙酮酸钠                             2 g/L
将21 g PPLO肉汤溶于700 ml无离子水中，121℃高压灭菌20 分钟，其余成分混合溶解后用0.22μm滤膜过滤，无菌加入冷却的PPLO肉汤中，用灭菌的1M NaOH调pH至7.6~7.8，分装试管或三角瓶等，2~8℃保存备用。
二、山羊支原体山羊肺炎亚种多糖抗原制备
取取山羊支原体山羊肺炎亚种M1601株种子按培养基总量的5％，接种MTB培养基中，置37℃培养2～5日。将培养物12000r/min离心30min，取上清，用冰醋酸调节培养物上清pH为5.0，煮沸1小时，等冷却后用Whatman滤纸过滤，除去杂质，收集滤液。用酚-醇法提取多糖抗原，并进行纯化处理，得到目标抗原。测定多糖浓度，备用。
三、山羊支原体山羊肺炎亚种全菌的多抗IgG制备
菌种用山羊支原体山羊肺炎亚种M1601株。用弗氏完全佐剂3mL加1.2mg/ml山羊和支原体山羊肺炎亚种浓缩全菌液，3mL制备出弗氏完全佐剂抗原，并充分混合乳化；用弗氏不完全佐剂3mL加1.2mg/ml山羊支原体山羊肺炎亚种浓缩全菌液3mL制备出弗氏不完全佐剂抗原，并充分混合乳化；选用2kg左右、12月龄的健康雄性家兔。在兔两后腿足部皮下，腘淋巴结处及背部皮下多点接种弗氏完全佐剂抗原，接种总量为1.5mL；14日后仍以弗氏完全佐剂抗原1.5ml由背部皮下多点接种，进行第二次免疫；隔14日后，以弗氏不完全佐剂抗原，在每只兔脚掌两点，背部皮下多点接种，接种总量为3mL，为其第三次免疫；隔14日后由耳缘静脉采血分离血清，以IHA试验试血，免疫兔血清IHA效价达1:512，正式采血，采用37℃温箱放置1小时，4℃冰箱放置2小时，自然析出后3000rpm离心5min分离血清，得到山羊支原体山羊肺炎亚种高免血清，用饱和硫酸铵沉淀法将分离到的血清纯化获得山羊支原体山羊肺炎亚种多抗IgG。
四、金溶胶的制备
取1g氯化金，一次溶解于超纯水中配制成1%的氯金酸水溶液，1%氯金酸水溶液稀释成0.01%100mL，加热至沸，搅拌加入１％柠檬酸三钠水溶液2mL，金黄色的氯金酸水溶液在2min内变为紫红色，继续煮沸15min。冷却后即为胶体金。加入0.02%的NaN3，经一次性灭菌滤器过滤，装入洁净的玻璃瓶中备用。胶体金浓度以检测特定波长下的光吸收值定量，D 523nm为1.1～1.2。
五、抗原标记
取制备的胶体金300mL，用0.1mol/LK2CO3溶液调整pH值为7.0，加入山羊支原体山羊肺炎亚种全菌抗原，终浓度为40μg/ml。室温下电磁搅拌30min，且在抗原结合的过程中加入20% BSA 50ul/ml、1%PEG 20000 50ul/ml进行封闭，封闭时间为30分钟， 4℃，2000rpm离心10min，弃沉淀，收集上清液。4℃，12000rpm离心30min，小心吸去上清液，用0.01mol/L pH7.2的PBS洗涤沉淀物两次，离心后的重悬液其配方为：（0.02M四硼酸钠、0.5% BSA、5%蔗糖、0.05%吐温20），用重悬液重悬后铺金，37℃干燥1小时，然后再进行试纸条的组装。用0.01mol/L pH7.2的PBS缓冲液回复体积，即为金标抗原。置4℃保存备用，1周后没有发生凝集。测定胶体金抗原溶液D 523nm =2.5。
六、试纸条制备:取玻璃纤维纸，用喷膜机按15μL/cm将金标山羊支原体山羊肺炎亚种全菌抗原喷涂于玻璃纤维纸上，室温干燥，制成金标垫；在20mm×300mm 硝酸纤维（NC）膜上，用喷膜机横向线状以1.0μL/cm喷涂山羊支原体山羊肺炎亚种多糖抗原，形成检测带。间隔8mm，以1.0μL/cm横向线状喷涂多抗IgG，形成质控带。用含10%BSA的0.02mol/L pH7.2的PBS对喷涂的NC膜进行封闭、洗脱，室温晾干；在PVC底板上分别将洁净的玻璃纤维纸制成的样品垫、包被有检测带和质控带的NC膜、金标垫和吸水纸制成的吸收垫，按下图装配（各部分重叠约1-2mm），按纵向剪切，裁成宽为4.8mm的条状成品。
试纸条组装的具体操作按如下步骤进行：在PVC背衬板上由上至下分别将胶体金垫2，包括检测线3和质控线4的硝酸纤维素膜7以及吸收垫1按顺序装配，将PVC衬板设在最底部，衬板上部中段设有硝酸纤维素膜7，硝酸纤维素膜7上部左端贴有吸收垫1，硝酸纤维素膜7上部右端设有金标垫2，金标垫2的上部右端设有吸水垫5，再分别用喷枪将前述得到的多糖抗原和IgG在硝酸纤维素膜上制出检测线和质控线，在本发明中检测线与质控线两线间距离保持在0.8mm。再将试纸切割成4mm宽的条状，即制成如附图1的结构本发明的山羊支原体山羊肺炎亚种抗体检测试纸条。
本发明试纸条实际检测：将山羊支原体山羊肺炎亚种阳性血清和阴性健康血清用本发明的试纸条进行检测，结果阳性血清出现阳性结果，在检测线和质控线均出现两条带，阴性血清则为阴性结果，只在对照线出现一条带，检测线不出条带，如图2示。
试纸条的特异性：运用该试纸条对山羊支原体山羊肺炎亚种免疫血清进行检测（经间接血凝经间接血凝试剂检测效价均≥1:64）。用该检测试纸条对绵羊肺炎支原体（Y98）和丝状支原体山羊亚种（PG3）两种不同病原的阳性血清进行检测。检测结果为山羊支原体山羊肺炎亚种阳性血清为阳性，在检测线和对照线均出现条带，绵羊肺炎支原体和丝状支原体山羊亚种为阴性，只在对照线出现条带，而检测线上没有任何条带，参见图3。这一实验表明本发明的试纸条特异性良好。
试纸条的敏感性：将山羊支原体山羊肺炎亚种M1601高免兔血清（IHA效价为1：512）进行梯度稀释，用检测试纸条进行检测，当达到1：1024时均能在检测线和对照线出现条带，仍能检测为阳性，表明本发明的试纸条敏感性好，参见图4。
将试纸条密封分别存放于2～8℃条件下，每隔15天取出检测检测山羊支原体山羊肺炎亚种M1601高免兔血清（IHA为1：512）和阴性血清，结果表明该试纸条能在2～8℃条件下保存6个月，且特异性特异性、敏感性均无明显变化。
相关实验表明，本发明的试纸条具有特异性好、敏感性强和重复性的优点。

Claims (7)

1.检测山羊支原体山羊肺炎亚种的试纸条，包括：底板、设置于底板上依次线性排列的样品吸收垫、包被有抗原的胶体金垫、硝酸纤维膜和吸水垫组成，在硝酸纤维素膜上包被有质控线与检测线，其特征在于：胶体金垫包被的抗原为经超声波破碎处理后得到的山羊支原体山羊肺炎亚种全菌抗原，检测线包被的是山羊支原体山羊肺炎亚种多糖抗原，质控线为山羊支原体山羊肺炎亚种全菌的多抗IgG。
2.根据权利要求1所述的检测山羊支原体山羊肺炎亚种的试纸条，其特征在于胶体金垫包被的抗原为山羊支原体山羊肺炎亚种M1601菌株经超声波破碎处理后得到全菌抗原。
3.权利要求1所述的检测山羊支原体山羊肺炎亚种的试纸条制备方法，其特征在于：
a.在胶体金中加入山羊支原体山羊肺炎亚种全菌抗原，得到金标山羊支原体山羊肺炎亚种全菌抗原；
b.在不透水材料的底板上依次固定吸水材料制成的样品垫、玻璃纤维材料构成的连接垫、硝酸纤维膜和固定吸水材料制成的样品垫，并确保：样品垫与连接垫间、连接垫与硝酸纤维膜间和硝酸纤维素膜和吸收垫间相互重叠；
c.将金标山羊支原体山羊肺炎亚种全菌抗原喷涂于连接垫上，形成金标垫，在硝酸纤维膜上以横向线状分别喷涂山羊支原体山羊肺炎亚种多糖抗原和山羊支原体山羊肺炎亚种全菌的多抗IgG，形成检测线和质控线，其中检测线与质控线间以间隙相隔，再用含BSA的PBS封闭硝酸纤维膜；
e．经洗脱，干燥处理后按需裁剪成适当宽度的试纸条。
4.根据权利要求3所述的检测山羊支原体山羊肺炎亚种的试纸条制备方法，其特征在于：抗原结合金标垫的pH值为7.0，且在抗原结合的过程中加入20% BSA 50ul/ml、1%PEG 20000 50ul/ml进行封闭，封闭时间为30分钟，离心后的重悬液其配方为：0.02M四硼酸钠、0.5% BSA、5%蔗糖、0.05%吐温20，重悬后铺金，37℃干燥1小时，然后再进行试纸条的组装。
5.权利要求3或4所述的方法中涉及的山羊支原体山羊肺炎亚种全菌抗原制备方法，其特征在于取种子接种于MTB培养基，中，置37℃培养2～5日，将培养物离心处理后弃上清，将沉淀用用磷酸缓冲液清洗超声破碎处理后离心处理，取上清得到所需的山羊支原体山羊肺炎亚种全菌抗原，其中所用的MTB培养基制备方法如下：
成分
不含结晶紫的P PLO肉汤                 21g/L
25%鲜酵母浸液                       100mL/L
灭活马血清                           200mL/L
5%醋酸铊溶液                        4mL/L
青霉素                               20万IU/L
葡萄糖                               2 g/L
0.4%酚红                             0.18mL
丙酮酸钠                             2 g/L
将21 g PPLO肉汤溶于700 ml无离子水中，121℃高压灭菌20 分钟，其余成分混合溶解后用0.22μm滤膜过滤，无菌加入冷却的PPLO肉汤中，用灭菌的1M NaOH调pH至7.6~7.8，分装试管或三角瓶等，2~8℃保存备用。
6.权利要求3或4所述的方法中涉及的山羊支原体山羊肺炎亚种多糖抗原制备方法，其特征在于取山羊支原体山羊肺炎亚种种子接种于MTB培养基中，置37℃培养2～5日，将培养物离心处理后取上清，用冰醋酸调节培养物上清pH为5.0，煮沸1小时，冷却后用Whatman滤纸过滤，除去杂质，收集滤液，用酚-醇法提取多糖抗原后纯化处理，得到目标抗原。
7.权利要求3或4所述的方法中涉及的山羊支原体山羊肺炎亚种全菌的多抗IgG制备方法，其特征在于在1.2mg/ml山羊支原体山羊肺炎亚种M1601株浓缩全菌液3mL中加入弗氏完全佐剂3mL，经充分混合乳化；在1.2mg/ml山羊支原体山羊肺炎亚种M1601株浓缩全菌液3mL中加入弗氏不完全佐剂3mL，经充分混合乳化；选用健康雄性家兔在兔两后腿足部皮下，腘淋巴结处及背部皮下多点接种弗氏完全佐剂抗原，接种总量为1.5mL；14日后仍以弗氏完全佐剂抗原1.5ml由背部皮下多点接种，进行第二次免疫；隔14日后，以弗氏不完全佐剂抗原，在每只兔脚掌两点，背部皮下多点接种，接种总量为3mL，为其第三次免疫；隔14日后由耳缘静脉采血分离血清，以IHA试验试血，免疫兔血清IHA效价达1:512，正式采血，采用37℃温箱放置1小时，4℃冰箱放置2小时，自然析出后3000rpm离心5min分离血清，再用饱和硫酸铵沉淀法将分离到的血清纯化获得山羊支原体山羊肺炎亚种多抗IgG。
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