CN103235126B - 定量检测食品或自来水中大肠杆菌标志物β-碱性磷酸酯酶的双抗体夹心法 - Google Patents

Abstract

定量检测食品或自来水中大肠杆菌标志物β-碱性磷酸酯酶的双抗体夹心法，属于免疫分析领域。本发明用β-碱性磷酸酯酶免疫8周龄的BALB/c小鼠，经正常的免疫、细胞融合、筛选后得13株β-碱性磷酸酯酶单抗。13株抗体分别标记辣根过氧化物酶并进行两两配对。确定以4号抗体CGMCC No.7204为包被抗体、5号抗体CGMCC No.7205为酶标抗体，以β-碱性磷酸酯酶为标准品建立了β-碱性磷酸酯酶的夹心ELISA法，LOD为0.8ng/mL，R²=0.98，线性范围50-400ng/mL。本发明用β-碱性磷酸酯酶为免疫原，制备了理化性质高度均一、特异性好、可大量制备的β-碱性磷酸酯酶单抗，建立的夹心法为食品及自来水中E.coli菌属的检测提供了新颖、快速、高效的分析手段。

Description

定量检测食品或自来水中大肠杆菌标志物β-碱性磷酸酯酶的双抗体夹心法

技术领域

本发明涉及了一种定量检测食品或自来水中大肠杆菌E.coli标志物β-碱性磷酸酯酶的双抗体夹心法，属于免疫分析领域。

背景技术

大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli），1885年由Escherich发现，分布在自然界，主要附生在人或动物的肠道里，为正常菌群，少数的大肠杆菌具有毒性，可引起疾病。

E.coli常随粪便散布在环境中，作为温血动物肠道细菌的代表，大肠杆菌常作为饮水和食物（或药物）的卫生学标准。若在水和食品中检出此菌，可认为是被粪便污染的指标，从而可能有肠道病原菌的存在。β-碱性磷酸酯酶是位于大肠杆菌胞质空间和表面的一种分子量为50kDa，具有两个相同亚基的酶蛋白，在缺乏磷酸盐时大量合成。因此，β-碱性磷酸酯酶是ELISA检测大肠埃希氏菌E.coli的理想检测对象。

目前，检测E.coli的方法有培养法、酶底物法、PCR方法等。培养法是检测E.coli的国标方法，尽管权威可靠，但一般需要10天得到结果，且操作过程繁琐，不能适应快速检测的要求；酶底物法多利用E.coli属特异性的β-碱性磷酸酯酶或者β-D-葡萄糖苷酸酶的酶学活性催化底物产生荧光，从而在24h内实现对E.coli的检测，优点是检测时间短，操作简单，缺点是酶活性质易受温度、pH、离子强度的影响，所用酶的国外产品质量较为稳定，但相对比较昂贵；PCR方法，检测E.coli属特异性的DNA片段，具有灵敏度高、检测时间短的特点，缺点是成本较高、需要较高的操作技术，且不能避免增菌过程。

尽管食源性致病菌检测方法不断发展，ELISA凭借其快速、灵敏、特异性好、高通量、不需要大型仪器，易于推广的特点成为目前检测微生物的常用方法。直接检测微生物的ELISA试剂盒检测抗原通常为菌体的表面抗原，检测抗体一般有多克隆抗体和单克隆抗体两种。由于单克隆抗体具有理化性质单一、特异性好、亲和力高并可以无限生产的特点，比多克隆抗体具有更大的应用价值。本发明首次通过制备单克隆抗体并建立起检测大肠杆菌分泌的β-碱性磷酸酯酶的双抗体夹心法来实现对大肠杆菌的检测，为食品和自来水中大肠埃希氏菌的快速检测提供了新方法。

发明内容

(一)要解决的技术问题

本发明的目的在于建立一种具有灵敏度高、特异性好、操作方法简单的基于单克隆抗体的大肠杆菌标志物β-碱性磷酸酯酶双抗体夹心法，用于食品和自来水中大肠埃希氏菌的批量、快速检测。

(二)技术方案

为实现上述目的，本发明建立了一种大肠杆菌β-碱性磷酸酯酶的双抗体夹心检测方法，该方法包括对检测方法的优化。

其中，单克隆抗体是采用大肠杆菌β-碱性磷酸酯酶（megazyme）经过特定免疫程序免疫BALB/c小鼠，经杂交瘤技术融合、筛选得到的。

其中，用于配对的抗体是通过优化参数下夹心法配对，并通过多次试验筛选确定的，具有稳定性好、灵敏度高的特点。

其中，建立的夹心法优化了包被抗体的浓度，包被液，封闭液，标准品稀释液，酶标抗体稀释液，酶标抗体稀释浓度。LOD达到0.8ng/mL，R²为0.98，实际检测限为50ng/mL。

定量检测食品或自来水中大肠杆菌E.coli标志物β-碱性磷酸酯酶的双抗体夹心法：

（1）β-碱性磷酸酯酶单克隆抗体的制备

以β-碱性磷酸酯酶（megazyme，来源于大肠杆菌，市售）为免疫原，免疫8周龄的BALB/c小鼠，免疫程序如下：第一周进行首免，100μg/只，弗氏完全佐剂乳化后皮下多点注射；第四周进行二免，100μg/只，弗氏不完全佐剂乳化后皮下多点注射；第六周进行三免，50μg/只，弗氏不完全佐剂乳化后皮下多点注射；第七周尾部采血测效价，选择效价最高的鼠；第八周进行冲刺免疫，20μg/只，生理盐水溶解，腹腔注射；冲刺免疫3天后眼眶采血后进行融合，筛选采用间接ELISA进行，共筛选到13个细胞株。

（2）单克隆抗体的配对筛选

将纯化后的13株单克隆抗体分别标记辣根过氧化物酶HRP，直接法鉴定标记成功后进行夹心法配对；配对参数如下：包被抗体5μg/mL；包被液为pH9.6、0.01M的碳酸盐缓冲液；标品浓度100ng/mL；标品稀释液pH7.2、0.01M的PBS；酶标抗体稀释500倍使用；在此条件下，实验成功得到了16对P/N值>5的配对；

（3）夹心法的建立

选择检测限最稳定的配对，即以11号抗体CGMCC No.7204为包被抗体，以1号抗体CGMCC No.7205为酶标抗体建立夹心法；具体参数如下：

抗体包被浓度：5μg/mL，

包被液：pH9.6、0.01M的碳酸盐缓冲液，

标品稀释液：pH7.2、0.01M的PBS，

检测抗体浓度：4μg/mL，

反应时间：包被、封闭：37℃2h；标准品：37℃1h；检测抗体：37℃1h；显色12min；

优化后β-碱性磷酸酯酶夹心法，LOD：0.8ng/mL，检测限50ng/mL。

本发明方法的检测分析原理是：

酶标板上包被了捕获抗体4（CGMCC No.7204），合适的浓度下可以最大限度捕获β-碱性磷酸酯酶，37℃2h；洗板3次，洗去未结合的抗体，加入封闭液220μL，37℃2h封闭板孔上多余结合位点；洗板3次，加入样品及对照，37℃孵育1h；洗板3次，加入酶标抗体5-HRP（CGMCC No.7205-HRP），37℃孵育1h；洗板4次，加入显色液显色12min。如果样品有≥50ng/mL的β-碱性磷酸酯酶，那么β-碱性磷酸酯酶被捕获抗体4捕获并与酶标抗体5-HRP（CGMCCNo.7205-HRP）结合，并催化底物在450nm产生吸收值，并被判定为阳性；如果样品β-碱性磷酸酯酶浓度＜50ng/mL那么样品不被捕获或者捕获数量太小不足以引起足够的信号，被判定为阴性。

(三)有益效果

本发明提供的大肠杆菌标志物β-碱性磷酸酯酶双抗体夹心检测方法，采用了理化性质高度均一、特异性好、可以大量制备的单克隆抗体，建立的夹心法灵敏度高，稳定性好、成本低，样品的前处理过程简单，能同时检测大量样品，适合食品行业和自来水中大肠杆菌的快速高通量检测，具有推广和应用价值。

生物材料样品保藏：

1、单克隆细胞株4号，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号CGMCC No.7204，保藏日期2013年1月23日。

2、单克隆细胞株5号，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号CGMCC No.7205，保藏日期2013年1月23日。

附图说明

图1大肠杆菌β-碱性磷酸酯酶双抗体夹心法的标准曲线。

具体实施方式

实施例1

以下通过实施例进一步说明本发明。

一、仪器：

TGL－40B台式低速离心机，上海安亭科学仪器厂

KFLOW纯水机，凯佛隆公司

ZD–9556水平摇床，太仓科教器材厂

96孔8×12可拆酶标板，厦门怡佳美实验器材有限公司

MuLtiska Mks酶标仪，Thermo Labsystems公司

可调试移液器，Thermo Labsystems公司

涡旋混合器，上海沪西仪器分析厂

二、试剂：

四甲基联苯胺(TMB)，上海晶纯实业有限公司

其他试剂均为分析纯试剂

三、步骤

1．单克隆抗体的制备

（1）实验动物：选5只8周龄的BALB/c小鼠进行免疫。

（2）抗原配置：将免疫原（β-碱性磷酸酯酶）用生理盐水稀释，配成1mg/mL的溶液。

（3）乳化：将上述溶液与等量完全或不完全福氏佐剂用混合搅拌法将其乳化，乳化完全后皮下多点注射小鼠。

免疫方法：按照特定免疫流程免疫小鼠，3免后用间接竞争法测定效价，效价达到要求后，进行冲刺免疫；冲免3天后眼眶采血后进行融合。

（4）采血：第三次免疫后1周进行断尾采血，采用间接非竞争酶联免疫法测定抗血清效价。

（5）融合、筛选：采用杂交瘤技术进行融合，采用间接ELISA筛选阳性细胞孔，采用有限稀释法对阳性孔进行亚克隆。

（6）抗体的纯化和保存：采用辛酸-饱和硫酸铵法纯化腹水，透析后得到单克隆抗体，采用微量紫外方法测定其浓度后分装后放入-20℃保存。

2、ELISA反应过程：

抗体效价测定步骤：

（1）将包被原用包被缓冲液作系列稀释包被96孔酶标板，100μL/孔，于4℃冰箱过夜。次日取出酶标板回至室温，每孔注入200μL PBST溶液，摇床上振荡3min，用力甩掉洗涤液，在吸水纸上拍干，继续洗涤2次。以下洗涤方法相同。

（2）充分洗涤后，用封闭缓冲液封闭酶标板，200μL/孔，于37℃温育箱内温育2h后取出烘干待用。

（3）将阳性血清系列稀释对应加入到酶标板的前7行列，第8行加入阴性血清，100μL/孔，37℃孵育1h后洗涤、拍干。

（4）每孔加入100μL、1:3000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG，37℃孵育1h后洗涤、拍干。

（5）每孔加入100μL显色液(TMB与底物液比例为1:5)，暗处37℃反应15min，取出后每孔加入100μL终止液(2mol/L的硫酸)，用酶标仪测定吸光值A₄₅₀。

大肠杆菌β-碱性磷酸酯酶双抗体夹心法测定步骤：

a、包被：用6μg/mL的4号抗体（CGMCC No.7204）包被酶标板，100μL/孔，4℃过夜。

b、洗涤：用PBST洗涤反应板三次，每次3min，200μL/孔，然后甩干反应板。

c、封闭：含0.2%明胶的CBS，200μL/孔，37℃封闭2h。

d、洗涤：同b。

e、样品：用PBS将大肠杆菌β-碱性磷酸酯酶母液稀释成6.25，12.5，25，50，100，200，400ng/mL系列浓度，另设一个PBS空白对照。每孔加入100μL样品，于37℃温育1h。

f、洗涤：同b。

g、加酶标抗体(CGMCC No.7205-HRP，4μg/mL),100μL/孔，37C反应lh。

h、洗涤：同b。

i、显色：加底物TMB100μL/孔，显色15min。

j、终止：加终止液50μL/孔。

k、测定：用酶标仪检测OD_450nm

试验结果如下：

1、标准曲线：本发明所获得的抗原检测的线性范围为50～400ng/mL，R²=0.98，请见说明书附图。

2、LOD：LOD是空白的平均吸收值加3倍的标准偏差对应的抗原浓度，大肠杆菌标志物β-碱性磷酸酯酶双抗体夹心法LOD为0.8ng/mL。

Claims (1)

1.定量检测食品或自来水中大肠杆菌E.coli标志物β-碱性磷酸酯酶的双抗体夹心法，其特征在于步骤为：

（1）β-碱性磷酸酯酶单克隆抗体的制备

    以来源于大肠杆菌的β-碱性磷酸酯酶为免疫原，免疫 8周龄的BALB/c小鼠，经融合、筛选，共筛选到13个细胞株；

（2）单克隆抗体的配对筛选

将纯化后的13株单克隆抗体分别标记辣根过氧化物酶HRP，直接法鉴定标记成功后进行夹心法配对；配对参数如下：包被抗体5μg/mL；包被液为pH9.6、0.01M的碳酸盐缓冲液；标品浓度100ng/mL；标品稀释液pH7.2、0.01M的PBS；酶标抗体稀释500倍使用；在此条件下，实验成功得到了16对P/N值>5的配对；

（3）夹心法的建立

选择检测限最稳定的配对，即以4号抗体CGMCC No.7204为包被抗体，以5号抗体CGMCC No.7205为酶标抗体建立夹心法；具体参数如下：

抗体包被浓度：5μg/mL，

包被液：pH9.6、0.01M的碳酸盐缓冲液，

标品稀释液：pH7.2、0.01M的PBS，

酶标抗体浓度：4μg/mL，

反应时间：封闭：37℃ 2h；标准品：37℃ 1h；酶标抗体：37℃ 1h；显色12min；

优化后β-碱性磷酸酯酶夹心法，LOD：0.8ng/mL，检测限50ng/mL。