CN103698521B

CN103698521B - 一种检测食品中大肠杆菌胞内β-葡萄糖苷酸酶的双抗体夹心法

Info

Publication number: CN103698521B
Application number: CN201310691119.3A
Authority: CN
Inventors: 匡华; 胥传来; 王文彬; 徐丽广; 马伟; 刘丽强; 宋珊珊; 胡拥明
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2013-12-17
Filing date: 2013-12-17
Publication date: 2015-09-23
Anticipated expiration: 2033-12-17
Also published as: CN103698521A

Abstract

一种检测食品中大肠杆菌胞内β-葡萄糖苷酸酶的双抗体夹心法，属于免疫分析技术领域。本发明应用大肠杆菌β-葡萄糖苷酸酶（EC 3.2.1.31）免疫7周龄BALB/c小鼠，经融合、筛选得10株单抗，分别标记HRP，并配对。以CGMCC No.7209为包被抗体和CGMCC No.7211为酶标抗体，以重组表达的大肠杆菌β-葡萄糖苷酸酶为标准品建立夹心ELISA分析方法。本法通过裂解大肠杆菌ATCC 25922检测胞内β-葡萄糖苷酸酶，实现大肠杆菌检测，LOD为3.27*10^4cfu/mL。本法首次制备了大肠杆菌的标志物β-葡萄糖苷酸酶的单抗并建立了检测大肠杆菌的双抗夹心法，本法与沙门氏菌、E.coli、阪崎肠杆菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌无交叉反应，为食品中大肠杆菌的检测提供了新的检测手段。

Description

一种检测食品中大肠杆菌胞内β-葡萄糖苷酸酶的双抗体夹心法

技术领域

本发明涉及了一种基于单克隆抗体的检测食品中大肠杆菌胞内β-葡萄糖苷酸酶的双抗体夹心法，属于免疫分析技术领域。

背景技术

大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli），1885年由Escherich发现，分布在自然界，主要附生在人或动物的肠道里，为正常菌群，少数的大肠杆菌具有毒性，可引起疾病。

E.coli常随粪便散布在环境中，作为温血动物肠道细菌的代表，大肠杆菌常作为饮水和食物（或药物）的卫生学标准。若在水和食品中检出此菌，可认为是被粪便污染的指标，从而可能有肠道病原菌的存在。大肠杆菌β-葡萄糖苷酸酶是位于大肠杆菌胞质空间和表面的一种分子量为 68KDa的酶。因此，β-葡萄糖苷酸酶是Elisa检测大肠埃希氏菌E.coli的理想检测对象。

目前，检测E.coli的方法有培养法、酶底物法、PCR方法等。培养法是检测E.coli的国标方法，尽管权威可靠，但一般需要10天得到结果，且操作过程繁琐，不能适应快速检测的要求；酶底物法多利用E.coli属特异性的β-碱性磷酸酯酶或者β-D-葡萄糖苷酸酶的酶学活性催化底物产生荧光，从而在24h内实现对E.coli的检测，优点是检测时间短，操作简单，缺点是酶活性质易受温度、pH、离子强度的影响，国外产品质量较为稳定，但相对比较昂贵；PCR方法，检测E.coli属特异性的DNA片段，具有灵敏度高、检测时间短的特点，缺点是成本较高、需要较高的操作技术，且不能避免增菌过程。

尽管食源性致病菌检测方法不断发展，Elisa凭借其快速、灵敏、特异性好、高通量、不需要大型仪器，易于推广的特点成为目前检测微生物的常用方法。直接检测微生物的Elisa试剂盒检测抗原通常为菌体的表面抗原，检测抗体一般有多克隆抗体及单克隆抗体两种。由于单克隆抗体具有理化性质单一、特异性好、亲和力高并可以无限生产的特点，比多克隆抗体具有更大的应用价值。本发明首次通过制备单克隆抗体并建立起检测大肠杆菌分泌的β-葡萄糖苷酸酶的双抗体夹心法来实现对大肠杆菌的检测，为食品中大肠埃希氏菌的快速检测提供了新方法。

发明内容

（一）要解决的技术问题

E.coli的血清型繁多，如何实现对绝大多数E.coli的检测是目前仍需要解决的问题。本发明的目的在于建立一种具有高灵敏度、高特异性、高准确度、高精确度、操作方法简单的酶联免疫吸附检测方法，通过检测大肠杆菌胞内β-葡萄糖苷酸酶从而实现食品中大肠杆菌的批量、快速检测。

（二）技术方案

为实现上述目的，本发明的技术方案：一种基于单克隆抗体的检测食品中大肠杆菌胞内β-葡萄糖苷酸酶的双抗体夹心法。本发明还包括对方法的优化。

大肠杆菌胞内β-葡萄糖苷酸酶作为大肠杆菌ELISA检测抗原的发现及证明。

通过文献查阅发现大肠杆菌胞内β-葡萄糖苷酸酶是广泛作为大肠杆菌标志物的一种酶，在饮用水、食品样品大肠杆菌的检测中作为大肠杆菌的检测目标。97%的大肠杆菌可以正常分泌β-葡萄糖苷酸酶。但以往的研究一般均采用显色平板或者分子生物学方法检测β-葡萄糖苷酸酶的基因MUG来检测大肠杆菌。本发明首次在蛋白水平实现了对大肠杆菌胞内β-葡萄糖苷酸酶的检测，从而间接检测大肠杆菌，本方法为大肠杆菌的检测提供了新的选择。

（1）单克隆抗体的制备

以重组表达的大肠杆菌β-葡萄糖苷酸酶为免疫原，免疫 7周龄的BALB/c小鼠，进行免疫、融合、筛选，共筛选到10个细胞株；免疫程序如下：第一周进行首免，100μg/只，弗氏完全佐剂乳化后皮下多点注射；第四周进行二免，100μg/只，弗氏不完全佐剂乳化后皮下多点注射；第六周进行三免，50μg/只，弗氏不完全佐剂乳化后皮下多点注射；第七周尾部采血测效价，选择效价最高的老鼠；第八周进行冲刺免疫，20μg/只，生理盐水溶解，腹腔注射；冲刺免疫3天后眼眶采血后进行融合；筛选采用间接Elisa进行，共筛选到10个细胞株；

重组表达的大肠杆菌β-葡萄糖苷酸酶，购自爱尔兰megazyme公司，货号120501；购买证明见证明文件1。

（2）单克隆抗体的配对筛选

将纯化后的10株单克隆抗体分别标记辣根过氧化物酶HRP，直接法鉴定标记成功后进行夹心法配对；配对参数如下：包被抗体5μg/mL；包被液为pH9.6、0.01M的碳酸盐缓冲液；以重组表达的大肠杆菌β-葡萄糖苷酸酶为标品，浓度为10ng/mL；标品稀释液为pH7.2、0.01M的PBS；酶标抗体稀释1000倍使用；在此条件下，实验成功得到了9对P/N值>5的配对；

（3）夹心法的建立

选择检测限稳定、灵敏的配对，即分别以10B6即细胞株9号CGMCC No.7209单抗为包被抗体和4F2即细胞株11号CGMCC No.7211单抗为酶标抗体建立夹心法；具体参数如下：

抗体包被浓度：5μg/mL，

包被液：pH9.6、0.01M的碳酸盐缓冲液，

标品稀释液：pH7.2、0.01M的PBS+0.1% Tween，

检测抗体浓度：1.6μg/mL，

反应时间：包被、封闭：37℃、2h；标准品：37℃、1h；检测抗体：37℃、1h；显色10min；

优化后大肠杆菌胞内β-葡萄糖苷酸酶夹心法LOD：0.012ng/mL；

（4）大肠杆菌裂解过程

裂解液配制：0.1M磷酸盐缓冲液，0.01% Triton 100，0.05% EDTA，pH7.2；

裂解液采用温和的非离子表面活性剂裂解菌体，优化后效果较好。

裂解过程：大肠杆菌ATCC 25922（见证明文件2）经EC肉汤增菌，取增菌后的液体样品以液体样品︰裂解液体积比1︰9的比例加入到裂解液中，在室温下振荡15min，取100μL裂解后的样品进行大肠杆菌β-葡萄糖苷酸酶夹心法检测；

本方法检测大肠杆菌的LOD为3.27*10^4cfu/mL。

其中，单克隆抗体是采用重组的大肠杆菌β-葡萄糖苷酸酶经过特定免疫程序免疫BALB/c小鼠，经杂交瘤技术融合、筛选得到的。

其中，用于配对的抗体是通过优化参数下夹心法配对，并通过多次试验筛选确定的，具有稳定性好、灵敏度高的特点。

其中，建立的夹心法优化了包被抗体的浓度，包被液，封闭液，标准品稀释液，酶标抗体稀释液，酶标抗体稀释浓度。LOD达到0.012ng/mL，R²为0.997。

本发明方法的检测分析原理是：

酶标板上包被了捕获抗体10B6（细胞株9号CGMCC No.7209），合适的浓度下可以最大限度捕获大肠杆菌胞内β-葡萄糖苷酸酶；洗板3次，洗去未结合的抗体，加入封闭液220μL封闭板孔上多余结合位点；洗板3次，加入样品和对照，37℃孵育1h；洗板3次，加入酶标抗体4F2（细胞株11号CGMCC No.7211）-HRP，37℃孵育1h；洗板4次，加入显色液显色12min。如果样品有足够的大肠杆菌胞内β-葡萄糖苷酸酶，那么大肠杆菌胞内β-葡萄糖苷酸酶被捕获抗体捕获并与酶标抗体4F2-HRP结合，并催化底物在450nm产生吸收值（P/N≥2.1），并被判定为阳性；如果样品大肠杆菌胞内β-葡萄糖苷酸酶浓度太低（P/N＜2.1）那么样品不被捕获或者捕获数量太小不足以引起足够的信号，被判定为阴性。

（三）有益效果

本发明提供的大肠杆菌β-葡萄糖苷酸酶双抗体夹心法提供了一种通过检测大肠杆菌胞内保守蛋白的方法实现了对大肠杆菌的检测。该方法对大肠杆菌β-葡萄糖苷酸酶标品以及大肠杆菌菌体的LOD分别为0.012ng/mL和3.27*10^4cfu/mL。

生物材料样品保藏：

单克隆细胞株9号（10B6），已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号CGMCC No.7209，保藏日期2013年1月23日。

单克隆细胞株11号（4F2），已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号CGMCC No.7211，保藏日期2013年1月23日。

附图说明

图1 大肠杆菌β-葡萄糖苷酸酶双抗体夹心法的标准曲线。

图2 大肠杆菌β-葡萄糖苷酸酶双抗体夹心法检测大肠杆菌标准曲线。

具体实施方案

以下通过实施例进一步说明本发明。

一、仪器：

TGL－40B台式低速离心机，上海安亭科学仪器厂

KFLOW纯水机，凯佛隆公司

ZD–9556水平摇床，太仓科教器材厂

96孔8×12可拆酶标板，厦门怡佳美实验器材有限公司

MuLtiska Mks酶标仪，Thermo Labsystems公司

可调试移液器，Thermo Labsystems公司

涡旋混合器，上海沪西仪器分析厂

二、试剂：

四甲基联苯胺(TMB)，上海晶纯实业有限公司

其他试剂均为分析纯试剂

三、步骤

1．单克隆抗体的制备

（1）实验动物：选5只7周龄的BALB/c小鼠进行免疫；

（2）抗原配置：将重组表达的大肠杆菌胞内β-葡萄糖苷酸酶用生理盐水稀释，涡旋混合均匀；

（3）乳化：将上述溶液与等量完全或不完全福氏佐剂用混合搅拌法将其乳化，乳化完全后皮下多点注射小鼠；

免疫方法：按照特定免疫流程免疫小鼠，3免后用间接竞争法测定效价，效价达到要求后，进行冲刺免疫；冲免3天后眼眶采血后进行融合；

（4）采血：第三次免疫后1周进行断尾采血，采用间接非竞争酶联免疫法测定抗血清效价；

（5）融合、筛选：采用杂交瘤技术进行融合，采用间接ELISA筛选阳性细胞孔，采用有限稀释法对阳性孔进行亚克隆：

（6）抗体的纯化和保存：采用辛酸-饱和硫酸铵法纯化腹水，透析后得到单克隆抗体，采用微量紫外方法测定其浓度后分装后放入-20℃保存。

2、ELISA反应过程：

抗体效价测定步骤：

（1）将包被原用包被缓冲液作系列稀释包被96孔酶标板，100 μL/孔，于4℃冰箱过夜。次日取出酶标板回至室温，每孔注入200 μL PBST溶液，摇床上振荡3 min，用力甩掉洗涤液，在吸水纸上拍干，继续洗涤2次。以下洗涤方法相同；

（2）充分洗涤后，用封闭缓冲液封闭酶标板，200 μL/孔，于37 ℃温育箱内温育2 h后取出烘干待用；

（3）将阳性血清系列稀释对应加入到酶标板的前7行列，第8行加入阴性血清，100 μL/孔，37 ℃孵育1 h后洗涤、拍干；

（4）每孔加入100 μL、1:3000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG，37 ℃孵育1 h后洗涤、拍干；

（5）每孔加入100 μL显色液（TMB与底物液比例为1:5），暗处37℃反应15 min，取出后每孔加入100 μL终止液（2 mol/L的硫酸），用酶标仪测定吸光值A₄₅₀。

大肠杆菌胞内β-葡萄糖苷酸酶双抗体夹心法测定步骤：

a、包被：用5μg/mL的10B6（细胞株9号CGMCC No.7209）包被酶标板，100μL /孔，4℃过夜；

b、洗涤：用PBST洗涤反应板三次，每次3min，200μL/孔，然后甩干反应板；

c、封闭：含0.2%明胶的CBS，200μL /孔，37℃封闭2h；

d、洗涤：同b；

e、样品：用PBST将重组表达的大肠杆菌β-葡萄糖苷酸酶稀释成8、2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125、0.0156 ng/mL系列浓度，另设一个PBST空白对照。每孔加入100μL样品，于37℃温育1h；

f、洗涤：同b；

g、加酶标抗体（4F2-HRP，2μg/mL）, 100μL /孔，37 C反应1h；

h、洗涤：同b；

i、显色：加底物TMB 100 μL /孔，显色10min；

j、终止：加终止液50μL /孔；

k、测定：用酶标仪检测OD₄₅₀nm。

3、交叉率的测定

将沙门氏菌、E.coli、阪崎肠杆菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌精确稀释成10⁸ cfu/mL、10⁷ cfu/mL、10⁶ cfu/mL、10⁵cfu/mL，在建立的大肠杆菌胞内β-葡萄糖苷酸酶双抗体夹心法体系中检测吸光值，并设空白孔和大肠杆菌胞内β-葡萄糖苷酸酶阳性对照，每个浓度做6次测定平均值，做3次重复实验。

试验结果如下：

1、标准曲线：本方法对β-葡萄糖苷酸酶的检测线性范围是0.0156～1ng/mL，R²=0.997，对大肠杆菌的检测范围为5.49×10^4cfu/mL。具体请见说明书附图。

2、LOD：LOD是空白的平均吸收值加3倍的空白吸收值的标准偏差对应的抗原浓度。本方法对β-葡萄糖苷酸酶的LOD为0.012ng/mL。检测大肠杆菌的LOD为3.27*10^4cfu/mL。

3、交叉反应率（CR%）

结果：大肠杆菌胞内β-葡萄糖苷酸酶正常显色，而10⁸ cfu/mL以及以下浓度的其它测试菌株均不显色（OD< 0.15）。说明建立的大肠杆菌胞内β-葡萄糖苷酸酶夹心法与沙门氏菌、E.coli、阪崎肠杆菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌无交叉反应，特异性良好。

Claims

1.一种基于单克隆抗体的检测食品中大肠杆菌胞内β-葡萄糖苷酸酶的双抗体夹心法，其特征在于

（1）单克隆抗体的制备

以重组表达的大肠杆菌β-葡萄糖苷酸酶为免疫原，免疫 7周龄的BALB/c小鼠，进行免疫、融合、筛选，共筛选到10个细胞株；

重组表达的大肠杆菌β-葡萄糖苷酸酶，购自爱尔兰Megazyme公司，货号120501；

（2）单克隆抗体的配对筛选

（3）夹心法的建立

抗体包被浓度：5μg/mL，

包被液：pH9.6、0.01M的碳酸盐缓冲液，

标品稀释液：pH7.2、0.01M的PBS+0.1% Tween，

酶标抗体浓度：1.6μg/mL，

反应时间：包被；封闭：37℃、2h；标准品：37℃、1h；酶标抗体：37℃、1h；显色10min；

优化后大肠杆菌胞内β-葡萄糖苷酸酶夹心法LOD：0.012ng/mL；

（4）大肠杆菌裂解过程

裂解过程：大肠杆菌经EC肉汤增菌，取增菌后的液体样品以液体样品︰裂解液体积比1︰9的比例加入到裂解液中，在室温下振荡15min，取100μL裂解后的样品进行大肠杆菌β-葡萄糖苷酸酶夹心法检测；

本方法检测大肠杆菌的LOD为3.27 10⁴ cfu/mL。