CN103197073B - 一种检测食品中大肠杆菌的酶联免疫方法 - Google Patents
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Abstract
一种检测食品中大肠杆菌的酶联免疫方法,属于免疫分析领域。本发明应用大肠杆菌E.coliO146(ATCC8739),购自中国医学微生物菌种保藏管理中心,菌体免疫8周龄的BALB/c小鼠,经过正常的免疫、细胞融合、筛选后得到5株大肠杆菌E.coli单克隆抗体。5株单抗分别标记辣根过氧化物酶(HRP)并进行两两配对。分别以1号单抗CGMCC No.7202为包被抗体、2号单抗CGMCC No.7203为酶标抗体,以大肠杆菌E.coli为标准品建立了大肠杆菌E.coli的夹心ELISA分析方法,LOD为4.8×105cfu/mL,R2=0.99。本发明采用大肠杆菌E.coli作为免疫原,制备了理化性质高度均一、特异性好、可大量制备的大肠杆菌E.coli单克隆抗体,建立的夹心法为食品中E.coli菌的检测提供了快速、高效的分析手段。
Description
技术领域
本发明涉及了一种定量检测食品中大肠杆菌E.coli的双抗体夹心法,属于免疫分析领域。
背景技术
大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli),1885年由Escherich发现,分布在自然界,主要附生在人或动物的肠道里,为正常菌群,少数的大肠杆菌具有毒性,可引起疾病。
E.coli常随粪便散布在环境中,作为温血动物肠道细菌的代表,大肠杆菌常作为饮水和食物(或药物)的卫生学标准。若在水和食品中检出此菌,可认为是被粪便污染的指标,从而可能有肠道病原菌的存在。目前,检测E.coli的方法有培养法、酶底物法、PCR方法等。培养法是检测E.coli的国标方法,尽管权威可靠,但一般需要10天得到结果,且操作过程繁琐,不能适应快速检测的要求。酶底物法多利用E.coli属特异性的大肠杆菌E.coli或者β-D-葡萄糖苷酸酶的酶学活性催化底物产生荧光,从而在24h内实现对E.coli的检测;其优点是检测时间短,操作简单,缺点是酶活性质易受温度、pH、离子强度的影响,国外产品质量较为稳定,但相对比较昂贵。PCR方法,检测E.coli属特异性的DNA片段,具有灵敏度高、检测时间短的特点,缺点是成本较高、需要较高的操作技术,且不能避免增菌过程。
尽管食源性致病菌检测方法在不断发展,酶联免疫方法ELISA凭借其快速、灵敏、特异性好、高通量、不需要大型仪器,易于推广的特点成为目前检测微生物的常用方法。直接检测微生物的ELISA试剂盒检测抗原通常为菌体的表面抗原,检测抗体一般有多克隆抗体和单克隆抗体两种。由于单克隆抗体具有理化性质单一、特异性好、亲和力高并可以无限生产的特点,比多克隆抗体具有更大的应用价值。本发明首次通过制备单克隆抗体并建立起检测大肠杆菌E.coli的双抗体夹心法来实现对大肠杆菌的检测,为食品中大肠杆菌E.coli的快速检测提供了新方法。
发明内容
(一)要解决的技术问题
本发明的目的在于建立一种具有灵敏度高、特异性好、操作方法简单的基于单克隆抗体的大肠杆菌E.coli双抗体夹心法,用于食品中大肠杆菌E.coli的批量、快速检测。
(二)技术方案
为实现上述目的,本发明建立了一种大肠杆菌E.coli的双抗体夹心检测方法,该方法包括对检测方法的优化。
其中,单克隆抗体是采用加热灭活的大肠杆菌E.coli O142(CMCC44737)菌体经过特定免疫程序免疫BALB/c小鼠,经杂交瘤技术融合、筛选得到的。
其中,用于配对的抗体是通过优化参数下夹心法配对,并通过多次试验筛选确定的,具有稳定性好、灵敏度高的特点。
一种检测食品中大肠杆菌E.coli的酶联免疫方法,
(1)大肠杆菌E.coli单克隆抗体的制备
以加热灭活的大肠杆菌E.coli为免疫原,进行免疫、融合、筛选,共筛选到5个细胞株;
所述大肠杆菌E.coli为E.coli O142,保藏号为CMCC44737,购自中国医学微生物菌种保藏管理中心;http://www.atcc.org/Products/All/8739.aspx ATCC网站链接。
(2)单克隆抗体的配对筛选
将纯化后的5株单克隆抗体分别标记辣根过氧化物酶HRP,直接法鉴定标记成功后进行夹心法配对,配对参数如下:包被抗体5μg/mL;包被液为pH9.6、0.01M的碳酸盐缓冲液;标品浓度100ng/mL,标品稀释液pH7.2、0.01M的PBS;酶标抗体稀释500倍使用,在此条件下,实验成功得到了5对P/N值>2.1的配对;
(3)夹心法的建立
选择检测限最稳定的配对,即以CGMCC No.7202抗体为包被抗体,以CGMCC No.7203抗体作为酶标抗体建立夹心法;具体参数如下:
抗体包被浓度:5μg/mL,
包被液:pH9.6、0.01M碳酸盐缓冲液,
标品稀释液:pH7.2、0.01M的PBS,
检测抗体浓度:4μg/mL,
反应时间:包被、封闭:37℃,2h;标准品:37℃,1h;检测抗体:37℃,1h;显色12min;优化后大肠杆菌E.coli夹心法,LOD=4.8×105cfu/mL(检测限3.3×106cfu/mL)。
其中,建立的夹心法优化了包被抗体的浓度,包被液,封闭液,标准品稀释液,酶标抗体稀释液,酶标抗体稀释浓度。
本发明方法的检测分析原理是:
酶标板上包被了捕获抗体1(CGMCC No.7202),合适的浓度下可以最大限度捕获大肠杆菌E.coli;洗板3次,洗去未结合的抗体,加入封闭液220μL封闭板孔上多余结合位点;洗板3次,加入样品和对照,37℃孵育1h;洗板3次,加入酶标抗体2-HRP(CGMCC No.7203-HRP),37℃孵育1h;洗板4次,加入显色液显色12min。如果样品中有≥3.3×106cfu/mL的大肠杆菌E.coli,那么大肠杆菌E.coli被捕获抗体1捕获并与酶标抗体2-HRP结合,并催化底物在450nm产生吸收值,并被判定为阳性;如样品大肠杆菌E.coli浓度<3.3×106cfu/mL那么样品E.coli不被捕获或捕获数量太小不足以引起足够的信号,被判定为阴性。
(三)有益效果
本发明提供的大肠杆菌E.coli双抗体夹心检测方法采用了理化性质高度均一、特异性好、可以大量制备的单克隆抗体,建立的夹心法灵敏度高,稳定性好、成本低,样品的前处理过程简单,能同时检测大量样品,适合食品行业中大肠杆菌的快速高通量检测。
生物材料样品保藏:
1、单克隆细胞株2号,已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,简称CGMCC,地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所,保藏编号CGMCC No.7202,保藏日期2013年1月23日。
2、单克隆细胞株3号,已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,简称CGMCC,地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所,保藏编号CGMCC No.7203,保藏日期2013年1月23日。
附图说明
图1大肠杆菌E.coli双抗体夹心法的标准曲线。
具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明。
实施例1
一、仪器:
TGL-40B台式低速离心机,上海安亭科学仪器厂
KFLOW纯水机,凯佛隆公司
ZD-9556水平摇床,太仓科教器材厂
96孔8×12可拆酶标板,厦门怡佳美实验器材有限公司
MuLtiska Mks酶标仪,Thermo Labsystems公司
可调试移液器,Thermo Labsystems公司
涡旋混合器,上海沪西仪器分析厂
二、试剂:
四甲基联苯胺(TMB),上海晶纯实业有限公司
其他试剂均为分析纯试剂
三、步骤
1.单克隆抗体的制备
(1)实验动物:选5只8周龄的BALB/c小鼠进行免疫。
(2)抗原配置:将大肠杆菌培养液加热灭活后离心,去除上清后将沉淀冻存在-20℃直至使用。
(3)乳化:将上述溶液与等量完全或不完全福氏佐剂用混合搅拌法将其乳化,乳化完全后皮下多点注射小鼠。
免疫方法:按照特定免疫流程免疫小鼠,3免后用间接竞争法测定效价,效价达到要求后,进行冲刺免疫;冲免3天后眼眶采血后进行融合。
(4)采血:第三次免疫后1周进行断尾采血,采用间接非竞争酶联免疫法测定抗血清效价。
(5)融合、筛选:采用杂交瘤技术进行融合,采用间接Elisa筛选阳性细胞孔,采用有限稀释法对阳性孔进行亚克隆。
(6)抗体的纯化和保存:采用辛酸-饱和硫酸铵法纯化腹水,透析后得到单克隆抗体,采用微量紫外方法测定其浓度后分装后放入-20℃保存。
2、ELISA反应过程:
抗体效价测定步骤:
(1)将包被原用包被缓冲液作系列稀释包被96孔酶标板,100μL/孔,于4℃冰箱过夜。次日取出酶标板回至室温,每孔注入200μL PBST溶液,摇床上振荡3min,用力甩掉洗涤液,在吸水纸上拍干,继续洗涤2次。以下洗涤方法相同。
(2)充分洗涤后,用封闭缓冲液封闭酶标板,200μL/孔,于37℃温育箱内温育2h后取出烘干待用。
(3)将阳性血清系列稀释对应加入到酶标板的前7行列,第8行加入阴性血清,100μL/孔,37℃孵育1h后洗涤、拍干。
(4)每孔加入100μL、1:3000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG,37℃孵育1h后洗涤、拍干。
(5)每孔加入100μL显色液(TMB与底物液比例为1:5),暗处37℃反应15min,取出后每孔加入100μL终止液(2mol/L的硫酸),用酶标仪测定吸光值A450。
大肠杆菌E.coli双抗体夹心法测定步骤:
a、包被:用5μg/mL的1号抗体包被酶标板,100μL/孔,4℃过夜。
b、洗涤:用PBST洗涤反应板三次,每次3min,200μL/孔,然后甩干反应板。
c、封闭:含0.2%明胶的CBS,200μL/孔,37℃封闭2h。
d、洗涤:同b
e、样品:用PBS将大肠杆菌E.coli从108cfu/mL开始3倍稀释,一共7个梯度,另设一个PBS空白对照。每孔加入100μL样品,于37℃温育1h。
f、洗涤:同b
g、加酶标抗体(抗体2-HRP,4μg/mL),100μL/孔,37C反应1h。
h、洗涤:同b
i、显色:加底物TMB100μL/孔,显色15min。
j、终止:加终止液50μL/孔。
k、测定:用酶标仪检测OD450nm
试验结果如下:
1、标准曲线:本发明所获得的检测限为3.3×106cfu/mL,R2=0.99,具体请见说明书附图。
2、LOD:LOD是空白的平均吸收值加3倍的标准偏差对应的抗原浓度,大肠杆菌E.coli双抗体夹心法LOD=4.8×105cfu/mL。
Claims (1)
1.一种检测食品中大肠杆菌E.coli的酶联免疫方法,其特征在于包括以下步骤:
(1)大肠杆菌E.coli单克隆抗体的制备
以加热灭活的大肠杆菌E.coli为免疫原,进行免疫、融合、筛选,共筛选到5个细胞株;
所述大肠杆菌E.coli 为E.coli O142,保藏号为CMCC 44737,购自中国医学微生物菌种保藏管理中心;
(2)单克隆抗体的配对筛选
将纯化后的5株单克隆抗体分别标记辣根过氧化物酶HRP,直接法鉴定标记成功后进行夹心法配对,配对参数如下:包被抗体5μg/mL;包被液为pH9.6、0.01M的碳酸盐缓冲液;标品浓度100ng/mL,标品稀释液pH7.2、0.01M的PBS;酶标抗体稀释500倍使用,在此条件下,实验成功得到了5对P/N值>2.1的配对;
(3)夹心法的建立
选择检测限最稳定的配对,即以CGMCC No.7202抗体为包被抗体,以CGMCC No.7203抗体为酶标抗体建立夹心法;具体参数如下:
抗体包被浓度:5μg/mL,
包被液:pH9.6、0.01M碳酸盐缓冲液,
标品稀释液:pH7.2、0.01M的PBS,
酶标抗体浓度:4μg/mL,
反应时间:包被、封闭:37℃ 2h;标准品:37℃ 1h;酶标抗体:37℃ 1h;显色12min;优化后大肠杆菌E.coli夹心法,LOD=4.8*105cfu/mL。
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