CN107177559B - 一株分泌潮霉素b特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株zxl-1及其应用 - Google Patents

一株分泌潮霉素b特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株zxl-1及其应用 Download PDF

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Abstract

一株分泌潮霉素B特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株ZXL‑1及其应用，属于免疫检测技术领域。本发明一株分泌潮霉素B（HB）特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株ZXL‑1，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号CGMCC No.13097。将得到的特异性分泌HB抗体的杂交瘤细胞株ZXL‑1经过腹水制备以及纯化，即可得到抗HB单克隆抗体。该抗体可用于动物源食品中HB残留的免疫检测，满足目前市场上对HB快速免疫检测产品的需求。

Description

一株分泌潮霉素B特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株ZXL-1及 其应用
技术领域
本发明涉及一株分泌潮霉素B特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株ZXL-1及其应用，涉及潮霉素B单克隆抗体的制备方法，以及动物源食品中潮霉素B的间接竞争酶联免疫检测方法的建立，属于免疫检测技术领域。
背景技术
潮霉素B，即Hygromycin B（HB）是一种由吸水链霉菌产生的氨基糖苷类抗生素，它可以通过抑制蛋白质合成杀死细菌、真菌和高级真核细胞。具有一定的驱虫活性，在猪禽饲料中长期添加，具有良好的驱线虫效果。
动物源性食品中兽药残留问题是近年来国际社会研究的公共卫生热点一，受到人们的普遍关注。由于临床已证明HB具有耳毒性和肾毒性，因此欧盟规定禁止使用HB作为家畜的生长促进剂。鉴于这类抗生素在临床应用方面的副作用及易使细菌产生耐药性，美国食品与药品管理局（Food and Drug Administration）对动物源性食品中氨基糖苷类兽药残留也极为关注。我国农业部235公告中规定HB可做畜禽类动物治疗用药，但不得在相关动物性食品中检出。
目前，HB的最常用的检测方法为高效液相色谱法等仪器检测方法，该种检测方法耗时长，操作需要掌握相关的专业技术，样品前处理繁琐等。而免疫分析方法具有低成本、高通量、高灵敏、对技术人员要求低等特点，因此适用于大量样品的现场快速筛查。
发明内容
本发明的目的是提供一种能够分泌潮霉素B特异性单克隆抗体的细胞株制备方法，建立检测潮霉素B的免疫学检测方法。
本发明的技术方案：一株分泌潮霉素B特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株ZXL-1，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号CGMCCNo.13097，保藏日期2016年10月31日，分类命名单克隆细胞株。
潮霉素B特异性单克隆抗体，其是由所述保藏编号CGMCC No.13097的杂交瘤细胞株ZXL-1分泌产生。
所述潮霉素B特异性单克隆抗体的应用，用于动物源食品中潮霉素B的快速免疫检测。
提供的潮霉素B杂交瘤细胞株的制备方法基本步骤为：
1、免疫原和包被原的制备：采用戊二醛法，将HB与牛血清蛋白（BSA）偶联得到的免疫原HB-BSA；采用碳化二亚胺法，与鸡蛋清白蛋白（OVA）偶联得到的HB-OVA作为包被抗原。
HB-BSA的具体合成步骤如下：
a、称取 10mg HB，溶于1mL 0.1M pH7.4的磷酸盐缓冲溶液中，再逐滴加入稀释10倍后的质量分数为25%的戊二醛溶液100μL，室温搅拌30min后，得到活化液；
b、称取50mg BSA，溶于5mL 0.1M pH 9.0碳酸盐缓冲溶液中，在不断搅拌下，逐滴加入活化液，室温下，反应3～4h后，将反应液用0.01M pH7.4的磷酸盐缓冲液透析，即可得到HB-BSA。
HB-OVA的具体合成步骤如下：
a、称取20mg OVA，溶于3mL 0.1M pH6.0的一水合2-（N-吗啡啉）乙磺酸（MES）溶液中；不断搅拌下，先加入24mg N-羟基琥珀酰亚胺，15min后，再加入31mg 1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基-碳二亚胺）；在室温下，搅拌2h，得到活化液；
b、称取5mg HB，溶于1mL 0.1M pH 9.0碳酸盐缓冲溶液中；在不断搅拌下，逐滴加入活化液，室温下，反应4h后，将反应液用0.01M pH7.4的磷酸盐缓冲液透析，即可得到HB-OVA。
2、动物免疫与效价测定：采用小剂量短周期方案免疫健康BALB/c 雌性小鼠，首次免疫用100μg HB-BSA与等量弗氏完全佐剂混匀后进行皮下注射，间隔3周后，再用100μgHB-BSA与等量弗氏不完全佐剂加强免疫，此后每隔3周用半量HB-BSA加强免疫一次；冲刺免疫剂量减半，与等体积的生理盐水混合后采用腹腔免疫，用HB与鸡蛋清白蛋白（OVA）的偶联物HB-OVA作为包被抗原，通过间接竞争ELISA检测血清效价和抑制；
其具体ELISA 程序如下：
（1）包被：将包被抗原用0.05M pH9.6 碳酸盐缓冲液梯度稀释，100μL/孔，37℃孵育2h；
（2）洗涤：将板内溶液倾去，每孔注入200μL PBST溶液，置于摇床上振荡3min，甩干，洗涤3次；以下洗涤方法相同；
（3）封闭：拍干后，加入200μL/孔封闭液，37℃孵育2h；洗涤后烘干备用；
（4）加样：酶标板上半部分加入0.01M pH7.4 磷酸盐缓冲溶液，50μL/孔（上半部分称为0标），下半部分加入不同浓度的用0.01M pH7.4磷酸盐缓冲溶液稀释的HB标准品，将抗血清从1:1000开始梯度稀释，50μL/孔（下半部分称为加标），上下部分对应加入不同稀释梯度包被抗原的孔中，37℃孵育30min；充分洗涤后，加入1:3000稀释的鼠二抗，100μL/孔，37℃孵育30min，洗涤后拍干；
（5）显色：将酶标板取出，充分洗涤后，每孔加入100μL的显色液（TMB与底物液体积比例1:5），37℃避光反应15min；
（6）终止和测定：取出酶标板，每孔加入50μL终止液（2mol/L的硫酸）终止反应，然后用酶标仪测定各孔的吸光值OD450；
（7）结果判读：以OD值大于或等于阴性血清对照孔的2.1倍（即P/N≥2.1）所对应的血清最高稀释倍数即为血清的ELISA效价；上下部分对照，加标OD值为0标一半的即是所加的标准品浓度；
3、细胞融合与筛选：在冲击免疫三天后，按照常规PEG（聚乙二醇，分子量为1450）方法进行细胞融合，具体步骤如下：
a、无菌取小鼠脾脏，研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，并进行细胞计数；
b、收集SP2/0细胞，悬浮于RPMI-1640基础培养液中，进行细胞计数；
c、将脾细胞和SP2/0细胞按照10:1（数量比）的比例混合，离心后用50% PEG融合，时间1min，之后按照从慢到快，加入RPMI-1640基础培养液，离心后悬浮于含20% 胎牛血清、2%的50×HAT的RPMI-1640筛选培养液中，加到96孔细胞培养板，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。在细胞融合的第三天对融合细胞进行RPMI-1640筛选培养液半换液，第6天用含20%胎牛血清、1%的100×HT的RPMI-1640过渡培养液进行全换液，在第9天取细胞上清进行筛选；
筛选分两步：第一步先用间接ELISA筛选出阳性细胞孔，第二步选用HB标准品，用间接竞争ELISA对阳性细胞进行抑制效果测定。选出对HB具有较好抑制的孔，采用有限稀释法进行亚克隆，用同样的方法进行检测。重复三次，即可得到能稳定分泌HB单克隆抗体的细胞株。
4、单克隆抗体的制备与鉴定：取8～10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射石蜡油1mL；7天后每只小鼠腹腔注射1×106杂交瘤细胞，从第七天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-硫酸铵法纯化，获得的单抗置于-20℃保存。
本发明的有益效果：本发明将得到的特异性分泌HB抗体的杂交瘤细胞株ZXL-1经过腹水制备以及纯化，即可得到抗HB单克隆抗体。该抗体可用于动物源食品中HB残留的免疫检测，使用间接竞争ELISA和间接ELISA，测定单克隆抗体对HB的半数抑制率IC50为9.26ng/ml；为动物源食品中HB的快速免疫检测提供了可能，满足目前市场上对HB快速免疫检测产品的需求。
生物材料样品保藏：分泌潮霉素B特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株ZXL-1，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.13097，保藏日期2016年10月31日，分类命名单克隆细胞株。
附图说明
图1是本发明获得的单克隆抗体检测潮霉素B的ELISA标准曲线。
具体实施方式
本发明下面的实施例仅作为本发明内容的进一步说明，不能作为本发明的限定内容或范围，下面通过实施例对本发明作进一步说明。
本发明通过将完全抗原免疫小鼠，通过细胞融合，HAT选择性培养基培养，通过间接ELISA和间接竞争ELISA筛选细胞上清，将筛选得到的对HB抑制较好的细胞株扩大培养，并经过腹水制备以及纯化，最终得到了具有较好灵敏度的HB单克隆抗体。
实施例1 HB单克隆抗体的制备
1、免疫原和包被原的制备：采用戊二醛法，将HB与牛血清蛋白（BSA）偶联得到的免疫原HB-BSA；采用碳化二亚胺法，与鸡蛋清白蛋白（OVA）偶联得到的HB-OVA作为包被抗原。
HB-BSA的具体合成步骤如下：
a、称取10mg HB，溶于1ml 0.1 M pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液中，再逐滴加入稀释10倍后的质量分数为25%的戊二醛溶液100μL，室温搅拌30min后，得到活化液；
b、称取50mg BSA，溶于5mL 0.1M pH9.0碳酸盐缓冲溶液中，在不断搅拌下，逐滴加入活化液，室温下，反应3～4h后，将反应液用0.01M pH 7.4的磷酸盐缓冲液透析，即可得到HB-BSA。
HB-OVA的具体合成步骤如下：
a、称取20mg OVA，溶于3mL 0.1M pH6.0的一水合 2-（N-吗啡啉）乙磺酸（MES）溶液中；不断搅拌下，先加入24mg N-羟基琥珀酰亚胺，15min后，再加入31mg 1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基-碳二亚胺）；在室温下，搅拌2h，得到活化液；
b、称取5mg HB，溶于1mL 0.1M pH 9.0碳酸盐缓冲溶液中；在不断搅拌下，逐滴加入活化液，室温下，反应4h后，将反应液用0.01M pH 7.4的磷酸盐缓冲液透析，即可得到HB-OVA。
2、动物免疫：采用小剂量短周期方案免疫健康BALB/c 雌性小鼠，首次免疫用100μg HB-BSA与等量弗氏完全佐剂混匀后进行皮下注射，间隔3周后，再用100μg HB-BSA与等量弗氏不完全佐剂加强免疫，此后每隔3周用半量HB-BSA加强免疫一次；冲刺免疫剂量减半，与等体积的生理盐水混合后采用腹腔免疫，用HB与鸡蛋清白蛋白（OVA）的偶联物HB-OVA作为包被抗原，通过间接竞争ELISA检测血清效价和抑制；
其具体ELISA 程序如下：
（1）包被：将包被抗原用0.05M pH9.6 碳酸盐缓冲液梯度稀释，100μL/孔，37℃孵育2h；
（2）洗涤：将板内溶液倾去，每孔注入200μL PBST溶液，置于摇床上振荡3min，甩干，洗涤3次；以下洗涤方法相同；
（3）封闭：拍干后，加入200μL /孔封闭液，37℃孵育2h。洗涤后烘干备用；
（4）加样：酶标板上半部分加入0.01 M pH 7.4 磷酸盐缓冲溶液，50μL/孔（上半部分称为0标），下半部分加入不同浓度的用0.01 M pH 7.4 磷酸盐缓冲溶液稀释的HB标准品，将抗血清从1:1000开始梯度稀释，50μL/孔（下半部分称为加标），上下部分对应加入不同稀释梯度包被抗原的孔中，37℃孵育30min；充分洗涤后，加入1:3000稀释的鼠二抗，100μL/孔，37℃孵育30min，洗涤后拍干；
（5）显色：将酶标板取出，充分洗涤后，每孔加入100μL的显色液（TMB与底物液比例1:5），37℃避光反应15min；
（6）终止和测定：取出酶标板，每孔加入50μL终止液（2mol/L的硫酸）终止反应，然后用酶标仪测定各孔的吸光值OD450；
（7）结果判读：以OD值大于或等于阴性血清对照孔的2.1倍（即P/N≥2.1）所对应的血清最高稀释倍数即为血清的ELISA效价。上下部分对照，加标OD值为0标一半的即是所加的标准品浓度；
3、细胞融合：在冲击免疫三天后，按照常规PEG（聚乙二醇，分子量为1450）方法进行细胞融合，具体步骤如下：
（1）无菌取小鼠脾脏，研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，并进行细胞计数；
（2）收集SP2/0细胞，悬浮于RPMI-1640基础培养液中，进行细胞计数；
（3）将脾细胞和SP2/0细胞按照10:1（数量比）的比例混合，离心后用50% PEG融合，时间1 min，之后按照从慢到快，加入RPMI-1640基础培养液，离心后悬浮于含20% 胎牛血清、2 %的50×HAT的RPMI-1640筛选培养液中，加到96孔细胞培养板，置于37℃，5% CO2的培养箱中培养。
4、细胞筛选与细胞株建立：在细胞融合的第三天对融合细胞进行RPMI-1640筛选培养液半换液，第6天进行用含20% 胎牛血清、1%的100×HT的RPMI-1640过渡培养液进行全换液，在第9天取细胞上清进行筛选；
筛选分两步：第一步先用间接ELISA筛选出阳性细胞孔，第二步选用HB标准品，用间接竞争ELISA对阳性细胞进行抑制效果测定。选出对HB标准品均具有较好抑制的孔，采用有限稀释法进行亚克隆，用同样的方法进行检测。重复三次，即可得到能稳定分泌HB单克隆抗体的细胞株。
5、单克隆抗体的制备与鉴定：取8～10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射石蜡油1 mL；7天后每只小鼠腹腔注射1×106杂交瘤细胞，从第七天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-硫酸铵法纯化，获得的单抗置于-20℃保存。
使用间接竞争ELISA和间接ELISA，测定单克隆抗体对HB的半数抑制率IC50为9.26ng/ml；为动物源食品中HB的快速免疫检测提供了可能。
综上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用来限定本发明的实施范围。即凡依本发明申请专利范围的内容所作的等效变化与修饰，都应为本发明的技术范畴。

Claims (3)

1.一株分泌潮霉素B特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株ZXL-1，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号CGMCC No.13097，保藏日期2016年10月31日；其免疫原和包被原的制备：采用戊二醛法，将HB与牛血清蛋白BSA偶联得到免疫原HB-BSA；采用碳化二亚胺法，将HB与鸡蛋清白蛋白OVA偶联得到HB-OVA作为包被抗原。
2.潮霉素B特异性单克隆抗体，其特征在于：其由权利要求1所述保藏编号CGMCCNo.13097的杂交瘤细胞株ZXL-1分泌产生，IC50为9.26 ng/ml。
3.权利要求2所述潮霉素B特异性单克隆抗体的应用，其特征在于：用于动物源食品中潮霉素B的快速免疫检测。
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Development of a Monoclonal Antibody-Based ELISA for the Anthelmintic Hygromycin B;Carol Kamps-Holtzapple等;《Journal of Agricultural and Food Chemistry》;19940301;第42卷(第3期);摘要，第822页右栏最后1段-第823页左栏第6段 *

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