CN108866009B - 一株甲霜灵单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用 - Google Patents

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Abstract

一株甲霜灵单克隆抗体杂交瘤细胞株20170507及其应用，属于食品安全免疫检测技术领域。本发明甲霜灵完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化完全，通过背部皮下注射免疫BALB/c小鼠。首次免疫（100μg/只）用完全弗氏佐剂，多次加强免疫（50μg/只）用不完全弗氏佐剂，最后一次用甲霜灵完全抗原（25μg/只，不含佐剂）冲击免疫。取高效价的IC50小鼠的脾细胞，通过PEG方法与小鼠骨髓瘤细胞融合，经过间接竞争酶联免疫法筛选和三次亚克隆，得到甲霜灵单克隆抗体杂交瘤细胞株20170507。此细胞株分泌的单克隆抗体，对甲霜灵具有较好的特异性和检测灵敏度（IC50值为40 ng/mL），为食品中甲霜灵残留的免疫检测提供了原料，具有实际应用价值。

Description

一株甲霜灵单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用
技术领域
本发明涉及一株甲霜灵单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，属于食品安全免疫检测技术领域。
背景技术
甲霜灵(metalaxyl，简称MET)，属酰胺类杀菌剂，高效低毒、残效期长。主要用于卵菌纲、藻菌纲、真菌引起的各种霜霉病、晚疫病、早疫病、猝倒病以及枯腐病、果腐病等。
2017年6月22日，欧盟委员会发布(EU) 2017/1164号实施条例，修订（EC）396/2005法规中甲霜灵的最大残留限量标准（MRL），其在坚果类、乳、蛋中的最大残留限量标准（MRL）均为0.01mg/kg。
为了有效监督监测食品中使用甲霜灵的情况，需要寻找一种特异性好，灵敏度高的测定方法，而目前检测方法如薄层层析法、气相色谱法、液相色谱法等，分离纯化过程冗长，灵敏度低，加上食品中干扰物多，难以获得准确结果。因此建立快速简便的甲霜灵检测方法具有重要意义。酶联免疫法（ELISA）是一种极为高效、敏感、快速的检测方法，检测时对样本的纯度要求不高而且操作简便，适用于大量样本的现场快速检测。建立高效的免疫学检测方法，筛选高特异性的单克隆抗体是重要前提。
发明内容
本发明的目的在于克服上述不足之处，提供一株甲霜灵单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，由该细胞株制备的抗体对甲霜灵具有较好特异性和检测灵敏度，可以用来建立甲霜灵的免疫学检测方法。
按照本发明提供的技术方案，一株甲霜灵单克隆抗体杂交瘤细胞株20170507，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.14703，保藏日期为2017年9月5日。
甲霜灵单克隆抗体，其由所述保藏编号为CGMCC No.14703的甲霜灵单克隆抗体杂交瘤细胞株20170507分泌产生。
所述甲霜灵单克隆抗体的应用，将其应用在食品安全中甲霜灵残留的分析检测中。
本发明提供的甲霜灵单克隆抗体杂交瘤细胞株20170507的制备基本步骤为：
（1）半抗原的合成：
将2g化合物1溶于200mL水中，然后加入200mg KOH中。混合物在100℃搅拌过夜。加入水，用EA提取水层。水相用6mol/L盐酸水溶液酸化直至pH＝7，并浓缩至干。粗产物通过硅胶盒上的色谱纯化，得到化合物2即目标产物，为白色固体。
（2）完全抗原的制备：免疫原MET-BSA的制备：称取MET 8.0mg，1-乙基碳二亚胺盐酸盐18mg，N-羟基琥珀酰亚胺8.0mg，用400μL无水N,N-二甲基甲酰胺溶解，室温搅拌反应4-5h(称为A液)。取牛血清白蛋白BSA 10mg，加入3mL硼酸缓冲溶液（称为B液）。在室温条件，逐滴将A液加入到B液中，室温反应过夜，即得偶联物MET-BSA混合液，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原；包被原MET-OVA的制备：称取MET 6mg，1-乙基碳二亚胺盐酸盐14mg，N-羟基琥珀酰亚胺8.0mg，用400μL无水N,N-二甲基甲酰胺溶解，室温搅拌反应4-5h(称为A液)。称取10mg 鸡卵白蛋白OVA，溶解于2mL硼酸缓冲溶液中（称为B液）。在室温条件下，逐滴将A液加入到B液中，室温反应过夜，即得偶联物MET-OVA混合液，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原。
（3）小鼠的免疫：MET-BSA完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化后，通过背部皮下注射免疫BALB/c小鼠。首次免疫用完全弗氏佐剂，多次加强免疫用不完全弗氏佐剂。首次免疫与第二次加强免疫之间间隔一个月，多次加强免疫之间间隔21天。最后一次用MET-BSA完全抗原（不含佐剂）冲击免疫；通过间接竞争酶联免疫法（ic-ELISA）检测血清效价和抑制。
（4）细胞融合与细胞株建立：通过聚乙二醇（PEG 4000）法将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合，通过HAT培养基培养，利用间接竞争酶联免疫法（ic-ELISA）检测阳性细胞孔，并进一步利用ic-ELISA测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制的阳性细胞孔进行三次亚克隆，最终筛选获得甲霜灵单克隆抗体杂交瘤细胞株20170507。
（5）杂交瘤细胞株性质的鉴定：通过ic-ELISA测定灵敏度和特异性。取高效价的IC50小鼠的脾细胞，通过PEG方法与小鼠骨髓瘤细胞融合，经过间接竞争酶联免疫法筛选和三次亚克隆，得到一株杂交瘤细胞株。
本发明的有益效果：本发明获得的甲霜灵单克隆抗体杂交瘤细胞株20170507，分泌获得的单克隆抗体，对甲霜灵具有较好的特异性和检测灵敏度（IC50值为40 ng/mL），可实现对水、果蔬、谷物中甲霜灵残留量的检测，为食品中甲霜灵残留的免疫检测提供了原料，具有实际应用价值。
生物材料样品保藏：一株甲霜灵单克隆抗体杂交瘤细胞株20170507，所述杂交瘤细胞株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.14703，保藏日期为2017年9月5日，分类命名为单克隆细胞株。
附图说明
图1是甲霜灵单克隆抗体对甲霜灵的抑制标准曲线。
具体实施方式
本发明下面的实施例仅作为本发明内容的进一步说明，不能作为本发明的限定内容或范围。下面通过实施例对本发明作进一步说明。
本发明通过将甲霜灵完全抗原免疫小鼠，通过细胞融合，HAT选择性培养基培养，通过ic-ELISA筛选细胞上清，最终得到了对甲霜灵有较好特异性和灵敏度的单克隆抗体杂交瘤细胞株。
实施例1 甲霜灵单克隆抗体杂交瘤细胞株20170507的制备
（1）半抗原的合成：
将2g化合物1溶于200mL水中，然后在溶液中加入200mg KOH。混合物在100℃搅拌过夜。加入水，用EA提取水层。水相用6mol/L盐酸水溶液酸化直至pH＝7，并浓缩至干。粗产物通过硅胶盒上的色谱纯化，得到化合物2即目标产物，为白色固体。
（2）完全抗原的合成：
免疫原MET-BSA的制备：称取MET 8.0mg，1-乙基碳二亚胺盐酸盐18mg，N-羟基琥珀酰亚胺8.0mg，用400μL无水N,N-二甲基甲酰胺溶解，室温搅拌反应4-5h(称为A液)。取牛血清白蛋白BSA 10mg，加入3mL硼酸缓冲溶液（称为B液）。在室温条件，逐滴将A液加入到B液中，室温反应过夜，即得偶联物MET-BSA混合液，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原；包被原MET-OVA的制备：称取MET 6mg，1-乙基碳二亚胺盐酸盐14mg，N-羟基琥珀酰亚胺8.0mg，用400μL无水N,N-二甲基甲酰胺溶解，室温搅拌反应4-5h(称为A液)。称取10mg鸡卵白蛋白OVA，溶解于2mL硼酸缓冲溶液中（称为B液）。在室温条件下，逐滴将A液加入到B液中，室温反应过夜，即得偶联物MET-OVA混合液，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原。
（3）动物免疫：选择健康的6～8周龄的BALB/c小鼠进行免疫。取甲霜灵完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化后，通过背部皮下注射免疫BALB/c小鼠。第一次免疫用完全弗氏佐剂，之后都用不完全弗氏佐剂。首次免疫与第二次加强免疫之间间隔一个月，多次加强免疫之间间隔21天。第三次免疫后7天采血，使用ic-ELISA测定小鼠血清效价和抑制，选择效价高抑制好的小鼠，在第五次免疫后21天冲击免疫，腹腔注射，要求冲免剂量减半且不含任何佐剂。
（4）细胞融合：在冲击免疫三天后，按照常规PEG（聚乙二醇，分子量为4000）方法进行细胞融合，具体步骤如下：
a、摘眼球取血，颈椎脱臼法处死小鼠后，立即放入75%酒精中消毒，浸泡 5min左右，无菌操作取出小鼠的脾脏，用注射器的胶头适度研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，收集，离心（1200rpm，8 min），用RPMI-1640培养基洗涤脾细胞三次，最后一次离心后，将脾细胞稀释到一定体积，计数，备用；
b、收集SP2/0细胞：融合前 7-10 天，将 SP2/0 瘤细胞用含10% FBS（胎牛血清）RPMI-1640 培养基在5% CO2培养箱中。融合前要求SP2/0瘤细胞数量达到（1~4）×107，保证融合前SP2/0瘤细胞处于对数生长期。融合时，收集瘤细胞，悬浮于RPMI-1640基础培养液中，进行细胞计数；
c、融合过程7min。第1min，将1mL的PEG 1500 由慢到快滴加到细胞中；第2min，静置。第3min 和第4min，在1min内滴加1mL RPMI-1640培养基；第5min 和第6min，在1min内滴加2mL RPMI-1640 培养基；第7min，每10s 滴加1mL 的 RPMI-1640 培养基。然后37℃温浴5min。离心（800 rpm，8 min），弃上清，重悬入含20%胎牛血清、2%的50×HAT的RPMI-1640筛选培养液中，按照200μL/孔加到 96 孔细胞板，置于37℃、5% CO2培养箱中培养。
（5）细胞筛选与细胞株建立：在细胞融合的第3天对融合细胞进行RPMI-1640筛选培养液半换液，第5天进行用含20% 胎牛血清、1%的100×HT的RPMI-1640过渡培养液进行全换液，在第7天取细胞上清进行筛选。筛选分两步：第一步先用ic-ELISA筛选出阳性细胞孔，第二步选用甲霜灵为标准品，用ic-ELISA对阳性细胞进行抑制效果测定。选择对甲霜灵标准品均有较好抑制的细胞孔，采用有限稀释法进行亚克隆，用同样的方法进行检测。重复三次，获得甲霜灵单克隆抗体杂交瘤细胞株20170507。
实施例2 甲霜灵单克隆抗体的制备与鉴定
取8-10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射无菌石蜡油1mL；7天后每只小鼠腹腔注射1×106杂交瘤细胞，从第七天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-硫酸铵法纯化。在偏酸条件下，正辛酸可以沉淀腹水中除IgG免疫球蛋白外的其他杂蛋白，然后离心，弃沉淀；再用等量饱和度的硫酸铵溶液沉淀 IgG型的单克隆抗体，离心，弃上清，用0.01 M PBS溶液（pH7.4）溶解后，透析脱盐，最终得到纯化后的单克隆抗体置于-20℃保存。
实施例3 甲霜灵单克隆抗体的应用
（1）包被：将包被原MET-OVA用0.05M pH9.6 碳酸盐缓冲液从1µg/mL开始倍比稀释，100μL/孔，37℃反应2h；
（2）洗涤：将板内溶液倾去，并用洗涤液洗涤3次，每次3min；
（3）封闭：拍干后，加入200μL/孔封闭液，37℃反应2h。洗涤后烘干备用；
（4）加样：将抗血清从1:1000开始倍比稀释，并加入到各稀释度的包被孔中，100μL/孔，37℃反应30min；充分洗涤后，加入1:3000稀释的HRP-羊抗鼠IgG，100μL/孔，37℃反应30min；
（5）显色：将酶标板取出，充分洗涤后，每孔加入100μL的TMB显色液，37℃避光反应15min；
（6）终止和测定：每孔加入50μL终止液以终止反应，然后用酶标仪测定各孔的OD450值。
用ic-ELISA测定甲霜灵单克隆抗体的IC50为40 ng/mL，说明对甲霜灵有很好的灵敏度，可用于甲霜灵免疫分析检测。
溶液的配置：碳酸盐缓冲液（CBS）：称取Na2CO3 1.59 g，NaHCO3 2.93 g，分别溶于少量双蒸水后混合，加双蒸水至约800mL混匀，调pH值至9.6，加双蒸水定容至1000mL，4℃贮存备用。
磷酸盐缓冲液（PBS）：8.00g NaCl，0.2g KCl，0.2g KH2PO4，2.9g Na2HPO4·12 H2O，溶于800mL纯水中，用NaOH或HCl调pH到7.2～7.4，定容至1000mL；
PBST：含0.05 % 吐温 20的PBS；
TMB显色液：A液：Na2HPO4 .12H2O 18.43g，柠檬酸 9.33g，纯水定容至1000mL；B液：60mg TMB 溶于100mL乙二醇中。A、B液按体积比1:5混合即为TMB显色液，现用现混。

Claims (3)

1.一株甲霜灵单克隆抗体杂交瘤细胞株20170507，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.14703，保藏日期为2017年9月5日。
2.甲霜灵单克隆抗体，其特征在于：其由权利要求1所述保藏编号为CGMCC No.14703甲霜灵单克隆抗体杂交瘤细胞株20170507分泌产生。
3.权利要求2所述甲霜灵单克隆抗体的应用，其特征是：将其应用在食品安全中甲霜灵残留的分析检测中。
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