CN108998422A - 一种分泌噻虫嗪单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种分泌噻虫嗪单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用，属于食品安全免疫检测领域。所述杂交瘤细胞株的保藏编号为：CGMCC No.14699，是将BALB/c小鼠用完全弗氏佐剂进行首次免疫，不完全弗氏佐剂进行3次加强免疫，不含佐剂的噻虫嗪完全抗原进行1次冲击免疫，使得BALB/c小鼠获得免疫；将高效价低IC50的获得免疫的小鼠脾细胞通过PEG方法与小鼠骨髓瘤细胞融合，经过间接竞争ELISA筛选和三次亚克隆，得到的细胞株。此细胞株分泌的单克隆抗体，对噻虫嗪具有较好的特异性和检测灵敏度(IC50值为0.81ng/mL)可以用于食品中噻虫嗪的残留检测。

Description

一种分泌噻虫嗪单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用
技术领域
本发明涉及一种分泌噻虫嗪单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用，属于属于食品安全免疫检测领域。
背景技术
噻虫嗪(Thiamethoxam，TMX)是先正达公司1991年研发的第二代新烟碱杀虫剂；从结构上看，以2-氯-5-噻唑基和甲基作为药效基团是对恶二嗪先导物最理想的修饰结合；从作用靶标看，作为乙酰胆碱受体抑制剂干扰昆虫神经信号传导，方式新颖；从杀虫活性看，比第一代新烟碱杀虫剂活性更强，且使用方式多样化；从作用范围看，它对几乎所有咀嚼式口器和绝大多数刺吸口器害虫均有优良防效，尤其在控制对常规杀虫剂产生抗性的害虫方面优势突出；从安全性看，它对哺乳动物低毒，无致畸、致突变效应。
基于以上优点，近年来噻虫嗪在农业生产中被广泛应用，不仅使许多靶标害虫产生了抗药性，而且其在农产品中的高水平残留对消费者造成了潜在威胁。
噻虫嗪的传统检测方法有气质联用法、毛细管电泳法、高效液相色谱法和毛细管电泳质谱联用法等，然而这些方法的前处理比较复杂、费时，不适用于大量样品的快速检测，为了维护广大消费者的利益，有必要建立一种针对噻虫嗪的高效、快速的检测方法。
酶联免疫法(ELISA)是一种极为高效、敏感、快速的检测方法，检测时对样本的纯度要求不高而且操作简便，适用于大量样本的现场快速检测，然而，使用酶联免疫法检测噻虫嗪的前提是得到对噻虫嗪具有高特异性和高灵敏度的单克隆抗体，因此，找到一种制备对噻虫嗪具有高特异性和高灵敏度的单克隆抗体的方法十分关键。
发明人尝试通过杂交瘤细胞制备噻虫嗪单克隆抗体，但在制备能分泌噻虫嗪单克隆抗体的杂交瘤细胞株的过程中，如何制备噻虫嗪半抗原和噻虫嗪完全抗原、如何使小鼠产生强免疫，还需进一步的研究；如何使得制备出的杂交瘤细胞株能够成功分泌出噻虫嗪单克隆抗体，还需进一步的研究；如何使得分泌出的噻虫嗪单克隆抗体特异性强、灵敏度高，也还需进一步的研究。
发明内容
本发明的目的是获得一种能分泌噻虫嗪单克隆抗体的杂交瘤细胞株。此杂交瘤细胞株分泌的噻虫嗪单克隆抗体对噻虫嗪具有较好的特异性和检测灵敏度(IC50值为0.81ng/mL)，可以用于建立噻虫嗪的免疫学检测方法，检测食品中噻虫嗪的残留。
本发明的技术方案如下：
本发明提供了一种分泌噻虫嗪单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株已于2017年9月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.14699，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明提供了上述一种分泌噻虫嗪单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备方法，包含如下步骤：
步骤1：制备噻虫嗪半抗原及噻虫嗪完全抗原，将获得的噻虫嗪完全抗原制备成弗氏佐剂与不完全弗氏佐剂；
步骤2：将得到的弗氏佐剂通过背部皮下注射，注射进入BALB/c小鼠体内进行多次免疫，首次免疫采用完全弗氏佐剂，加强免疫采用不完全弗氏佐剂；
步骤3：将经过上述免疫过程的小鼠进行采血，通过间接ELISA检测小鼠血清免疫效价和免疫抑制能力，删选出血清中噻虫嗪抗体含量高的获得免疫的小鼠；
步骤4：将删选出的小鼠用不完全弗氏佐剂再进行最后一次加强免疫，然后通过腹腔注射进行冲击免疫，冲击免疫采用不含弗氏佐剂的噻虫嗪完全抗原进行；
步骤5：将进行冲击免疫后的BALB/c小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞融合，将融合的细胞通过培养基培养，利用间接ELISA检测阳性细胞孔，并进一步利用间接竞争ELISA法测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制的阳性细胞孔进行亚克隆，最终筛选出获得能分泌噻虫嗪单克隆抗体的杂交瘤细胞株；
所述步骤1中的噻虫嗪半抗原的分子式如下：
所述步骤1中的噻虫嗪完全抗原的分子式如下：
在本发明的一种实施方式中，所述步骤2、4中的首次免疫与加强免疫之间间隔一个月，加强免疫之间间隔21天，加强免疫与冲击免疫之间间隔18～21天。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤2、4中的首次免疫剂量为100μg/只，加强免疫剂量为50μg/只，冲击免疫剂量为25μg/只。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤2、4中的免疫过程，包含1次首次免疫、4次加强免疫和1次冲击免疫；
在本发明的一种实施方式中，所述步骤3中的采血为第3次免疫过程结束后第7天进行采血。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤5中的细胞融合是在冲击免疫结束3天后进行。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤5中的细胞融合是通过聚乙二醇(PEG4000)法进行的。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤5中的培养基为RPMI-1640培养基。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤5中的亚克隆次数为3次。
本发明提供了上述一种分泌噻虫嗪单克隆抗体的杂交瘤细胞株或上述一种分泌噻虫嗪单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备方法在制备噻虫嗪单克隆抗体方面的应用。
本法明提供了一种噻虫嗪半抗原，所述噻虫嗪半抗原的分子式如下：
本发明提供了上述一种噻虫嗪半抗原的制备方法，所述方法为将二甲亚砜(DMSO)溶解于噻虫嗪(TMX)，加入氢氧化钾，搅拌并滴加β-巯基丙酸溶液，升温进行反应，得到反应液；待反应液自然冷却后，加入水，以HCl调反应液pH，以二氯甲烷萃取，得到提取液；提取液经干燥、浓缩、结晶，得到噻虫嗪半抗原(TMX-COOH)。
在本发明的一种实施方式中，所述方法为将20mL二甲亚砜(DMSO)溶解于5.8g噻虫嗪(TMX)，加入2.25g氢氧化钾，边搅拌边滴加β-巯基丙酸溶液，油浴升温至100℃进行反应，得到反应液；待反应液自然冷却至室温后，加入50mL水，以6mol/L的HCl调反应液pH至3，以90mL二氯甲烷萃取，得到提取液；提取液经无水NaSO4干燥、浓缩、结晶，得到黄色晶体，即为噻虫嗪半抗原(TMX-COOH)。
在本发明的一种实施方式中，所述β-巯基丙酸溶液是通过将β-巯基丙酸溶解于DMSO得到的。
在本发明的一种实施方式中，所述β-巯基丙酸溶液是通过将2.1g的β-巯基丙酸溶解于10mL的DMSO得到的。
本发明提供了上述一种噻虫嗪半抗原或上述一种噻虫嗪半抗原的制备方法在在制备噻虫嗪完全抗原、分泌噻虫嗪单克隆抗体的杂交瘤细胞株、噻虫嗪单克隆抗体方面的应用。
本发明提供了一种噻虫嗪完全抗原，所述噻虫嗪完全抗原的分子式如下：
本发明提供了上述一种噻虫嗪完全抗原的制备方法，所述方法为将噻虫嗪半抗原(TMX-COOH)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶解于无水N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，搅拌进行反应，得到噻虫嗪半抗原(TMX-COOH)溶液；将N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)溶解于无水DMF后，加入到TMX-COOH溶液中，搅拌进行反应，得到A液；将钥孔血蓝蛋白(KLH)用磷酸盐缓冲溶液(PBS)稀释，得到B液；将A液加入到B液中进行反应，得到反应液；用PBS溶液透析反应液，得到完全抗原(TMX-COOH-KLH)。
在本发明的一种实施方式中，所述方法为将2.8mg噻虫嗪半抗原(TMX-COOH)、2.8mgN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶解于300μL无水N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，室温搅拌反应10min，得到噻虫嗪半抗原(TMX-COOH)溶液；将4.8mg N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)溶解于100μL无水DMF后，加入到TMX-COOH溶液中，室温搅拌进行反应6-8h，得到A液；将6.8mg钥孔血蓝蛋白(KLH)用1mL磷酸盐缓冲溶液(PBS)稀释，得到B液；将逐滴将A液缓慢加入到B液中进行反应，得到反应液；用PBS溶液透析反应液，除去未反应的小分子半抗原，得到完全抗原(TMX-COOH-KLH)。
在本发明的一种实施方式中，所述磷酸盐缓冲溶液(PBS)为浓度为0.01mol/L、pH为7.4。
本发明提供了上述一种噻虫嗪完全抗原或上述一种噻虫嗪完全抗原的制备方法在制备分泌噻虫嗪单克隆抗体的杂交瘤细胞株、噻虫嗪单克隆抗体方面的应用。
本发明提供了一种噻虫嗪单克隆抗体，所述噻虫嗪单克隆抗体是由保藏编号为CGMCC No.14699的杂交瘤细胞株分泌获得的。
本发明提供了上述一种噻虫嗪单克隆抗体的制备方法，所述方法为取BALB/c小鼠，腹腔注射石蜡油，再腹腔注射保藏编号为CGMCC No.14699的杂交瘤细胞株，注射后收集腹水，将腹水纯化，将获得的单抗低温保存。
在本发明的一种实施方式中，所述方法为取8-10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射石蜡油1mL，7天后每只小鼠腹腔注射1×106保藏编号为CGMCC No.14699的杂交瘤细胞株，从第7天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-硫酸铵法纯化，获得的单抗置于-20℃保存。
本发明提供了上述一种噻虫嗪单克隆抗体或上述一种噻虫嗪单克隆抗体的制备方法在识别噻虫嗪方面的应用。
本发明提供了应用上述一种分泌噻虫嗪单克隆抗体的杂交瘤细胞株或上述一种噻虫嗪完全抗原或上述一种噻虫嗪单克隆抗体制备得到的检测试剂盒。
有益效果：
(1)本发明获得的噻虫嗪单克隆抗体，对噻虫嗪有较好的检测灵敏度和特异性(IC50值为0.81ng/mL、对噻虫嗪类似物交叉小于10％，交叉率＝(噻虫嗪的IC50/类似物的IC50)×100％)；
(2)本发明提供了一种全新的噻虫嗪完全抗原及其合成思路；
(3)本发明获得的噻虫嗪单克隆抗体细胞株可以用于免疫分析检测。
生物材料保藏
一种分泌噻虫嗪单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分类命名为：单克隆细胞株，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：CGMCC No.14699，保藏日期为：2017年9月5日。
附图说明
图1为本发明噻虫嗪半抗原的合成过程；
图2为本发明噻虫嗪单克隆抗体对噻虫嗪的抑制标准曲线。
具体实施方式
本发明下面的实施例仅作为本发明内容的进一步说明，不能作为本发明的限定内容或范围。下面通过实施例对本发明作进一步说明。
下述实施例中涉及的培养基如下：
RPMI-1640培养基(mg/L)：L-精氨酸290、L-门冬酰胺50、L-门冬氨酸20、L-胱氨酸二盐酸盐65.15、L-谷氨酸20、甘氨酸10、L-组氨酸15、L-羟脯氨酸20、L-异亮氨酸50、L-亮氨酸50、L-赖氨酸盐酸盐40、L-甲硫氨酸15、L-苯丙氨酸15、L-脯氨酸20、L-丝氨酸30、L-苏氨酸20、L-色氨酸5、L-酪氨酸23.19、L-缬氨酸20、对氨基苯甲酸1、硝酸钙100、无水硫酸镁48.84、无水磷酸二氢钠676.13、氯化钾400、氯化钠6000、葡萄糖2000、还原谷胱甘肽1、酚红5、L-谷氨酰胺300、生物素0.2、D-泛酸钙0.25、叶酸1、i-肌醇35、烟酰胺1、氯化胆碱3、盐酸吡哆醇1、核黄素0.2、盐酸硫胺素1、维生素B12 0.005、碳酸氢钠2000。
下述实施例中涉及的试剂如下：
碳酸盐缓冲液(CBS)：称取Na2CO3 1.59g，NaHCO3 2.93g，分别溶于少量双蒸水后混合，加双蒸水至约800mL混匀，调pH值至9.6，加双蒸水定容至1000mL，4℃贮存备用。
磷酸盐缓冲液(PBS)：8.00g NaCl，0.2g KCl，0.2g KH2PO4，2.9g Na2HPO4·12H2O，溶于800mL纯水中，用NaOH或HCl调pH到7.2～7.4，定容至1000mL；
PBST：含0.05％吐温20的PBS；
TMB显色液：A液：Na2HPO4.12H2O 18.43g，柠檬酸9.33g，纯水定容至1000mL；B液：60mg TMB溶于100mL乙二醇中。A、B液按5：1混合即为TMB显色液，现用现混。
下述实施例中涉及的检测方法如下：
噻虫嗪抑制率检测方法：通过棋盘试验选择ic-ELISA中最合适的抗原和抗体浓度。用包被缓冲液液抗原稀释至0.01,0.03,0.1和0.3μg/mL，并用抗体稀释液将抗体稀释至0.03,0.1,0.3和1μg/mL。选择最佳工作点后，将噻虫嗪标准品稀释为8个浓度(0，0.125，0.25，0.5，1，2，4，8ng/mL)，按照ic-ELISA操作步骤，最后用OriginPro 8.5做图(结果如图2所示)，获得TMX标准抑制曲线，计算IC50。
实施例1：噻虫嗪半抗原的合成
合成路径如图1。
由于噻虫嗪小分子不具有免疫原性，不能刺激小鼠产生免疫应答，进而产生抗体，因此需通过蛋白连接技术将噻虫嗪偶联到蛋白上，使其获得免疫原性；蛋白偶联技术中常用的活泼基团有氨基，羧基，羟基，巯基等，鉴于TMX分子结构式中不含有这些活泼基团，因此需要衍生。
将20mL二甲亚砜(DMSO)溶解于5.8g噻虫嗪(TMX)，加入2.25g氢氧化钾，边搅拌边滴加β-巯基丙酸溶液(β-巯基丙酸溶液是通过将2.1g的β-巯基丙酸溶解于10mL的DMSO得到的)，油浴升温至100℃进行反应，得到反应液；待反应液自然冷却至室温后，加入50mL水，以6mol/L的HCl调反应液pH至3，以90mL二氯甲烷萃取，得到提取液；提取液经无水NaSO4干燥、浓缩、结晶，得到黄色晶体，即为噻虫嗪半抗原(TMX-COOH)。
实施例2：噻虫嗪完全抗原的合成
将2.8mg噻虫嗪半抗原(TMX-COOH)、2.8mgN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶解于300μL无水N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，室温搅拌反应10min，得到噻虫嗪半抗原(TMX-COOH)溶液；将4.8mg N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)溶解于100μL无水DMF后，加入到TMX-COOH溶液中，室温搅拌进行反应6-8h，得到A液；将6.8mg钥孔血蓝蛋白(KLH)用1mL浓度为0.01mmol/L、pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液(PBS)稀释，得到B液；将逐滴将A液缓慢加入到B液中进行反应，得到反应液；用PBS溶液透析反应液，除去未反应的小分子半抗原，得到完全抗原(TMX-COOH-KLH)。
实施例3：噻虫嗪包被原的合成
将5mg噻虫嗪半抗原(TMX-COOH)、4.8mgN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶解于300μL无水N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，室温搅拌反应10min，得到噻虫嗪半抗原(TMX-COOH)溶液；将7.6mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶解于100μL无水DMF后，加入到TMX-COOH溶液中，室温搅拌进行反应6-8h，得到A液；将10mg鸡卵白蛋白(OVA)用1mL浓度为0.01mmol/L、pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液(PBS)稀释，得到B液；将逐滴将A液缓慢加入到B液中进行反应，得到反应液；用PBS溶液透析反应液，除去未反应的小分子半抗原，得到包被原(TMX-COOH-OVA)。
实施例4：分泌噻虫嗪单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备
1、动物免疫的获得
将TMX完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化后，对BALB/c小鼠进行颈背部皮下多点注射免疫(冲刺免疫除外)；首次免疫用完全弗氏佐剂，剂量为100ug/只；多次加强免疫用不完全弗氏佐剂且剂量减半即为50ug/只；冲刺免疫不用佐剂，直接用生理盐水稀释后腹腔注射，剂量再减半即为25ug/只；首次免疫与第二次加强免疫之间间隔一个月，多次加强免疫之间间隔21天，冲刺免疫与最后一次加强免疫之间间隔18-21天；通过间接竞争酶联免疫法(ic-ELISA)观测小鼠免疫效果即检测小鼠血清的效价和抑制；
2、细胞融合
在冲刺免疫三天后，按照常规PEG(聚乙二醇，分子量为4000)方法进行细胞融合，具体步骤如下：
a、摘眼球取血，颈椎脱臼法处死小鼠后，立即放入75％酒精中消毒，浸泡5min左右，无菌操作取出小鼠的脾脏，用注射器的胶头适度研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，收集，离心(1200rpm，8min)，用RPMI-1640培养基洗涤脾细胞三次，最后一次离心后，将脾细胞稀释到一定体积，计数，备用；
b、收集SP2/0细胞：融合前7-10天，将SP2/0瘤细胞用含10％FBS(胎牛血清)RPMI-1640培养基在5％CO2培养箱中，融合前要求SP2/0瘤细胞数量达到1～4×107，保证融合前SP2/0瘤细胞处于对数生长期，融合时，收集瘤细胞，悬浮于RPMI-1640基础培养液中，进行细胞计数；
c、融合过程7min：第1min，将1mL的PEG 1500由慢到快滴加到细胞中；第2min，静置；第3min和第4min，在1min内滴加1mL RPMI-1640培养基；第5min和第6min，在1min内滴加2mL RPMI-1640培养基；第7min，每10s滴加1mL的RPMI-1640培养基；然后37℃温浴5min；离心(800rpm，8min)，弃上清，重悬入含20％胎牛血清，2％的50×HAT的RPMI-1640筛选培养液中，按照200μL/孔加到96孔细胞板，置于37℃，5％CO2培养箱中培养。
3、细胞筛选与细胞株建立
在细胞融合的第3天对融合细胞进行RPMI-1640筛选培养液半换液，第5天进行用含20％胎牛血清，1％的100×HT的RPMI-1640过渡培养液进行全换液，在第7天取细胞上清进行筛选。
筛选分两步：第一步先用ic-ELISA法筛选出阳性细胞孔，第二步选用噻虫嗪为标准品，用ic-ELISA法对阳性细胞进行抑制效果测定。
选择对噻虫嗪标准品有较好抑制的细胞孔，采用有限稀释法进行亚克隆，七天后用同样的方法进行检测。
按上述方法进行三次亚克隆，最终获得噻虫嗪单克隆抗体细胞株。
实施例5：噻虫嗪单克隆抗体的制备与鉴定
取8-10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射无菌石蜡油1mL；7天后每只小鼠腹腔注射1×106噻虫嗪杂交瘤细胞，从第七天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-饱和硫酸铵法进行抗体纯化。
在偏酸条件下，正辛酸可以沉淀腹水中除IgG免疫球蛋白外的其他杂蛋白，然后离心，弃沉淀；再用等量饱和度的硫酸铵溶液沉淀IgG型的单克隆抗体，离心，弃上清，用0.01M的PBS溶液(pH7.4)溶解后，透析脱盐，最终得到纯化后的单克隆抗体置于-20℃保存。
使用间接竞争ELISA，测得噻虫嗪单克隆抗体的IC50值为0.81ng/mL、对噻虫嗪类似物交叉小于10％，说明对噻虫嗪有很好的灵敏度，可用于噻虫嗪免疫分析检测。
(交叉率＝(噻虫嗪的IC50/类似物的IC50)×100％)
实施例6：噻虫嗪单克隆抗体的应用
将杂交瘤细胞株通过体内腹水制备的单克隆抗体应用于TMX的ELISA添加回收试验，具体步骤如下：
(1)将用碳酸盐缓冲液(CBS)稀释好的浓度为0.3μg/mL的包被原包被96孔酶标板，每孔100μL，37℃包被2h后，用PBST洗液洗板三次，每次每孔200μL，每次3min，拍干；
(2)用含0.2％明胶的CBS进行封闭，每孔200μL，37℃封闭2h，用PBST洗液洗板三次，每次每孔200μL，每次3min，拍干；
(3)用磷酸盐缓冲液(PBS)分别配置0、0.078125、0.15625、0.3125、0.625、1.25、2.5、5μg/L的TMX标准溶液，将标准溶液以及待检测样品提取液，分别加入到已经封闭好的酶标板中，每孔50μL，每个样品重复3个孔，再每孔加入50μL以1:32000稀释的抗DNSH单克隆抗体，37℃反应0.5h后，洗板拍干；
(4)每孔加入100μL用含0.1％明胶的PBS以1:3000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG二抗，37℃反应0.5h后，洗板拍干；
(5)每孔加入100μL的TMB显色液，37℃显色15min后，每孔加入50μL 2M的H2SO4终止液，450nm测吸光值；
(6)添加回收及样品前处理：
选择黄瓜为检测样品。
待测样品洗净、切碎，分别称取三份样品，每份10g，向样品中分别添加5ppb、50ppb、100ppb的TMX标准品(根据抗体线性范围及IC50设定添加浓度)，加入20mL乙腈，剧烈振荡2min，加入1gNaCl，4gMgSO4，剧烈振荡2min，4000rpm离心10min，收集上清液，取上清液1mL，氮气吹干，用5mLPBS复溶(即稀释了五倍以减少样品基质的影响)。
采用间接竞争ELISA进行添加回收试验，其回收率分别为97％，89％，93％。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种分泌噻虫嗪单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，所述杂交瘤细胞株已于2017年9月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.14699，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2.如权利要求1所述的一种分泌噻虫嗪单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备方法，其特征在于，包含如下步骤：
步骤1：制备噻虫嗪半抗原及噻虫嗪完全抗原，将获得的噻虫嗪完全抗原制备成弗氏佐剂与不完全弗氏佐剂；
步骤2：将得到的弗氏佐剂通过背部皮下注射，注射进入BALB/c小鼠体内进行多次免疫，首次免疫采用完全弗氏佐剂，加强免疫采用不完全弗氏佐剂；
步骤3：将经过上述免疫过程的小鼠进行采血，通过间接ELISA检测小鼠血清免疫效价和免疫抑制能力，删选出血清中噻虫嗪抗体含量高的获得免疫的小鼠；
步骤4：将删选出的小鼠用不完全弗氏佐剂再进行最后一次加强免疫，然后通过腹腔注射进行冲击免疫，冲击免疫采用不含弗氏佐剂的噻虫嗪完全抗原进行；
步骤5：将进行冲击免疫后的BALB/c小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞融合，将融合的细胞通过HAT培养基培养，利用间接ELISA检测阳性细胞孔，并进一步利用间接竞争ELISA法测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制的阳性细胞孔进行亚克隆，最终筛选出获得能分泌噻虫嗪单克隆抗体的杂交瘤细胞株；
所述步骤1中的噻虫嗪半抗原的分子式如下：
所述步骤1中的噻虫嗪完全抗原的分子式如下：
3.权利要求1所述的一种分泌噻虫嗪单克隆抗体的杂交瘤细胞株或权利要求2所述的一种分泌噻虫嗪单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备方法在制备噻虫嗪单克隆抗体方面的应用。
4.一种噻虫嗪完全抗原，其特征在于，所述噻虫嗪完全抗原的分子式如下：
5.如权利要求4所述的一种噻虫嗪完全抗原的制备方法，其特征在于，所述方法为将噻虫嗪半抗原(TMX-COOH)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶解于无水N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，搅拌进行反应，得到噻虫嗪半抗原(TMX-COOH)溶液；将N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)溶解于无水DMF后，加入到TMX-COOH溶液中，搅拌进行反应，得到A液；将钥孔血蓝蛋白(KLH)用磷酸盐缓冲溶液(PBS)稀释，得到B液；将A液加入到B液中进行反应，得到反应液；用PBS溶液透析反应液，得到完全抗原(TMX-COOH-KLH)。
6.权利要求4所述的一种噻虫嗪完全抗原或权利要求5所述的一种噻虫嗪完全抗原的制备方法在制备分泌噻虫嗪单克隆抗体的杂交瘤细胞株、噻虫嗪单克隆抗体方面的应用。
7.一种噻虫嗪单克隆抗体，其特征在于，所述噻虫嗪单克隆抗体是由保藏编号为CGMCCNo.14699的杂交瘤细胞株分泌获得的。
8.如权利要求7所述的一种噻虫嗪单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述方法为取BALB/c小鼠，腹腔注射石蜡油，再腹腔注射保藏编号为CGMCC No.14699的杂交瘤细胞株，注射后收集腹水，将腹水纯化，将获得的单抗低温保存。
9.权利要求7所述的一种噻虫嗪单克隆抗体或权利要求8所述的一种噻虫嗪单克隆抗体的制备方法在识别噻虫嗪方面的应用。
10.应用权利要求1所述的一种分泌噻虫嗪单克隆抗体的杂交瘤细胞株或权利要求4所述的一种噻虫嗪完全抗原或权利要求7所述的一种噻虫嗪单克隆抗体制备得到的检测试剂盒。
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