CN109825478A - 一株分泌抗格列本脲单克隆抗体的杂交瘤细胞株e号及其应用 - Google Patents

Abstract

一株分泌抗格列本脲单克隆抗体的杂交瘤细胞株E号及其应用，属于食品安全免疫检测领域。本发明分泌抗格列本脲单克隆抗体的杂交瘤细胞株E号，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2018年5月24日，保藏编号CGMCC No.17305。本发明将格列本脲的完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化，通过颈背部皮下多点注射免疫BALB/c小鼠，最终得到分泌抗格列本脲单克隆抗体的杂交瘤细胞株E号。此细胞株分泌的单克隆抗体，对格列本脲具有较好的特异性和检测灵敏度（IC₅₀值为0.8 ng/mL），可实现对保健食品中格列本脲残留量的检测，为食品中格列本脲残留的免疫检测提供了原料，具有实际应用价值。

Description

一株分泌抗格列本脲单克隆抗体的杂交瘤细胞株E号及其 应用

技术领域

本发明涉及一株分泌抗格列本脲单克隆抗体的杂交瘤细胞株E号及其应用，属于食品安全免疫检测领域。

背景技术

格列本脲（Glibenclamide）是第二代磺脲类口服降糖药的代表，其作用机制主要是促进胰腺胰岛B细胞分泌胰岛素，它还可以通过增加门静脉胰岛素水平或对肝脏直接作用，抑制肝糖原分解和糖原异生作用使肝生成和输出葡萄糖减少，也可能增加胰外组织对胰岛素的敏感性和糖的利用。因此，总的作用是降低空腹血糖与餐后血糖。其疗效特点为降糖作用强、持续时间长。由于我国糖尿病人的增长速度较快，我国的糖尿病非处方药、保健食品市场也是种类繁多。目前，某些中药保健品生产厂家为增强降糖效果，在其生产的中药保健品中非法掺入化学药品格列本脲。

格列本脲的降血糖作用较甲苯磺丁脲强250～500倍。由于它清除率长，最易发生低血糖反应，故临床使用要谨慎。而长期服用掺有格列本脲的保健品可能会产生严重的低血糖反应，特别是服用过量时，有致死的危险。除此之外，格列本脲可引起血小板减少性紫瘢，过敏性血管炎。该药有肝脏毒性，在不知情的情况下服用格列本脲是非常危险的，长期大量地服用格列本脲，最终会造成病人的低血糖和肾病，甚至导致死亡。

目前，国内外报道的格列本脲化合物检测主要是通过高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)、气相色谱串联质谱(GC-MS)、毛细管电泳法（CE）等。但这些方法的样品前处理过程复杂，实验周期长，不适合大量样本的快速检测。而国内尚未建立格列本脲的检测标准及其测定方法，这给格列本脲食品添加剂生产使用和进出口贸易以及食品卫生监测工作带来很大的困难。基于酶联免疫分析方法（ELISA）简单、灵敏、快捷和高通量的优点，建立一种高效的格列本脲免疫学检测方法很有必要，而建立此方法的一个重要前提即需筛选出针对格列本脲的高特异性单克隆单体。

发明内容

本发明的目的是提供一株分泌抗格列本脲单克隆抗体的杂交瘤细胞株E号及其应用，由该细胞株制备的抗体对格列本脲具有较好特异性和检测灵敏度，可以用来建立格列本脲的免疫学检测方法。

本发明的技术方案，一株分泌抗格列本脲单克隆抗体的杂交瘤细胞株E号，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2018年5月24日，保藏编号CGMCC No.17305。

抗格列本脲单克隆抗体，它由所述保藏编号CGMCC No.17305的抗格列本脲单克隆抗体的杂交瘤细胞株E号分泌产生。

所述抗格列本脲单克隆抗体的应用，用于食品安全检测中格列本脲残留的分析检测。

本发明所述分泌抗格列本脲单克隆抗体的杂交瘤细胞株E号的制备基本步骤为：

（1）半抗原结构：

结构类似物 Mol. Wt: 501

（2）完全抗原格列本脲-KLH的制备：称取3.6mg 格列本脲（格列本脲与钥孔血蓝蛋白（KLH）摩尔比为6000：1），2.5mg N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），溶解于300μL N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，室温搅拌反应10min；再称取4.2mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，用100μL DMF充分溶解后，加入到格列本脲溶液中，室温搅拌反应6-8 h(称为A液)。取6mg KLH，用2mL 0.01M硼酸盐缓冲溶液（BB, pH=8.6）溶解（称为B液）。再逐滴将A液缓慢加入到B液中，室温反应过夜；然后用0.01M PBS溶液透析，除去未反应的小分子半抗原，得到完全抗原格列本脲-KLH，并通过紫外吸收扫描方法进行鉴定；

（3）小鼠的免疫：将格列本脲完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化后，对BALB/c小鼠进行颈背部皮下多点注射免疫（冲刺免疫除外）。首次免疫用完全弗氏佐剂，剂量为分泌抗格列本脲单克隆抗体的杂交瘤细胞株E号100μg/只；多次加强免疫用不完全弗氏佐剂且剂量减半即为50μg/只；冲刺免疫不用佐剂，直接用生理盐水稀释后腹腔注射，剂量再减半即为25μg/只。首次免疫与第二次加强免疫之间间隔一个月，多次加强免疫之间间隔21天，冲刺免疫与最后一次加强免疫之间间隔18-21天。通过间接竞争酶联免疫法（ic-ELISA）观测小鼠免疫效果即检测小鼠血清的效价和抑制；

（4）细胞融合与细胞株建立：通过聚乙二醇（PEG 4000）法将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞进行融合，采用选择性培养基（HAT培养基）筛选出杂交瘤细胞，并用HT培养基进行细胞培养。融合一周后利用ic-ELISA法检测阳性细胞孔，并进一步利用ic-ELISA法测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对抑制较好的阳性细胞孔进行亚克隆，一周后再次检测、挑孔、亚克隆。按上述方法进行三次亚克隆后获得格列本脲的高分泌特异抗体的单克隆杂交瘤细胞株E号；

（5）杂交瘤细胞株性质的鉴定：通过ic-ELISA测定灵敏度和特异性。

格列本脲完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化完全，通过颈背部皮下多点注射免疫BALB/c小鼠。首次免疫（100μg /只）用完全弗氏佐剂，多次加强免疫（50μg /只）用不完全弗氏佐剂，最后一次冲刺免疫用格列本脲完全抗原（25μg /只，不含佐剂）进行小鼠腹腔注射。取特异性高，IC₅₀低的小鼠脾细胞，通过PEG方法与小鼠骨髓瘤细胞融合，经过ic-ELISA法筛选细胞和三次亚克隆，得到一株高分泌特异抗体的杂交瘤细胞株。

本发明的有益效果：本发明提供的杂交瘤细胞株E号分泌的单克隆抗体，对格列本脲具有较好的特异性和检测灵敏度（IC₅₀值为0.8ng/mL），可实现对保健食品中格列本脲残留量的检测，为食品中格列本脲残留的免疫检测提供了原料，具有实际应用价值。

生物材料样品保藏：一株分泌抗格列本脲单克隆抗体的杂交瘤细胞株E号，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期2018年5月24日，保藏编号CGMCCNo.17305。

附图说明

图1 抗格列本脲单克隆抗体对格列本脲的标准抑制曲线。

具体实施方式

本发明下面的实施例仅作为本发明内容的进一步说明，不能作为本发明的限定内容或范围。下面通过实施例对本发明作进一步说明。

本发明通过将格列本脲完全抗原免疫小鼠，通过细胞融合，HAT选择性培养基培养，通过ic-ELISA筛选细胞上清，最终得到了针对格列本脲具有高分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株。

实施例1 杂交瘤细胞株E号的制备

（1）完全抗原的合成：称取3.6mg格列本脲（格列本脲与钥孔血蓝蛋白（KLH）摩尔比为6000：1），2.5 mg N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），溶解于300μL N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，室温搅拌反应10min；再称取4.2mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，用100μL DMF充分溶解后，加入到格列本脲溶液中，室温搅拌反应6-8h(称为A液)。取6mg KLH，用2mL 0.01M硼酸盐缓冲溶液（BB, pH=8.6）溶解（称为B液）。再逐滴将A液缓慢加入到B液中，室温反应过夜；然后用0.01M PBS溶液透析，除去未反应的小分子半抗原，得到完全抗原格列本脲- KLH，并通过紫外吸收扫描方法进行鉴定；

（2）动物免疫：将格列本脲完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化后，对BALB/c小鼠进行颈背部皮下多点注射免疫（冲刺免疫除外）。首次免疫用完全弗氏佐剂，剂量为100μg/只；多次加强免疫用不完全弗氏佐剂且剂量减半即为50μg/只；冲刺免疫不用佐剂，直接用生理盐水稀释后腹腔注射，剂量再减半即为25μg/只。首次免疫与第二次加强免疫之间间隔一个月，多次加强免疫之间间隔21天，冲刺免疫与最后一次加强免疫之间间隔18-21天。通过间接竞争酶联免疫法（ic-ELISA）观测小鼠免疫效果即检测小鼠血清的效价和抑制；

（3）细胞融合：在冲刺免疫三天后，按照常规PEG（聚乙二醇，分子量为4000）方法进行细胞融合，具体步骤如下：

a、小鼠摘眼球取血，颈椎脱臼法处死小鼠后，立即放入 75% 酒精中消毒，浸泡 5min左右，无菌操作取出小鼠的脾脏，用注射器胶头适度研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，收集，离心（1200rpm，8 min），用RPMI-1640培养基洗涤脾细胞三次，最后一次离心后，将脾细胞稀释到一定体积，计数，备用；

b、收集SP2/0细胞：融合前 7-10 天，将 SP2/0 瘤细胞用含10% FBS（胎牛血清）RPMI-1640 培养基在5% CO₂培养箱中培养。融合前要求SP2/0瘤细胞数量达到（1-4）×10⁷，保证融合前SP2/0瘤细胞处于对数生长期。融合时，收集瘤细胞，悬浮于RPMI-1640基础培养液中，进行细胞计数；

c、融合过程7min：第1min，将1mL的PEG 4000由慢到快滴加到细胞中；第2min，静置。第3min 和第4min，在1min内滴加1mL RPMI-1640培养基；第5min 和第6min，在1min内滴加2mLRPMI-1640 培养基；第7min，每10s 滴加1mL 的 RPMI-1640 培养基。然后37℃温浴5min。离心（800rpm，10min），弃上清，细胞轻轻敲散，并向其内加入含20%胎牛血清，2% 50×HAT的RPMI-1640选择性培养基（HAT培养基），按照200μL/孔加到 96 孔细胞板，置于37℃、5% CO₂培养箱中培养。

（4）细胞筛选与细胞株建立：在细胞融合后的第3天用HAT培养基对融合细胞进行半换液；第5天用含20% 胎牛血清，1%的100×HT的RPMI-1640过渡培养液（HT培养基）进行全换液；第7天取细胞上清进行筛选。筛选分两步：第一步先用ic-ELISA法筛选出阳性细胞孔，第二步选用格列本脲为标准品，用ic-ELISA法对阳性细胞进行抑制效果测定。选择对格列本脲标准品有较好抑制的细胞孔，采用有限稀释法进行亚克隆，七天后用同样的方法进行检测。按上述方法进行三次亚克隆，最终获得格列本脲单克隆抗体细胞株E号。

（5）单克隆抗体的制备与鉴定：取8-10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射无菌石蜡油1mL；7天后每只小鼠腹腔注射1×10⁶ 格列本脲杂交瘤细胞，从第七天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-饱和硫酸铵法进行抗体纯化。在偏酸条件下，正辛酸可以沉淀腹水中除IgG免疫球蛋白外的其他杂蛋白，然后离心，弃沉淀；再用等量饱和度的硫酸铵溶液沉淀 IgG型的单克隆抗体，离心，弃上清，用0.01 M PBS溶液（pH7.4）溶解后，透析脱盐，最终得到纯化后的单克隆抗体置于-20℃保存。

5.1包被：将包被原格列本脲-BSA用0.05M pH9.6 碳酸盐缓冲液从1μg/mL开始3倍比稀释，100μL/孔，37℃反应2h；

5.2洗涤：将板内溶液倾去，并用洗涤液洗涤3次，每次3min；

5.3封闭：拍干后，加入200μL/孔封闭液，37℃反应2h。洗涤后烘干备用；

5.4加样：将抗血清从1:1000开始倍比稀释，并加入到各稀释度的包被孔中，100μL/孔，37℃反应30min；充分洗涤后，加入1:3000稀释的HRP-羊抗鼠IgG，100μL/孔，37℃反应30min；

5.5显色：将酶标板取出，充分洗涤后，每孔加入100μL的TMB显色液，37℃避光反应15min；

5.6终止和测定：每孔加入50μL终止液以终止反应，然后用酶标仪测定各孔的OD₄₅₀值。

用ic-ELISA测定单克隆抗体格列本脲的IC₅₀为0.8ng/mL，说明对格列本脲有很好的灵敏度，可用于格列本脲免疫分析检测。

溶液的配置：

碳酸盐缓冲液（CBS）：称取Na₂CO₃ 1.59 g，NaHCO₃ 2.93 g，分别溶于少量双蒸水后混合，加双蒸水至约800mL混匀，调pH值至9.6，加双蒸水定容至1000mL，4℃贮存备用；

磷酸盐缓冲液（PBS）：8.00g NaCl，0.2g KCl，0.2g KH₂PO₄，2.9g Na₂HPO₄·12 H₂O，溶于800mL纯水中，用NaOH或HCl调pH到7.2～7.4，定容至1000mL；

PBST：含0.05 % 吐温20的PBS；

TMB显色液：A液：Na₂HPO₄ ^.12H₂O 18.43g，柠檬酸 9.33g，纯水定容至1000mL；B液：60mgTMB 溶于100mL乙二醇中。A、B液按体积比5：1混合即为TMB显色液，现用现混。

综上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用来限定本发明的实施范围。即凡依本发明申请范围的内容所作的等效变化与修饰，都应为本发明的技术范畴。

Claims (3)

1.一株分泌抗格列本脲单克隆抗体的杂交瘤细胞株E号，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2018年5月24日，保藏编号CGMCCNo.17305。

2.抗格列本脲单克隆抗体，其特征在于：它由权利要求1所述保藏编号CGMCC No.17305的抗格列本脲单克隆抗体的杂交瘤细胞株E号分泌产生。

3.权利要求2所述抗格列本脲单克隆抗体的应用，其特征在于：用于食品安全检测中格列本脲残留的分析检测。