CN108948188B - 一株分泌噻虫胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株j6及其应用 - Google Patents

一株分泌噻虫胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株j6及其应用 Download PDF

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Abstract

一株分泌噻虫胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株J6及其应用，属于食品安全免疫检测技术领域。本发明提供了一株分泌噻虫胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株J6，所述杂交瘤细胞株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.14700，保藏日期为2017年9月5日。此细胞株分泌的单克隆抗体，对噻虫胺具有较好的特异性和检测灵敏度（IC50值为0.48ng/mL），可以用于建立噻虫胺的免疫学检测方法，用于食品中噻虫胺的残留检测。

Description

一株分泌噻虫胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株J6及其应用
技术领域
本发明涉及一株分泌噻虫胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株J6及其应用，属于食品安全免疫检测技术领域。
背景技术
噻虫胺（clothianidin，CTA）是含噻唑环的新型广谱新烟碱类杀虫剂，是一种高效安全、高选择性的杀虫剂，由日本Takeda武田公司/拜耳公司联合开发，于2001年12月在日本获得登记。噻虫胺作用机理是结合昆虫神经系统突触后膜的烟碱型乙酰胆碱受体，具有触杀、胃毒和内吸性，同时具有灵活的使用方法，可以通过叶面喷雾或土壤处理使用。田间试验表现出广谱、高效、低用量、低毒性、药效期长、与常规农药无交互抗性等优点，是高毒有机磷农药的一种替代品。
然而，随着农药使用品种和使用范围的不断扩大，农药残留造成的环境污染和食品安全问题曰益受到各国政府和消费者的广泛关注。研究表明，噻虫胺能对蜜蜂、蚕等有益生物和非靶标烟碱型乙酰胆碱受体昆虫造成致命的伤害，对蜜蜂接触为高毒，经口剧毒，极高风险性；对鸟和鱼为中等毒，低风险性；其对蜜蜂和家蚕剧毒，极高风险性。同时噻虫胺残留会对食品和环境造成潜在的风险，威胁人类健康。
噻虫胺的传统检测方法有气质联用法、毛细管电泳法、高效液相色谱法和毛细管电泳质谱联用法等，然而这些方法的前处理比较复杂、费时，不适用于大量样品的快速检测，为了维护广大消费者的利益，有必要建立一种针对噻虫胺的高效、快速的检测方法。
酶联免疫法（ELISA）是一种极为高效、敏感、快速的检测方法，检测时对样本的纯度要求不高而且操作简便，适用于大量样本的现场快速检测，然而，使用酶联免疫法检测噻虫胺的前提是得到对噻虫胺具有高特异性和高灵敏度的单克隆抗体，因此，找到一种制备对噻虫胺具有高特异性和高灵敏度的单克隆抗体的方法十分关键。
发明人尝试通过杂交瘤细胞制备噻虫胺单克隆抗体，但在制备能分泌噻虫胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株的过程中，如何制备噻虫胺半抗原和噻虫胺完全抗原、如何使小鼠产生强免疫，还需进一步的研究；制备出的杂交瘤细胞株是否能分泌出噻虫胺单克隆抗体，还需要进一步验证；分泌出的噻虫胺单克隆抗体特异性、灵敏度如何，也需要进一步验证。
发明内容
本发明的目的在于克服上述不足之处，提供一株分泌噻虫胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株J6及其应用。此杂交瘤细胞株分泌的噻虫胺单克隆抗体对噻虫胺具有较好的特异性和检测灵敏度（IC50值为0.48ng/mL），可以用于建立噻虫胺的免疫学检测方法，检测食品中噻虫胺的残留。
按照本发明提供的技术方案，一种噻虫胺半抗原，结构式如下：
Figure RE-RE-DEST_PATH_IMAGE001
。
本发明提供了上述一种噻虫胺半抗原的制备方法，所述方法为将二甲亚砜（DMSO）溶解噻虫胺（CTA），加入氢氧化钾，搅拌并滴加4-巯基丁酸溶液，升温进行反应，得到反应液；待反应液自然冷却后，加入水，以HCl调反应液pH，以正丁醇萃取，得到提取液；提取液经干燥、浓缩、结晶，得到噻虫胺半抗原（CTA-COOH）。
在本发明的一种实施方式中，所述方法为用20mL二甲亚砜DMSO溶解2.4g噻虫胺CTA，加入0.94g氢氧化钾，边搅拌边滴加4-巯基丁酸溶液，油浴升温至75℃反应72h，得到反应液；待反应液自然冷却至室温后，加入50mL水，以6mol/L的HCl调反应液pH至3，以90mL正丁醇萃取，得到提取液；提取液经无水Na2SO4干燥、浓缩、结晶，得到白色晶体，即为噻虫胺半抗原CTA-COOH。
在本发明的一种实施方式中，所述4-巯基丁酸溶液是通过将4-巯基丁酸溶解于DMSO得到的。
在本发明的一种实施方式中，所述4-巯基丁酸溶液是通过将2.1g的4-巯基丁酸溶解于10mL的DMSO得到的。
本发明提供了上述一种噻虫胺半抗原或上述一种噻虫胺半抗原的制备方法在制备噻虫胺完全抗原、分泌噻虫胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株J6和噻虫胺单克隆抗体方面的应用。
一种噻虫胺完全抗原，结构式如下：
Figure RE-DEST_PATH_IMAGE002
。
所述噻虫胺完全抗原的制备方法，步骤如下：将所述噻虫胺半抗原CTA-COOH、N-羟基琥珀酰亚胺NHS溶解于无水N,N-二甲基甲酰胺DMF中，搅拌进行反应，得到噻虫胺半抗原CTA-COOH溶液；将N,N'-二环己基碳二亚胺DCC溶解于无水DMF后，加入到CTA-COOH溶液中，搅拌进行反应，得到A液；将钥孔血蓝蛋白KLH用碳酸盐缓冲溶液CBS稀释，得到B液；将A液加入到B液中进行反应，得到反应液；用PBS溶液透析反应液，得到噻虫胺完全抗原CTA-COOH-KLH。
在本发明的一种实施方式中，所述方法为将3.8mg噻虫胺半抗原（CTA-COOH）、1.6mgN-羟基琥珀酰亚胺（NHS）溶解于300μL无水N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，室温搅拌反应10min，得到噻虫胺半抗原（CTA-COOH）溶液；将2.8mg N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)溶解于100μL无水DMF后，加入到CTA-COOH溶液中，室温搅拌进行反应4-6h，得到A液；将10mg钥孔血蓝蛋白（KLH）用2mL碳酸盐缓冲溶液（CBS）稀释，得到B液；逐滴将A液缓慢加入到B液中进行反应，室温反应12h得到反应液；用PBS溶液透析反应液，除去未反应的小分子半抗原，得到完全抗原（CTA-COOH-KLH）。
在本发明的一种实施方式中，所述碳酸盐缓冲溶液（CBS）为浓度为0.01mol/L、pH为9.6。
本发明提供了上述一种噻虫胺完全抗原或上述一种噻虫胺完全抗原的制备方法在制备分泌噻虫胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株、噻虫胺单克隆抗体方面的应用。
所述噻虫胺完全抗原的应用，将其应用于制备分泌噻虫胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
一株分泌噻虫胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株J6，所述杂交瘤细胞株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.14700，保藏日期为2017年9月5日，分类命名为单克隆细胞株。
所述杂交瘤细胞株J6的制备方法如下：
（1）制备噻虫胺半抗原及噻虫胺完全抗原，将获得的噻虫胺完全抗原制备成弗氏佐剂与不完全弗氏佐剂；
（2）将得到的弗氏佐剂通过背部皮下注射，注射进入BALB/c小鼠体内进行多次免疫，首次免疫采用完全弗氏佐剂，加强免疫采用不完全弗氏佐剂；
（3）将经过上述免疫过程的小鼠进行采血，通过间接ELISA检测小鼠血清免疫效价和免疫抑制能力，筛选出血清中噻虫胺抗体含量高的获得免疫的小鼠；
（4）将筛选出的小鼠用不完全弗氏佐剂再进行最后一次加强免疫，然后通过腹腔注射进行冲击免疫，冲击免疫采用不含弗氏佐剂的噻虫胺完全抗原进行；
（5）将进行冲击免疫后的BALB/c小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞融合，将融合的细胞通过培养基培养，利用间接ELISA检测阳性细胞孔，并进一步利用间接竞争ELISA法测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制的阳性细胞孔进行亚克隆，最终筛选出获得能分泌噻虫胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤2、4中的首次免疫与加强免疫之间间隔一个月，加强免疫之间间隔21天，加强免疫与冲击免疫之间间隔18~21天。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤2、4中的首次免疫剂量为100μg/只，加强免疫剂量为50μg/只，冲击免疫剂量为25μg/只。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤2、4中的免疫过程，包含1次首次免疫、4次加强免疫和1次冲击免疫；
在本发明的一种实施方式中，所述步骤3中的采血为第3次免疫过程结束后第7天进行采血。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤5中的细胞融合是在冲击免疫结束3天后进行。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤5中的细胞融合是通过聚乙二醇（PEG4000）法进行的。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤5中的培养基为RPMI-1640培养基。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤5中的亚克隆次数为3次。
一种噻虫胺单克隆抗体，其由所述保藏编号为CGMCC No.14700的杂交瘤细胞株J6分泌产生。
所述噻虫胺单克隆抗体的制备方法，步骤为：取BALB/c小鼠，腹腔注射石蜡油，再腹腔注射保藏编号为CGMCC No. 14700的杂交瘤细胞株J6，注射后收集腹水，将腹水纯化，将获得的单抗低温保存制得。
在本发明的一种实施方式中，所述方法为取8-10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射石蜡油1mL，7天后每只小鼠腹腔注射1×106保藏编号为CGMCC No.14700的杂交瘤细胞株，从第7天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-硫酸铵法纯化，获得的单抗置于-20℃保存。
所述噻虫胺单克隆抗体的应用，将其应用于识别噻虫胺。
所述噻虫胺单克隆抗体的应用，将噻虫胺单克隆抗体应用于制备噻虫胺检测试剂盒。
本发明的有益效果：本发明提供了一种全新的噻虫胺完全抗原及其合成思路，通过噻虫胺完全抗原筛选获得的分泌噻虫胺单克隆抗体的细胞株，分泌的噻虫胺单克隆抗体，对噻虫胺有较好的检测灵敏度和特异性；其检测限（抑制率20%-80%对应的加标量）为0.243-0.964 ng/mL，IC50值为0.48ng/mL、对噻虫胺类似物交叉小于10%，交叉率=（噻虫胺的IC50/类似物的IC50）×100%，能够用于噻虫胺的免疫分析检测。
生物材料样品保藏：一株分泌噻虫胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株J6，所述杂交瘤细胞株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.14700，保藏日期为2017年9月5日。
附图说明
图1为本发明噻虫胺半抗原的合成过程。
图2为本发明噻虫胺单克隆抗体对噻虫胺的抑制标准曲线。
具体实施方式
本发明下面的实施例仅作为本发明内容的进一步说明，不能作为本发明的限定内容或范围。下面通过实施例对本发明作进一步说明。
下述实施例中涉及的培养基如下：
RPMI-1640培养基；
下述实施例中涉及的试剂如下：
碳酸盐缓冲液（CBS）：称取Na2CO3 1.59 g，NaHCO3 2.93 g，分别溶于少量双蒸水后混合，加双蒸水至约800mL混匀，调pH值至9.6，加双蒸水定容至1000mL，4℃贮存备用。
磷酸盐缓冲液（PBS）：8.00g NaCl，0.2g KCl，0.2g KH2PO4，2.9g Na2HPO4·12 H2O，溶于800mL纯水中，用NaOH或HCl调pH到7.2～7.4，定容至1000mL；
PBST：含0.05 % 吐温20的PBS；
TMB显色液：A液：Na2HPO4 .12H2O 18.43g，柠檬酸 9.33g，纯水定容至1000mL；B液：60mg TMB 溶于100mL乙二醇中。A、B液按5：1混合即为TMB显色液，现用现混。
下述实施例中涉及的检测方法如下：
噻虫胺抑制率检测方法：通过棋盘试验选择ic-ELISA中最合适的抗原和抗体浓度。用包被缓冲液将抗原稀释至0.01，0.03，0.1和0.3μg/mL，并用抗体稀释液将抗体稀释至0.03，0.1，0.3和1μg/mL。选择最佳工作点后，将噻虫胺标准品稀释为8个浓度（0，0.0625，0.125，0.25，0.5，1，2，4ng/mL），按照ic-ELISA操作步骤，最后用OriginPro 8.5做图，结果如图2所示。获得CTA标准抑制曲线，计算IC50。
实施例1：噻虫胺半抗原的合成
合成路径如图1。
由于噻虫胺小分子不具有免疫原性，不能刺激小鼠产生免疫应答，进而产生抗体，因此需通过蛋白连接技术将噻虫胺偶联到蛋白上，使其获得免疫原性；蛋白偶联技术中常用的活泼基团有氨基，羧基，羟基，巯基等，鉴于CTA分子结构式中不含有这些活泼基团，因此需要衍生。
用20mL二甲亚砜（DMSO）溶解2.4g噻虫胺（CTA），加入0.94g氢氧化钾，边搅拌边滴加4-巯基丁酸溶液，油浴升温至75℃反应72h，得到反应液；待反应液自然冷却至室温后，加入50mL水，以6mol/L的HCl调反应液pH至3，以90mL正丁醇萃取，得到提取液；提取液经无水NaSO4干燥、浓缩、结晶，得到白色晶体，即为噻虫胺半抗原（CTA-COOH）。
实施例2：噻虫胺完全抗原的合成
所述方法为将3.8mg噻虫胺半抗原（CTA-COOH）、1.6mgN-羟基琥珀酰亚胺（NHS）溶解于300μL无水N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，室温搅拌反应10min，得到噻虫胺半抗原（CTA-COOH）溶液；将2.8mg N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)溶解于100μL无水DMF后，加入到CTA-COOH溶液中，室温搅拌进行反应4-6h，得到A液；将10mg钥孔血蓝蛋白（KLH）用2mL碳酸盐缓冲溶液（CBS）稀释，得到B液；逐滴将A液缓慢加入到B液中进行反应，室温反应12h得到反应液；用PBS溶液透析反应液，除去未反应的小分子半抗原，得到完全抗原（CTA-COOH-KLH）。
实施例3：噻虫胺包被原的合成
将5mg噻虫胺半抗原（CTA-COOH）、4.8mg N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）溶解于300μL无水N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，室温搅拌反应10min，得到噻虫胺半抗原（CTA-COOH）溶液；将7.6mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）溶解于100μL无水DMF后，加入到CTA-COOH溶液中，室温搅拌进行反应6-8h，得到A液；将10mg鸡卵白蛋白（OVA）用1mL浓度为0.01mmol/L、pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液（PBS）稀释，得到B液；逐滴将A液缓慢加入到B液中进行反应，得到反应液；用PBS溶液透析反应液，除去未反应的小分子半抗原，得到包被抗原（CTA-COOH-OVA）。
实施例4：分泌噻虫胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备
1、动物免疫的获得：将CTA完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化后，对BALB/c小鼠进行颈背部皮下多点注射免疫（冲刺免疫除外）；首次免疫用完全弗氏佐剂，剂量为100ug/只；多次加强免疫用不完全弗氏佐剂且剂量减半即为50ug/只；冲刺免疫不用佐剂，直接用生理盐水稀释后腹腔注射，剂量再减半即为25ug/只；首次免疫与第二次加强免疫之间间隔一个月，多次加强免疫之间间隔21天，冲刺免疫与最后一次加强免疫之间间隔18-21天；通过间接竞争酶联免疫法（ic-ELISA）观测小鼠免疫效果即检测小鼠血清的效价和抑制；
2、细胞融合：在冲刺免疫三天后，按照常规PEG（聚乙二醇，分子量为4000）方法进行细胞融合，具体步骤如下：
a、摘眼球取血，颈椎脱臼法处死小鼠后，立即放入75%酒精中消毒，浸泡5min左右，无菌操作取出小鼠的脾脏，用注射器的胶头适度研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，收集，离心（1200rpm，8min），用RPMI-1640培养基洗涤脾细胞三次，最后一次离心后，将脾细胞稀释到一定体积，计数，备用；
b、收集SP2/0细胞：融合前7-10天，将SP2/0瘤细胞用含10% FBS（胎牛血清）RPMI-1640 培养基在5% CO2培养箱中，融合前要求SP2/0瘤细胞数量达到（1~4）×107，保证融合前SP2/0瘤细胞处于对数生长期，融合时，收集瘤细胞，悬浮于RPMI-1640基础培养液中，进行细胞计数；
c、融合过程7min：第1min，将1mL的PEG 1500由慢到快滴加到细胞中；第2min，静置；第3min和第4min，在1min内滴加1mL RPMI-1640培养基；第5min和第6min，在1min内滴加2mL RPMI-1640培养基；第7min，每10s滴加1mL的RPMI-1640培养基；然后37℃温浴5min；离心（800rpm，8min），弃上清，重悬入含20%胎牛血清，2%的50×HAT的RPMI-1640筛选培养液中，按照200μL/孔加到96孔细胞板，置于37℃，5% CO2培养箱中培养。
3、细胞筛选与细胞株建立：在细胞融合的第3天对融合细胞进行RPMI-1640筛选培养液半换液，第5天进行用含20% 胎牛血清，1%的100×HT的RPMI-1640过渡培养液进行全换液，在第7天取细胞上清进行筛选。
筛选分两步：第一步先用ic-ELISA法筛选出阳性细胞孔，第二步选用噻虫胺为标准品，用ic-ELISA法对阳性细胞进行抑制效果测定。
选择对噻虫胺标准品有较好抑制的细胞孔，采用有限稀释法进行亚克隆，七天后用同样的方法进行检测。
按上述方法进行三次亚克隆，最终获得噻虫胺单克隆抗体细胞株。
实施例5：噻虫胺单克隆抗体的制备与鉴定
取8-10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射无菌石蜡油1mL；7天后每只小鼠腹腔注射1×106噻虫胺杂交瘤细胞，从第七天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-饱和硫酸铵法进行抗体纯化。
在偏酸条件下，正辛酸可以沉淀腹水中除IgG免疫球蛋白外的其他杂蛋白，然后离心，弃沉淀；再用等量饱和度的硫酸铵溶液沉淀IgG型的单克隆抗体，离心，弃上清，用0.01M的PBS溶液（pH7.4）溶解后，透析脱盐，最终得到纯化后的单克隆抗体置于-20℃保存。
使用间接竞争ELISA，采用OriginPro 8.5做图，结果如图2所示。获得CTA标准抑制曲线，其R2 = 0.997，Y=0.117+1.46/(1+(X/0.484) 2.014)，检测限（抑制率20%-80%对应的加标量）为0.243-0.964 ng/mL，IC50值为0.48ng/mL、对噻虫胺类似物交叉小于10%，说明对噻虫胺有很好的灵敏度，可用于噻虫胺免疫分析检测。
（交叉率=（噻虫胺的IC50/类似物的IC50）×100%）
实施例6：噻虫胺单克隆抗体的应用
将杂交瘤细胞株通过体内腹水制备的单克隆抗体应用于CTA的ELISA添加回收试验，具体步骤如下：
（1）将用碳酸盐缓冲液（CBS）稀释好的浓度为0.3μg/mL的包被原包被96孔酶标板，每孔100μL，37℃包被2h后，用PBST洗液洗板三次，每次每孔200μL，每次3min，拍干；
（2）用含0.2%明胶的CBS进行封闭，每孔200μL，37℃封闭2h，用PBST洗液洗板三次，每次每孔200μL，每次3min，拍干；
（3）用磷酸盐缓冲液（PBS）分别配置0、0.078125、0.15625、0.3125、0.625、1.25、2.5、5μg/L的CTA标准溶液，将标准溶液以及待检测样品提取液，分别加入到已经封闭好的酶标板中，每孔50μL，每个样品重复3个孔，再每孔加入50μL以1:32000稀释的抗DNSH单克隆抗体，37℃反应0.5h后，洗板拍干；
（4）每孔加入100μL用含0.1%明胶的PBS以1:3000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG二抗，37℃反应0.5h后，洗板拍干；
（5）每孔加入100μL的TMB显色液，37℃显色15min后，每孔加入50μL 2M的H2SO4终止液，450nm测吸光值；
（6）添加回收及样品前处理：以水资源为例，检测其中的噻虫胺残留量
Figure RE-RE-DEST_PATH_IMAGE003
样品前处理：从江苏省进出口检验检疫局获得阴性样品，加标噻虫胺后离心，取上清50µL（或进行一定稀释）用于检测。
Figure RE-DEST_PATH_IMAGE004
样品检测：按照实施例2步骤，加标和实际检测同时进行，结果如表1。回收率在86.8%-101.8%，基质干扰较小，结果较理想。
表 1. ic-ELISA检测加标后的水样（n=6）
Figure RE-RE-DEST_PATH_IMAGE005
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一株分泌噻虫胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株J6，所述杂交瘤细胞株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.14700，保藏日期为2017年9月5日。
2.一种噻虫胺单克隆抗体，其特征在于：其由权利要求1所述保藏编号为CGMCCNo.14700的杂交瘤细胞株J6分泌产生。
3.权利要求2所述噻虫胺单克隆抗体的制备方法，其特征在于步骤为：取BALB/c小鼠，腹腔注射石蜡油，再腹腔注射保藏编号为CGMCC No. 14700的杂交瘤细胞株J6，注射后收集腹水，将腹水纯化，将获得的单抗低温保存制得。
4.权利要求2所述噻虫胺单克隆抗体的应用，其特征在于：将其应用于识别噻虫胺。
5.如权利要求4所述噻虫胺单克隆抗体的应用，其特征在于：将噻虫胺单克隆抗体应用于制备噻虫胺检测试剂盒。
6.如权利要求1所述分泌噻虫胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株J6，其特征在于：通过噻虫胺完全抗原制备而成。
7.如权利要求6所述分泌噻虫胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株J6，其特征在于：所述噻虫胺完全抗原结构式如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
。
8.如权利要求7所述分泌噻虫胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株J6，其特征在于：所述噻虫胺完全抗原的制备方法步骤如下：将噻虫胺半抗原CTA-COOH、N-羟基琥珀酰亚胺NHS溶解于无水N,N-二甲基甲酰胺DMF中，搅拌进行反应，得到噻虫胺半抗原CTA-COOH溶液；将N,N'-二环己基碳二亚胺DCC溶解于无水DMF后，加入到CTA-COOH溶液中，搅拌进行反应，得到A液；将钥孔血蓝蛋白KLH用碳酸盐缓冲溶液CBS稀释，得到B液；将A液加入到B液中进行反应，得到反应液；用PBS溶液透析反应液，得到噻虫胺完全抗原CTA-COOH-KLH；
具体为：将3.8mg噻虫胺半抗原CTA-COOH、1.6mgN-羟基琥珀酰亚胺NHS溶解于300μL无水N,N-二甲基甲酰胺DMF中，室温搅拌反应10min，得到噻虫胺半抗原CTA-COOH溶液；将2.8mg N,N'-二环己基碳二亚胺DCC溶解于100μL无水DMF后，加入到CTA-COOH溶液中，室温搅拌进行反应4-6h，得到A液；将10mg钥孔血蓝蛋白KLH用2mL碳酸盐缓冲溶液CBS稀释，得到B液；逐滴将A液缓慢加入到B液中进行反应，室温反应12h得到反应液；用PBS溶液透析反应液，除去未反应的小分子半抗原，得到完全抗原CTA-COOH-KLH。
9.如权利要求8所述分泌噻虫胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株J6，其特征在于：所述噻虫胺半抗原CTA-COOH结构式如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE004
。
10.如权利要求9所述分泌噻虫胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株J6，其特征在于：所述噻虫胺半抗原的制备方法步骤如下：将二甲亚砜DMSO溶解噻虫胺CTA，加入氢氧化钾，搅拌并滴加4-巯基丁酸溶液，升温进行反应，得到反应液；待反应液自然冷却后，加入水，以HCl调反应液pH，以正丁醇萃取，得到提取液；提取液经干燥、浓缩、结晶，得到噻虫胺半抗原CTA-COOH。
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