CN108330102A - 一株泰妙菌素单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株泰妙菌素单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，属于食品安全免疫检测领域。本发明泰妙菌素完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化完全，通过背部皮下注射免疫BALB/c小鼠。首次免疫(100μg/只)用完全弗氏佐剂，多次加强免疫(50μg/只)用不完全弗氏佐剂，最后一次用泰妙菌素完全抗原(20μg/只，不含佐剂)冲击免疫。取高效价低IC₅₀小鼠的脾细胞，通过PEG方法与小鼠骨髓瘤细胞融合，经过间接竞争酶联免疫法筛选和三次亚克隆，得到一株杂交瘤细胞株。此细胞株分泌的单克隆抗体，对泰妙菌素具有较好的特异性和检测灵敏度(IC₅₀值为0.73ng/mL)，为食品中泰妙菌素残留的免疫检测提供了原料，具有实际应用价值。

Description

一株泰妙菌素单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用

技术领域

本发明涉及一株泰妙菌素单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，属于食品安全免疫学检测技术领域。

背景技术

泰妙菌素(Tiamulin，TML)，又称硫姆林、泰妙霉素、泰妙灵、支原净、泰牧霉素，是一种截短侧耳素类动物专用抗生素，对支原体及某些革兰氏阳性菌具有良好的抗菌活性，还有促生长作用，在动物体内吸收迅速，体内分布广泛，因而作为兽药抗生素和饲料添加剂被广泛使用。但泰妙菌素在动物体内的残留可能对人类的健康造成严重的潜在威胁。欧盟、美国、日本都对动物源性食品中抗生素泰妙菌素最高残留限量(MRL)做出明确规定。我国农业部2002年第235号公告中规定了泰妙菌素的残留标识物包括泰妙菌素和其代谢产物8-α-hydroxymutilin，其在猪肉、鸡肉中的最高残留限量为100μg/kg。

为了有效监督监测食品中使用泰妙菌素的情况，需要寻找一种特异性好，灵敏度高的测定方法。目前，用于泰妙菌素残留检测的方法主要是一些理化检测方法，包括气相色谱法、液相色谱法、质谱法等。早期泰妙菌素被认为是大环内酯类抗生素，许多文献报道了泰妙菌素在内的大环内酯类抗生素的多残留分析，这些方法中多配合紫外或质谱检测器。理化检测方法虽然灵敏度高，但对操作人员专业性要求高、耗时较长、且仪器昂贵，免疫学检测方法具有快速灵敏、操作简单，高通量等特点，应用前景广阔，虽然免疫检测方法的建立需要较长时间，一旦制备出好的抗体，建立检测方法将对泰妙菌素的快速检测非常有利。

发明内容

本发明的目的是提供一株泰妙菌素单克隆抗体杂交瘤细胞株，由该细胞株制备的抗体对泰妙菌素具有较好特异性和检测灵敏度，可以用来建立泰妙菌素的免疫学检测方法。

本发明的第一个目的是提供一株单克隆细胞株，已于2017年9月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.14698，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

本发明的第二个目的是提供一种检测泰妙菌素的方法，所述方法是利用所述的单克隆细胞株分泌产生的泰妙菌素单克隆抗体。

本发明的第三个目的是提供一种泰妙菌素单克隆抗体，由所述的单克隆细胞株所分泌产生。

本发明的第四个目的是提供所述的泰妙菌素单克隆抗体的应用，用于食品安全检测中泰妙菌素残留的分析检测。

本发明的第五个目的是提供一种试剂盒，含有所述的单克隆细胞株或所述的泰妙菌素单克隆抗体。

在本发明的一种实施方式中，所述试剂盒用于食品安全检测中泰妙菌素残留的分析检测。

本发明的第六个目的是提供所述的试剂盒在检测泰妙菌素含量中的应用。

本发明的第七个目的是提供所述的单克隆细胞株3B1的制备方法，所述方法基本步骤为：

1)半抗原的合成：

称取泰妙菌素5g，10mmol和4-溴丁酸苄酯7.7g，30mmol溶解于二甲亚砜20mL中，加入氢氧化钾0.6g，10.5mmol，在70℃下搅拌过夜，然后加水20mL，用乙酸乙酯萃取。有机层用盐水洗涤，干燥并浓缩，得到粗产物。粗品通过制备型-HPLC纯化，得到化合物A 800mg；称取化合物A 700mg，1.25mmol溶解在四氢呋喃2mL和水2mL混合溶液中，加入氢氧化锂125mg，3mmol，并在室温下搅拌1小时。反应溶液用乙酸乙酯萃取。将有机层用盐水洗涤，干燥并浓缩，得到粗产物。通过制备型HPLC纯化粗产物，得到半抗原TML-HS；

2)完全抗原TML-HS-KLH的制备：称取5mg TML-HS，二环己基碳二亚胺5mg，N-羟基琥珀酰亚胺3mg，用1mL无水N,N-二甲基甲酰胺溶解(称为A液)，室温搅拌反4-5h。取匙孔血蓝蛋白KLH 1.47mL(6.8mg/mL),加入等体积硼酸缓冲溶液(称为B液)，在室温条件，逐滴将A液加入到B液中，室温反应过夜，即得偶联物TML-HS-KLH混合液，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原，并通过紫外吸收扫描方法鉴定；

3)小鼠的免疫：TML-HS-KLH完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化后，通过背部皮下注射免疫BALB/c小鼠。首次免疫用完全弗氏佐剂，多次加强免疫用不完全弗氏佐剂。首次免疫与第二次加强免疫之间间隔一个月，多次加强免疫之间间隔21天。最后一次用TML-HS-KLH完全抗原(不含佐剂)冲击免疫；通过间接竞争酶联免疫法(ic-ELISA)检测血清效价和抑制；

4)细胞融合与细胞株建立：通过聚乙二醇(PEG4000)法将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合，通过HAT培养基培养，利用间接竞争酶联免疫法(ic-ELISA)检测阳性细胞孔，并进一步利用ic-ELISA测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制的阳性细胞孔进行三次亚克隆，最终筛选获得泰妙菌素单克隆抗体杂交瘤细胞株3B1；

5)杂交瘤细胞株性质的鉴定：通过ic-ELISA测定灵敏度和特异性。

取高效价低IC₅₀小鼠的脾细胞，通过PEG方法与小鼠骨髓瘤细胞融合，经过间接竞争酶联免疫法筛选和三次亚克隆，得到一株杂交瘤细胞株。

本发明的有益效果：本发明提供的细胞株3B1分泌的单克隆抗体，对泰妙菌素具有较好的特异性和检测灵敏度(IC₅₀值为0.73ng/mL)，可实现对猪肉、鸡肉等动物性食品中泰妙菌素残留量的检测，为食品中泰妙菌素残留的免疫检测提供了原料，具有实际应用价值。

生物材料保藏

一株单克隆细胞株，已于2017年9月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.14698，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

附图说明：

图1为3B1单克隆抗体对泰妙菌素的抑制标准曲线。

具体实施方式

本发明下面的实施例仅作为本发明内容的进一步说明，不能作为本发明的限定内容或范围。下面通过实施例对本发明作进一步说明。

本发明通过将泰妙菌素完全抗原免疫小鼠，通过细胞融合，HAT选择性培养基培养，通过ic-ELISA筛选细胞上清，最终得到了对泰妙菌素有较好特异性和灵敏度的单克隆抗体杂交瘤细胞株。

溶液的配置：碳酸盐缓冲液(CBS)：称取Na₂CO₃ 1.59g，NaHCO₃ 2.93g，分别溶于少量双蒸水后混合，加双蒸水至约800mL混匀，调pH值至9.6，加双蒸水定容至1000mL，4℃贮存备用。

磷酸盐缓冲液(PBS)：8.00g NaCl，0.2g KCl，0.2g KH₂PO₄，2.9gNa₂HPO₄·12H₂O，溶于800mL纯水中，用NaOH或HCl调pH到7.2～7.4，定容至1000mL；

PBST：含0.05％吐温20的PBS；

TMB显色液：A液：Na₂HPO₄·12H₂O 18.43g，柠檬酸9.33g，纯水定容至1000mL；B液：60mg TMB溶于100mL乙二醇中。A、B液按1:5混合即为TMB显色液，现用现混。

实施例1：杂交瘤细胞株3B1的制备

(1)称取泰妙菌素5g，10mmol和4-溴丁酸苄酯7.7g，30mmol溶解于二甲亚砜20mL中，加入氢氧化钾0.6g，10.5mmol，在70℃下搅拌过夜，然后加水20mL，用乙酸乙酯萃取。有机层用盐水洗涤，干燥并浓缩，得到粗产物。粗品通过制备型-HPLC纯化，得到化合物A800mg；称取化合物A700mg，1.25mmol溶解在四氢呋喃2mL和水2mL混合溶液中，加入氢氧化锂125mg，3mmol，并在室温下搅拌1小时。反应溶液用乙酸乙酯萃取。将有机层用盐水洗涤，干燥并浓缩，得到粗产物。通过制备型HPLC纯化粗产物，得到半抗原TML-HS；

(2)完全抗原的合成：称取5mg TML-HS，二环己基碳二亚胺5mg，N-羟基琥珀酰亚胺3mg，用1mL无水N,N-二甲基甲酰胺溶解(称为A液)，室温搅拌反4-5h。取匙孔血蓝蛋白KLH1.47mL(6.8mg/mL),加入等体积硼酸缓冲溶液(称为B液)，在室温条件，逐滴将A液加入到B液中，室温反应过夜，即得偶联物TML-HS-KLH混合液，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原，并通过紫外吸收扫描方法鉴定。

(3)动物免疫：选择健康的6～8周龄的BALB/c小鼠进行免疫。取泰妙菌素完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化后，通过背部皮下注射免疫BALB/c小鼠。第一次免疫用完全弗氏佐剂，之后都用不完全弗氏佐剂。首次免疫与第二次加强免疫之间间隔一个月，多次加强免疫之间间隔21天。第三次免疫后7天采血，使用ic-ELISA测定小鼠血清效价和抑制，选择效价高抑制好的小鼠，在第五次免疫后21天冲击免疫，腹腔注射，要求冲免剂量减半且不含任何佐剂。

(4)细胞融合：在冲击免疫三天后，按照常规PEG(聚乙二醇，分子量为4000)方法进行细胞融合，具体步骤如下：

a、摘眼球取血，颈椎脱臼法处死小鼠后，立即放入75％酒精中消毒，浸泡5min左右，无菌操作取出小鼠的脾脏，用注射器的胶头适度研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，收集，离心(1200rpm，8min)，用RPMI-1640培养基洗涤脾细胞三次，最后一次离心后，将脾细胞稀释到一定体积，计数，备用；

b、收集SP2/0细胞：融合前7-10天，将SP2/0瘤细胞用含10％FBS(胎牛血清)RPMI-1640培养基在5％CO₂培养箱中。融合前要求SP2/0瘤细胞数量达到1～4×10⁷，保证融合前SP2/0瘤细胞处于对数生长期。融合时，收集瘤细胞，悬浮于RPMI-1640基础培养液中，进行细胞计数；

c、融合过程7min。第1min，将1mL的PEG 1500由慢到快滴加到细胞中；第2min，静置。第3min和第4min，在1min内滴加1mLRPMI-1640培养基；第5min和第6min，在1min内滴加2mL RPMI-1640培养基；第7min，每10s滴加1mL的RPMI-1640培养基。然后37℃温浴5min。离心(800rpm，8min)，弃上清，重悬入含20％胎牛血清，2％的50×HAT的RPMI-1640筛选培养液中，按照200μL/孔加到96孔细胞板，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养。

(5)细胞筛选与细胞株建立：在细胞融合的第3天对融合细胞进行RPMI-1640筛选培养液半换液，第5天进行用含20％胎牛血清，1％的100×HT的RPMI-1640过渡培养液进行全换液，在第7天取细胞上清进行筛选。筛选分两步：第一步先用ic-ELISA筛选出阳性细胞孔，第二步选用泰妙菌素为标准品，用ic-ELISA对阳性细胞进行抑制效果测定。选择对泰妙菌素标准品均有较好抑制的细胞孔，采用有限稀释法进行亚克隆，用同样的方法进行检测。重复三次，获得细胞株3B1。

(6)单克隆抗体的制备与鉴定：取8-10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射无菌石蜡油1mL；7天后每只小鼠腹腔注射1×10⁶杂交瘤细胞，从第七天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-硫酸铵法纯化。在偏酸条件下，正辛酸可以沉淀腹水中除IgG免疫球蛋白外的其他杂蛋白，然后离心，弃沉淀；再用等量饱和度的硫酸铵溶液沉淀IgG型的单克隆抗体，离心，弃上清，用0.01M PBS溶液(pH7.4)溶解后，透析脱盐，最终得到纯化后的单克隆抗体置于-20℃保存。

6.1包被：将包被原TML-OVA用0.05M pH9.6碳酸盐缓冲液从1μg/mL开始倍比稀释，100μL/孔，37℃反应2h。

6.2洗涤：将板内溶液倾去，并用洗涤液洗涤3次，每次3min.

6.3封闭：拍干后，加入200μL/孔封闭液，37℃反应2h。洗涤后烘干备用。

6.4加样：将抗血清从1:1000开始倍比稀释，并加入到各稀释度的包被孔中，100μL/孔，37℃反应30min；充分洗涤后，加入1:3000稀释的HRP-羊抗鼠IgG，100μL/孔，37℃反应30min。

6.5显色：将酶标板取出，充分洗涤后，每孔加入100μL的TMB显色液，37℃避光反应15min.

6.6终止和测定：每孔加入50μL终止液以终止反应，然后用酶标仪测定各孔的OD450值。

用ic-ELISA测定单克隆抗体泰妙菌素的IC₅₀为0.73ng/mL，说明对泰妙菌素有很好的灵敏度，可用于泰妙菌素免疫分析检测。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一株单克隆细胞株，已于2017年9月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.14698，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

2.一种检测泰妙菌素的方法，其特征在于，所述方法是利用权利要求1所述的单克隆细胞株分泌产生的泰妙菌素单克隆抗体。

3.一种泰妙菌素单克隆抗体，其特征在于，由权利要求1所述的单克隆细胞株所分泌产生。

4.权利要求3所述的泰妙菌素单克隆抗体的应用，其特征在于，用于食品安全检测中泰妙菌素残留的分析检测。

5.一种试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述的单克隆细胞株。

6.根据权利要求5所述的一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于食品安全检测中泰妙菌素残留的分析检测。

7.权利要求5或6所述的试剂盒在检测泰妙菌素含量中的应用。

8.一种试剂盒，其特征在于，含有权利要求3所述的泰妙菌素单克隆抗体。

9.根据权利要求8所述的一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于食品安全检测中泰妙菌素残留的分析检测。

10.权利要求8或9所述的试剂盒在检测泰妙菌素含量中的应用。