KR100422050B1 - 항원성이 보강된 장내세균을 생산하는 방법과 이를 포함하는 방법 - Google Patents

항원성이 보강된 장내세균을 생산하는 방법과 이를 포함하는 방법 Download PDF

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Abstract

장내 세균 항원 또는 독성인자의 발현을 유도하거나 강화시키는 시험관내 공정을 이용하는 방법을 상술하고 있다. 항원적으로 보강된 세균을 이용하는 방법 또한 상술되고 있고 장내 세균을 포함하는 백신에 대해서도 상술하고 있다. 특이적으로 헬리코박터 종에 의해 전체 장내 세균 또는 이의 성분으로 제공된다. 또한 본 발명에 유용한 다른 장내 세균도 있다. 한 형태, 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni) C. 제주니의 표면추출물 가수분해물에서 탄수화물의 HPLC 결과에 대한 그래프를 나타내었다.

Description

항원성이 보강된 장내세균을 생산하는 방법과 이를 포함하는 방법.{METHODS FOR PRODUCING ENHANCED ANTIGENIC ENTERIC BACTERIA AND VACCINES COMPRISING SAME}
통사의 배지와 조건을 이용하여 시험관에서 배양된 세균은 동물숙주에서 보통의 미생물총(microflora) 또는 병원균의 생체내 성장을 포함하는 이들의 자연적 특성에서 성장하는 동안에 나타내는 특징과는 상이한 특징을 발현한다는 것은 널리 알려진 바 있다. 따라서, 이와 같은 시험관내에서 생장시킨 병원성 세균은 백신성분으로써 이용하기에는 적합하지는 않다. 그러나, 독성인자, 관련 생리적 조건 또는 외표면 항원을 포함하는 항원의 발현을 촉진시키거나 강화시킬 수 있는 조건이 정의될 수 있다면, 중요한 생산물과 치료요법(예로써, 백신에 대한 신규항원, 새로운 표적의 항생제, 진단에 이용할 수 있는 신규 박테리아 특징) 등이 신속하게 확인될 수 있다.
박테리아에서 독성인자 결성요소의 발현에 영향을 줄 수 있는 몇가지 환경적요인이 확인되었다(Mekalanos, J.J., J. Bacteriol., 174:1-7, 1992). 예로써, 박테리아 특히 쉬겔라(Shigella)(Payne, Mol. MicroBiol., 3:1301-1306, 1989), 나이세리아(Neisseria)(Payne and Finkelstein, J. Clin. Microbiol., 6:293-297, 1977)와 파스테렐라(Pasteurella)(Gilmour, et al., Vaccine, 9:137-140, 1991)의 철과 독성 사이에 관계에 대한 상당 기간의 연구가 이루어졌다.
페놀화합물, 모노사카라이드, 아미노산, 온도, 삼투성 그리고 다른 이온 등을 포함한 다른 환경적 요인이 식물과 동물에서 다양한 세균의 상호 제어된 독성결정인자의 발현을 조절한다(Mekalanos, J. Bacteriol., 174:1-7, 1992).
내장(예로 경구경로를 통하여)을 통하여 숙주동물에 들어가는 박테리아성 명소는 독성 인자의 세균 생리와 발현에 영향을 줄 수도 있는 다양한 숙주 환경요소와 조건을 만나게 된다. 이들 요소와 조건 등에는 담즙, 담즙산 또는 염, 위 pH, 미호기성 조건(장은 CO2가 높고 O2가 낮다), 삼투성 등을 포함하나 아직 정의되지 않은 많은 조건 등이 있다. 침투성 장 병독소는 내화작용을 이루기 위해서 단백질 합성을 요구한다(Headley and Payne, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:4179-4183, 1990). 따라서, 세균들은 시험관에 있는 침투성 인자들을 선택적으로 생산하게 된다. 이와 같은 가설은 통상적으로 생장시킨 C. 제주니(jejuni)에 대한 항혈청은 시험관내에서 내화작용을 차단하는데 최저효과만을 가지도록 생산된다는 최근의 보고서가 뒷받침하고 있다(Konkel, et al., J. Infect. Dis., 168:948-954, 1993). 그러나, 침투성을 강화시키는 조건하에서 상피세포 단층에서 생장시킨캄필로박터(campylobacter)의 추출물로 토끼를 면역화 시키면 세균의 내화작용을 현저히 저해시키는 항혈청이 생산된다.
연구자들은 관련 독성인자들을 확인하기 위해 장내환경에서 세균의 성장에 대해 연구하였다. 예로써, 토끼 회장 루프에서 생장한 캄필로박터 균주 81-176은 시험관 배양조건에서 통상적인 실험실 조건하에서 발현되지 않았다(Panigrahi, et al., Infect. Immun., 60:4938-4944, 1992). 상피세포 없이 배양된 세균과 비교하였을 때 INT 407 세포에서 배양된 캄필로박터에서는 신규의 또는 단백질 합성이 강화되었음을 볼 수 있다(Konkel, et al., J. Infect. Dis., 168:948-954, 1993). 더욱이, 이와 같은 변화들은 C. 제주니의 침투성 증가와 일시적으로 연관된 것으로 보인다. 병아리 배를 통하여 융모막을 통하여 침투하였을 때 세포형태, 플라겔라 상실, 신규막 단백질의 발현 그리고 세포-표면 탄수화물의 변화 등과 같은 변경이 C. 제주니와 같은 비독성 균주에서 강화되었다(Field et al., J. Med. Microbiol. 38:293-300, 1993).
일부 세균에서는 담즙산 또는 염과 같은 다른 장요소등이 저해성이 있는 것으로 공지되었으나 박테리아에 의해 독소 발현에 영향을 줌으로써 담즙산이 또다른 역할을 하는 것으로 보인다.
Pope and Payne (93rd Am. Soc. Microbiol., B-147, 1993)는 체노데옥시콜레이트 나트륨을 포함하는 배양물에서 배양된 쉬겔라 플렉네리가 HeLa 세포 단층의 침투성이 3 내지 5배 강화된다는 것을 보고하였다. 그러나, 다른 담즙산 그리고 콜레이트, 글리코콜레이트, 타우로데옥시콜레이트, CHAPS 시리즈, 디지토닌과 트리톤X-100과 이의 나트륨염을 포함한 계면활성제가 S.플렉네리의 침투성에 영향을 주지는 않는다고 보고하였다. 또한, 체노데옥시콜레이트를 포함하는 이들의 배양물에는 대장균 또는 쉬겔라의 다른 무독성균주의 침투성에는 영향이 없었다.
S. 플렉네리에 의해 생산된 신규 단백질의 합성은 성장배지에서 pH, 온도, 이온성 조성물을 변경시켜 유도될 수 있다(Mekalanos, J. Bacteriol. 174:1-7, 1992).
PCT 출원 WO 93/22423, 1993, 11.11 에는 포스파티딜세린과 같은 지질 또는 뮤커스에서 세균을 배양시키고 포스파티딜세린 존재하에서 생장시켜 이의 발현을 강화시켜 이 단백질을 분리하는 방법에 대해 상술하고 있다. 그러나 이 참고문헌에서는 강화된 독성 또는 항원성질을 가지는 장내 세균을 생산하는 본 발명의 방법에 대해서는 암시하지 못했다.
캄필로박터와 쉬겔라와 같은 많은 장내 독소에 대한 백신은 지금은 당장 이용할 수 없으나, 이들 질병이 만연하기 때문에 백신으로 사용해야할 필요성이 잇다. 세균성적리(Shigellosis)는 전세계적으로 만연하고 개발도상국에서는 설사로 인해 매년 사망하는 5만명의 어린이들중 약 10%가 이 때문이다. 장내 독소로써 최근에 확인된 캄필로박터는 선진국과 개발도상국 모두에서 설사의 주요원인으로 인식되고 있다. 매년 400 내지 500만 캄필로박터 설사가 발생되고 2만건 이상이 미국에서 발생된다.
세균성적리는 결장점막에 세균이 침입하는 과정이다. 이와 같은 침입은 모든 침투성 분리물에서 발견되는 플라스미스와 연관된다(Sansonetti et al. Infect.Immun., 35:852-860, 1982). 이 플라스미드에는 항원(Ipa) 유전자, IpaA, IpaC 와 IpaD를 포함하고 침투과정에는 IpaB, IpaC와 IpaD 단백질이 필수적이다(Baudry et al., J. Gen. Microbiol., 133:3403-3413, 1987).
Ipa 단백질은 이들의 보호성 효과가 완전하게 정립되지는 않았지만 국소 백신물로 애용된다. IpaB와 IpaC는 면역우세 단백질이다(Hale, et al., Infect. Immun., 50:620-629, 1985). 또한, 62KDa IpaB 단백질(막결합된 식균성 소의 응혈시에 세포내 침입과 기능을 개시하는 침투단백질)(High, et al., EMBO. J. 11:1991-1999, 1992)은 쉬겔라종에서는 매우 보존되어 있다. 쉬겔라 Ipa에 대한 점막항체를 가지지 못한 영양실조 어린이에게서 볼 수 있는 장시간 질병은 Ipa에 대한 점막항체의 존재가 감염의 전파와 심각성을 제한한다고 볼 수 있다.
쉬겔라에 대한 다수의 백신 추천물을 사람과 동물에서 테스트하였으나 성공적인 것은 없었다. 독성에서 Ipa 단백질의 상당한 가능성에도 불구하고, 세균성적리에 대해 발생한 대부분의 백신 추출물은 혈청형-특이적 결정인자를 가지는 리포폴리사카라이드 항원에 기초한다. 폴리사카라이드-단백질 공액물 백신의 비경구 투여시에도 발생되나 동물에서는 여전히 상당한 보호성을 나타낸다(Robbins et al., Rev. Inf. Dis., 13:S362-365, 1991). 유사하게 리보좀성 백신 투여에서도 점막 면역성을 유도하나 이의 보호효과에 대해서는 설명이 되지 않고 있다(Levenson et al., Arch. Allergy Appl. Immunol., 87:25-31, 1988).
캄필로박터 감염에서 병원성은 쉬겔라 경우와 같이 충분히 이해되지는 못했다. 시험관에서의 세포 침투연구(Konkel, et al., J. Infect. Dis., 168:948-954,1993)와 조직 병리학적 검사(Russell, et al., J. Infect. Dis., 168:210-215, 1993)에서는 결장 침투가 또한 중요한 것으로 나타났다. 이와 같은 결론은 캄필로박터에 의한 설사는 배변에서 혈액이 묻어나오는 상당히 심각한 관측과 일치한다. 이들 활성은 면역우세한 62 kDa 플라겔린 단백질과 연합된 것으로 보인다. 최근 보고서에서는 플라겔라 존재가 극성화된 상피세포 단층을 캄필로박터가 가로지르는데 필수적이라는 것이다(Grant et al., Infect. Immun., 61:1764-1771, 1993).
보호성이 있는 특이적인 캄필로박터 항원이 정립되지는 않았다. 그러나, 저분자량(28-31 kDa) 단백질, PEB 단백질과 면역우세 플라겔라 단백질이 이에 대해 공통점이 있는 것으로 간주된다(Pavlovskis et al., Infect. Immun., 59:2259-2264, 1992; Blaser and Gotschilch, J. Bio. Chem., 265:14529-14535, 1990). 그러나 캄필로박터 백신에 기초한 플라겔라 단백질에는 8-10 임상적으로 Lior 소집단과 연관이 있는 것으로부터의 플라겔라 단백질 항원을 포함해야만 한다.
따라서, 본 발명의 목적은 1) 세포표면 특징을 포함한 침투활성 그리고/또는 특정 세포특징을 적절히 유도하거나 또는 보강하는 장내 세균을 배양하거나 처리하는 시험관내 배양조건; 2) 항원성 프로파일에서 변화와 표면 특징을 포함하는 세포의 특징 또는 관련된 변경 침투성; 3) 작은 실험동물에서 이들 유기체의 독성 증가; 그리고 4) 통상적으로 생장한 박테리아에 대한 혈청보다 생체내 또는 시험관에서 도전시에 사용되는 살아있는 유기체를 중화시키는데 더욱 효과적인 표면특징을 포함하는 항혈청 특징을 포함한다. 본 발명은 이들 필요성에 관계한다.
전술한 참고문헌에서는 본 발명의 방법 또는 항원성 보강된 장내 세균으로구성된 본 발명의 백신에 대해서는 언급하지 않았다. 본 출원에서 참고문헌은 본 발명의 일부로 간주하기 위해 첨언한 것이 아니다.
발명의 요약
본 발명에서는 특성인자와 다른 항원을 유도하거나 존재를 보강하기 위해 장내 세균의 성장배지에 결합된 배양조건과 성분에 대해 정의한다. 적절하게는 이와 같은 항원은 면역원이다. 더욱 적절하게는 이와 같은 면역원성 항원은 독소의 색인과 관계한다.
장내 세균은 유기체가 자연에 노출된 생체 조건에서 특정물을 모방한 성분과 조건하에서 생장시켰다. 본 발명의 방법은 세포당 총단백질의 증가, 신규 또는 증가된 개별 단백질, 표면 탄수화물의 변경 또는 증가, 신규 또는 증가된 개별 단백질, 표면 탄수화물의 변경 또는 증가, 표면 리포폴리사카라이드 변경, 증가된 흡수성, 증가된 침투성 그리고/또는 증가된 세포내 유주와 같은 표현형성 변화와 함께 항원성으로 보강된 장세균을 생산한다. 또한, 본 발명의 방법은 상업적으로 이용할 수 있는 실제 대규모 배양에도 적합하다.
이와 같은 항원성으로 보강된 장세균은 비활성화된 전체세포 또는 소단위 백신을 생산하는데 이용되거나 또는 병원성 장내 세균의 감지와 항체의 생산을 위하나 진단목적 그리고 항생제의 생산 등이 이용될 수 있다. 또한, 본 발명의 보강된 장내 세균에 의해 유도되는 항생제는 수동적 백신으로 이용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 목적은 캄필로박터 sp.(Campylobacter sp.), 에르시니아 sp.(Yersinia sp.), 헬리코박터 sp.(Helicobacter sp.), 가스트로스피필룸sp.(Gastrospifillum sp.), 박테로이드 sp.(Bacteroides sp.), 클렙스엘라 sp.(Klebsiella sp.), 엔테로박터 sp.(Enterobacter sp.), 살모넬라 sp.(Salmonella sp.), 쉬겔라 sp.(Shigella sp.), 에어로모나스 sp.(Aeromonas sp.), 비브리오 sp.(Vibrio sp.), 클로스트리듐 sp.(Clostridium sp.), 엔테로코커스 sp.(Entrococcus sp.)와 대장균 (Escherichia coli)에서 선택된 장내 세균을 생산하는 방법에 관계하는데 이들 모두 보강된 항원성 성질을 가지는 것으로, 이 방법은 a) 5% 내지 20% CO2와 80% 내지 95% 공기, 5% 내지 20% CO2와 80% 내지 95% N2, 또는 5% 내지 10% O2, 10% 내지 20% CO2와 70% 내지 85% N2와 같은 미호기성 조건에서 초기 로그상태, 초기로그와 정체상, 그리고 정지상 정도를 성장될 때까지 30 내지 42℃에서 0.05% 내지 3% 담즙 또는 0.025% 내지 0.6% 하나 이상의 담즙산 또는 이의 염과 그리고 0 내지 100μM, 적절하게는 25μM BAPTA/AM, 0 내지 10mM EGTA와 0 내지 100μM EGTA/AM 와 같은 이가 양이온 킬레이트 존재하에서; 또는 b) 0.1 내지 100μM 적절하게는 25μM BAPTA/AM, 0.5 내지 10mM EGTA 또는 1 내지 μM EGTA/AM 과 같은 이가 양이온 킬레이트 존재를 제외하고, 임의 담즙, 담즙산 또는 이의 염 없이 배양조건에서 시험관내 장세균을 배양하는 것으로 구성된다.
본 발명에 따르면, 개별 담즙산 또는 이의 염이 농도는 0.025% 내지 0.6%, 적절하게는 0.05% 내지 0.5% 더욱 적절하게는 0.05% 내지 0.2%, 가장 적절하게는 0.05% 내지 0.1%를 포함한다. 적절하게는 담즙산 또는 이의 염은 데옥시콜레이트 또는 글리코레이트로 구성된다.
본 발명의 또다른 목적은 캄필로박터 sp.(Campylobacter sp.), 에르시니아 sp.(Yersinia sp.), 헬리코박터 sp.(Helicobacter sp.), 가스트로스피필룸 sp.(Gastrospifillum sp.), 박테로이드 sp.(Bacteroides sp.), 클렙스엘라 sp.(Klebsiella sp.), 엔테로박터 sp.(Enterobacter sp.), 살모넬라 sp.(Salmonella sp.), 쉬겔라 sp.(Shigella sp.), 에어로모나스 sp.(Aeromonas sp.), 비브리오 sp.(Vibrio sp.), 클로스트리듐 sp.(Clostridium sp.), 엔테로코커스 sp.(Entrococcus sp.)와 대장균 (Escherichia coli)에서 선택된 장내 세균을 항원성 성질이 보강되도록 하기 위해 복합조건에서 시험관 배양시키는데 이 조건은 a) 5% 내지 20% CO2와 80% 내지 95% 공기, 5% 내지 20% CO2와 80% 내지 95% N2, 또는 5% 내지 10% O2, 10% 내지 20% CO2와 70% 내지 85% N2와 같은 미호기성 조건에서 초기 로그상태, 초기로그와 정체상, 그리고 정지상 정도를 성장될 때까지 30 내지 42℃에서 0.05% 내지 3% 담즙 또는 0.025% 내지 0.6% 하나 이상의 담즙산 또는 이의 염과 그리고 0 내지 100μM, 적절하게는 25μM BAPTA/AM, 0 내지 10mM EGTA와 0 내지 100μM EGTA/AM 와 같은 이가 양이온 킬레이트 존재하에서; 또는 b) 0.1 내지 100μM 적절하게는 25μM BAPTA/AM, 0.5 내지 10mM EGTA 또는 1 내지 μM EGTA/AM과 같은 이가 양이온 킬레이트 존재를 제외하고, 임의 담즙, 담즙산 또는 이의 염없이 배양조건에서 시험관내 장세균을 배양하는 것으로 구성된다.
캄필로박터 sp.(Campylobacter sp.), 에르시니아 sp.(Yersinia sp.), 헬리코박터 sp.(Helicobacter sp.), 가스트로스피필룸 sp.(Gastrospifillum sp.), 박테로이드 sp.(Bacteroides sp.), 클렙스엘라 sp.(Klebsiella sp.), 엔테로박터 sp.(Enterobacter sp.), 살모넬라 sp.(Salmonella sp.), 쉬겔라 sp.(Shigella sp.), 에어로모나스 sp.(Aeromonas sp.), 비브리오 sp.(Vibrio sp.), 클로스트리듐 sp.(Clostridium sp.), 엔테로코커스 sp.(Entrococcus sp.)와 대장균 (Escherichia coli) 또는 면역학적 단편 또는 이의 유도체에서 선택된 장내 세균 또는 이의 성분으로 구성된 백신에 관계하는데 이들 모두 보강된 항원성 성질과 제약학적으로 수용가능한 담체 또는 희석제로 구성된다.
적절하게는 백신은 전체, 비활성인 항원적으로 보강된 장내 세균으로 구성된 백신에 관계한다. 본 발명의 또다른 목적은 어쥬번트를 포함하는 백신에 관계한다.
본 발명의 또다른 목적은 본 발명의 장내 세균의 적어도 하나의 항원 결정인자에 특이적으로 결합할 수 있는 항체(항혈청, 정제된 IgG 또는 IgA 항체, Pab 단편 등을 포함하나 이에 한정시키지 않음)에 관계한다. 이와 같은 다클론과 단클론 항체는 동물 또는 이의 생물학적 시료에 있는 장내 세균을 감지하는 면역검사시약으로 유용하다. 본 발명의 다클론과 단클론 항체는 장내 세균 감염과 질병으로부터 보호하는데 유용한 수동적 백신으로 유용하다.
본 발명의 또다른 목적은, 캄필로박터 sp.(Campylobacter sp.), 에르시니아 sp.(Yersinia sp.), 헬리코박터 sp.(Helicobacter sp.), 가스트로스피필룸 sp.(Gastrospifillum sp.), 박테로이드 sp.(Bacteroides sp.), 클렙스엘라 sp.(Klebsiella sp.), 엔테로박터 sp.(Enterobacter sp.), 살모넬라 sp.(Salmonella sp.), 쉬겔라 sp.(Shigella sp.), 에어로모나스 sp.(Aeromonassp.), 비브리오 sp.(Vibrio sp.), 클로스트리듐 sp.(Clostridium sp.), 엔테로코커스 sp.(Entrococcus sp.)와 대장균 (Escherichia coli)에서 선택된 항원성질이 보강된 장내세균과 강력한 시약을 접촉시키고, 살균성 또는 세균 억제효과에 대해 검사하는 것으로 구성된 강력한 항균제를 시험관에서 검사하는 방법에 관계한다.
또한 본 발명의 또다른 목적은, 캄필로박터 sp.(Campylobacter sp.), 에르시니아 sp.(Yersinia sp.), 헬리코박터 sp.(Helicobacter sp.), 가스트로스피필룸 sp.(Gastrospifillum sp.), 박테로이드 sp.(Bacteroides sp.), 클렙스엘라 sp.(Klebsiella sp.), 엔테로박터 sp.(Enterobacter sp.), 살모넬라 sp.(Salmonella sp.), 쉬겔라 sp.(Shigella sp.), 에어로모나스 sp.(Aeromonas sp.), 비브리오 sp.(Vibrio sp.), 클로스트리듐 sp.(Clostridium sp.), 엔테로코커스 sp.(Entrococcus sp.)와 대장균 (Escherichia coli)에서 선택된 항원성질이 보강된 장내세균, 이의 항원 또는 이에 대한 항체와 숙주의 생물학적 시료를 접촉시키고 항체; 항원 상호작용에 대해 스크린하는 숙주에서 항체 생산 또는 동물에서 장내 세균 감지 방법에 대한 것이다.
본 발명의 또다른 목적은, 캄필로박터 sp.(Campylobacter sp.), 에르시니아 sp.(Yersinia sp.), 헬리코박터 sp.(Helicobacter sp.), 가스트로스피필룸 sp.(Gastrospifillum sp.), 박테로이드 sp.(Bacteroides sp.), 클렙스엘라 sp.(Klebsiella sp.), 엔테로박터 sp.(Enterobacter sp.), 살모넬라 sp.(Salmonella sp.), 쉬겔라 sp.(Shigella sp.), 에어로모나스 sp.(Aeromonas sp.), 비브리오 sp.(Vibrio sp.), 클로스트리듐 sp.(Clostridium sp.), 엔테로코커스 sp.(Entrococcus sp.)와 대장균 (Escherichia coli) 또는 이의 항체에서 선택된 항원성질이 보강된 장내 세균으로 구성된 장내 세균을 감지하거나 장내 세균에서 항체의 생산을 감지하는 진단 키트에 관계한다.
본 발명의 다양한 측면에서 연관된 적절한 장내 세균에는 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 캄필로박터 콜라이(Campylobacter coli), 에르시니아 에테로콜리티카(Yersinia enterocolitica), 에르시니아 페스티스(Yersinia pestis), 에르시니아 슈도튜블러큘로시스(Yersinia pseudotuberculosis), 대장균(Escherichia coli), 쉬겔라 플렉네리(Shigella flexneri), 쉬겔라 소네이(Shigella sonnei), 쉬겔라 디센테리(Shigella dysenteriae), 쉬겔라 보이디(Shigella boydii), 헬리코박터 피로리(Helicobacter pylori), 헬리코박터 페리스(Helicobacter felis), 가스트로스피릴룸 호미누스(Gastrospirillum hominus), 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae), 비브리오 파라헤모리티푸스(Vibrio parahaemolyticus), 비브리오 불니퍼쿠스(Vibrio vulnificus), 박테로이드 플라길리스(Bacteroides fragilis), 클로스트리둠 디피실(Clostridium difficile), 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium), 살모넬라 티피(Salmonella typhi), 살모넬라 엔테리티시드(Salmonella enteritidis), 클렙스엘라 뉴모니(Klebsiella pneumoniae), 엔테로박터 클로아세(Enterobacter cloacae)와 엔테로박터 페아콜리스(Enterococcus faecalis) 등이 된다. 적절하게는 대장균에는 장내 독성, 장내 용혈성, 장내 비침투성, 장내 병원성 또는 다른 균주들을 포함할 수 있으나 이에 한정시키지는 않는다.
본 발명은 본 발명의 항원적으로 보강된 장내 세균이 통상의 배양조건에서 생장시켰으나 동일 장내 세균에서 유도된 것 이상으로 동일 박테리아종의 광범위한 균주 또는 혈청형에 대해 교차-보호성이 있는 면역반응을 유도하는 놀라운 발견에 기초한다. 적어도 한 측면에서, 본 발명의 항원성으로 보강된 장내 세균에 의해 유도된 면역 반응은 다른 종의 장내 세균에 대해서도 교차-보호성이 없다.
[도면의간단한설명]
도 1A, 1B, 1C는 C. 제주니 81-176의 표면 추출물 가수분해물로부터 모노사카라이드의 HPLC 결과를 그래프로 나타낸 것이다; 도 1A 에서 푸코스 "Fuc", N-아세틸-갈락토사민 "GalNac", N-아세틸-글루코사민 "GlcNac", 갈락토즈 "Gal", 포도당 "Glc", 만노스 "Man". 도 1B 에서 통상적으로 생장한 세균의 표면 추출물 "BHI". 도 1C에서 본 발명의 방법에 따라 생장된 세균의 표면 추출물 "DOC".
도 2 에서는 통상적으로 생장한 "BHI" 또는 본 발명의 방법에 따라 생장한(0.8% 옥스갈 담즙산 "OX" 또는 0.1% 데옥시콜레이트 "DOC") C. 제주니 71-176의 전체세포(컬럼 1,2,3) 또는 표면 추출물(컬럼 5와 6)의 단백질을 비교한 SDS-PAGE의 결과를 나타낸다.
도 3 에서는 C. 제주니 81-176의 전체 세포에 의해 감염되어 생산된 뮤커스를 포함하는 페렛 IgA가 결합된 단백질을 비교한 웨스턴-블랏분석을 그래프로 나타낸 것이다. 통상적으로 생장시킨 전체 세포 C. 제주니 81-176은 "1"; 또는 본 발명의 방법에 따라 생장시킨 전체 세포 C. 제주니 81-176은; 0.8% 옥스갈 담즙산 "2" 또는 0.1% 데옥시콜레이트, "3"; 통상적으로 생장한 C. 제주니 81-176의 표면 추출물, "4"; 본 발명의 방법에 따라 생장한 C. 제주니 81-176의 표면 추출물, 0.1% 데옥시콜레이트, "5".
도 4 에서는 본 발명의 방법에 따라 생장시킨, "3"; 통상적으로 생장한, "2"; 또는 본 발명의 방법에 따라 배양기에서 생장한, "1". 각 전체 세포 C. 제주니 81-176으로부터 플라겔린-특이적 단클론 항체가 결합된 단백질을 비교한 웨스턴 블랏분석 결과를 나타낸다.
도 5 에서는 통상적으로 배양된 전체 세포 S. 플렉네리 2457T, "1" 또는 본 발명의 방법에 따라 배양된, 0.1% 데옥시콜레이트, 칼럼 "2"의 리포폴리사카라이드(LPS)를 비교한 SDS-PAGE의 결과를 나타낸 것이다.
도 6에서는 본 발명의 방법에 따라 생장된 C. 제주니의 면역교차 활성의 보강을 그래프로 나타낸 것이다. 통상적인 방법에 따라 또는 본 발명의 방법에 따라 생장시킨 C. 제주니 81-176 세포는 항체를 유도하는데 이용된다. 다양한 C. 제주니 혈청형에 대한 두가지 종류 항체(예로 BHI에서 배양시킨 항-C. 제주니 81-176과 DOC에서 배양시킨 항-C. 제주니 81-176)의 응집활성을 나타낸다. 9단락에서 실시예 32에 상술됨.
도 7A, 7B 와 7C 에서는 살아있는 C, 제주니 81-176 세포의 비강 수송에 대해 쥐를 보호하는데에서 비활성화된 C. 제주니 81-176 전체 소포로 구성된 백신 효과를 도면으로 나타낸 것이다. 쥐는 인산완충염(PBS; 직선), PBS + LT 어쥬번트(어쥬번트; 점선), 어쥬번트 없이(CWC; 0/직선) 또는 LT 어쥬번트와 함께 (CWC + 어쥬번트; 0/직선) 본 발명 실시예 5에 따라 생장수득한 포르말린-비활성화시킨 C. 제주니 81-176 전체 세포로 백신처리하였다. 장내 콜로니화 검사를-이용하여 백신 효과를 검사하였다. 도 7A(위쪽)에서는 약량당 105비활성화시킨 박테리아 입자가 있는 3회 경구약량을 이용하여 백신처리하는 경우 보호결과를 나타낸다. 도 7B(중간)에서는 약량당 107비활성화시킨 박테리아 입자가 있는 3회 경구약량을 이용한 백신처리 경우 보호 결과를 나타내었다. 도 7C(바닥)에서는 약량당 109비활성화시킨 박테리아 입자가 있는 3회 경구약량을 이용한 백신처리시에 보호결과를 나타내었다. 단락 11의 실시예 34에서 상술함.
도 8A, 8B 와 8C 에서는 살아있는 C. 제주니 81-176 세포의 구강 수송에 대해 쥐를 보호하는데에서 비활성화된 C. 제주니 81-176 전체 소포로 구성된 백신 효과를 도면으로 나타낸 것이다. 쥐는 도 7A, 7B, 7C의 간단한 설명과 같이 처리한다. 장내 콜로니화 검사를-이용하여 백신효과를 검사하였다. 도 8A(위쪽)에서는 약량당 105비활성화시킨 박테리아 입자가 있는 3회 경구약량을 이용하여 백신처리하는 경우 보호결과를 나타낸다. 도 8B(중간)에서는 약량당 107비활성화시킨 박테리아 입자가 있는 3회 경구약량을 이용한 백신처리 경우 보호 결과를 나타내었다. 도 8C(바닥)에서는 약량당 109비활성화시킨 박테리아 입자가 있는 3회 경구약량을 이용한 백신처리시에 보호결과를 나타내었다. 단락 11의 실시예 34에서 상술함.
도 9 에서는 쉬겔라 플렉네리 2457T 세포의 침투성에 대해 쉬겔라 플렉네리배양물의 성장상태의 효과를 그래프로 나타내었다. 쉬겔라 플렉네리 2457T 세포는 통상적으로 생장(BHI)시키거나 실시예 9에 의해 예시화된 본 발명의 방법(DOC-EL) 또는 - 즉 배양물을 초기 로그상에 있을 때 세포를 수득하거나 - 또는 실시예 9에 따라 하나 세포를 수득하기 전에 배양물이 후기 로그상에 있게 된다(DOC-LL). 이와 같은 상이한 준비물에서 침투성을 나타낸다. 단락 12의 실시예 35에서 상술함.
도 10 에서는 본 발명의 방법을 이용하여 배양될 때 쉬겔라 세포의 침투성을 보강한 도면을 나타낸다. S. 소네이와 S. 디센테리 3818은 실시예 9의 방법에 따라 또는 통상적으로(BHI) 배양되었다. INT-407 세포에 대한 상이한 쉬겔라 세포의 준비물의 침투성을 나타내었다. 단락 12의 실시예 35에서 상술함.
도 11 에서는 본 발명에 따라 생장된 쉬겔라의 면역교차 반응성의 보강을 나타낸 것이다. 실시예 9에서 예시된 본 발명의 방법에 따라 생장시킨 S. 플렉네리 2457은 항체를 유도하는데 이용된다. 통상적으로 생장된(BHI) 또는 실시예 9에서 예시된 본 발명의 방법에 따라 생장시킨 S. 플렉네리, S. 소네이, S. 디겐테리와 S. 보디에 대한 유도된 항체의 응집활성을 나타낸다. 단락 12의 실시예 36에서 상술함.
도 12 에서는 헬리코박터 피로리 NB3-2 세포의 접착성에 헬리코박터 피로니 배양물의 성장상태와 담즙농도의 효과를 그래프로 나타내었다. H. 피로리 HB3-2 세포는 0%, 0.025%, 0.05 또는 0.1% 담즙을 포함하는 배양배지에서 성장시키고 접종후 8, 10, 12, 18 시간에 수득하였다. INT-407 세포에 대한 H. 피로리 NB3-2 세포의 이들 준비물에 침투성을 나타내었다. 단락 14의 실시예 38에서 상술함.
도 13 에서는 헬리코박터 피로리 G1-4 세포의 접착성에 헬리코박터 피로니 배양물의 성장상태와 담즙농도의 효과를 그래프로 나타내었다. H. 피로리 G1-4 세포는 0%, 0.1% 또는 0.2% 담즙을 포함하는 배양배지에서 성장시키고 접종후 6, 8, 10, 12, 18 시간에 수득하였다. INT-407 세포에 대한 H. 피로리 G1-4 세포의 이들 준비물에 침투성을 나타내었다. 단락 14의 실시예 38에서 상술함.
본 발명은 시험관에서 장내 세균 항원 또는 독성인자의 발현을 유도하거나 강화하는 방법에 관계하여 항원적으로 강화된 장내 세균이 생산할 수 있으며 이의 이용방법과 이를 포함하는 백신에 관계한다.
본 발명의 방법은 항원 그리고/또는 독성인자의 발현을 유도하거나 강화시키기 위해 선택된 특정 성분과 함께 특정 조건을 복합시켜 시험관에서 장내 세균을 배양하는 것에 관계한다.
여기에서 사용된 "장내"는 동물의 위장관에서 보통 발견되거나 또는 임의 부분과 연합된 동물의 위장관의 일부에 감염원인이 되는 세균과 연관된다. 이와 같은 장내 세균에는 그램 양성과 그램 음성 세균을 포함한다.
여기에서 사용된 "성분"과 "조건"은 생체환경에서 장내 세균과 연합된 많은 인자 그리고 다른 인자와 연관된다. 이와 같은 성분과 조건에는 콜레스테롤, pH, 미호기성 조건, 삼투성, 소요의 박테리아 성장상태에서 세균을 수득하고 모으는 것과 같은 담즙, 담즙산 또는 이의 염 또는 이의 생물학적 전구체를 포함하나 이에 국한시키지는 않는다.
여기에서 사용된 "항원"과 이와 관련된 "항원성"은 세포형 또는 세포운동성에 거대분자의 역할; 단백질; 좀 더 구체적으로는 표면 단백질, 피로폴리사카라이드와 탄수화물을 포함하는 항원 또는 항원성 특징을 포함하나 이에 국한시키지는않는다. 적절하게는 항원은 면역원이 된다.
여기에서 사용된 "면역원"이란 본 발명에 의해 생산된 전체 세균 또는 이의 단편으로 구성된 조성물에 동물을 노출시킨 후에 동물에서 항체의 생산을 유도할 수 있는 능력을 말한다.
여기에서 사용된 "항원적으로 보강된" 또는 "보강된 항원성질" 또는 "보강된"은 본 발명의 방법에 따라 배양된 장내 세균의 항원 상태를 의미한다. 이와 같은 세균은 통상의 방법을 이용하여 생장시킨 동일한 세균과 비교하였을 때 특정 면역성 항원 그리고/또는 신규 면역성 항원이 상당부분 가진다.
여기에서 사용된 "통상적인"은 기준 기술에서 공지된 것과 관계한다.
여기에서 사용된 "미호기성 조건"은 5% 내지 20% CO2와 80% 내지 95% 공기; 5% 내지 20% CO2와 80% 내지 95% N2; 또는 10% O2와 10% 내지 20% CO2와 70%와 85% N2와 같은 상승된 CO2수준 또는 혐기성 조건과 관계한다.
여기에서 사용된 "독성"은 숙주에 흡착하거나 침입하거나 생존하는 능력이 있어 병리적 상태가 되게 하는 장내 세균의 인자를 말한다.
여기에서 사용된 "면역-교차 보호성"이란 동일종의 상이한 세균 균주, 혈청형 또는 종에 의해 동일 숙주의 감염을 막거나 또는 감쇠시키기 위해 하나의 박테리아 균주 또는 혈청형, 전체 세포 또는 그 외에 것에 의해 면역반응을 유도할 수 있는 능력에 관계한다.
여기에서 사용된 "면역-교차 반응성"이란 동일종의 상이한 세균 균주, 혈청형 또는 종과 교차반응할 수 있는 (예로 항체 결합) 하나의 박테리아 균주 또는 혈청형, 전체 세포에 의해 면역반응을 유도하는 (항체) 능력을 말한다. 면역-교차 반응성이란 박테리아 이뮤노겐의 면역-교차보호를 의미하고 그 역도 포함한다.
여기에서 사용된 "숙주"는 생체 동물 또는 시험관 동물 배양물을 의미한다. 여기에서 사용된 "동물"이란 포유류와 새(병아리, 칠면조, 오리 등)와 같은 모든 온혈동물을 포함하나 이에 한정시키지는 않는다.
본 발명에 따르면, 항원적으로 보강된 장내 세균 또는 면역원적 단편 또는 이의 유도체로 구성된 백신에서 장내 세균은 살아있는 세균이거나 또는 비활성이거나 또는 알룸, 물-오일 유액, 장내독소 대장균(LT) 비독성형(mLT)으로부터 열변성된 독소 그리고/또는 이의 개별소단위, 바실 칼메트-구에린(Bacille Calmette-Guerin (BCG)) 또는 플루언트 어쥬번트와 같은 어쥬번트를 포함하는데 또한 염, 덱스트로즈 또는 다른 수용액을 포함한 제약학적 담체를 추가로 포함한다. 다른 적절한 제약학적 담체는 Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company에서 상술한다. 여기에서 "백신"에는 "수동 백신"을 포함하는데 이는 원하는 감염 또는 질병보호에 대한 병소에 특이적으로 결합하는 항체로 구성된다.
여기에서 "비활성세균"은 죽은 세균과 감쇠된 것을 포함하여 감염과 콜로니화를 할 수 없는 장내 세균을 의미한다. 감쇠된 세균은 복제는 할 수 있으나 감연 또는 질병을 유발할 수는 없다. 이와 같은 세균의 비활성화는 본 기술의 공지방법을 이용하면 실행할 수 있다. 예로써, 세균은 포르말린 고정과 같은 화학적으로 비활성화시키거나 또는 열, 초음파파쇄 또는 방사능과 같이 물리적으로 비활성화시켜복제, 감염 또는 질병을 유발할 수 있는 능력이 제거된다.
효과량의 백신이 투여되었을 때 여기에서 정의된 "효과량"은 개체에서 면역반응을 유도할 수 있는 장내 세균 또는 면역학적 단편, 또는 이의 유도체량을 말한다. 필요한 량은 백신처리되는 개체의 종과 무게, 사용된 세균, 단편 또는 이의 유도체의 항원성에 따라 달라지는데 표준 기술을 이용하면 된다. 적절하게는 본 발명의 구체예에서 백신 효과량은 백신처리전에 항체 역가의 적어도 2배가 되는 항-세균성 항체 역가를 생산한다. 적절한 특정 구체예에서, 약 107내지 1011세균 적절하게는 108내지 1010세균을 숙주에 투여한다. 적절하게는 비활성화된 전체 세균의 구성된 백신이다.
수동적 백신에 적용되는 "효과량"은 박테리아 질병 또는 감염을 예방하거나 감쇠시킬 수 있는 항체량이다. 필요한 량은 항체의 형태, 항체 역가에 따라, 그리고 백신처리되는 개체의 종과 무게에 따라 달라지는데 표준 기술을 이용하여 정의할 수 있다.
본 발명의 백신은 정맥내, 피하내, 근육내, 질내, 복막내, 비강내, 구강 또는 다른 점막 경로를 포함하나 이에 국한시키지 않은 공지방법에 의해 국소 그리고/도는 전신으로 투여될 수 있다.
백신은 적절한 비독성 제약학적 담체를 통하여 투여될 수 있는데 이는 마이크로 캡슐에 포함되거나 또는 서방형으로 투여될 수 있다.
백신은 항체 수준을 유지시키기 위해 적절한 간격으로 투여되는 것이 바람직하다.
본 발명의 백신은 다른 살균 또는 정균 방법과 연합하여 사용될 수 있다.
본 발명의 항체는 Antibodies A. Laboratory Manual (Z. Harlow, D. Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)과 같은 기존 방법에 의해 수득되나 이에 한정하지는 않는다. 일반적으로, 동물(광범위한 척추 동물이 이용될 수 있으나 가장 보편적으로 쥐, 들쥐, 기니아 피그, 햄스터와 토끼)은 어쥬번트 유무하에 또는 정기적인 간격으로 면역원의 효과를 보강시킬 수 있는 물질의 존재유무에 관계없이 본 발명의 항원적으로 보강된 장내 세균 전에 세포 또는 이의 면역학적 단편 또는 이의 유도체로 면역화시킨다. 동물 혈청은 통상의 방법에 의해 소요의 항체 존재하에 검사할 수 있다. 동물의 혈청 또는 혈액이 다클론 항체원으로 이용될 수 있다.
단클론 항체에서 동물을 전술한 것과 같이 처리한다. 수용가능한 항체 역가가 감지되었을 때 동물은 마취시키고 지라를 유합을 위해 멸균상태에서 떼어낸다. 지라세포는 특이적으로 선택된 죽지않은 골수 세포주와 혼합시키고 혼합물은 물질, 일반적으로 세포융합을 촉진시키는 폴리에틸렌 글리콜 또는 유사체에 노출시킨다. 이와 같은 조건 하에서 융합은 무작위로 일어나고 각 형태의 융합안된 세포와 함께 융합된 세포 혼합물이 생성물이 된다. 융합에 이용된 골수 세포주를 HAT; 하이포산틴, 아미노프테린과 티미딘 선택성 배지를 이용하여 특이적으로 선택되고, 융합혼합물로부터 배양물에는 면역화된 기증자에서 유도된 세포와 골수세포 사이에서 하이브리드된 것만이 지속적이 된다. 융합후에 세포는 희석하고 선택성 배지에서 배양한다. 배양 배지는 선택된 항원에 대한 소요의 특이성을 가지는 항체 존재에 대해 스크린한다. 선택된 항체를 포함하는 배양물은 세포 배양물이 단일 세포가 될 때까지 희석하여 클론된다. 본 발명의 항체는 장내 세균 감염과 질병에 대한 수동 백신으로 유용하다.
숙주에서 항체 또는 세균의 감지방법은 면역검사를 포함한다. 이와 같은 면역검사는 본 기술에 공지되어 있고 방사능 면역검사(RIA), 효소-연결된 면역흡수 검사(ELISA), 형광 면역검사와 형광 편광 면역검사(FPIA)를 포함하나 이에 한정시키지 않는다.
또다른 구체예에는 본 발명에 다른 소요의 면역검사를 실행하는데 요구되는 필수적인 시약으로 구성된 진단키트를 포함한다. 진단키트는 필수 시약을 포함하는 하나 이상의 용기등이 복합된 상업적으로 포장된 형태로 제공된다. 이와 같은 키트는 통상의 키트 요소와 복합하여 본 발명의 장내 세균 또는 단클론 또는 다클론 항체로 구성된다. 통상의 키트 성분은 본 기술에 공지의 것으로 다수의 공고문에 포함된다(Antibodies a Laboratory Manual (E. Harlow, D. Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)) 통상의 키트 성분에는 미량적정 플레이트, 검사 혼합술의 pH를 유지시키는 완충액(트리스, HEPES를 포함하나 이에 국한시키지 않음), 과산화효소 공액된 항-쥐 IgG(또는 제 1 항체가 유도된 동물에 항-IgG)와 같은 공액된 제 2 항체와 유사물 그리고 다른 표준 시약 등을 포함하나 이에 국한시키지는 않는다.
본 발명의 방법은 상업적으로 이용할 수 있는 뇌 심장 주입 배지 "BHI", 루리아 배지 "LB", 양 혈액아가 "SBA", 부루셀라 배지, 무엘라-힌톤 배지, 프로테오즈 펩톤 소 추출물 배지를 포함하나 이에 한정되지 않은 적절한 필수 배양 배지에서 장내 세균을 배양시키는데 이때 다양한 조건과 성분이 포함되는데 예로써, 공기 또는 5% 내지 20% CO2와 80% 내지 95% 공기; 5% 내지 20% CO2와 80% 내지 95% N2; 또는 5% 내지 10% O2와 10% 내지 20% CO2와 70% 내지 85% N2와 같은 미호기성 조건에서 그리고 0 내지 100μM 적절하게는 25μM BAPTA/AM C2'(에틸렌디옥시)디아닐린 n, n, n', n'-테트라아세트산/아세톡시메틸 에스테르; Molecular Probes, Eugene, OR), 0 내지 10mM EGTA(에틸렌비스(옥시에틸렌니트릴로)-테트라아세트산/아세톡시 메틸 에스테르; Molecular Probes, Eugene, OR); 과 같은 이가 양이온 킬레이트 존재하에; 항원적으로 보강된 장내 세균을 생산하는 조건과 성분의 복합하에서 초기 로그상태, 초기 로그와 정체상 또는 정체상으로 될 때까지 30℃ 내지 42℃ 온도에서 0.05%, 3% 담즙 또는 0.025% 내지 0.6% 하나 이상의 담즙산 또는 이의 염 또는 콜레스테롤과 같은 생물학적 전구체를 포함하나 다양한 조건과 성분하에서 배양하는 것이다.
본 발명의 또다른 구체예에서, 본 발명의 방법은 1.0 내지 100μM EGTA/AM을 포함한 2가 양이온 킬레이트 존재를 제외한, 그러나 담즙; 담즙산 또는 염은 없이 전술한 것과 동일하게 장내 세균을 배양하였다.
본 발명에 유용한 담즙 또는 담즙산 또는 이의 염은 간에서 분비되는 자연적인 담즙 화합물로 담낭에서 농축되거나 또는 공지의 기술로 합성된 담즙산 예로써"OXGAIL"(Difco Laboratories, Detroit, Michigan), 소담즙(Sigma Chemicals, St. Louis, Missouri) 또는 다른 상업적으로 이용할 수 있는 성분물, 콜린, 데옥시콜린, 타우로콜린과 글리콜린 산을 포함하나 이에 한정시키지는 않는다. 적절하게는 일부 장내 세균에 의해 콜로니화된 소장과 대장에서 생체에 있는 상업적으로 이용할 수 있는 담즙산인 데옥시콜레이트(DOC)가 적절하다. 또한 글리코콜레이트(GC)도 적절하다.
본 발명에 따르면, 캄필로박터 sp.(Campylobacter sp.), 에르시니아 sp.(Yersinia sp.), 헬리코박터 sp.(Helicobacter sp.), 가스트로스피필룸 sp.(Gastrospifillum sp.), 박테로이드 sp.(Bacteroides sp.), 클렙스엘라 sp.(Klebsiella sp.), 엔테로박터 sp.(Enterobacter sp.), 살모넬라 sp.(Salmonella sp.), 쉬겔라 sp.(Shigella sp.), 에어로모나스 sp.(Aeromonas sp.), 비브리오 sp.(Vibrio sp.), 클로스트리듐 sp.(Clostridium sp.), 엔테로코커스 sp.(Entrococcus sp.)와 대장균 (Escherichia coli)에서 선택된 장내 세균 배양물은 본 기술에 숙지된 방법에 의해 냉동된 원액으로 준비하고 장기사용을 위해 -80℃에 유지시킨다. 예로써, 캄필로박터 제주니 원액은 20시간 동안 37℃에서 5% O2, 10% CO2, 85% N2(미호기성 조건 "MC")에서 5% 디프리비네이트된 양 적혈세포(SBA)를 포함하는 트립티카제 콩 아가에서 유기체를 배양시켜 준비할 수 있다. 대장균, 살모넬라 티피뮤리움, 헬리코박터 피로리는 뇌 심장 주입 배지("BHI")에서 유기체를 배양시켜 만들 수 있다. 세균은 공지의 방법에 의해 냉동시키고 배양물을 빼내어 30% 글리세롤을 포함하는 BHI에 재현탁시킴으로써 수득할 수 있다. 실험을 위한 배양물 또는 발효생산을 위한 배양물은 MC 또는 대기하에 37℃에서 1.5% 한천에 BHI로 유기체를 배양시키고 하나의 콜로니를 배양액에 옮기고 여기에서 상술하는 본 발명의 방법에 따라 배양시키는 일반적인 방법에 따라 준비할 수 있다. 세균을 원심분리와 같은 본 기술에 공지된 방법을 이용하여 수득할 수 있다.
구체예에서, 캄필로박터 종의 항원적으로 보강된 세포, 적절하게는 제주니종 또는 콜라이종, 가장 적절하게는 제주니 균주 81-176을 10 내지 20% CO2와 80 내지 90% 대기 혼합물에서 37℃ 0.1% DOC 또는 약 0.8% 담즙을 추가로 포함하는 BHI 배지에서 생장시키고 배양물의 성장이 약 로그 후기 단계 내지 정체 단계에 도달한 후에 일반적으로 접종후 20시간 정도에서 수득한다.
또다른 구체예에서, 쉬겔라종의 항원적으로 보강된 세포, 적절하게는 플렉네리종 또는 디센타리종, 가장 적절하게는 플렉네리 균주 2457T를 대기에서 37℃ 0.1% DOC 또는 약 0.8% 담즙을 추가로 포함하는 BHI 배지에서 생장시키고 배양물의 성장이 약 로그 초기 단계에 도달한 후에 일반적으로 접종후 30분 정도에서 배양물이 로그 중단계에 있을 때 수득한다.
또다른 구체예에서, 헬리코박터 피로니의 항원적으로 보강된 세포, 적절하게는 ATCC 49503 균주, NB3-2 또는 G1-4를 10 내지 20% CO2와 80 내지 90% 또는 10% CO2와 5% O2, 85% N2대기 혼합물에서 37℃ 0.05% 내지 0.2% 담즙 또는 0.05% 글리코레이트(GC)를 추가로 포함하는 BHI 배지에서 생장시키고 배양물의 성장이 약 로그 단계 내지 정체 단계에 도달한 후에 수득한다.
적절한 구체예에서 세포는 배양물이 로그 단계에 도달된 후에 수득한다.
본 발명에 따른 방법에 따라 배양된 장내 세균은 기저 배지에서 생장한 세포와 비교할 때 세포 형태가 변형되거나, 세포 운동성이 변경되거나 또는 신규 단백질, 리포폴리사카라이드 또는 탄수화물이 변형된 수준으로 생산된다. 세포 수득률을 강화시키고 병원성 색인이 되는 적절한 배양조건 등이 확인되었다. 이들 배양 조건을 이용하면, 강화되거나 또는 유도될 수 있는 독성 관련된 항원이 확인될 수 있다.
처리안된 또는 착색된 세균의 현미경 검사에 의해 이동성과 전체 형태학적 변화를 볼 수 있다. 전자 현미경 또는 형광 현미경을 통하여 본 발명의 방법에 따른 다른 형태적 변화를 볼 수 있다.
본 발명에 따라 배양된 장내 독소의 형태와 뮤코스-유사 특징에서 캡슐 그리고/또는 표면층 발현이 유도될 수 있다. 캡슐 생산을 테스트하기 위해 표면 성분예로 단백질, 탄수화물과 리포폴리사카라이드와 같은 것의 페놀 추출몰이 적절하다. HPLC에 의해 보강된 탄수화물을 볼 수 있다.
본 발명의 독성을 보강시키는 성장 조건하에서 생장된 장내 세균으로부터 준비한 외막의 단백질 프로파일은 SDS-PAGE로 특징화시키고 통상의 배지에서 생장시킨 유기체에서의 것과 비교한다. SDS-PAGE는 항원 보강 또는 변경조건에 반응하여 박테리아 세포와 추출된 단백질에서 유도된 변화를 평가하기 위해 실행한다. 이들데이터는 증가된 침투성 또는 변경된 항원성과 연관된 표면의 변화에 관계된 정보를 정량, 정성적으로 제공한다.
웨스트 블랏에 의해 유도된 또는 변경된 단백질 항원의 면역원 성질을 확인할 수 있다. SDS-PAGE에 의해 확인된 유도된 또는 변경된 박테리아 단백질의 면역원 성질은 하기에서 설명하는 바와 같이 웨스턴 블랏 기술에 의해 평가될 수 있다. 박테리아 항원을 검사하기 위해 C. 제주니 플라겔린과 교차-반응성이 있는 예로써 회복기에 있는 면역 토끼 또는 흰 담비 혈청(통상적으로 또는 본 발명의 방법에 따라 생장시킨 살아있는 유기체를 경구 감염시킨 동물에서 항체원료, 장내 점액(IgA 항체의 원료), 다클론성 항혈청 또는 단클론 항체 등 임의 항체가 이용될 수 있다.
이들 세균성 항원의 증가된 생산은 독성과 연관된 성질의 강화를 수반한다. 이들 성질에는 배양된 사람 내장 상피세포에 흡착과 침투 그리고 콩고 레드 염료의 결합을 포함한다. 콩고 레드 염료 결합검사는 독성의 지표가 되는 일반적으로 수긍하는 방법으로 하기에서 설명한다(Andrew et al., (Infect. Immun., 60:3287-3295, 1992); and Yoder (Avian Dis., 33:502-505, 1989)). 콩고 레드에 박테리아 결합은 헤민에 결합할 수 있는 능력을 나타내는데 헤민에 결합하는 능력이 독성과 연관된다. 또한 콩고 레드 결합은 상피세포의 보강된 세균 침입과 연관된다.
대부분 통상적으로 배양된 C. 제주니 Lior 혈청형은 면역-교차 반응성이 없음은 이미 본 바가 있다. 이와 같은 정보에 기초하여 캄필로박터에 대해 일반적인 보호를 하기 위한 복합 백신 또는 다수의 Lior 혈청형 균주 백신을 준비하고 투여하는 것이 필수적이다. 본 발명에 따른 생산된 항원적으로 보강된 캄필로박터는 통상적으로 생장시킨 캄필로박터를 이용하여 수득되는 것에 비교하여 광역의 Lior 혈청형에 대해 면역-교차 반응성을 가진다. 유사하게 본 발명의 방법에 따라 준비된 항원적으로 보강된 쉬겔라는 통상적으로 생산된 쉬겔라를 이용하여 수득한 것과 비교하였을 때 광범위한 쉬겔라에 대해 면역-교차 반응성과 면역-교차 보호성이 있다. 이와 같은 면역-교차 반응성과 면역-교차 보호성은 하기에서 상술하는 바와 같이 응집 검사와 백신연구 결과로써 볼 수 있다.
항원적으로 보강된 장내 세균의 생산을 위한 본 발명의 방법은 작은 동물에서 독성의 강화와 연관된다. 사람에서 캄필로박터 질병의 모델로써 몇가지 가금류를 이용한다. 면역화 효과의 입장에서 연구된 것은 가역적인 장 매듭, 성인 토끼 설사(RITARD)(Caldwell, et al., (Infect. Immun., 42:1176-1182, 1983))이다. 이와 같은 모델에서 교차-균주 보호와 Lior 혈청형이 연관되어 있다는 것을 설명한다. 그러나 이 모델에서는 질병에 저항성이 있다기 보다는 콜로니 형성에 저항성을 측정한다. Bell의 된 담비모델(Infect. Immun., 58:1848-1852,1990)이 유용한데 그 이유는 사람에서의 캄필로박터 질병과 유사한 질병 중상을 동물이 나타내기 때문이다. 최근의 모델은 Bagar의 쥐 콜로니화 모델이다(Infection and Immunity, 63:3731-3735, 1995). 이 모델은 면역화된 쥐에 살아있는 캄필로박터의 비강 또는 구강내 감염에 의해 면역화시키고, 가금물에 캄필로박터가 있는지를 모니터함으로써 장내 콜로니화를 검사한다. Mallett et al. (see infra Section 13)에서 설명한 쉬겔라에서도 쥐 비강 감염검사는 독성과 백신 효과를 평가하기 위해 이용된다. (Lancet, 339:1120-1121, 1992)에서 설명한 것과 같이 헬리코박터 페리스 위장 콜로니화 모델은 본 발명의 방법에 의해 생산된 H. 피로리의 백신능력을 평가하기 위해 이용된다.
장내 세균 침입과 감염과 연관된 다른 동물 모델이 있고 본 발명에 따라 생산된 보강된 장내 세균의 백신 효과를 테스트하기 위해 이용된다.
본 발명의 방법에 의해 생산된 항원적으로 보강된 장내 세균은 죽은 전체 세포 또는 소단위 백신의 프로토 타입을 만드는데 이용할 수 있다. 동물에 이들 백신이 투여되었을 때 항체를 유도하고 백신 보호능이 정립되는 것을 볼 수 있다. 세균 세포에서 이들 항원의 상승 또는 유도는 좀 더 효과적인 백신을 만드는 세포를 생산할 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 생산된 백신 추천물은 장내 면역 반응을 유도하기 위해 다양한 점막 면역화 전략에 이용될 수 있다. 항원성 보강유무에 관계없이 병원균의 도전에 대해 동물을 보호하기 위한 성공적인 면역화 과정으로 이용될 수도 있다. 또한 백신은 조성되어 복합백신 예로써 쉬겔라와 캄필로박터 세포 또는 이의 성분이 복합된 것으로 테스트할 수도 있다.
하기에서 설명하는 것은 표면항원과 보강된 침투성과 연관된 다른 특징의 변화를 감지할 수 있게 한다. 이와 같은 변화는 정성, 정량적이다. 가장 중요한 것은 본 발명방법이 침투성을 강화시키고 면역학적으로 연관된 항원을 유도한다는 것이다. 이와 같은 항원적으로 보강된 세균은 광범위한 박테리아 균주, 혈청형에 의해 감염에 대해 보호적인 면역반응을 유도하고 따라서 통상의 세균 배양과 비교하였을 때 효과적인 백신으로 이용할 수 있다.
본 기술에 숙지된 자에게 공지된 몇가지 잘 정립된 모델이 있고 하기에서 설명하는 보강된 양원성질, 박테리아 독성과 백신효과를 평가하는데 유용하다.
본 발명의 실시예를 하기에서 설명하나 이에 한정하지 않는다.
6. 실시예 : 세균에 대한 보강된 항원을 생산하는 방법.
실시예 1
캄필로박터 제주니 균주 81-176은 혈액 한천 플레이트(트립티카제 콩한천 + 5% 섬유소 제거한 양 적혈구세포)에서 도말하고 37℃에서 20시간 미호기성 GasPak jar(BBL, Cockeysville, MD)에서 배양시킨다. 박테리아 균총은 제거하고 10% CO2, 90% 공기, 0.8% OXGAIL(Difco, Detroit, MI)로 균질화시킨 BHI 배지 1L을 포함하는 플라스크에 접종시킨다. 배양물은 10% CO2, 90% 공기에서 닫힌 플라스크에서 37℃ 교반시키면서 20시간 배양시키고 전술한 것과 같이 수득한다.
실시예 2
캄필로박터 제주니 균주 81-176은 혈액 한천 플레이트(트립티카제 콩한천 + 5% 섬유소 제거한 양 적혈구세포)에서 도말하고 37℃에서 20시간 미호기성 GasPak jar(BBL, Cockeysville, MD)에서 배양시킨다. 박테리아 균총은 제거하고 10% CO2, 0.01 내지 0.1% 데옥시콜레이트 나트륨(DOC)으로 균질화시킨 BHI 배지 1L을 포함하는 플라스크에 접종시킨다. BHI 배지에서 별도 원액으로 DOC를 준비하고 증기 멸균시키는 것이 중요하다. 세균접종 전에 최종 농도가 0.01% 내지 0.1% 되게 BHI 배지에 무균 첨가한다. 배양물은 5% O2, 10% CO2, 85% N2에서 닫힌 플라스크에서 37℃ 교반시키면서 20시간 배양시키고 전술한 것과 같이 수득한다.
실시예 3
캄필로박터 제주니 균주 81-176은 혈액 한천 플레이트(트립티카제 콩한천 + 5% 섬유소 제거한 양 적혈구세포)에서 도말하고 37℃에서 20시간 미호기성 GasPak jar(BBL, Cockeysville, MD)에서 배양시킨다. 박테리아 균총은 제거하고 10% CO2, 와 0.01 내지 0.1% 데옥시콜레이트로 균질화시킨 부루셀라 배지 1L을 포함하는 플라스크에 접종시킨다. 배양물은 5% O2, 10% CO2, 85% N2에서 닫힌 플라스크에서 37℃ 교반시키면서 20시간 배양시키고 전술한 것과 같이 수득한다.
실시예 4
캄필로박터 제주니 균주 81-176은 혈액 한천 플레이트(트립티카제 콩한천 + 5% 섬유소 제거한 양 적혈구세포)에서 도말하고 37℃에서 20시간 미호기성 GasPak jar(BBL, Cockeysville, MD)에서 배양시킨다. 박테리아 균총은 제거하고 10% CO2, 0.01 내지 0.1% 데옥시콜레이트 나트륨(DOC)으로 균질화시킨 뮤엘라-힌톤 배지 1L를 포함하는 플라스크에 접종시킨다. 배양물은 5% O2, 10% CO2, 85% N2공기에서 닫힌 플라스크에서 37℃ 교반시키면서 20시간 배양시키고 전술한 것과 같이 수득한다.
실시예 5
캄필로박터 제주니 균주 81-176은 혈액 한천 플레이트(트립티카제 콩한천 + 5% 섬유소 제거한 양 적혈구세포)에서 도말하고 37℃에서 20시간 미호기성 GasPak jar(BBL, Cockeysville, MD)에서 배양시킨다. 박테리아 균총은 제거하고 10% CO2, 와 0.1% 데옥시콜레이트 나트륨(DOC)으로 균질화시킨 BHI 배지 1L을 포함하는 플라스크에 접종시킨다. 배양물은 10% CO2, 90% 공기에서 닫힌 플라스크에서 37℃ 교반시키면서 20시간 배양시키고 전술한 것과 같이 수득한다.
실시예 6
비브리오 콜레라는 BHI 한천 플레이트(트립티카제 콩한천 + 5% 섬유소 제거한 양 적혈구세포)에서 도말하고 37℃에서 20시간 미호기성 GasPak jar(BBL, Cockeysville, MD)에서 배양시킨다. 박테리아 균총은 제거하고 0.1% 데옥시콜레이트 나트륨과 BHI 배지 1L을 포함하는 플라스크에 접종시킨다. 배양물은 공기에서 닫힌 플라스크에서 37℃ 교반시키면서 20시간 배양시키고 전술한 것과 같이 수득한다.
실시예 7
살모넬라 콜레라시누스는 BHI 한천 플레이트에서 도말하고 37℃에서 20시간 미호기성 GasPak jar(BBL, Cockeysville, MD)에서 배양시킨다. 박테리아 균총은 제거하고 0.1% 데옥시콜레이트 나트륨과 BHI 배지 1L을 포함하는 플라스크에 접종시킨다. 배양물은 공기에서 닫힌 플라스크에서 37℃ 교반시키면서 20시간 배양시키고 전술한 것과 같이 수득한다.
실시예 8
살모넬라 티피뮤리움은 루리아 배지 한천 플레이트에 도말하고 대기하에서 37℃ 20시간 동안 배양시킨다. 균총은 0.1% 데옥시콜레이트 나트륨이 있는 BHI 1L을 포함한 플라스크에 접종시킨다. 배양물은 10% CO2, 90% 대기하에서 37℃ 교환하면서 20시간 배양시킨다. 한 개 콜로니를 0.1% DOC를 포함하는 LB 1ℓ에 옮기고 서서히 교반하면서 37℃에서 위를 막은 플라스크에 배양시킨다. 12시간 후 60㎖ 배양물을 동일한 새로 만든 예열시킨 배지 1ℓ로 희석시키고 추가 30분 배양한 다음 전술한 것과 같이 수득한다.
실시예 9
쉬겔라 플렉네리 2457T는 콩고 한천 플레이트에 도말하고 대기하에서 37℃ 20시간 동안 배양시킨다. 한 개 붉은 콜로니를 BHI 1ℓ에 옮기고 12시간 교반시킨다. 50㎖ 배양물을 0.1% 데옥시콜레이트 나트륨을 포함한 예열시킨 BHI 250㎖에 접종시키는데 이용한다. 이 배양물은 0.1% DOC를 포함하는 예열시킨 BHI로 OD600이 0.17이 되게 희석하고 37℃ 대기에서 교반하면서 30분간 배양시키고 전술한 것과 같이 수득한다.
실시예 10
캄필로박터 제주니 균주 81-176, 81-116 또는 HC(30% 글리세롤과 BHI에서)를 신속하게 해동시키고 양 혈액 한천(SBA, 0.1㎖ 플레이트당)에 배양시킨다. 접종된 플레이트는 37℃에서 20시간 동안 CampyPak Plus 미호기성 환경 발생기(BBL,Cockeysville, MD)가 있는 GasPak jar에 배양시킨다. 균총은 플레이트에서 떼어내어 10㎖ BHI에 균을 현탁시킨다. 균 현탁액은 BHI 배지 단독 또는 2ℓ플라스크에서 10% CO2, 90% 공기를 균등화시킨 0.1% DOC를 포함하는 BHI 배지 1ℓ에 접종시킨다. 접종물은 OD625가 0.05가 될 때까지 미리 균형을 맞춘 배지에 첨가한다. 접종된 플라스크는 10% CO2와 90% 대기상태로 복원시키고 37℃ 20시간 동안 서서히 교반시킨다. 이때 박테리아는 전술한 것과 같이 수득한다.
실시예 11
헬리코박터 피로리는 BHI 배지와 4% 송아지 혈청에 첨가한다. 접종후에 플라스크에 5% O2, 10% CO2, 85% N2를 공급하고, 교반하면서 37℃에서 22시간 동안 배양시킨다. 배양 후에, 2.5㎖ 배양물은 4% 송아지 혈청이 있는 BHI 배지를 포함하는 플라스크에 옮기거나 또는 0.05% 글리콜레이트 나트륨을 추가로 포함하는 동일 배지에 옮긴다. 이 배양물에 미호기성 기체 혼합물(5% O2, 10% CO2, 85% N2)을 보충하고 37℃ 20-24시간 배양시킨다. 세포는 전술한 것과 같이 수득한다.
실시예 12
살모넬라 티피뮤리움(30% 글리세롤이 있는 LB)은 LB 한천 플레이트에 접종시키고 대기하에서 37℃에 18-20 시간 동안 배양시킨다. 한 개 콜로니를 선택하고 LB 또는 10% CO2, 5% W2, 85% N2가 충진된 플라스크에 0.1% DOC를 포함하는 LB에 옮기고 봉하고 교반하면서 37℃ 12시간 동안 배양시킨다. 세균은 OD600이 0.17이 되도록 동일 배지로 희석시키고 동일한 조건하에서 배양시켜 배양몰이 초기 로그상태 일반적으로 희석후 30분 정도까지 배양시킨다. 세포는 전술한 것과 같이 수득한다.
실시예 13
살모넬라 티피뮤리움은 LB 한천 플레이트에 접종시키고 대기하에서 37℃에 18-20 시간 동안 배양시킨다. 한 개 콜로니를 선택하고 LB 또는 0.1% DOC를 포함하는 LB에 옮기고 대기하에서 37℃ 12시간 동안 배양시킨다. 배양물은 동일한 새로 만든 배지로 희석(1/5)하고 동일 조건에서 추가 4시간 배양한다. 배양물은 OD600이 0.17이 되도록 새로 만든 동일 배지로 희석시키고 동일한 조건하에서 배양시켜 배양물이 로그상태 일반적으로 희석후 30분 정도까지 배양시킨다. 세포는 전술한 것과 같이 수득한다.
실시예 14
클렙스엘라 뉴모니에는 BHI 한천 플레이트에 도말하고 공기중에서 37℃ 18-20시간 배양시킨다. 하나의 콜로니를 선택하고 BHI 또는 0.1% DOC를 포함하는 BHI 1ℓ에 접종시키고 대기하에서 37℃ 12시간 동안 교반시킨다. 세균은 OD600이 0.17이 되도록 동일한 배지로 희석시키고 30분간 추가 배양시키고 전술한 것과 같이 수득한다.
실시예 15
엔테로박터 클로아케는 BHI 한천 플레이트에 도말하고 공기중에서 37℃ 18-20시간 배양시킨다. 하나의 콜로니를 선택하고 BHI 또는 0.1% DOC을 포함하는 BHI1ℓ에 접종시키고 37℃ 12시간 동안 교반시킨다. 세균은 OD600이 0.17이 되도록 동일한 배지로 희석시키고 30분간 추가 배양시키고 전술한 것과 같이 수득한다.
실시예 16
대장균 균주 0157:H7은 양 혈액 한천 플레이트에 도말하고 공기중에서 37℃ 18-20시간 배양시킨다. 하나의 콜로니를 선택하고 BHI 또는 0.1% DOC를 포함하는 BHI 1ℓ에 접종시키고 대기하에서 37℃ 12시간 동안 교반시킨다. 세균은 OD600이 0.17이 되도록 동일한 배지로 희석시키고 30분간 추가 배양시키고 전술한 것과 같이 수득한다.
실시예 17
엔테로코커스 페칼리스는 양 혈액 한천 플레이트에 도말하고 공기중에서 37℃ 18-20시간 배양시킨다. 하나의 콜로니를 선택하고 BHI 또는 0.1% DOC를 포함하는 BHI 1ℓ에 접종시키고 대기하에서 37℃ 12시간 동안 교반시킨다. 세균은 OD600이 0.17이 되도록 동일한 배지로 희석시키고 30분간 추가 배양시키고 전술한 것과 같이 수득한다.
실시예 18
클로스트리듐 디피실(30% 글리세롤과 분쇄육 배지로 수정된)은 1.5% 한천을 포함한 무균용 고기 간 배지 플레이트에 도말하고 미호기성 조건(5% CO2, 95% N2)하에서 37℃배양시킨다. 하나의 콜로니를 선택하고 변형된 분쇄육 배지 또는 0.1% DOC를 포함하는 동일 배지 1ℓ에 접종시킨다. 세균은 미호기성 조건하에서 37℃ 12시간 동안 배양시킨 다음 전술한 것과 같이 수득한다.
실시예 19
박테리오이드 프라길리스(30% 글리세롤과 분쇄육 배지로 수정된)는 1.5% 한천을 포함한 무균용 고기 간 배지 플레이트에 도말하고 미호기성 조건(5% CO2, 95% N2)하에서 37℃배양시킨다. 하나의 콜로니를 선택하고 변형된 분쇄육 배지 또는 0.1% DOC를 포함하는 동일 배지 1ℓ에 접종시킨다. 세균은 미호기성 조건하에서 37℃ 12시간 동안 배양시킨 다음 전술한 것과 같이 수득한다.
실시예 20
에르시나 슈도튜블러큘로시스(30% 글리세롤을 포함하는 루리아배지)는 루리아 한천 플레이트에 도말하고 30℃ 배양시킨다. 하나의 콜로니를 LB 또는 0.1% DOC를 포함하는 LB에 희석(1/5)시킨다. 연속적으로 배양물은 OD600이 0.17이 되도록 동일한 배지로 희석시키고 30분간 추가 배양시키고 전술한 것과 같이 수득한다.
실시예 21
헬리코박터 피로리는 BHI 배지와 4% 송아지 혈청에 첨가한다. 접종후에 플라스크에 5% O2, 10% CO2, 85% N2를 공급하고, 교반하면서 37℃에서 22시간 동안 배양시킨다. 배양 후에, 2.5㎖ 배양물은 4% 송아지 혈청이 있는 BHI 배지를 포함하는 플라스크에 옮기거나 또는 0.1% 내지 0.2% 소담즙을 추가로 포함하는 동일 배지에 옮긴다. 이 배양물에 미호기성 기체 혼합물(5% O2, 10% CO2, 85% N2)을 보충하고 37℃ 20-24시간 배양시킨다. 세포는 전술한 것파 같이 수득한다.
7. 실시예 : 항원성이 보강된 세균.
실시예 22
이동성과 전체 형태를 검사하기 위해 습윤 탑재된 박테리아의 현미경 검사가 이용된다. 표면층은 인디아 잉크(니그로신)에 캡슐 착색에 의해 관찰될 수 있다. 공기 건조후에, 세포는 자색 결정으로 반-착색된다. 모든 관찰은 1000×확대에서 이루어진다.
본 발명에 따라 배양된 박테리아 형태(이하 "ENHANCED"균이라 칭함)는 기저 배지 단독(통상적으로 배양된)에서 배양된 것과 비교하면 변경된 것이다. 예로써 "보강된(ENHANCED)" C. 제주니는 응집되어 큰 세포 덩어리를 형성하고 통상적으로 생장된 세포는 주로 단독으로 있다. 박테리아 표면에서 변화는 본 발명의 방법을 이용하여 배양함으로써 영향을 받는다는 것은 캡슐 착색(데이타에서는 나타나지 않음)으로부터 명백해진다. 이와 같은 표면 변화는 균주로부터 니그로신 입자의 "보강된(ENHANCED)" 세포에 의해 결합이 증가되었다. "보강된(ENHANCED)" 세균은 상당한 운동성이 남아있다.
실시예 23
C. 제주니 표면 성분은 페놀 추출에 의해 분석할 수 있다. 추출물은 전술한 실시예 2에 따라 배양된 또는 통상적으로 생장한 C. 제주니 71-176에서 만든다. C. 제주니 세포는 전술한 것과 같이 배양 배지로부터 수득한다. 세포 펠렛은 1% 페놀로 실온에서 2시간 동안 추출하였다, 고유 세포는 45분간 원심분리에 의해 추출된물질로부터 분리할 수 있다. 추출된 박테리아 표면 성분은 포함하는 상충액은 증류수를 통해 12시간 투석시킨다. 보유물질은 4℃, 3시간 동안 105,000×g 류 원심분리시킨다. 추출된 펠렛은 10% NaCl에 다시 용해시키고 2배 용적은 냉각 95% 에탄올로 침전시킨다. 연속하여 샘플은 추가 분석을 위해 1mg/㎖에서 물에 희석시킨다.
추출물의 탄수화물 함량은 기준으로 포도당을 이용하여 일반적으로 이용하는 페놀-황산으로 검사한다. 카르바졸 시약을 이용하여 Dishe 방법으로 추출물의 우론산 함량을 측정하였다. 페놀 추출물에서 총 단백질 함량은 비시치논산 검사 키트로 평가한다(Pierce Chem. CO., Rockford, IL).
우론산은 추출물에 없다는 것이 명백하다. 많은 일반적인 세균 캡슐은 우론산 고분자로 구성된다. 놀랍게도 C. 제주니 81-176의 표면 추출물은 주로 단백질이다. 그러나, "보강된(ENHANCED)" 세포 추출물의 총 탄수화물 함량은 통상적으로 생장된 세포에 비해 증가되었다.
하기 표 1 에서는 추출물에서 탄수화물과 단백질 비율을 나타내었다.
[표 1]
실시예 2에 방법에 따라 ("보강된") 또는 통상적으로 생장된 C. 제주니의 세포 표면 추출물에서 탄수화물 : 단백질 비율
Figure pct00001
배양배지에서 DOC 함입과 박테리아로부터 표면 추출가능한 탄수화물의 증가된 수준 사이에는 직접적인 연관이 있다(표 1). 표면 추출 가능한 탄수화물은 본 발명의 방법에 따라 배양된 세균에서 8배 이상 증가되었다; 통상적으로 배양한 세균에서는 증가를 볼 수 없었다. DOC 배지에서 배양된 세균 세포의 응집은 표면 추출물의 성분에 기여하고 있는 것으로 보인다.
재수화시에, 추출물은 상당한 겔형성능을 가지고 있어 물에서 매우 점성이 큰 점액성을 제공하는데 이는 응집된 세균에서 특징과 유사하다. 추출물의 능력은 점소와 유사한 당단백질을 모방한다.
개별적 모노사카라이드 분석시에, 추출물은 봉해진 바이알에서 1N 트리플로로아세트산에서 가수분해 될 수 있다. 샘플은 질소하에서 2시간 동안 건조시키고 증류수에서 재현탁시킨다. 당은 Dionex Corp 색측분석 매트릭스를 이용하여 HPLC에 의해 분리시키고 용매 시스템은 용매로써 3% 0.5%N NaOH/97% H2O로 구성된다. 전류적정 감지는 분리된 모노사카라이드의 측정에 이용할 수 있다. 비교를 위해 표준 모노사카라이드 즉 퓨코스, 갈락토사민, 글루코사민, 갈락토즈, 글루코즈와 만노즈도 HPLC 분석한다.
가수분해된 표면 추출물의 HPLC 분석에서는 몇가지 모노사카라이드의 존재가 밝혀졌다(도 1). 상기 실시예 2의 방법에 따라 배양한 세균 또는 통상적으로 생장시킨 것에서의 추출물의 탄수화물 조성이 정량적으로 차이를 보이지는 않았다. 그러나 약간의 정량적인 차이는 보인다.
실시예 24
세균성 단백질은 SDS-PAGE와 웨스턴 블랏팅에 의해 분석하였다. Lugtenberg, et al. (FEBS Letters 58:254-258, 1975)의 겔 시스템이 이용된다. 겔 시스템은 낮은 농도의 아크릴아미드 겔(일반적으로 4%) 스태킹 겔 pH 6.8과 높은 농도의 아크릴 아미드 분리 겔 pH 8.8로 구성된 분연속 겔이 된다. SDS(0.1%)는 이용된 겔과 모든 완충액에 포함된다. 단백질 분리는 분자크기에 따라 이루어지는데 8 또는 12% 아크릴아미드 분리 겔이 이용된다. 분리된 단백질의 확인은 고정된 겔의 실버 착색에 의해 이루어지고 분자 크기 결정은 표준으로써 사용되는 공지의 단백질 Mr 값에 기초하여 만들어진다.
C. 제주니 세포 단백질은 SDS-PAGE에 의해 분리되고 실버 착색에 의해 볼 수 있다. 62 kDa 단백질은 포함한 4개 단백질이 DOC와 배양된 세포에서 유도되거나 보강된다(도 2).
실시예 25
S. 플렉네리 LPS는 페놀 추출물에 의해 분석된다. 통상적으로 배양된 또는 상기 실시예 9에서와 같이 본 발명의 방법에 따라 배양된 S. 플렉네리 세포는 전술한 것과 같이 원심분리에 의해 배양 배지로부터 수득한다. 리포폴리사카라이드(LPS)는 Westphal and Jahn (In: R. Whistler, ed., Methods in Carbohydrate Chemistry vol 5; p. 83, 1965)의 방법에 의해 추출한다. 간략하면, BHI에 배양된 또는 실시예 9에서 예시화된 세포는 원심분리에 의해 수득하고 PBS로 세척한다. 세포는 68℃에서 45% 페놀/물로 15분간 추출한다. 추출물은 10℃로 냉각시키고 원심분리한다. 상충 수용액상을 포함하는 LPS는 뽑아내고 증류수에 대해 투석한다. 보유물은 4℃ 80,000×g 에서 7시간 동안 원심분리시키고 105,000g 에서 3시간 동안 3회 원심분리 시킨다. 최종 펠렛은 냉동 건조시킨다. 분석 전에 LPS는 물(1mg/㎖)에 재현탁시킨다. 정제된 LPS는 전술한 것과 같이 탄수화물 함량에 대해 특징화시키고 하기에서 그리고 도 5 에서 볼 수 있는 것과 같이 SDS-PAGE에 의해 특징화시킨다.
S. 플렉네리 단백질 프로파일에서는 이와 같은 특정 SDS-PAGE 시스템을 이용하여 분석하였을 때 통상적으로 배양된 그리고 "보강" 세포 사이에 큰 차이는 없었다. "보강된" 세포에서 탄수화물과 LPS의 건중량비는 BHI 세포로부터의 추출물과 비교하였을 때 감소되었다. 그러나, 산화반응후에 SDS-PAGE와 S. 플렉네리 LPS의 실버 착색에서는 LPS 구조에 주요한 변화가 있음을 설명한다(도 5). 겔의 "2" 라인에서 볼 수 있는 것과 같이 "보강된" S. 플렉네리로부터 LPS의 0-항원 부분의 길이가 감소되었다. 이 결과는 "보강된" 세포로부터 탄수화물/LPS의 건중량비가 감소되었다는 발견과 상충하였다.
이 결과에서 "보강된" 세포에서 더 짧은 0-항원 곁사슬 침투가 있고 이는 균이 더 소수성이 되게 한다. 소수성이 큰 균주는 위장에서 소수성 표면과 상호작용이 더 많다.
실시예 26
단백질의 면역원성은 웨스턴 블랏에 의해 결정된다. 통상적으로 배양된 또는 상기 실시예 1 또는 5 에서 예시된 것과 같은 본 발명의 방법에 따라 배양된 세균에서의 단백질은 SDS-PAGE에 의해 분리하고 그 다음 니트로셀룰로오즈 또는 PVDF막에 전기영동적으로 이동시키고 표준 차단제 [3% BSA, 50mM 트리스(pH 8.5), 50mM NaCl, 0.2% 트윈 20]으로 차단시킨다. 1차 항체는 차단 완충액에 넣고 블랏은 세척해내고 2차 항체 수용체 코그네이트(Cognate)를 적용시킨다. 세척 후에, 블랏은 빛으로 보거나, 발색 기질을 이용하면 볼 수 있다. 이용된 보고 물질은 양고추 냉이 과산화효소 또는 알칼리 포스포타제이다.
도 3 에서는 IgA를 포함하는 면역 토끼 점액과 웨스턴 블랏팅으로부터 단백질을 나타낸 것이다. 보는 바와 같이, 62kDa 단백질은 면역 우세 항원이다. 62kDa 단백질의 항원성은 DOC 또는 담즙으로 배양시킨 세포에서 상당히 강화되었다. 이와 같은 단백질은 또한 DOC로 배양된 세포의 표면 추출물에서 우세 항원이다.
캄필로박터 플라겔린과 교차-반응성이 있는 쥐 단클론 항체를 이용하면, 보강된 단백질은 C. 제주니 플라겔린이라는 것이 설명된다(도 4). 이는 몇 연구자들이 C. 제주니 플라겔린이 병원성과 세균의 침투성질과 연관이 있다는 설명을 하였기 때문에 상당한 발견이 된다.
실시예 27
독성을 측정하기 위해 콩고 레드 염료 결합이 이용된다. 통상적으로 배양된 또는 0.025% 콩고를 포함하고 BHI 한천 플레이트에서 본 발명의 방법("보강된")에 따라 생장시킨 장내 세균은 증류수에 재현탁시키고 10분간 아세톤으로 추출하였다. 세포 찌꺼기는 원심분리에 의해 펠렛화시키고 염료의 OD488/OD660비율로 나타낸다. 데이터는 하기 표 2 에서 나타낸다.
[표 2]
통상적으로 생장된 또는 본 발명의 방법 (ENHANCED)에 따라 생장된 장내 병원군의 콩고 레드 염료 결합
Figure pct00002
표 2 에서는 본 발명에 따라 배양된 몇몇 장내 세균에서 콩고 레드 염료 결합이 보강되었음을 나타낸다. 이들 결과에서는 본 발명의 시험관 방법이 독성과 다른 세균에 대한 생체내 병원성과 연관된 것으로 알려진 다른 특징을 유도하는데 유용하다는 것을 설명하고 있다.
실시예 28
배양된 상피세포에 박테리아 흡착에 대해 분석하였다. 박테리아 흡착은 Galan과 Curtiss의 방법에 따라 검사한다. 조직 배양세포(INT-407 또는 헨리세포(ATCC # CCL6)와 CaCo-2(ATCC # HTB37) 사람 내장 세포주)를 60-80% 합체가 이루어지도록 24-웰 조직 배양 플레이트(37℃, 5% CO2)에 배양하였다. 배지는 사용된 세포주에 따라 달리 사용하나, 10% 태아 소혈청과 각 50mg/㎖ 페니실린 G와 스트렙토 마이신이 보충된 둘베코 수정 이글스 배지가 헨리세포에서는 이용되고, CaCo-2 세포의 배양에서는 10% 태아 소혈청과 각 50mg/㎖ 페니실린 G와 스트렙토마이신이 보충된 RPMI 1640 배지가 이용된다. 검사 적어도 3시간 전에, 배양 배지를 제거하고 세포는 마그네슘과 칼슘과 Hank의 균형된 염 용액(HBSS)으로 2회 세척한다. 단층은 항생제 없는 성장 배지로 덧깐다.
흡착 검사를 위해서, 세균은 다음과 같이 준비한다. 캄필로박터와 헬리코박터와 같은 서서히 성장하는 장내 세균에서는, 세균 배양을 밀도를 새로 균등화시킨 배지를 사용하여 OD625가 0.1이 되도록 희석하고 검사에 이용한다. 쉬겔라와 다른 빠르게 성장하는 장내 세균에서는 세균 배양물은 새로운 균등화된 배지로 OD625가 0.17이 되도록 희석하고 검사에 이용한다. 세균은 포화를 피하기 위해 세포당 10개 세균이 다중 감염되도록 상피세포에 첨가한다. 조직 배양 웰이 접종되는 균의 수는 플레이트 카운팅에 의해 계산된다. 캄필로박터에서 5% CO2하에 2시간 감염후, 쉬겔라의 경우에서는 30분간 감염시킨 후, 결합안된 균들은 HBSS로 세척해내고 0.1% 데옥시콜레이트로 단층을 용혈시키고 흡착을 결정하기 위해 플레이트한다.
하기 표 3에서는 실시예 5 에 예시된 본 발명의 방법에 따라 또는 통상적으로 생장한 C. 제주니 81-176에 의해 INT-407 세포 흡착에서 온도 효과를 나타내었다.
하기 표 4에서는 본 발명의 방법에 따라 또는 통상적으로 생장시킨 C. 제주니의 몇가지 균주에서 흡착의 차이를 나타내고 있다.
흡착 비율은 단층에서 회수된 콜로니 형성 단위(CFU) 수를 단층에서 접종된 CFU 수로 나누고 100을 곱한 것으로 나타낸다.
[표 3]
본 발명에 따른 (ENHANCED) 또는 통상적으로 생장시킨(BHI) C. 제주니에 의한 INT-407 세포에 흡착시에 온도효과
Figure pct00003
[표 4]
본 발명의 방법에 따른 또는 통상적으로 배양시킨 C. 제주니의 상이한 균주에 의해 INT-407에 흡착 (증가배수)
Figure pct00004
침투 검사에서는 흡착 검사에서와 마찬가지로 전술한 방법에 따라 상피세포를 생장시키고 준비한다. 통상적으로 생장된 또는 본 발명의 방법에 따라 생장한 세균은 포화를 피하기 위해 세포당 10마리 세균을 감염시키도록 상피 세포에 첨가한다. 조직 배양 웰에 접종되는 균의 수는 플레이트 카운팅에 의해 계산된다. 이때 담아있는 배양 세포가 상피세포 단층에 침투한다. C. 제주니 감염세포의 경우에는 CO2하에 3시간, 쉬겔라의 경우에서는 1.5 시간 배양을 지속한다. 단층은 HBSS로 세척해내고 0.1% 데옥시콜레이트를 첨가하여 단층을 용혈시킨다. 용혈물에서 세균을 플레이트 카운트에 의해 헤아리고 침투 비율은 접종 세균수와 비교하여 젠타마이신저항성 세균수로 나타낸다.
침투 비율은 젠타마이신 처리후에 단층에서 회수된 콜로니 형성단위(CFU) 수를 단층에서 접종된 CFU 수로 나누고 100을 곱한 것으로 나타낸다. 통상적으로 하기 표 5 에서는 실시예 5의 방법에 따라 또는 통상적으로 생장한 C. 제주니 균주 81-176에 의해 INT-407 세포 침투에서 온도 효과를 나타내었다.
하기 표 6 에서는 본 발명의 방법에 따라 또는 통상적으로 생장시킨 C. 제주니의 몇가지 균주에서 침투의 차이를 나타내고 있다.
하기 표 7 에서는 통상적으로 생장된 또는 실시예 5 의 방법에 따라 생장된 C. 제주니 균주 81-176에 의한 INT-407 세포에 흡착과 침투의 DOC 효과를 나타낸다.
하기 표 8 에서는 통상적인 방법으로 생장된 실시예 5 의 방법에 따라 생장된 쉬겔라에 의한 INT-407 세포에 흡착과 침투의 DOC 효과를 나타낸다.
[표 5]
본 발명에 따른 (ENHANCED) 또는 통상적으로 생장시킨(BHI) C. 제주니에 의한 INT-407 세포에 침투시에 온도효과
Figure pct00005
[표 6]
본 발명의 방법에 따른 또는 통상적으로 배양시킨 C. 제주니의 상이한 균주에 의해 INT-407에 침투 (증가배수)
Figure pct00006
[표 7]
본 발명의 방법에 따라("보강된") 또는 통상적으로 생장된 C. 제주니 81-176에 의한 INT-407 의 흡착과 침투시에 DOC 농도효과
Figure pct00007
[표 8]
본 발명의 방법에 따라("보강된") 또는 통상적으로 생장된 S.플렉네리가 INT-407 세포에 침투(%) 또는 흡착(%)시에 DOC 효과
Figure pct00008
C. 제주니의 몇가지 사람 분리체에 의해 배양된 INT-407 세포에 흡착과 침투는 배양 배지에 담즙 또는 데옥시콜레이트를 첨가하면 상당히 보강된다(표 4와 6). 가장 효과적인 DOC량은 0.1%이다(표 7). 최대 반응은 37℃에서 수득되나 42℃(캄필로박터가 통상적으로 배양되었을 때의 온도)에서는 아니다.
유사한 발견이 쉬겔라 플렉네리에서도 나타났다(표 8). 본 발명에 따라 생장된 쉬겔라는 흡착과 침투 모두에서 능력이 상당히 증가되었다.
이들 데이터에서는 장내 독소의 침투와 흡착이 본 발명의 방법에 의해 강화되었음을 나타낸다.
실시예 29
면역-교차 반응성을 나타내기 위해 신속한 슬라이드 응집검사를 이용한다. 통상적으로 생장된 또는 실시예 5 에서와 같이 본 발명의 방법에 따라 생장된 C. 제주니 균주는 통상적으로 또는 본 발명의 방법에 따라 (실시예 5) 생장된 C. 제주니 균주 81-176(Lior 6)으로 면역화시킨 동물로부터 혈청 IgG에 노출시켰다. IgG 항체는 단백질 A 피복된 라텍스비드에 고정시킨다. 테스트 혈청형과 Lior 5 혈청형에 대한 항체 사이에 교차 반응성 에피토프가 있는 경우에 덩어리를 형성한 (응집) 세포를 바로 볼 수 있다. 이들 덩어리는 반응을 짧은 시간 동안에 진행되도록 한 뒤에 0 내지 3 등급으로 분류한다. 이때 0은 관측되는 덩어리가 없고 3은 응집도가 가장 높다는 것을 의미한다. 표 9 에서는 4개 균주에서 나타난 결과를 나타낸다.
[표 9a]
본 발명의 방법 ("ENHANCED")에 따른 또는 통상적으로 생장한 Lior 혈청형의교차 반응성이다.
Figure pct00009
[표 9b]
Figure pct00010
표 9 에서는 보강된 C. 제주니 균주 81-176에 Lior 혈청형 L5로 면역화시킨 동물에서 발생된 항체와 테스트된 Lior 혈청형 4개 모두 (L5,L2,L8,L21) 교차 반응하는 것을 보여준다. 본 발명의 방법에 따라 배양된 C. 제주니의 10개 주요 임상적 혈청형(사람 병원균)중 8개와 반응하는 IgA로 구성된 C. 제주니 균주 81-176으로 감염된 토끼의 내장으로부터 점성 세장이 Lior 5 혈청형 균주에 대한 항체와 교차반응한다는 것이다(표 16). 이 결과에서, 본 발명의 방법은 C. 제주니의 Lior 5 혈청형으로 면역화된 동물에서 항-혈청과 교차 반응하는 Lior 혈청형의 수를 상당히증가시킴을 볼 수 있다.
또한, 통상의 방법이 아닌 본 발명에 따른 방법으로 생장시킨 쉬겔라의 몇가지 종은 DOC로 생장시킨 쉬겔라 플렉네리 2457T로 면역화시킨 동물에서 IgG 항체와 교차 반응한다는 것을 볼 수 있다.
8. 실시예 : 백신효과
실시예 30
캄필로박터 병원성을 연구하기 위한 흰담비 모델이 콜로니화와 질병으로부터 보호하는데 백신 효과를 평가하기 위해 이용되는데 그 이유는 담비의 감염으로 사람에서 볼 수 있는 3가지 질병중 2가지를 반복적으로 생산하기 때문이다.
통상적으로 생장시킨 (BHI) 또는 실시예 5의 방법에 따라(ENHANCED) 생장시킨 포르말린-고정시킨 C. 제주니 균주 81-176 또는 PBS(콘트롤)을 7 내지 9주 된 24마리 수컷 담비의 경구로 면역화시킨다. 기저 IgG 역가를 결정하기 위해 혈청을 분리하였다. 모든 백신과 PBS는 1주 간격으로 2회씩 (0일째와 7일째 "백신처리") 어쥬번트 LT 존재하에 투여한다. IgG 항체 역가를 결정하기 위해 1주일 뒤에(14일째) 혈청을 수득하였다("백신화 후"). 백신화반응 후 4주에(도전), 담비는 ACE 프로마진-케타민으로 마취시키고 살아있는 C. 제주니 균주 81-176 (1×1010CFU)를 포함하는 10㎖ PBS 용액으로 경구로 감염시킨다. 그 다음 점액 설사, 세균혈증, 가금물에 캄필로박터 함입, 체중변호, 잠복혈, 백혈구 세포 배설 등을 동물에서 매일 모니터한다. 마취된 담비의 경정맥에서 1 내지 2㎖ 혈액을 빼내어 구멍이 난 트립티카제 콩 배지 배양물에서 견본을 배양시킨다. 혈액 한천 배양물에 계대 배양은 감염 후 2, 5, 7일에 취한다. 혈청 샘플은 면역화(도전) 전에, 제 2 면역화 후 1주째에, 도전시에 그리고 도전 후 1주째에 IgG 역가를 확인하기 위해 혈청 샘플을 모은다.
잠복혈은 Hemacult 카드에서 가금물을 테스트하여 감지할 수 있다. 가금물질은 슬라이드에 얹고 배설 백혈구를 감지하기 위해 메틸렌 블루로 착색한다. 캄필로박터의 가금물 함입은 캄필로박터-선택성 배지 플레이트(트립티카제 콩한청, 5% 양 혈액, 트리메토프림, 반코마이신, 폴리믹신 B, 세팔로틴, 암포테리신 B, 라멜, 레넥사, KS)에 직장으로부터 찍어낸 물질을 배양하면 된다. 이들 실험 결과는 하기 표 10과 11에 나타내었다.
[표 10]
담비에서 C. 제주니 81-176에 대한 보호성 백신
Figure pct00011
[표 11]
담비 혈청 IgG 게노메트릭 평균역가
Figure pct00012
표 10 에서는 살아있는 세균의 도전시에 본 발명의 죽은-전체세포 백신으로 면역화된 동물이 콜로니형성과 질병으로부터 보호된다는 것을 보여준다. 표 11 의 데이터에서는 통상적으로 생장된 장내 세균보다 본 발명의 백신(ENHANCED)로부터 IgG 항체 역가가 더 크다는 것을 보여주고 있다.
이들 결과로부터 통상적으로 생장한 세균으로 백신처리된 동물에서 볼 수 있는 것보다 본 발명에 따라 백신처리된 경우에서 면역원성(표 11)과 감염으로부터 보호(표 10)는 더 크다는 것을 나타내준다. 따라서, 감염으로부터 포유류를 보호하기 위한 백신으로는 본 발명에 의해 생산되는 박테리아가 더 유용하다.
실시예 31
쥐는 담비에서처럼 캄필로박터 또는 쉬겔라 감염을 자연적으로 발생되지는 않으나 본 기술에 숙지된 자들은 면역화된 동물의 폐감염을 통하여 질병에 저항성이 있는 또는 면역화된 동물의 경구 도전시에 내장 콜로니 형성에 대해 저항성을 보여주기 위해 이들을 사용한다. 쥐 내장 접종 모델은 동물 또는 사람에서 이용할 수 있는 백신의 효과를 예측하기 위해 사용된다. 이 검사는 Mallet, et al. (Vaccine, 11:190-196, 1993)에 상술되어 있다.
약 16주 된 10마리 암컷 Bal b/c 쥐 집단은 실시예 5 에 따라(ENHANCED) 생장된 C. 제주니 또는 통상적으로 배양된 C. 제주니(BHI) 인산 완충염은 107CFU 또는 109CFU 약량으로 경구 면역화시키고 도전시킨다. 각 집단에서 내장 점액에서 IgA 역가는 ELISA 방법으로 결정하고 하기 표 12에서 결과를 나타내었다.
[표 12]
쥐에 캄필로박터 전체 세포백신으로 경구 면역화(107또는 109)후에 IgA 반응
Figure pct00013
표 12 에서는 본 발명의 방법에 따라 생장된 박테리아로 면역된 동물이 통상적으로 생장한 세균으로 면역화된 동물보다 더 큰 반응을 나타내는 더 큰 내장 IgA 항체 역가를 가진다고 볼 수 있다.
9. 실시예 : DOC에 의해 항원성의 변경 또는 보강 기작.
실시예 32
비록 본 발명은 특정 작용 기작에 한정하고자 함은 아니지만, 본 발명은 데옥시콜레이트(DOC)가 장내 세균의 항원성을 변경하거나 보강하는데 2배 작용을 하는 증거를 제시한다. 증거에서는 DOC는 칼슘에 결합되어 배지에 있는 칼슘 농도를 낮추기 때문에 DOC는 효과의 한 측면이 칼슘 의존성 효과를 통해 조정된다. 증거는 다음과 같다. C. 제주니 균주 81-176는 DOC 없이 막 침투가능한 칼슘 킬레이트 BAPTA/AM 으로 배양할 때 INT-407 세포의 침투성은 약 10배 증가된다(하기 표 13). 그러나 BAPTA/AM 단독 처리는 C. 제주니 균주 81-176 세포의 면역 교차-반응성을 보강하지는 않는다.
표 13 에 나타난 결과에서는 25μM BAPTA/AM 을 0.1% DOC로 대체한 것을 제외하고는 실시예 5 에 상술된 프로토콜에 따라 배양되니 C. 제주니 균주 81-176을 이용하여 수득한다. 발명 검사는 상기 단락 7의 실시예 28에서 상술된 것과 같이 실행되고 기록한다.
[표 13]
통상적으로 배양된(BHI) 또는 BAPTA/AM으로 배양된 C. 제주니에 의해 INT-407 세포의 침입
Figure pct00014
담즙 또는 DOC와 같은 담즙산에 의해 항원성의 보강 또는 변형되는 것으로 보이는 몇가지 박테리아종(예로써, 캄필로박터, 쉬겔라, 헬리코박터)은 에르시니아로부터 낮은 칼슘 반응(lcr) 유전자와 유사한 유전자를 가진다. lcr 위치는 낮은 칼슘 수준에 반응하여 에르시니아의 독성을 제어하는 것으로 공지된다. 플라겔린발현에 관계하는, 침투에 필요한 어셈블리(flaA, flbA)는 2개 캄필로박터 유전자와 lcr 생성물에 의해 부분적으로 조절된다. 통상적으로 생장된 또는 본 발명의 독성 보강 조건하에서 생장된 캄필로박터 flaA 와 flbB 의 특징 분석에서, 침투는 콩고 레드 염료 결합이나 증가된 교차 활성이 아닌 칼슘 의존성이라는 것을 보여준다(하기 표 14).
표 14에 나타난 결과에서 통상적으로 배양된 또는 실시예 5에서 예시한 것과 같은 본 발명의 방법에 따라 배양된 C. 제주니를 이용하여 수득할 수 있다. 본 발명의 검사는 전술한 실시예 28 에 따라 실행하고 기록한다.
[표 14]
통상적으로 생장시킨 또는 본 발명에 따른 방법(ENHANCED)으로 생장된 C. 제주니 돌연변이에 의한 INT-407 세포의 침투
Figure pct00015
C. 제주니 fla 와 flaA 돌연변이는 DOC와 배양하였을 때 상당히 보강된 콩고 레드 결합과 면역-교차 반응성을 나타내지는 않는다. 통상적으로 생장시킨 또는 상기 실시예 5 에서 예시한 것과 같은 본 발명의 방법에 따라 배양된 C. 제주니를 이용하여 수득한다. 콩고 레드 염료결합 검사는(결과는 표 15 에서 나타냄) 상기 실시예 26 에 예시된 것과 같이 실행하였다. 면역-교차 반응성은(도 6 에 결과를 나타냄) 상기 실시예 29에서 예시된 것과 같이 실행하였다.
[표 15]
통상적으로 생장된(BHI) 또는 본 발명의 방법 (ENHANCED)에 따라 생장된 C. 제주니 돌연변이에 의한 콩고 레드 염료 결합
Figure pct00016
flaA 돌연변이는 플라겔린을 발현시킬 수 없다. flaA 돌연변이와 flaA-flaB 이중 돌연변이(C. Grant, NIH로부터 받음)는 DOC 처리후에도 비침투성으로 플라겔린이 침투에 요구됨을 나타낸다. 흥미로운 것은, 돌연변이에서는 C. 제주니의 다른 Lior 혈청형과 이들 fla 돌연변이체의 동유전자 모균주 사이에 관측된 통상적으로 관찰되는(DOC유도안된) 면역-교차 반응성도 없다. 그러나 DOC 처리는 보강된 면역-교차 반응성과 콩고 레드 결합을 나타내는 이들 플라겔린 없는 돌연변이를 유도할 수 있다.
이들 발견에서 DOC는 칼슘-의존성(예로써 침투성)과 칼슘 독립적 기작(콩고 레드 염료결합)을 경유하여 장내 세균에 독성 기작을 조절한다는 것을 나타낸다.
10. 실시예 : DOC는 캄필로박터 제주니의 보강된 혈청형과 면역-교차 반응성을 유도한다.
실시예 33
본 발명의 방법에 따라 생장한 캄필로박터 제주니의 혈청형 면역교차 반응성은 신속한 슬라이드 응집 검사를 이용하여 검사한다. 캄필로박터의 이형 균주의 교차 반응성에 배양 조건을 변경시키는 효과를 결정하기 위해 면역화된 그리고 면역화안된 토끼의 내장 점액을 검사에 이용하였다. 토끼는 통상적으로 생장시킨 살아있는 C. 제주니 균주 81-176으로 면역화시킨다. 점액 항체의 응집항체는 BHI-YE 배지에서 통상적으로 배양시킨 또는 실시예 5 에서 예시한 것과 같은 본 발명의 방법에 따라 배양된 18개 혈청형으로 구성된 24개 캄필로박터 균주에 대해 테스트하였다.
응집검사 결과에서는 균주는 통상적으로 생장시켰을 때보다 본 발명의 방법에 따라 생장시켰을 때 대부분의 경우에서 이형 캄필로박터 균주의 교차-응집이 더 광범위하고 더 큰 것을 보여준다. 특이적으로는, 이형 응집 반응성에서 약 2배 이상 증가되었는데; 24개 통상적으로 배양된 이형 균주중 6개가 항-81-176 면역 점액에서 수준(+) 또는 그 이상에서 응접되는 반면, DOC 조건 하에 성장된 동일한 24균주중 14개가 수준(+) 또는 그 이상에서 응집되었다. 또한, 통상적으로 배양하였을 때 이형 균주들 중 18개가 약한(±) 또는 응집이 나타나지 않았고 ENHANCED 배양조건하에서 생장시켰을 때(배지에 DOC를 포함) 동일 균주중 7개가 보강된 응집반응을 나타내었다.
표 16 에서는 통상적으로 생장된 (BHI-YE) 또는 실시예 5 의 방법(ENHANCED)을 이용하여 생장된 22균주로 구성된 19개 이형 Lior 혈청형에 대한 항-81-176 면역 토끼 점액의 교차-반응성을 설명하였다. 이 실험은 공지의 Lior 혈청형의 단편을 검사하였으나 이 결과에서는 본 발명의 방법이 Lior 혈청형 사이에 실제 면역-교차 반응성을 유도하였다. 또한 결과는 캄필로박터에서 항원을 유도하거나 보강하는 DOC는 캄필로박터에 의한 내장 감염에 저항성과 이로부터 회수와 연관된 분비성 IgA 반응에 중요한 것으로 나타났다.
Lior 혈청형 8의 균주는 캄필로박터 콜라이 종과는 상이하다. 이들 혈청형의 두 균주(VC 167)중 하나는 항-81-176 면역 토끼 점액에서 강력히 응집되었다(3+). 이 결과에서 C. 제주니 균주로부터 유도된 백신(예로써 Lior 5)은 동종내에서 이형 혈청형에 대해 교차-보호할 수 있고 또한 다른 캄필로박터종(예로써 캄필로박터 콜라이)에 대해서도 가능하다. 전세계적으로 만연된 가장 우세한 질병과 연관된 혈청형 가운데 Lior 혈청형 1, 2, 4, 9, 11은 가치가 없었다. 이들 모두는 이 검사에서 감지가능한 교차-반응성을 설명한다.
[표 16]
통상적으로 생장한 (BHI-YE) 또는 본 발명의 방법에 따라 생장시킨 20개 캄필로박터 혈청형이 비-면역b또는 항-81-176a면역 토끼 점액에 응집반응
Figure pct00017
11. 실시예
캄필로박터의 백신효과의 추가 실험
Baqar (Infect. & Immun.. 63:3731-3735. 1995)에 의해 보고된 쥐 콜로니화 모델을 이용하여 본 발명의 방법에 따라 생장시킨 포르말린-고정된 전체 세포 캄필로박터 제주니의 보호효과를 결정하였다.
C. 제주니 81-176은 실시예 5에 따라 생장수득시키고 전술한 것과 같이 0.075% 포르말린으로 비활성화시킨다. 다섯 마리의 6 내지 8주된 암컷 Balb/c 쥐에 105, 107또는 109비활성화된 박테리아 입자 단독 또는 대장균(LT)으로부터 열민감성 내독소 25㎍이 복합된 것을 포함하는 3회 경구 약량(0.025㎖/약량 내독소없는 PBS)을 주사한다. 약량은 48시간 간격으로 제공되고 위산을 중화시키기 위해 5% 중탄산나트륨 용액(pH 8.5) 0.5㎖ 2회 약량을 15분 간격으로 바로 투여한다. 컨트롤로써, 동물집단은 PBS 단독 또는 LT 어쥬번트른 복합시켜 백신처리한다. 3회째 약량 투여후 28일 경에 백신처리된 동물은 통상적으로 생장시킨 살아있는 C. 제주니 균주 81-176의 약 108CFU를 비강 또는 구강으로 감염도전을 받는다. 내장 콜로니화 기간은 9일에 경과후 매일 배설물을 모니터하여 결정할 수 있다. 배설물은 멸균 PBS로 유화시키고 몇방울은 캄필로박터 혈액 한천에 도말시킨다. 플레이트는 C. 제주니가 성장할 수 있도록 3-5일간 미호기성 조건(Campylobacter GasPak, BBL)하에서 35℃ 배양시킨다. 콜로니 형성 결과는 주어진 샘플 일자에 캄필로박터 유기체를 배설하는 동물의 비율로 나타낸다.
도 7 에서 볼 수 있는 것과 같이, 비강으로 도전을 받은 동물, 면역화된 동물과 컨트롤에서 도전 후 바로 (1일) 유기체를 배설하였다. 컨트롤 동물의 80내지 100%는 도전후 9일간 콜로니를 가지고 있었다. 대조적으로, 백신처리된 집단에서는 검사 9일 과정 동안에 유기체를 배설하는 동물의 수는 상당히 적었다. 도전 유기체를 제거하는 정도와 그 시간은 투여된 백신의 양에 따라 달라진다. 소량(105입자/약량)과 간헐적인 백신량(107입자/약량)이 점진적으로 제공될 때 제거는 불완전하게 된다. 이 약량에서 어쥬번트의 존재는 보호정도를 증가시킨다. 놀라운 것은 테스트된 최대 약량에서(109입자/약량) 비교할만한 약량이 LT 어쥬번트와 투여하였을 때와 비교하여 동일한 또는 약간 큰 보호수준을 나타내었다.
경구 백신화된 동물에 연속적으로 경구로 도전을 할 경우에도 유사한 결과가 나타났다(도 8). 이 결과에서는 본 발명의 방법에 따라 생장한 비활성화된 캄필로박터로 면역화시키면 살아있는 캄필로박터의 연속적인 도전에 대해 보호를 하고 어쥬번트를 사용하지 않고도 경구 투여하였을 때도 면역화가 효과적이었다.
본 발명에 따른 방법으로 생장시킨(실시예 5) 캄필로박터 제주니의 포르말린 고정시킨 전체 세포를 복막내(IP) 투여하는 경우 보호 효과를 평가하였다. 이들 실험에서 20마리 암컷 Balb/c 쥐 집단에는 어쥬번트 없이 0.5㎖ 내독소없는 PBS 0.5㎖에 1.3×1010, 2.5×109, 5.0×108, 1.0×108또는 2.0×107비활성화된 C. 제주니 입자의 1회 약량을 투여하였다. 동물은 복막으로 투여된 살아있는 C. 제주니 균주 81-176(내독소없는 PBS에서 약 1.0×1010CFU)의 1회 치사량으로 14일 뒤에 도전받는다. 동물은 치사도에 대해 4일간 매일 모니터한다.
표 17 에서 볼 수 있는 것과 같이, 5.0×108비활성화된 C. 제주니 입자의 1회 복막내 투여량은 살아있는 C. 제주니 도전에 대해 동물을 보호할 수 있는 충분한 양의 면역반응을 유도한다.
[표 17]
본 발명에 따라 준비된 비활성화된 C. 제주니를 IP로 수송한 경우 보호효과
Figure pct00018
12. 실시예 : DOC는 쉬겔라의 침투성, 콩고 레드 결합과 면역-교차 반응성을 강화시킨다.
실시예 35
시험관에서 생장시킨 쉬겔라 sp의 침투성은 배양물의 성장상에 의해 영향을 받는다. 통상적으로 생장한(BHI) 또는 실시예 29 에서 예시한 본 발명의 방법에 따라 (DOC-EL)(이때 세포는 초기 로그상 배양물로부터 수득함) 또는 실시예 9 에 따른, 그러나 배양물이 세포 수득 전에 후기 로그상에 도달한 (DOC-LL) 것으로 생장시킨 쉬겔라 플렉네리 2457T 세포의 침투성은 실시예 28 에서 상술한 과정에 따라, 테스트하였다. 결과에서 DOC로 배양하면 침투성이 강화되고 최대강화는 성장이 초기 로그상태 동안에 이루어진다(도 9).
본 발명의 방법에 따른 DOC로 배양하면 다른 쉬겔라종, S. 소네이와 S. 디센타리의 침투성을 강화시킨다(도 10). 편광된 상피세포에서, 상피세포는 세균에 의해 기저측면으로 감염하였을 때만 쉬겔라의 침투성이 강화되었음을 볼 수 있다. 이와 같은 발견은 생체에서 관측된 침투 과정과 일치한다.
비교연구에서 본 발명에 따라 생장된 쉬겔라는 Pope et al. (Infect. & Immun., 63:3642-3648, 1995)에서 상술한 과정에 따라 준비된 쉬겔라보다 거의 10배 더 침투성이 크다.
실시예 36
본 발명에 따라 배양된 쉬겔라는 보강된 콩고 레드 결합을 나타낸다. 통상적으로 생장된 또는 실시예 9 에서 예시한 것과 같은 본 발명의 방법에 따라 배양된 S. 플렉네리 2457T와 S. 소네이는 전술한 실시예 26 에서 상술하는 과정을 이용하여 이들의 염료 결합능력에 대해 검사하였다. 결과에서 DOC에서 성장은 2개 쉬겔라종에 의해 콩고 레드 결합이 10 내지 20배 보강된다는 것을 보여준다(표 18).
[표 18]
통상적으로 생장된 또는 본 발명의 방법에 따라 생장된 S. 플렉네러와 S. 소네이에 의한 콩고 레드 결합.
Figure pct00019
쉬겔라는 4개 종과 다양한 혈청형으로 나뉜다. 본 발명에 따른 방법으로 생장된 쉬겔라 플렉네리의 면역-교차 반응성을 실시예 28 에서 상술하고 있는 응집검사를 이용하여 검사하였다. 검사에서는 상이한 쉬겔라종의 면역-교차 반응성에서 배양조건의 효과를 결정하기 위해 면역화된 토끼로부터 항혈청을 이용한다. 토끼는 실시예 9 에 따라 생장한 포르말린 고정된 쉬겔라 플렉네리 2457T로 면역화시킨다. 면역화된 동물로부터 수득한 IgG 항체의 응집활성은 BHI 배지 또는 본 발명의 방법에 따라(실시예 9) 생장시킨 모든 4개 쉬겔라종에 대해 테스트하였다. 응집검사 결과에서는 DOC로 생장한 경우, 동종 쉬겔라 플렉네리의 응집활성과 항-S. 플렉네리 항체에 대해 이종인 3개 쉬겔라종에서도 응집활성을 상당히 보강시키는 것을 볼 수 있다.
13. 실시예 : 쉬겔라의 백신효과
실시예 37
본 발명의 방법에 따라 생장한 포르말린-고정된 전체 세포 쉬겔라 플렉네리의 보호효과는 C. P. Mallett et al. (Vaccine, 11:190-196, 1993)에 의해 개발된 쥐 비강 도전모델을 이용하여 결정하였다. 간략하면 쉬겔라 플렉네리는 실시예 9에서 예시한 방법에 따라 생장되고 수득되면, 실시예 30 에서 상술하는 것과 같이 0.07% 포르말린으로 비활성화시킨다. 약 107비활성화된 세균입자는 14-16주된 암컷 Balb/c 쥐를 백신처리하는데 이용된다. 비활성화된 S. 플렉네리는 108입자/㎖ 농도에서 멸균된 내독소없는 PBS에 현탁시키고 이 물질 35㎖는 10마리의 마취된 동물에 비강으로 투여한다. 14일 간격으로 총 3회 면역반응을 실시한다.
쉬겔라 전체 세포 백신의 보호효과에 어쥬번트의 역할을 테스트하기 위해 동물집단은 비활성화된 백신과 대장균(LT)으로부터 열에 민감한 내독소 5㎍을 포함하는 현탁액을 이용하여 면역화시킨다. 3회째 면역화후 14일 경, 동물을 살아있는 S. 플렉네리 또는 S. 소네이의 치사량 이하 약량(105CFU)으로 비강 도전시킨다. 하루전, 1, 2, 5, 7일에 도전을 실시하고 동물의 체중을 달고 평균 집단체중을 결정한다. 결과는 표 19에 나타내었다.
[표 19]
살아있는 S. 플렉네리 또는 S. 소네이로 비강도전시에 비활성화된 쉬겔라 플렉네리 전체세포 백신은 쥐를 보호한다.
Figure pct00020
본 발명에 따라 배양된 비활성화된 S. 플렉네리로 구성된 백신으로 면역화시킨 쥐는 살아있는 S. 플렉네리 유기체의 도전에 대해 보호를 받는다. 이들 쥐는 PBS 컨트롤 집단과 같이 백신처리 안된 쥐와 비교하였을 때 체중손실이 크고 신속한 체중회복을 한다. 놀라운 것은, S. 플렉네리 백신은 살아있는 S. 소네이로 도전을 받는 것에 대해 쥐를 보호한다. 흥미로운 것은, LT 어쥬번트 없이 백신만을 수용한 동물은 어쥬번트가 포함된 백신을 제공받은 동물에서 유사 S. 플렉네리 도전에 대해 보호를 받았다. S. 플렉네리 백신 단독은 S. 소네이에 의한 이형도전에 대해서도 보호하였다. 그러나 LT 어쥬번트를 포함하면 S. 소네이에 의한 도전에 대해서도 보호가 상당히 보강되었음을 볼 수 있다. 이와 같은 발견은 본 발명의 방법에 따라 준비된 비활성화된 쉬겔라로 구성된 백신이 인지된 쉬겔라 질병모델에서도 효과적으로 다양한 쉬겔라 감염을 예방하거나 감쇠하는데 어쥬번트를 요구하지는 않는다.
14. 실시예 : 동물 세포에 H. 필로리의 흡착에 영향을 끼치는 인자들
실시예 38
H. 필로니의 흡착은 글리코콜레이트 또는 담즙에서 성장에 의해 보강되었다. H. 필로리 균주 NB3-2 또는 G1-4의 세포는 BHI 배지 또는 4% 송아지 혈청에 첨가하였다. 접종 후 플라스크는 10%CO2-5%O2-85%N2로 충진하고 교반하면서 37℃에서 22시간 배양시킨다. 접종 후에 배양물은 다양한 농도(0.025% 내지 0.2%)의 소담즙을 포함하는 4% 소 혈청이 든 BHI 배지 1ℓ를 포함한 플라스크에서 1 내지 10배 희석시킨다. 이 배양물에 다시 동일한 기체 혼합물로 충진시키고 37℃에서 배양시킨다. 세포는 최고 18시간까지 다양한 시간 동안 수득하고 실시예 28에서 상술된 방법을 이용하여 INT-407 세포에 대한 흡착을 검사하였다. 결과에서 담즙으로의 배양은 H. 필로니가 INT-407 세포에 흡착이 강화되었음을 볼 수 있다(도 12 와 13). NB3-2 균주, 흡착 피크에서, 8시간 성장시킨 후에는 보강안된 배양물보다 4 내지 6배 증가되었다(도 12). G1-4 균주, 흡착 피크에서, 0.2% 담즙에서 12-14시간 성장동안에강화안된 배양물보다 약 2 내지 3배 증가되었다(도 13). 여기에서 "피크" 횟수는 각 균주 배양물이 로그 상태 성장에 있을 때의 기간에 일반적으로 상응한다.
15. 실시예 : 본 발명의 방법에 따라 배양된 헬리코박터의 백신효과.
실시예 39
본 발명의 방법에 따라 배양된 포르말린-고정된 전체 세포 헬리코박터 피로니의 보호효과는 Chen et al. (Lancet, 339:1120-1121, 1992)에서 상술한 것과 같은 쥐 헬리코박터 펠리스 위장 콜로니화 모델을 이용하여 결정한다. 헬리코박터 필로리 균주 G1-4는 4% 소 혈청을 포함하는 BSI 배지에서 10% CO2, 90% 공기하에서 37℃ 22시간 동안 종균 배양한다. 37℃에서 12-14시간 생장 후에 세포는 원심분리에 의해 수득하고 실온에서 Hank's 균형 염 용액(HBSS) 원래 용적의 1/10로 재현탁시킨다. 세포는 다시 원심분리하고 HBSS 원래 용적의 1/100로 다시 현탁시킨다. 완충된 세포 현탁액에, 포르말린은 0.075% 농도로 첨가되고 세포는 6시간 동안 실온에서 현탁액을 교반시키고 18시간 동안 4℃에서 용액을 냉각시켜 비활성화시킨다.
보호능력은 0, 7, 14일째 또는 0, 7, 21일째 6-8주 된 암컷 Balb/c 헬리코박터-없는 쥐에 이와 같은 비활성화된 전체세포 백신의 3회 약량을 투여하여 측정한다. 약량당 109세균입자가 대장균의 열에 민감한 내독소와 복합하여 평가된다. 3회 면역화 약량후에 14일 경에 동물에 살아있는 H. 펠리스 1회 약량(107CFU/약량)을 경구로 도전시킨다.
도전후 2주째 동물을 죽이고 H. 펠리스의 존재를 결정하기 위해 요소 분해효소 활성을 분석한다. 요소 분해효소 활성은 4-24시간 동안 실온에서 0.5㎖ Stuart's 요소분해효소 배지(Remel)에 강 조직 시료를 배양하여 결정한다.
표 20 에서 볼 수 있는 바와 같이, H. 필로리 G1-4를 이용하여 준비한 보강된 헬리코박터 전체 세포 백신의 투여로 H. 펠리스 경구 투여에 대해 동물을 보호한다.
[표 20]
본 발명의 방법에 따라 배양된 비활성화된 H. 필로리로 구성된 백신의 헬리코박터 감염에 대해 보호
Figure pct00021
이들 실험 결과에서 생체내 면역성에 대한 보강된 장내 세균 성질을 나타낸다.
본 발명의 방법은 보호성이 있어 백신으로 유용한 면역반응을 유도할 수 있는 세균을 만드는 것이다.
16. 미생물의 기탁
다음의 미생물은 American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive,Rockville, Maryland 20852, USA에 기탁되어 하기와 같은 기탁번호를 가진다.
Figure pct00022
본 발명의 방법과 등가의 다른 방법들이 본 기술에 숙지된 자에 의해 쉽게 만들 수 있고 이들은 본 발명의 범위에 속한다. 전술한 명세서는 본 발명을 실행하는데 필요한 모든 정보를 포함한다. 전술한 특허 또는 공고들은 여기에 사용된 모든 유용한 정보를 제공하고 이들은 참고문헌으로 기재한다.
Figure pct00023

Claims (17)

  1. 항원성이 강화된 장내 세균을 생산하는 방법에 있어서, 이때 장내 세균은 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 캄필로박터 콜라이(Campylobacter coli), 에르시니아종(Yersinia sp.), 박테로이드종 (Bacteroides sp.), 클렙스엘라종(Klebsiella sp.), 가스트라스필리룸종(Gastraspirillum sp.), 엔테로박터종(Enterobacter sp.), 살모넬라종 (Salmonella sp.), 쉬겔라종(Shigella sp.), 에어로모나스종(Aeromonas sp.), 비브리오종(Vibrio sp.), 클로스트리듐종(Clostridium sp.), 엔테로코커스종(Entrecoccus sp.), 장출혈성 대장균(enterohemorrhagic Escherichia coli)에서 선택되며, 반응 조건이
    a) 0.05% 내지 3% 담즙 또는 0.025% 내지 0.6% 하나 이상의 담즙산 이나 이의 염;
    b) 30℃ 내지 42℃ 사이의 온도;
    c) ⅰ) 5% 내지 20% CO2, 80% 내지 95% 공기;
    ⅱ) 5% 내지 20% CO2, 80% 내지 95% N2; 또는
    ⅲ) 5% 내지 10% O2, 10% 내지 20% CO2, 70% 내지 85% N2로 구성된 미호기성 조건;
    d) 0 내지 100μM BAPTA/AM, 0 내지 10mM EGTA, 0 내지 100μM EGTA/AM에서 선택된 2가 양이온 킬레이트로 구성된 복합조건하에서 장내세균을 시험관에서 배양시키고, 상기 배양물은 성장상태가 초기 로그상태, 초기 로그상과 정체상 사이 또는 정체상태의 성장 상태가 되고, 장내 세균의 항원성은 뇌-심장 주입액 브로스(BHI), Luris 브로스, 양의 혈액 한천배지, Brucella 브로스, Mueller-Hinton 브로스, 프로페오스 펩톤 비프 추출물 브로스에서 선택한 통상 배지에서 생장시킨 세균배양물의 균 항원성 성질과 비교하였을 때, 면역원성 항원의 수준이 더 높은 것을 특징으로 하는 장내 세균을 생산하는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 항원성이 강화된 장내 세균을 생산하는 방법에 있어서, 이때 장내 세균은 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 캄필로박터 콜라이(Campylobacter Coli), 에르시니아종(Yersinia sp.), 박테로이드종 (Bacteroides sp.), 클렙스엘라종(Klebsiella sp.), 가스트로필리륨종(Gastraspirillum sp,), 엔테로박터종(Enterobacter sp.), 살모넬라종 (Salmonella sp.), 쉬겔라종(Shigella sp.), 에어로모나스종(Aeromonas sp.), 비브리오종(Vibrio sp.), 클로스트리듐종(Clostridium sp.), 엔테로코커스종(Entrococcus sp.), 장출혈성 대장균(enterohemorrhagic Escherichia coli)에서 선택되며, 반응 조건이
    a) 0.05% 내지 3% 담즙 또는 0.025% 내지 0.6% 하나 이상의 담즙산 또는 이의 염;
    b) 30℃ 내지 42℃ 사이의 온도;
    c) ⅰ) 5% 내지 20% CO2, 80% 내지 95% 공기;
    ⅱ) 5% 내지 20% O2, 80% 내지 95% N2; 또는
    ⅲ) 5% 내지 10% O2, 10% 내지 20% CO2, 70% 내지 85% N2로 구성된 미호기성 조건 또는 대기;
    d) 0 내지 100μM BAPTA/AM, 0 내지 10mM EGTA, 0 내지 100μM EGTA/AM에서 선택된 2가 양이온 킬레이트로 구성된 복합조건하에서 장내세균을 시험관에서 배양시키고, 상기 배양물은 초기 로그상태, 초기 로그상과 정체상 사이에 또는 정체상태의 생장 상태가 되고, 장내 세균의 항원성은 뇌-심장 주입액 브로스(BHI), Luris 브로스, 양의 혈액 한천배지, Brucella 브로스, Mueller-Hinton 브로스, 프로페오스 펩톤 비프 추출물 브로스에서 선택한 통상 배지에서 생장시킨 세균 배양물의 균항원성 성질과 비교하였을 때, 사람의 내장 상피 세포를 이용한 세포 흡착 검사 또는 Congo red 염료 결합 평가에서 면역원성 항원 수준이 더 높거나 새로운 면역원성 항원을 가지는 것을 특징으로 하는 장내 세균을 생산하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 쉬겔라 디센타리에(Shigella dysentariae) 또는 쉬겔라 플렉네리(Shigella flexneri) 배양물을 생장시키는 것으로 구성된 항원성이 강화된 쉬겔라(Shigella)을 생산하는 방법에 있어서,
    a) 0.1% 데옥시콜레이트 또는 0.8% 담즙이 보충된 BHI 배지;
    b) 온도는 37℃;
    c) 대기 조건하에서 배양시키고, 상기 배양물은 초기 로그 상태가 되고, 생산된 쉬겔라(Shigella)는 통상의 BHI 배지에서 생장한 쉬겔라(Shigella)의 항원성 성질과 비교하였을 때, 더 높은 수준의 면역원성 항원을 가지거나 새로운 면역원성 항원을 가지는 것을 특징으로 하는 항원성이 강화된 쉬겔라(Shigella)를 생산하는 방법.
  4. 제 1 항 또는 2항에 있어서, 담즙염은 데옥시콜레이트 또는 글리코콜레이트로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 4 항에 있어서, 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni)는 134, 195, 170, 81-176, 6, 81-116, 35, 52, VC-167, 88, 244, 544, 699, 1180, 910, HC에서 선택된 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni)인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 2 항에 있어서, 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni)는 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni)균쥬 81-176이고
    a) 데옥시콜레이트 담즙염이 0.01% 또는 담즙이 0.8%;
    b) 온도는 37℃;
    c) 10% 내지 20% CO2, 80% 내지 90% 공기로 구성된 조건하에서 배양물은 정체상태가 되도록 배양시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 3 항에 있어서, 장내 세균은 플렉네리(flexneri), 소나이(sonnei), 디센타리에(dysentariae), 보이디(boydii)에서 선택된 쉬겔라종(Shigella sp.)인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 7 항에 있어서, 쉬겔라종(Shigella)은 쉬겔라 플렉네리(Shigella flexneri)는 또는 쉬겔라 디센타리에(Shigella dysentariae)이고, 배양 조건은 a) 0.1% 데옥시콜레이트 또는 0.8% 담즙;
    b) 온도는 37℃;
    c) 대기 상태가 되고;
    배양물은 초기 로그상이 되도록 배양하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 장내 세균은 에르시니아 종(Yersinia sp)인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 장내 세균은 비브리오종(Vibrio sp.)인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 장내 세균은 살모넬라종(Salmonella sp.)인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 장내 세균은 박테로이드종 (Bacteroides sp.)인 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 장내 세균은 클로스트리듐종(Clostridium sp.)인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 장내 세균은 엔테로코커스종(Enterococcus sp.)인 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 장내 세균은 클렙스엘라종(Klebsiella sp.)인 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 장내 세균은 엔테로박터종 (Enterobacter sp.)인 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 장내 세균은 가스트로스피릴륨종(Gastrospirillum sp.)인 것을 특징으로 하는 방법.
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