JP3394047B2 - 増強された抗原性腸内細菌の作出方法およびそれを含むワクチン - Google Patents

増強された抗原性腸内細菌の作出方法およびそれを含むワクチン

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Description

【発明の詳細な説明】 本出願は、1994年10月５日付けの係属中の米国特許出
願第08/318,409号の一部継続出願である。
1.発明の分野 本発明は、一般的には、腸内細菌の抗原および／また
は毒力因子（virulencefoctor）の発現を誘導または増
強することによって抗原的に増強された腸内細菌を作出
するin vitro方法、抗原的に増強された腸内細菌を用い
る方法、ならびに抗原的に増強された腸内細菌を含有す
るワクチンに関する。
2.発明の背景 従来の培地と条件を使ってin vitroで培養した細菌
は、その天然の棲息場所（動物宿主内の正常な微生物相
または病原体のin vivo棲息を含む）での成長中に発現
される特性とは異なる特性を発現することが広く認めら
れている。したがって、このようにin vitroで成長させ
た病原性細菌はワクチン成分として使用するには好適で
ないかもしれない。しかし、毒力因子、問題となる生理
学的特性、または外表面抗原を含めた抗原の発現を誘導
または増強する条件を規定することが可能であれば、重
要な生産物や治療剤（例えば、ワクチン用の新抗原、抗
生物質用の新標的、および診断に応用できる新規な細菌
の特性）がすみやかに同定されるだろう。
細菌の毒力決定因子の発現に影響を与える環境要因が
いくつか確認されている（Mekalanos,J.J.,J.Bacterio
l.174:1−7,1992）。例えば、鉄と細菌の毒力との関係
を研究する歴史は長く、特に、Shigella（赤痢菌）（Pa
yne,Mol.MicroBiol.,3:1301−1306,1989）、Neisseria
（ナイセリア）（Payne and Finkelstein,J.Clin.Micro
biol.,6:293−297,1977）およびPasteurella（パスツレ
ラ菌）（Gilmourら,Vaccine,9:137−140,1991）に関し
て研究されている。
植物と動物のさまざまな細菌の同調調節される毒力決
定因子の発現をコントロールすることが判明した他の環
境シグナルとして、フェノール性化合物、単糖、アミノ
酸、温度、容量オスモル濃度、その他のイオン類がある
（Mekalanos,J.Bacteriol.,174:1−7,1992）。
腸から（すなわち、経口的に）動物宿主に侵入する病
原菌は、細菌の生理や毒力因子の発現に影響を及ぼしう
る数多くの宿主環境成分および条件に出くわす。こうし
た成分および条件には、胆汁、胆汁酸またはその塩、胃
pH、微好気性条件（腸内は高CO2で低O2である）、容量
オスモル濃度、そしてまだ確定されていない多くの他の
要因が含まれる。侵襲性の腸内病原菌は内在化を行うた
めにde novoタンパク質合成を必要とする（Headley and
Payne,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:4179−4183,199
0）。それゆえ、細菌はin vitroでは通常存在しないあ
る種の環境シグナルに応答するときだけこれらの侵入因
子を最適に生産しうる。この仮説は、従来の方法で成長
させたC.jejuniに特異的な抗血清がin vitro内在化を阻
止するのに不十分な効果しか発揮しないという報告によ
り支持される（Konkelら,J.Infect.Dis.,168:948−954,
1993）。しかし、侵入を増強する条件である上皮細胞の
単層の存在下で成長させたCampylobacter（カンピロバ
クター菌）の抽出物でウサギを免疫すると、結果的にこ
の細菌の内在化を顕著に阻害する抗血清が産生された。
問題となる毒力因子を同定するために、研究者らは腸
内環境のもとでの細菌の成長を研究してきた。例えば、
ウサギの回腸ループ内で成長させたCampylobacter 81−
176株は、通常の実験室のin vitro培養条件下では発現
しなかったタンパク質を発現する（Panigrahiら,Infec
t.Immun.,60:4938−4944,1992）。INT 407細胞の単層と
ともに培養したCampylobacterでは、上皮細胞の不在下
で培養した該細菌と比べて、タンパク質の新たな合成ま
たは増強された合成が見られた（Konkelら,J.Infect.Di
s.,168:948−954,1993）。さらに、こうした変化はC.je
juniの侵襲力増加とも一時的に関連していた。C.jejuni
の無毒性株においては、その他の変化、例えば細胞の形
態、鞭毛の消失、新しい外膜タンパク質の発現、細胞表
面の炭水化物の変化などが、ニワトリの胚に静脈内およ
び漿尿膜通過させるとき、誘導または増強された（Fiel
dら,J.Med.Microbiol.,38:293−300,1993）。
胆汁酸やその塩のような他の腸内成分は一部の細菌に
とって抑制的であることが知られているが、胆汁酸は細
菌による毒力発現に影響を与えることによって別の役割
を果たしているのかもしれない。
PopeとPayne（93rd Am.Soc.Microbiol.,B−147,199
3）は、ケノデオキシコール酸ナトリウムを含有する培
地で成長させたShigella flexneri（フレクスナー赤痢
菌）が３〜５倍高いHeLa細胞単層への感染力を示したと
報告した。しかし、彼らは、他の胆汁塩や界面活性剤、
例えばコール酸塩、グルココール酸塩、タウロデオキシ
コール酸塩、CHAPS系列、ジギトニン、トリトンX100お
よびそのナトリウム塩などはS.flexneriの侵襲力に全く
影響を及ぼさなかったと報告した。その上、ケノデオキ
シコール酸塩を含有する彼らの培地はE.coliや他のShig
ellaの無毒性株の侵襲力に対して何も影響を及ぼさなか
った。
S.flexneriの新タンパク質の合成はまた、増殖培地の
pH、温度およびイオン組成を変えることによっても誘導
される（Mekalanos,J.Bacteriol.174:1−7,1992）。
1993年11月11日に公開されたPCT出願公開番号WO 93/2
2423には、ホスファチジルセリンのような脂質または粘
液の存在下で細菌を増殖させる方法、およびホスファチ
ジルセリンの存在下で増殖させることにより発現が高め
られたタンパク質を単離する方法が記載されている。こ
の文献は増強された毒力または抗原特性を有する腸内細
菌を作出するという本発明の方法を開示も示唆もしてい
ない。
CampylobacterやShigellaなどの多くの腸内病原菌に
対するワクチンは今のところ入手不能であるが、これら
の病原菌の疫学によれば、こうしたワクチンが重要な目
標となる。細菌性赤痢は世界中に広がっている風土病で
あり、開発途上国では毎年下痢により死亡する500万人
の子供の約10％を占めている。Campylobacterな、つい
最近腸内病原菌であると同定されたものであるが、今で
は開発途上国と低開発国の両方において下痢疾患の主要
な原因の一つであると理解されている。Campylobacter
による下痢は毎年概算で４〜５億の症例が発症してお
り、200万以上の症例が米国で発生している。
細菌性赤痢は結腸粘膜の細菌侵襲の結果である。この
侵襲はすべての侵襲性分離株に見られるプラスミドの存
在と関連している（Sansonettiら,Infect.Immun.,35:85
2−860,1982）。このプラスミドの断片は侵入プラスミ
ド抗原（Ipa）遺伝子のIpa A,−B,−Ｃおよび−Ｄを含
んでいる。Ipa B,−Ｃおよび−Ｄタンパク質は侵入過程
において不可欠である（Baudryら,J.Gen.Microbiol.,13
3:3403−3413,1987）。
Ipaタンパク質は論理にかなったワクチン候補である
が、その防御効果は明確には確立されていない。Ipa B
とIpa Cは免疫優性タンパク質である（Haleら,Infect.I
mmun.,50:620−629,1985）。さらに、62kDaのIpa Bタン
パク質（細胞侵入を開始させ、膜結合ファゴサイト液胞
の溶解において機能するインベーシン（Highら,EMBO
J.,11:1991−1999,1992）は、Shigella菌種の間で高度
に保存されている。Shigella Ipaに対する重要な粘膜抗
体を持ち合わせていない発育不良の子供たちに観察され
た長期の病気は、Ipaに対する粘膜抗体の存在が感染の
広がりや重症度を制限しうることを示唆している。
Shigellaの多数のワクチン候補がヒトと動物において
試験されたが、成功したものはまだ存在しない。毒力に
おけるIpaタンパク質の潜在的重要性にもかかわらず、
細菌性赤痢に対して開発された大部分のワクチン候補は
血清型特異的決定基をもっているリポ多糖抗原に基づく
ものである。非経口的に投与される多糖−タンパク質複
合ワクチンも開発されたが、これはまだ動物において有
意な防御を示していない（Robbonsら,Rev.Inf.Dis.,13:
S362−365,1991）。同様に投与されるリボソームワクチ
ンは粘膜免疫を引き出すが、その防御効力はまだ証明さ
れずに残っている（Levensonら,Arch.Allergy Appl.Imm
unol.,87:25−31,1988）。
Campylobacter感染の病因はShigella感染ほどにはよ
く理解されていない。in vitro細胞侵入研究（Konkel
ら,J.Infect.Dis.,168:948−954,1993）および組織病理
学的検査（Russellら,J.Infect.Dis.,168:210−215,199
3）から、結腸への侵入も重要であることが提唱され
た。この結論は、Campylobacterにより引き起こされる
下痢が重症であり、血便を伴うという観察と一致する。
これらの作用は免疫優性の62kDaのフラジェリンタンパ
ク質と関係があるらしい。最近の報告から、Campylobac
terが分極した上皮細胞単層を通過するには鞭毛の存在
が不可欠であることがわかった（Grantら,Infect.Immu
n.,61:1764−1771,1993）。
特定のCampylobacter抗原はどれも防御抗原として確
立されていない。しかし、低分子量（28〜31kDa）タン
パク質、つまりPEBタンパク質、および免疫優性鞭毛タ
ンパク質はこれに関して有望であると考えられる（Pavl
ovskisら,Infect.Immun.,59:2259−2264,1992;Blaser a
nd Gotschilch,J.Bio.Chem.,265:14529−14535,199
0）。鞭毛タンパク質の重要性は腸のコロニー形成およ
びLiorサブグループ内の感染に対する交差菌株防御との
関連により示される（Pavlovskisら,Infect.Immun.,59:
2259−2264,1992）。しかしながら、鞭毛タンパク質を
ベースとするCampylobacterワクチンは、８−10の最も
臨床的に関係のあるLior血清グループに由来する鞭毛タ
ンパク質抗原を含む必要があるかもしれない。
したがって、本発明の対象は、１）侵入活性および／
またはある種の細胞特性（細胞表面特性を含む）を最適
に誘導または増強する、腸内細菌を培養または処理する
ためのin vitro培養条件;2）相互に関連のある改変され
た侵入性または細胞特性（抗原プロフィールの変化を伴
う表面特性を含む）;3）小動物モデルにおけるこれらの
微生物の増大した毒力；および４）従来の方法で成長さ
せた細菌に対する抗血清よりもin vitroまたはin vivo
チャレンジに用いた生存微生物を中和するのに有効であ
る、侵入性を増強したまたは特性（表面特性を含む）を
改変した微生物に対する抗血清；を包含する。本発明は
これらのおよび他のニーズに対処するものである。
上述した文献はどれも本発明のin vitro方法と抗原的
に増強された腸内細菌を含有する本発明のワクチンを教
示も示唆もしていない。本節または本明細書の他の節で
引用した文献は、かかる文献が本発明に対する先行技術
として利用可能であることを示すものと解釈されるべき
でない。
3.発明の概要 本発明は、毒力因子およびその他の抗原の存在を誘導
または増強するための、腸内細菌の増殖培地に組み入れ
る成分および規定された培養条件を提供する。好ましく
は、こうした抗原は免疫原性がある。より好ましくは、
免疫原性のある抗原は毒力指数と関係がある。
腸内細菌は該細菌が自然界でさらされるいくつかのin
vivo状態を模倣する状態および成分の存在下で成長さ
せる。本発明の方法は、細胞あたりの総タンパク質量の
増加、新タンパク質または増加した個々のタンパク質、
表面炭水化物の変化または増加、表面リポ多糖の変化、
付着力の増加、侵入力の増加および／または細胞内遊走
（swarming）の増加といった表現型の変化を伴う、抗原
的に増強された腸内細胞をもたらす。さらに、本発明の
方法は商業的使用のために実際的なスケールアップ発酵
に適応させることができる。
前記の抗原的に増強された腸内細菌は、不活化全細胞
ワクチンやサブユニットワクチンのような防御ワクチン
をつくるために、抗体の産生や病原性腸内細菌の検出と
いった診断目的に、または抗生物質の生産に用いること
ができる。さらに、本発明の増強された腸内細菌により
誘導された抗体は受身ワクチンとして使用することがで
きる。
したがって、本発明の目的は、増強された抗原特性を
有するCampylobacter sp.（カンピロバクターsp.）、Ye
rsinia sp.（エルシニアsp.）、Helicobacter sp.（ヘ
リコバクターsp.）、Gastrospirillum sp.（ガストロス
ピリラムsp.）、Bacteroides sp.（バクテロイデスs
p.）、Klebsiella sp.（クレブシェラsp.）、Enterobac
ter sp.（エンテロバクターsp.）、Salmonella sp.（サ
ルモネラsp.）、Shigella sp.（シゲラsp.）、Aeromona
s sp.（アエロモナスsp.）、Vibrio sp.（ビブリオs
p.）、Clostridium sp.（クロストリジウムsp.）、Ente
rococcus sp.（エンテロコッカスsp.）およびEscherich
ia coli（エシェリキア・コリ）より成る群から選ばれ
る腸内細菌の作出方法であって、該方法は、腸内細菌
を、ａ）0.05〜３％の胆汁または0.025〜0.6％の１以上
の胆汁酸もしくはその塩、30〜42℃の温度で、早期対数
増殖期付近、早期対数期と定常期の間、または定常期付
近の成長相まで、空気中または微好気性条件下（例えば
５〜20％CO2と80〜95％空気、５〜20％CO2と80〜95％
N2）、または５〜10％O2と10〜20％CO2と70〜85％N
2で、場合により２価カチオンキレート剤（例えば、限
定するものではないが、０〜100μＭ、好ましくは25μ
ＭのBAPTA/AM、０〜10mMのEGTA、および０〜100μＭのE
GTA/AM）の存在下で；またはｂ）２価カチオンキレート
剤（例えば、1.0〜100μＭ、好ましくは25μＭのBAPTA/
AM、0.5〜10mMのEGTA、および１〜100μＭのEGTA/AM）
の存在下、および胆汁、胆汁酸または胆汁塩の非存在下
で行うことを除いてａ）と同じ条件；を含む組合せ条件
を用いてin vitroで成長させることを含んでなる。
本発明によれば、各胆汁酸またはその塩の濃度は0.02
5〜0.6％、好ましくは0.05〜0.5％、より好ましくは0.0
5〜0.2％であり、0.05％または0.1％が最適である。胆
汁酸またはその塩がデオキシコール酸（塩）またはグリ
ココール酸（塩）を含む方法が好適である。
本発明の更なる目的は、増強された抗原特性を引き出
すために、ａ）0.05〜３％の胆汁または0.025〜0.6％の
１以上の胆汁酸もしくはその塩、30〜42℃の温度で、早
期対数増殖期付近、早期対数期と定常期の間、または定
常期付近の成長相まで、空気中または微好気性条件下
（例えば５〜20％CO2と80〜95％空気、５〜20％CO2と80
〜95％N2、または５〜10％O2と10〜20％CO2と70〜85％N
2）で、場合により２価カチオンキレート剤（例えば、
限定するものではないが、０〜100μＭ、好ましくは25
μＭのBAPTA/AM、０〜10mMのEGTA、および０〜100μＭ
のEGTA/AM）の存在下で；またはｂ）２価カチオンキレ
ート剤（例えば、1.0〜100μＭ、好ましくは25μＭのBA
PTA/AM、0.5〜10mMのEGTA、および１〜100μＭのEGTA/A
M）の存在下、および胆汁、胆汁酸または胆汁塩の非存
在下で行うことを除いてａ）と同じ条件；を含む組合せ
条件のもとでin vitroで成長させてなる、Campylobacte
r sp.（カンピロバクターsp.）、Yersinia sp.（エルシ
ニアsp.）、Helicobacter sp.（ヘリコバクターsp.）、
Gastrospirillum sp.（ガストロスピリラムsp.）、Bact
eroides sp.（バクテロイデスsp.）、Klebsiella sp.
（クレブシェラsp.）、Enterobacter sp.（エンテロバ
クターsp.）、Salmonella sp.（サルモネラsp.）、Shig
ella sp.（シゲラsp.）、Aeromonas sp.（アエロモナス
sp.）、Vibrio sp.（ビブリオsp.）、Clostridium sp.
（クロストリジウムsp.）、Enterococcus sp.（エンテ
ロコッカスsp.）およびEscherichia coli（エシェリキ
ア・コリ）より成る群から選ばれる腸内細菌である。
本発明の別の目的は、増強された抗原特性を有するCa
mpylobacter sp.（カンピロバクターsp.）、Yersinia s
p.（エルシニアsp.）、Helicobacter sp.（ヘリコバク
ターsp.）、Gastrospirillum sp.（ガストロスピリラム
sp.）、Bacteroides sp.（バクテロイデスsp.）、Klebs
iella sp.（クレブシェラsp.）、Enterobacter sp.（エ
ンテロバクターsp.）、Salmonella sp.（サルモネラs
p.）、Shigella sp.（シゲラsp.）、Aeromonas sp.（ア
エロモナスsp.）、Vibrio sp.（ビブリオsp.）、Clostr
idium sp.（クロストリジウムsp.）、Enterococcus sp.
（エンテロコッカスsp.）およびEscherichia coli（エ
シェリキア・コリ）より成る群から選ばれる完全な腸内
細菌もしくはその構成成分、またはその免疫原性断片も
しくは誘導体、および場合により製薬学的に許容される
担体または希釈剤、を含有するワクチンである。
不活化された抗原的に増強された腸内細菌を含有する
ワクチンが好適である。本発明の更なる目的は、アジュ
バントをさらに含むワクチンである。
本発明の更なる目的は、本発明の腸内細菌の少なくと
も１つの抗原決定基に特異的に結合することができる抗
体（抗血清、精製IgGまたはIgA抗体、Fab断片などを含
むが、これらに限らない）に向けられる。このようなポ
リクローナルおよびモノクローナル抗体は、動物または
動物由来の生物学的サンプル中に存在する腸内細菌を検
出するためのイムノアッセイ試薬として有用である。ま
た、本発明のポリクローナルおよびモノクローナル抗体
は、腸内細菌による感染および疾病の防衛に用いる受身
ワクチンとしても有用である。
本発明の更なる目的は、Campylobacter sp.（カンピ
ロバクターsp.）、Yersinia sp.（エルシニアsp.）、He
licobacter sp.（ヘリコバクターsp.）、Gastrospirill
um sp.（ガストロスピリラムsp.）、Bacteroides sp.
（バクテロイデスsp.）、Klebsiella sp.（クレブシェ
ラsp.）、Enterobacter sp.（エンテロバクターsp.）、
Salmonella sp.（サルモネラsp.）、Shigella sp.（シ
ゲラsp.）、Aeromonas sp.（アエロモナスsp.）、Vibri
o sp.（ビブリオsp.）、Clostridium sp.（クロストリ
ジウムsp.）、Enterococcus sp.（エンテロコッカスs
p.）およびEscherichia coli（エシェリキア・コリ）よ
り成る群から選ばれる、増強された抗原特性を有する腸
内細菌を潜在的な抗菌剤と接触させ、殺菌または静菌効
果を調べる工程を含んでなる、潜在的な抗菌剤のin vit
roアッセイ法である。
本発明のさらに他の目的は、宿主由来の生物学的サン
プルを、Campylobacter sp.（カンピロバクターsp.）、
Yersinia sp.（エルシニアsp.）、Helicobacter sp.
（ヘリコバクターsp.）、Gastrospirillum sp.（ガスト
ロスピリラムsp.）、Bacteroides sp.（バクテロイデス
sp.）、Klebsiella sp.（クレブシェラsp.）、Enteroba
cter sp.（エンテロバクターsp.）、Salmonella sp.
（サルモネラsp.）、Shigella sp.（シゲラsp.）、Aero
monas sp.（アエロモナスsp.）、Vibrio sp.（ビブリオ
sp.）、Clostridium sp.（クロストリジウムsp.）、Ent
erococcus sp.（エンテロコッカスsp.）およびEscheric
hia coli（エシェリキア・コリ）より成る群から選ばれ
る、増強された抗原特性を有する本発明の腸内細菌、そ
の抗原またはそれに対する抗体と接触させ、抗体：抗原
相互作用をスクリーニングする工程を含んでなる、宿主
の抗体産生を検出するための、または動物もしくは動物
由来の生物学的サンプル中の腸内細菌を検出するための
in vitro法である。
本発明の別の目的は、Campylobacter sp.（カンピロ
バクターsp.）、Yersinia sp.（エルシニアsp.）、Heli
cobacter sp.（ヘリコバクターsp.）、Gastrospirillum
sp.（ガストロスピリラムsp.）、Bacteroides sp.（バ
クテロイデスsp.）、Klebsiella sp.（クレブシェラs
p.）、Enterobacter sp.（エンテロバクターsp.）、Sal
monela sp.（サルモネラsp.）、Shigella sp.（シゲラs
p.）、Aeromonas sp.（アエロモナスsp.）、Vibrio sp.
（ビブリオsp.）、Clostridium sp.（クロストリジウム
sp.）、Enterococcus sp.（エンテロコッカスsp.）およ
びEscherichia coli（エシェリキア・コリ）より成る群
から選ばれる、増強された抗原特性を有する腸内細菌ま
たはそれに対する抗体、および他の全ての必須キット成
分を含んでなる、腸内細菌に対する宿主の抗体産生を検
出するための、または腸内細菌を検出するための診断用
キットに関する。
本発明の種々の面で関係する好適な腸内細菌は、Camp
ylobacter jejuni（カンピロバクター・ジェジュニ）、
Campylobacter coli（カンピロバクター・コリ）、Yers
inia enterocolitica（エルシニア・エンテロコリチ
カ）、Yersinia pestis（ペスト菌）、Yersinia pseudo
tuberculosis（偽結核エルシニア菌）、Escherichia co
li（エシェリキア・コリ）、Shigella flexneri（フレ
クスナー赤痢菌）、Shigella sonnei（ソネ赤痢菌）、S
higella dysenteriae（志賀赤痢菌）、Shigella boydii
（ボイド赤痢菌）、Helicobacter pylori（ヘリコバク
ター・ピロリ）、Helicobacter felis（ヘリコバクター
・フェリス）、Gastrospirillum hominus（ガストロス
ピリラム・ホミヌス）、Vibrio cholerae（コレラ
菌）、Vibrio parahaemolyticus（ビブリオ・パラヘモ
リチクス）、Vibrio vulnificus（ビブリオ・バルニフ
ィクス）、Bacteroides fragilis（バクテロイデス・フ
ラギリス）、Clostridium difficile（クロストリジウ
ム・ディフィシル）、Salmonella typhimurium（ネズミ
チフス菌）、salmonella typhi（チフス菌）、Salmonel
la gallinarum（トリチフス菌）、Salmonella pullorum
（サルモネラ・プロラム）、Salmonella choleraesuis
（豚コレラ菌）、Salmonella enteritidis（腸炎菌）、
Klebsiella pneumoniae（肺炎杆菌）、Enterobacter cl
oacae（エンテロバクター・クロアカ）、およびEnteroc
occus faecalis（エンテロコッカス・フェーカリス）で
ある。好適なEscherichia coli（エシェリキア・コリ）
としては腸管毒性株、腸管出血性株、腸管侵入性株、腸
管病原性株、または他の菌株があり、これらに限らな
い。
本発明は、一部には、本発明の抗原的に増強された腸
内細菌が、従来の培養条件を用いて成長させた同じ腸内
細菌により誘導される免疫応答よりも、同一細菌種のよ
り広範囲の菌株または血清型に対して交差防御的な免疫
応答を誘導するという驚くべき発見に基づいている。少
なくとも一例において、本発明の抗原的に増強された腸
内細菌により誘導された免疫応答は、腸内細菌の異なる
種に対して交差防御的である。
4.図面の簡単な説明 図1A、1Bおよび1Cは、C.jejuni 81−176の表面抽出物
の加水分解産物からの単糖類の高速液体クロマトグラフ
ィーの結果をグラフにより示す。図1A:標準品：フコー
ス“Fuc"、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン“GalNac"、
Ｎ−アセチル−グルコサミン“GlcNac"、ガラクトース
“Gal"、グルコース“Glc"、マンノース“Man"。図1B:
従来の方法で成長させた細菌の表面抽出物“BHI"。図1
C:本発明の方法で成長させた細菌の表面抽出物“DOC"。
図２は、従来の方法“BHI"で成長させた、または本発
明の方法（0.8％Oxgall胆汁酸“OX"または0.1％デオキ
シコール酸塩“DOC"）で成長させたC.jejuni 81−176の
全細胞（カラム１、２および３）または表面抽出物（カ
ラム５および６）のタンパク質の比較を示すドデシル硫
酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS
−PAGE）の結果である。
図３は、C.jejuni 81−176の全細胞を感染させること
により産生されたフェレットIgA含有粘液により結合さ
れたタンパク質の比較を示すウエスタンブロット分析の
結果である。従来の方法で成長させたC.jejuni 81−176
の全細胞“1";または本発明の方法で成長させたC.jejun
i 81−176の全細胞:0.8％Oxgall胆汁酸“2"または0.1％
デオキシコール酸塩“3";または従来の方法で成長させ
たC.jejuni 81−176の表面抽出物“4";本発明の方法
（0.1％デオキシコール酸塩）で成長させたC.jejuni 81
−176の表面抽出物“5"。
図４は、本発明の方法で成長させた“3"、従来の方法
で成長させた“2"、または本発明の方法により発酵槽内
で成長させた“1"C.jejuni 81−176の全細胞由来のフラ
ジェリン特異的モノクローナル抗体により結合されたタ
ンパク質の比較を示すウエスタンブロット分析の結果で
ある。
図５は、従来の方法で成長させた（カラム“1"）、ま
たは本発明の方法（0.1％デオキシコール酸塩）で成長
させた（カラム“2"）S.flexneri 2457Tの全細胞のリポ
多糖類（LPS）の比較を示すSDS−PAGEの結果である。
図６は、本発明の方法で成長させたC.jejuni 81−176
の免疫交差反応性の増強をグラフにより示す。従来の方
法で、または実施例５に示すように本発明の方法（DO
C）で成長させたC.jejuni 81−176細胞を用いて抗体を
誘導した。種々のC.jejuni血清型に対する２種類の抗体
（すなわち、BHIで培養したときの抗C.jejuni 81−176
およびDOCで培養したときの抗C.jejuni 81−176）の凝
集活性を示す。詳細については第９節の実施例32を参照
のこと。
図7A、7Bおよび7Cは、C.jejuni 81−176生存細胞の鼻
腔内投与チャレンジからマウスを防御する場合の不活化
C.jejuni 81−176全細胞含有ワクチンの効力をグラフに
より示す。リン酸緩衝溶液（PBS;実線）、PBS＋LTアジ
ュバント（アジュバント；破線）、実施例５にしたがっ
て成長させ回収したアジュバント不含有（CWC;白丸／実
線）またはLTアジュバント含有（CWC＋アジュバット；
黒丸／実線）のホルマリン不活化C.jejuni 81−176全細
胞をマウスに接種した。ワクチンの効力は腸管定着アッ
セイを用いて試験した。図7A（上のパネル）は、１回に
つき105個の不活化細菌粒子を３回経口接種することに
より付与された防御の結果を示す。図7B（中のパネル）
は、１回につき107個の不活化細菌粒子を３回経口接種
することにより付与された防御の結果を示す。図7C（下
のパネル）は、１回につき109個の不活化細菌粒子を３
回経口接種することにより付与された防御の結果を示
す。詳細については第11節の実施例34を参照のこと。
図8A、8Bおよび8Cは、C.jejuni 81−176生存細胞の経
口投与チャレンジからマウスを防御する場合の不活化C.
jejuni 81−176全細胞含有ワクチンの効力をグラフによ
り示す。図7A、7Bおよび7Cの簡単な説明に記載したとお
りにマウスにワクチンを接種した。ワクチンの効力は腸
管定着アッセイを用いて試験した。図8A（上のパネル）
は、１回につき105個の不活化細菌粒子を３回経口接種
することにより付与された防御の結果を示す。図8B（中
のパネル）は、１回につき107個の不活化細菌粒子を３
回経口接種することにより付与された防御の結果を示
す。図8C（下のパネル）は、１回につき109個の不活化
細菌粒子を３回経口接種することにより付与された結果
を示す。実験の詳細については第９節の実施例34を参照
のこと。
図９は、Shigella flexneri 2457T細胞の侵入性に及
ぼすShigella flexneri培養物の成長相の影響をグラフ
により示す。Shigella flexneri 2457T細胞は従来の方
法（BHI）、または実施例９に示した本発明の方法（DOC
−EL）（培養物が早期対数期にあるとき細胞を収穫す
る）、または実施例９に従うが培養物を後期対数期に至
らせた後に細胞を収穫する方法（DOC−LL）で成長させ
た。これらの異なる細胞調製物の侵入性を示す。詳細に
ついては第12節の実施例35を参照のこと。
図10は、Shigella細胞を本発明の方法を用いて培養し
たときの該細胞の侵入性の増強をグラフにより示す。S.
sonneiとS.dysenteriae 3818を従来の方法（BHI）、ま
たは実施例９に示した本発明の方法により培養した。IN
T−407細胞に対するこれらの異なるShigella細胞調製物
の侵入性を示す。詳細については第12節の実施例35を参
照のこと。
図11は、本発明の方法にしたがって成長させたShigel
laの免疫交差反応性の増強をグラフにより示す。実施例
９に示した本発明の方法により成長させたS.flexneri 2
457Tを用いて抗体を誘導した。従来の方法（BHI）、ま
たは実施例９に示した本発明の方法により成長させたS.
flexneri、S.sonnei、S.dysenteriaeおよびS.boydiiに
対する誘導抗体の凝集活性を示す。詳細については第12
節の実施例36を参照のこと。
図12は、Helicobacter pylori NB3−２細胞の付着性
に及ぼす胆汁濃度およびHelicobacter pylori培養物の
成長相の影響をグラフにより示す。０％、0.025％、0.0
5％または0.1％の胆汁を含む培地でH.pylori NB3−２細
胞を成長させ、接種の８、10、12および18時間後に収穫
した。H.pylori NB3−２細胞のこれらの異なる調製物の
INT−407細胞に対する侵入を示す。詳細については第14
節の実施例38を参照のこと。
図13は、Helicobacter pylori G1−４細胞の付着性に
及ぼす胆汁濃度およびHelicobacter pylori培養物の成
長相の影響をグラフにより示す。０％、0.1％または0.2
％の胆汁を含む培地でH.pylori G1−４細胞を成長さ
せ、接種の６、８、10、12、14および16時間後に収穫し
た。H.pylori G1−４細胞のこれらの異なる調製物のINT
−407細胞に対する侵入を示す。詳細については第15節
の実施例38を参照のこと。
5.発明の詳細な説明 本発明の方法は、抗原および／または毒力因子の発現
を誘導または増強するために選択された、ある種の条件
とある種の成分との組合せの存在下で腸内細菌をin vit
roで成長させることに関する。
本明細書および請求の範囲で用いる「腸内」とは、動
物の胃腸管のいずれかの部分に常在するかまたはそれと
関連している細菌、および動物の胃腸管のいずれかの部
分において感染を引き起こす細菌を指す。このような腸
内細菌にはグラム陽性とグラム陰性の両方の細菌が含ま
れる。
本明細書および請求の範囲で用いる「成分」および
「条件」とは、腸内細菌の天然のin vivo環境およびそ
の他の要因と関連している多くの要因を指す。このよう
な成分および条件として、胆汁、胆汁酸またはその塩ま
たはコレステロールなどのその生物学的前駆物質、pH、
微好気性条件、容量オスモル濃度、所望の細菌成長相で
細菌を収穫または回収することなどがある。
本明細書および請求の範囲で用いる「抗原」とは、細
胞の形態または細胞の運動性に関与する巨大分子、タン
パク質、特に表面タンパク質、リポ多糖類および炭水化
物を含むがこれらに限らない抗原を指す。かかる抗原は
免疫原性があることが好ましい。
本明細書および請求の範囲で用いる「免疫原性」と
は、本発明により作出された全細菌または全細菌の断片
を含有する組成物に動物をさらした後に、該動物の体内
で抗体産生を誘導する能力のことである。
本明細書および請求の範囲で用いる「抗原的に増強さ
れた」または「増強された抗原特性」または「増強され
た」とは、本発明の方法にしたがって成長させた腸内細
菌の抗原状態をいう。このような細菌は、従来の方法を
用いて成長させた同一の細菌と比べて、より高いレベル
の特定の免疫原性抗原および／または新たな免疫原性抗
原を有する。
本明細書および請求の範囲で用いる「従来」とは、先
行技術において知られているものを指す。
本明細書および請求の範囲で用いる「微好気性条件」
とは、嫌気性条件または上昇したCO2濃度、例えば５〜2
0％CO2と80〜95％空気、５〜20％CO2と80〜95％N2、ま
たは５〜10％O2と10〜20％CO2と70〜85％N2を指す。
本明細書および請求の範囲で用いる「毒力」とは、宿
主に付着しかつ／または宿主内に侵入しかつ／または宿
主内で生存しかつ／または病理学的状態を引き起こす能
力と関連した腸内細菌の因子を指す。
本明細書および請求の範囲で用いる「免疫交差防御」
とは、ある細菌株または血清型（全細胞または他のも
の）により誘導された免疫応答が同一属の異なる細菌
性、血清型または種による同一宿主の感染を防止または
軽減できることを意味する。
本明細書および請求の範囲で用いる「免疫交差反応」
とは、ある細菌株または血清型（全細胞または他のも
の）により誘導された体液性免疫応答（すなわち、抗
体）が同一属の異なる細菌株、血清型または種と交差反
応（すなわち、抗体結合）することができることを意味
する。免疫交差反応性は細菌免疫原の免疫交差防御能力
を示しており、その逆もいえる。
本明細書および請求の範囲で用いる「宿主」とは、動
物におけるin vivoまたは動物細胞培養物におけるin vi
troのいずれかを指す。本明細書および請求の範囲で用
いる「動物」としては、哺乳類や鳥類（例えば、ニワト
リ、シチメンチョウ、アヒルなど）のような全ての温血
動物が含まれるが、これらに限らない。
本発明によると、抗原的に増強された腸内細菌または
その免疫原性断片もしくは誘導体を含有するワクチンに
おいて、腸内細菌は生きている細菌であっても不活化さ
れていてもよく、ミョウバン、油−水エマルジョン、毒
素原性大腸菌由来の熱不安定性トキシン（LT）、その非
毒性形態（例えば、mLT）および／またはその各サブユ
ニット、カルメット・ゲラン菌（BCG）、またはフロイ
ントアジュバントのようなアジュバントをさらに含むこ
とができ、また、生理食塩水、デキストロースまたは他
の水溶液を含むがこれらに限らない適当な製剤上の担体
をさらに含むことができる。他の適当な製剤上の担体は
この分野での標準的な参考書であるRemington's Pharma
ceutical Sciences,Mack Publishing Companyに記載さ
れている。本明細書および請求の範囲で用いる「ワクチ
ン」は、病原菌（その感染または疾病の防御が求められ
ている）と特異的に結合する抗体を含有する「受身ワク
チン」をも包含する。
本明細書および請求の範囲で用いる「不活化細菌」と
は、感染能および／または定着能のない腸内細菌のこと
であり、死滅した細菌ばかりでなく弱毒化されたものを
も含む。弱毒化細菌は複製しうるが、感染や疾病を引き
起こすことはない。細菌の不活化は当業者に知られたど
のような方法で行ってもよい。例えば、細菌を化学的に
（例えばホルマリン固定により）不活化することがで
き、また、物理的に（例えば熱処理、音波処理、照射に
より）不活化することもできる。こうして細菌は複製能
および／または感染能および／または病気を引き起こす
能力を失うこととなる。
有効量のワクチンが投与されるべきであり、ここで
「有効量」とは被験者において免疫応答を生じさせるこ
とができる腸内細菌またはその免疫原性断片もしくは誘
導体の量として定義される。必要とされる量は用いる細
菌、断片または誘導体の抗原性、並びにワクチンを接種
すべき被験者の種および体重により変化するであろう
が、標準的な手法を用いて確かめることができる。本発
明の好適な非限定的実施態様では、有効量のワクチンが
抗細菌抗体の抗体価をワクチン接種前の抗体価の少なく
とも２倍に上昇させる。本発明の好適な特定の非限定的
実施態様では、約107から1011の細菌、好ましくは108か
ら1010の細菌が宿主に投与される。不活化された全細菌
を含有するワクチンが好適である。
受身ワクチンに適用される「有効量」とは、細菌によ
る疾病または感染を防止または軽減することができる抗
体の量である。必要とされる量は抗体の種類および抗体
価、並びにワクチンを接種すべき被験者の種および体重
により変化するであろうが、標準的な手法を用いて確か
めることができる。
本発明のワクチンは、静脈内、皮下、筋肉内、膣内、
鼻腔内、経口または他の粘膜経路を含むがこれらに限ら
ない当技術分野で公知の方法により局所的におよび／ま
たは全身的に投与することができる。
ワクチンは適当な無毒性の製剤上の担体とともに投与
しても、マイクロカプセル内に保持させても、かつ／ま
たは持続放出インプラント内に保持させてもよい。
抗体レベルを維持するためにワクチンを間隔をおいて
数回投与することが望ましい。
本発明のワクチンは他の殺菌法または静菌法と併用す
ることができる。
本発明の抗体は、Antibodies A Laboratory Manual
（E.Harlow,D.Lane,Cold Spring Harbor Laboratory Pr
ess,1989）に記載の方法を含むがこれに限定されない、
当業者に公知の従来法により得られる。一般的には、動
物（広範囲の脊椎動物種を使用でき、通常はマウス、ラ
ット、モルモット、ハムスター、ウサギである）をアジ
ュバントまたは免疫原の有効性を増強しうる物質の非存
在下または存在下で本発明の抗原的に増強された腸内細
菌の全細胞または免疫原性断片もしくは誘導体により免
疫し、一定の間隔で追加免疫を施す。好適な方法で所望
の抗体の存在について動物の血清をアッセイする。この
動物の血清または血液をポリクローナル抗体の供給源と
して使用することができる。
モノクローナル抗体に関しては、動物を上記のように
処置する。許容できる抗体価が検出されたら、動物を安
楽死させ、融合のために脾臓を無菌的に摘出する。脾細
胞を特に選択された不死のミエローマ細胞系と混合し、
次に細胞の融合を促進する薬剤（典型的にはポリエチレ
ングリコールなど）にこの混合物をさらす。これらの状
況のもとではランダムな選択で融合が起こり、得られる
産物は各タイプの未融合細胞と融合細胞の混合物であ
る。用いるミエローマ細胞系は、HAT（ヒポキサンチ
ン、アミノプテリンおよびチミジン）のような選択培地
の使用により、融合混合物から培養下で生き残る細胞が
免疫したドナー由来の細胞とミエローマ細胞とのハイブ
リッド細胞だけになるように特別に選ばれる。融合後、
細胞を希釈して選択培地で培養する。所定の抗原に対し
て所望の特異性を有する抗体の存在について培地をスク
リーニングする。最適の抗体を含む培養物を、その細胞
培養物の起源が１個の細胞であることを提示できるよう
になるまで限界希釈法でクローニングする。本発明の抗
体は腸内細菌による感染および疾病に対する受身ワクチ
ンとして有用である。
宿主中の抗体または上記細菌の検出法としてはイムノ
アッセイがある。このようなイムノアッセイは当技術分
野で公知であり、例えばラジオイムノアッセイ（RI
A）、エンザイム結合イムノソルベントアッセイ（ELIS
A）、蛍光イムノアッセイおよび蛍光偏光イムノアッセ
イ（FPIA）が含まれるが、これらに限らない。
別の実施態様として、本発明にしたがって所望のイム
ノアッセイを行うために必要不可欠な試薬類をすべて含
んでなる診断用キットがある。この診断用キットは必要
な試薬類を保持する１以上の容器の組合せとして商業包
装形態で提供され得る。かかるキットは、本発明の腸内
細菌および／または本発明のモノクローナルもしくはポ
リクローナル抗体を、いくつかの通常のキット成分とと
もに含んでなる。通常のキット成分は当業者には明白で
あり、Antibodies A Laboratory Manual（E.Harlow,D.L
ane,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989）を含
めた多数の刊行物に記載されている。通常のキット成分
としては、例えばマイクロタイタープレート、アッセイ
混合物のpHを維持する緩衝液、例えばTris、HEPESな
ど、複合第二抗体、例えばペルオキシダーゼ結合抗マウ
スIgG（または第一抗体を誘導させた動物に対する抗Ig
G）、その他の標準試薬類といった品目がある。
本発明の方法は、腸内細菌を、適当な基礎必須培地
で、例えばブレインハートインフュージョン培地（BH
I）、ルリア培地（LB）、ヒツジ血液寒天（SBA）、ブル
セラ培地、ミュラー−ヒントン培地、プロテオースペプ
トンビーフ抽出物培地などで、種々の条件および成分を
用いて、例えば0.05〜３％の胆汁または0.025〜0.6％の
１以上の胆汁酸もしくはその塩またはコレステロールの
ようなその生物学的前駆物質、30〜42℃の温度で、早期
対数増殖期付近、早期対数期と定常期の間、または定常
期付近の成長相まで、空気中または微好気性条件下（例
えば５〜20％CO2と80〜95％空気、５〜20％CO2と80〜95
％N2、または５〜10％O2と10〜20％CO2と70〜85％N2）
で、場合により２価カチオンキレート剤、例えば、限定
するものではないが、０〜100μＭ、好ましくは25μＭ
のBAPTA/AM（2'（エチレンジオキシ）ジアニリンn,n,
n',n'−四酢酸／アセトキシメチルエステル;Molecular
Probes,Eugene,OR）、０〜10mMのEGTA（エチレンビス
（オキシエチレンニトリロ）−四酢酸;Sigma Chemical
Co.,St.Louis,MO）、または０〜100μＭのEGTA/AM（エ
チレンビス（オキシエチレンニトリロ）−四酢酸／アセ
トキシメチルエステル;Molecular Probes,Eugene,OR）
の存在下で成長させることを含む。こうした条件および
成分の組合せが抗原的に増強された腸内細菌を生み出
す。
別の実施態様によると、本発明の方法はまた、２価カ
チオンキレート剤、例えば、限定するものではないが、
1.0〜100μＭ、好ましくは25μＭのBAPTA/AM、0.5〜10m
MのEGTA、または1.0〜100μＭのEGTA/AMの存在下で、か
つ胆汁、胆汁酸または胆汁塩の非存在下で行うことを除
いて上記のように腸内細菌を成長させることを含む。
本発明にとって有用な胆汁、胆汁酸またはその塩とし
ては、肝臓から分泌されて通常は胆嚢で濃縮される天然
の胆汁化合物、当業者には公知の合成胆汁酸、例えば
“OXGALL"（Difco Laboratories,Detroit,Michigan）、
ウシ胆汁（Sigma Chemicals,St.Louis,Missouri）また
は他の市販されている調製物、コール酸、デオキシコー
ル酸、タウロコール酸およびグリココール酸がある。一
部の腸内細菌がコロニーを形成している遠位小腸および
大腸部位にin vivoで存在している、市販の胆汁酸であ
るデオキシコール酸（DOC）が好適である。グリココー
ル酸（GC）も好ましい。
本発明によると、Campylobacter sp.（カンピロバク
ターsp.）、Yersinia sp.（エルシニアsp.）、Helicoba
cter sp.（ヘリコバクターsp.）、Gastrospirillum sp.
（ガストロスピリラムsp.）、Bacteroides sp.（バクテ
ロイデスsp.）、Klebsiella sp.（クレブシェラsp.）、
Enterobacter sp.（エンテロバクターsp.）、Salmonela
sp.（サルモネラsp.）、Shigella sp.（シゲラsp.）、
Aeromonas sp.（アエロモナスsp.）、Vibrio sp.（ビブ
リオsp.）、Clostridium sp.（クロストリジウムs
p.）、Enterococcus sp.（エンテロコッカスsp.）およ
びEscherichia coli（エシェリキア・コリ）より成る群
から選ばれる腸内細菌培養物を当業者には公知の方法で
凍結ストックとして調製して、将来の使用のために−80
℃で維持することができる。例えば、Campylobacter je
juniのストックは、該微生物を、５％脱繊維素ヒツジ赤
血球を含むトリプチカーゼソイ寒天（SBA）上で５％
O2、10％CO2、85％N2（微好気性条件，“MC"）中37℃で
20時間成長させることにより調製できる。Escherichia
coli、Salmonella typhimurium、Helicobacter pylori
およびShigella flexneriのストックは、該微生物をブ
レインハートインフュージョン培地（BHI）中で成長さ
せることにより調製できる。凍結のために細菌を収穫す
るには公知の方法を使用し、例えば、培養物をスワブで
集めて取り出し、30％グリセロール含有BHI中に再験濁
する。分析実験用または生産発酵用の培養物を調製する
には、公知の方法で、例えば、微生物を1.5％寒天含有B
HI上で37℃でMCまたは大気条件下に成長させ、次に単一
のコロニーを培地に移して、ここに記載の本発明の方法
にしたがって培養する。細菌を使用する際には、当業者
に公知の方法で、例えば遠心分離により収穫することが
できる。
好ましい実施態様では、Campylobacter sp.（好まし
くはjejuniまたはcoli種、最も好ましくはjejuni 81−1
76株）の抗原的に増強された細胞を基礎必須培地、好ま
しくは約0.1％DOCまたは約0.8％胆汁を追加的に含むBHI
培地中37℃で約10〜20％CO2と約80〜90％空気の混合気
体下に成長させ、該培養物の成長がだいたい後期対数期
から定常期に達した後（典型的には接種の約20時間後）
に収穫する。
その他の好ましい実施態様では、Shigella sp.（好ま
しくはflexneriまたはdysentariae種、最も好ましくはf
lexneri 2457T株）の抗原的に増強された細胞を基礎必
須培地、好ましくは約0.1％DOCまたは約0.8％胆汁を追
加的に含むBHI培地中37℃で空気下に成長させ、該培養
物の成長がだいたい早期対数期に達した後（典型的には
早期から中間対数期にある培養物を接種した約30分後）
に収穫する。
更なる好ましい実施態様では、Helicobacter pylori
（好ましくはATCC 49503株、NB3−２またはG1−４）の
抗原的に増強された細胞を基礎必須培地、好ましくは約
0.05〜0.2％胆汁または約0.05％グリココール酸（GC）
を追加的に含むBHI培地中37℃で約５〜20％CO2と約80〜
95％空気または約10％CO2と約５％O2と約85％N2の混合
気体下に成長させ、該培養物の成長がだいたい対数期ま
たは定常期に達した後で収穫する。より好ましい実施態
様では、該培養物がだいたい対数期に達した後で細胞を
収穫する。
本発明の方法で培養した腸内細菌は改変された形態お
よび／または細胞運動性を有し、かつ／また、いくつか
の新しいタンパク質、リポ多糖類および／または炭水化
物および／または基礎培地のみで培養した細胞と比べて
変化したレベルの上記巨大分子を産生する。細胞の収量
および病原性指数を高める最適な培養条件を同定するこ
とができる。これらの培養条件を用いて、増強または誘
導される毒力関連抗原を同定することができる。
運動性と全体的な形態の変化は未処理のまたは染色し
た細菌の顕微鏡検査により観察し得る。本発明の方法か
らは電子顕微鏡や蛍光顕微鏡によって見ることができる
ような他の形態変化が生じる可能性がある。
本発明の方法で培養した腸内細菌の形態および粘液様
特性は、莢膜および／または表面層の発現が誘導されう
ることを示唆する。莢膜の生産を試験するために、タン
パク質、炭水化物、リポ多糖類などの表面成分のフェノ
ール抽出物を調製することができる。増加した炭水化物
は高速液体クロマトグラフィー（HPLC）で調べることが
できる。
毒力を増強する本発明の成長条件下で成長させた腸内
細菌から調製された外膜のタンパク質プロフィールをド
デシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動（SDS−PAGE）で特徴づけて、従来の培地で成長させ
た微生物から得られたものと比較することができる。SD
S−PAGEは、抗原を増強するまたは変化させる条件に応
答して細菌細胞タンパク質および抽出タンパク質におい
て生じた変化を評価するために行われる。これらのデー
タは、増大した侵入性または改変された抗原性と関連し
た表面変化に関する定性的および定量的情報を提供す
る。
誘導または改変されたタンパク質抗原の免疫原能力は
ウエスタンブロッティングで確認することができる。SD
S−PAGEにより同定された、誘導または改変された細菌
タンパク質の免疫原性は、後述するような、一般的に受
け入れられているウエスタンブロッティングの手法を用
いて評価しうる。回復期の免疫ウサギまたはフェレット
血清（従来の方法または本発明の方法で成長させた生存
微生物を経口的に感染させた動物由来の抗体の供給
源）、腸粘液（IgA抗体の供給源）、ポリクローナル抗
血清、またはモノクローナル抗体、例えば、C.jejuniフ
ラジェリンと交差反応するもの、などの抗体のどのよう
な供給源も細菌抗原のアッセイに使用できる。
これらの細菌抗原のいくつかの生産増加は毒力と関連
した性質の増強と同時に起こる。こうした性質として
は、培養したヒト腸上皮細胞への付着と侵入、およびコ
ンゴーレッド色素の結合がある。コンゴーレッド色素結
合アッセイは毒力を予測するための一般的に認められて
いる方法で、後述されるが、Andrewsら（Infect.Immu
n.,60:3287−3295,1992）およびYoder（Avian Dis.,33:
502−505,1989）に記載されている。細菌のコンゴーレ
ッド結合はヘミン結合能を示し、このヘミン結合能は毒
力と相関関係がある。コンゴーレッド結合はまた上皮細
胞の増大した細菌侵入とも関連している。
以前、従来法で成長させたC.jejuni Lior血清型はほ
とんどが免疫交差反応性でないことが明らかにされてい
る。この情報に基づくと、Campylobacterに対する広範
な、防御を得るために、数種のLior血清型株のワクチン
を多数作るかまたは混合ワクチンを作って投与すること
が必要であろう。本発明の方法により作出された抗原的
に増強されたCampylobacterは、従来法で成長させたCam
pylobacterを用いて得られたものより広範囲のLior血清
型に対して免疫交差反応性を示す。同様に、本発明の方
法により作出された抗原的に増強されたShigellaは、従
来法で成長させたShigellaを用いて得られたものより広
範囲のShigella種に対して免疫交差反応性で、免疫交差
防御的である。これらの免疫交差反応および免疫交差防
御の特性は、後述する凝集アッセイとワクチン研究の結
果により示される。
抗原的に増強された腸内細菌を作出する本発明の方法
は小動物モデルでの増強された毒力に相関する。ヒトの
Campylobacter疾患のモデルとして数種類の家畜を使用
することができる。免疫感作の有効性の観点からいちば
ん多く研究されたものは可逆的な腸管結紮で、Caldwell
らの成熟ウサギ下痢症（RITARDモデル）（Infect.Immu
n.,42:1176−1182,1983）である。このモデルはLior血
清型と交差菌株防御との関連をも実証した。しかし、こ
のモデルは病気に対する抵抗性よりもむしろ定着（コロ
ナイゼーション）に対する抵抗性を判定するものであ
る。Bellらのフェレットモデル（Infect.Immun.,58:184
8−1852,1990）はより有望なモデルかもしれない。なん
となれば、この動物はヒトのCampylobacter疾患の症状
によく似た症状を呈するからである。比較的最近のモデ
ルはBagarのマウス・コロナイゼーションモデル（Infec
tion and Immunity,63:3731−3735,1995）である。この
モデルは、免疫感作とこれに続く免疫マウスへの生存Ca
mpylobacterによる鼻または経口チャレンジ、その後に
糞便中のCampylobacterの存在をモニターすることによ
る腸管定着の試験を必要とする。Shigellaに関しては、
Mallettらにより記載されたマウス鼻チャレンジアッセ
イ（下記の第13節参照）を用いて毒力とワクチンの有効
性を評価する。Helicobacter pyloriに関しては、Chen
ら（Lancet,339:1120−1121,1992）により記載されたHe
licobacter felis胃コロナイゼーションモデルを用い
て、本発明の方法により作出されたH.pyloriのワクチン
効力を評価する。
腸内細菌の侵入および感染に関係した他の動物モデル
も存在し、それらは本発明の方法により増強された腸内
細菌のワクチン効力を試験するために用いられる。
本発明の方法により作出された抗原的に増強された腸
内細菌を用いて、基本型の死滅全細胞ワクチンまたはサ
ブユニットワクチンを調製する。これらのワクチンは、
動物に投与したとき抗体を誘導し、かくしてワクチンの
防御能を樹立することがわかる。細菌細胞におけるこれ
ら抗原の増強または誘導は、より有効なワクチンをつく
る細胞をもたらす。
本発明の方法により作られたワクチン候補調製物は、
腸の免疫応答を引き出すために種々の粘膜免疫法ととも
に使用することができる。その後、抗原性を増強させた
または増強させてない病原菌でチャレンジした動物を保
護するために、成功した免疫感作プロトコールを用い
る。また、ワクチンを混合ワクチンとして調製し、試験
することもできる。例えば、Shigella細胞とCampylobac
ter細胞またはそれらの構成成分を単一のワクチンとし
て組み合わせることができる。
下記の実験的手法は表面抗原の変化と他の特性（増強
された侵入性と関連している特性）の変化の検出を可能
にする。これらの変化は定性的かつ定量的である。最も
重要なことは、こうした実験により、本発明の方法が侵
入性を増強しかつ免疫原として関わりのある抗原を誘導
する、ということが確立されたことである。このような
抗原的に増強された細菌は、従来法で成長させた細菌と
比べて、より広範囲の細菌株、血清型および／または種
による感染に対して防衛的な免疫応答を引き出し、それ
ゆえ、有効なワクチンとして使用しうる。
当業者には公知の十分に確立されたモデルがいくつか
存在しており、これらは後述するように増強された抗原
特性、細菌の毒力およびワクチンの効力を評価するのに
有用である。
本発明の非限定的な実施例を以下に記載する。
6.実施例：増強された抗原性細菌の作出方法 実施例１ Campylobacter jejuni81−176株を血液寒天プレート
（トリプチカーゼソイ寒天および５％脱繊維素ヒツジ赤
血球を含有）上にストリークし、微好気性GasPakジャー
（BBL,Cockeysville,MD）中37℃で20時間インキュベー
ションした。細菌叢をスワブで取り上げ、0.8％OXGALL
（Difco,Detroit,MI）を含む10％CO2、90％空気に前平
衡化されたBHI培地１リットルを含有するフラスコ中に
接種した。培養物を、密閉フラスコ中10％CO2、90％空
気、37℃で振盪しながら、20時間インキュベーション
し、ついで上記のとおり収穫した。
実施例２ Campylobacter jejuni81−176株を血液寒天プレート
（トリプチカーゼソイ寒天および５％脱繊維素ヒツジ赤
血球を含有）上にストリークし、微好気性GasPakジャー
（BBL,Cockeysville,MD）中37℃で20時間インキュベー
ションした。細菌叢をスワブで取り上げ、0.01％〜0.1
％デオキシコール酸ナトリウム（DOC）を含む10％CO2に
前平衡化されたBHI培地１リットルを含有するフラスコ
中に接種した。（該BHI培地とは別のストック溶液とし
てDOCを調製し、高圧滅菌し、該細菌の接種直前に、最
終濃度が0.01％〜0.1％になるまでそれをBHI培地に無菌
的に加えることが重要である。）。培養物を、５％O2、
10％CO2、85％N2中37℃で振盪しながら、20時間までの
種々の時間インキュベーションし、ついで上記のとおり
収穫した。
実施例３ Campylobacter jejuni81−176株を血液寒天プレート
（トリプチカーゼソイ寒天および５％脱繊維素ヒツジ赤
血球を含有）上にストリークし、微好気性GasPakジャー
（BBL,Cockeysville,MD）中37℃で20時間インキュベー
ションした。細菌叢をスワブで取り上げ、0.01％〜0.1
％デオキシコール酸ナトリウムを含む10％CO2に前平衡
化されたブルセラ培地１リットルを含有するフラスコ中
に接種した。培養物を、５％CO2、10％CO2、85％N2中37
℃で振盪しながら、20時間インキュベーションし、つい
で上記のとおり収穫した。
実施例４ Campylobacter jejuni81−176株を血液寒天プレート
（トリプチカーゼソイ寒天および５％脱繊維素ヒツジ赤
血球を含有）上にストリークし、微好気性GasPakジャー
（BBL,Cockeysville,MD）中37℃で20時間インキュベー
ションした。細菌叢をスワブで取り上げ、0.01％〜0.1
％デオキシコール酸ナトリウムを含む10％CO2に前平衡
化されたミューラー・ヒントン培地１リットルを含有す
るフラスコ中に接種した。培養物を、５％CO2、10％C
O2、85％N2中37℃で振盪しながら、20時間インキュベー
ションし、ついで上記のとおり収穫した。
実施例５ Campylobacter jejuni81−176株を血液寒天プレート
（トリプチカーゼソイ寒天および５％脱繊維素ヒツジ赤
血球を含有）上にストリークし、微好気性GasPakジャー
（BBL,Cockeysville,MD）中37℃で20時間インキュベー
ションした。細菌叢をスワブで取り上げ、0.1％デオキ
シコール酸ナトリウムを含む10％CO2に前平衡化されたB
HI培地１リットルを含有するフラスコ中に接種した。培
養物を、10％CO2、90％空気中37℃でゆっくり撹拌しな
がら20時間インキュベーションし、ついで上記のとおり
収穫した。
実施例６ Vibrio choleraeをBHI寒天プレート（トリプチカーゼ
ソイ寒天および５％脱繊維素ヒツジ赤血球を含有）上に
ストリークし、空気中37℃で20時間インキュベーション
した。細菌叢をスワブで取り上げ、0.1％デオキシコー
ル酸ナトリウムを含むBHI培地１リットルを含有するフ
ラスコ中に接種した。培養物を、空気中37℃で振盪しな
がら20時間インキュベーションし、ついで上記のとおり
収穫した。
実施例７ Salmonella cholerasiusをBHI寒天プレート上にスト
リークし、空気中37℃で20時間インキュベーションし
た。細菌叢をスワブで取り上げ、0.1％デオキシコール
酸ナトリウムを含むBHI培地１リットルを含有するフラ
スコ中に接種した。培養物を、空気中37℃で振盪しなが
ら20時間インキュベーションし、ついで上記のとおり収
穫した。
実施例８ Salmonella typhimuriumをルリアブロス寒天プレート
上にストリークし、空気中37℃で20時間インキュベーシ
ョンした。細菌叢を、0.1％デオキシコール酸ナトリウ
ムを含むBHI培地１リットルを含有するフラスコ中に接
種した。培養物を、10％CO2、90％空気中37℃で振盪し
ながら20時間インキュベーションした。0.1％DOCを含有
するLB1リットルにコロニー１個を移し、ゆっくり振盪
しながら上端密閉フラスコ中37℃でインキュベーション
した。12時間後、該培養物60mlを同じ新鮮な加温培地１
リットル中に希釈し、さらに30分間インキュベーション
し、ついで上記のとおり収穫した。
実施例９ Shigella flexneri2457Tをコンゴーレッド寒天プレー
ト上にストリークし、空気中37℃で20時間インキュベー
ションした。BHI培地１リットルを含有するフラスコ中
に赤色コロニー１個を接種し、振盪しながら12時間イン
キュベーションした。ついで、この培養物50mlを用い
て、0.1％デオキシコール酸ナトリウムを含有する加温B
HI培地250mlに接種した。振盪しながら空気中37℃で４
時間、該培養物をインキュベーションした。ついで、OD
600が約0.17になるまで、0.1％DOCを含有する加温BHIで
この培養物を希釈し、空気中37℃で振盪しながら30分間
インキュベーションし、ついで上記のとおり収穫した。
実施例10 Campylobacter jejuni81−176、81−116またはHC（30
％グリセロールを含むBHI中）を急速解凍し、ヒツジ血
液寒天（SBA、0.1ml/プレート）上にプレーティングし
た。CampyPack Plus微好気性環境ジェネレーターの付い
たGasPakジャー（BBL,Cockeysville,MD）中37℃で20時
間、該接種プレートをインキュベーションした。該細菌
叢をスワブにより該プレートから取り、該細菌をBHI10m
lに再懸濁した。２リットルフラスコ中10％CO2、90％空
気に前平衡化した、BHI培地単独または0.1％DOCを含有
するBHI培地１リットルに該細菌懸濁液を接種した。OD
625が0.05に等しくなるまで、該接種物を前平衡化培地
に加えた。該接種フラスコを10％CO2、90％空気に戻
し、37℃で20時間、ゆっくり撹拌した。この時点で上記
のとおり該細菌を収穫した。
実施例11 ４％子ウシ血清を含むBHI培地にHelicobacter pylori
を加えた。接種後、該フラスコを５％O2、10％CO2、85
％N2でフラッシュし、振盪しながら37℃で22時間インキ
ュベーションした。このインキュベーションの後、４％
子ウシ血清を含むBHI培地またはさらに0.05％グリココ
ール酸ナトリウムを含有する同じ培地を含有するフラス
コへ該培養物2.5mlを移した。これらの培養物を微好気
性気体混合物（５％O2、10％CO2、85％N2）で再度フラ
ッシュし、37℃で20〜24時間インキュベーションした。
該細胞を上記のとおり収穫した。
実施例12 Salmonella typhimurium（30％グリセロールを含むLB
中）をLB寒天プレート上にストリークし、空気中37℃で
18〜20時間培養した。コロニー１個を拾い、10％CO2、
５％CO2、85％N2でフラッシュしたフラスコ中のLBまた
は0.1％DOC含有LB1リットル中へ移し、密閉し、振盪し
ながら37℃で12時間インキュベーションした。ついで、
OD600が0.17になるまで同じ培地中で該細菌を希釈し、
該培養物が初期対数期に達するまで、典型的には希釈後
30分間、同じ条件下でインキュベーションした。細胞を
上記のとおり収穫した。
実施例13 Salmonella typhimuriumをLB寒天プレート上にストリ
ークし、空気中37℃で18〜20時間培養した。コロニー１
個を拾い、LBまたは0.1％DOC含有LB1リットル中へ移
し、空気中37℃で12時間インキュベーションした。つい
で、該培養物を同じ新鮮培地中で希釈（1/5）し、同じ
条件下でさらに４時間インキュベーションした。つい
で、OD600が0.17になるまで同じ新鮮培地中で該培養物
を希釈し、該培養物が対数期に達するまで、典型的には
希釈後30分間、同じ条件下でインキュベーションした。
細胞を上記のとおり収穫した。
実施例14 Klebsiella pneumoniaeをBHI寒天プレート上にストリ
ークし、空気中37℃で18〜20時間インキュベーションし
た。コロニー１個を拾い、BHIまたは0.1％DOC含有BHI1
リットルに接種し、空気中37℃で12時間振盪した。つい
で、OD600が0.17になるまで同じ培地中で該細胞を希釈
し、さらに30分間増殖させ、ついで上記のとおり収穫し
た。
実施例15 Enterobacter cloacaeをBHI寒天プレート上にストリ
ークし、空気中37℃で18〜20時間インキュベーションし
た。コロニー１個をBHIまたは0.1％DOC含有BHI1リット
ルに接種し、37℃で12時間振盪した。ついで、OD600が
0.17になるまで同じ培地中で該細菌を希釈し、さらに30
分間増殖させ、ついで上記のとおり収穫した。
実施例16 Escherichia coliO157:H7株をヒツジ血液寒天プレー
ト上にストリークし、空気中37℃で18〜20時間インキュ
ベーションした。コロニー１個を１リットルのBHIまた
は0.1％〜0.2％DOC含有BHIを含むフラスコ中に接種し、
37℃で12時間振盪した。ついで、OD600が0.17になるま
で該細菌を希釈し、さらに30分間増殖させ、ついで上記
のとおり収穫した。
実施例17 Enterococcus faecalisをヒツジ血液寒天プレート上
にストリークし、空気中37℃で18〜20時間インキュベー
ションする。コロニー１個を１リットルのBHIまたは0.1
％DOC含有BHIを含むフラスコ中に接種し、37℃で12時間
振盪する。ついで、OD600が0.17になるまで該細菌を希
釈し、さらに30分間増殖させ、ついで上記のとおり収穫
する。
実施例18 Clostridium difficile（30％グリセロールを含む改
良細切肉培地）を、1.5％寒天を含む嫌気性菌用ビーフ
肝臓培地のプレート上にストリークし、微好気性条件下
（５％CO2および95％N2）37℃で培養する。コロニー１
個を改良細切肉培地または0.1％DOCを含む同じ培地の１
リットルに移す。該細菌を微好気性条件下37℃で12時間
培養し、上記のとおり収穫する。
実施例19 Bacteroides fragilis（30％グリセロールを含む改良
細切肉培地）を、改良細切肉培地寒天プレート上にスト
リークし、微好気性条件下（５％CO2および95％N2）37
℃で培養する。コロニー１個を改良細切肉培地または0.
1％DOCを含む同じ培地の１リットルに移す。該細菌を微
好気性条件下37℃で12時間培養し、上記のとおり収穫す
る。
実施例20 Yersinia pseudotuberculosis（30％グリセロールを
含有するルリア培地）をルリア培地寒天プレート上にス
トリークし、30℃でインキュベーションする。コロニー
１個をLB1リットルへ移し、30℃で12時間インキュベー
ションする。この培養物をLBまたは0.1％DOC含有LB中で
希釈（1/5）し、37℃で４時間インキュベーションす
る。ついで、OD600が0.17になるまで同じ培地中で該培
養物を希釈し、さらに30分間インキュベーションし、つ
いで上記のとおり収穫する。
実施例21 ４％子ウシ血清を含むBHI培地にHelicobacter pylori
を加えた。接種後、該フラスコを５％O2、10％CO2、85
％N2でフラッシュし、振盪しながら37℃で22時間インキ
ュベーションした。このインキュベーションの後、４％
子ウシ血清を含むBHI培地またはさらに約0.1％〜約0.2
％ウシ胆汁を含有する同じ培地を含有するフラスコへ該
培養物2.5mlを移した。これらの培養物を微好気性気体
混合物（５％O2、10％CO2、85％N2）で再度フラッシュ
し、37℃で20〜24時間インキュベーションした。該細胞
を上記のとおり収穫した。
7.実施例：増強された抗原性細菌 実施例22 湿封入（wet mounted）細菌の顕微鏡的検査により、
運動性および全形態を観察した。墨汁（ニグロシン（ni
grosine））による莢膜染色により表面層を観察した。
風乾後、該細胞をクリスタルバイオレット（crystal vi
olet）により対比染色した。すべての観察は1000倍の倍
率で行った。
本発明方法により培養した細菌（以下、「増強」細菌
と称する）の形態は、基礎培地単独中で培養したもの
（従来法で成長させた）と比べて変化していた。例え
ば、「増強」C.jejuniは集合し、細胞の大きなクランプ
を形成したのに対し、従来法で成長させた細胞は単生の
ものが優勢であった。細菌表面の変化が本発明方法で培
養することにより起こったことは莢膜染色（データは示
していない）から明らかであった。実際、この表面変化
の結果、該染色からのニグロシン粒子の「増強」細胞に
よる結合が増加した。該「増強」細菌の運動性は高く維
持された。
実施例23 フェノール抽出により、C.jejuni表面成分を分析し
た。抽出物は、従来法で成長させたか、または上記実施
例２により培養したC.jejuni81−176から得た。上記の
とおり遠心分離により培地からC.jejuni細胞を収穫し
た。室温で２時間、１％フェノールで該細胞ペレットを
抽出した。45分間の遠心分離により無傷細胞を抽出物か
ら分離した。抽出された細菌表面成分を含有する上清
を、蒸留水に対して一晩透析した。該保持物質を105,00
0×ｇ、４℃で３時間遠心分離した。該抽出ペレットを1
0％NaCl中に再溶解し、２倍容の冷95％エタノールで沈
殿させた。該沈殿を繰り返し、該サンプルを凍結乾燥し
た。ついで、さらに分析するために、該サンプルを水に
1mg/mlで溶解した。
グルコースを基準に用いる一般に許容されているフェ
ノール−硫酸法により、該抽出物の炭水化物含量を測定
した。カルバゾール試薬を用いるDischeの方法により、
該抽出物のウロン酸含量を測定した。ビシチン酸（bicc
ichinoic）アッセイキット（Pierce Chem.Co.,Rockfor
d,IL）を用いて該フェノール抽出物の総タンパク含量を
評価した。
該抽出物にウロン酸が存在しないことは注目に値し
た。多数の典型的な細菌莢膜はウロン膜ポリマーよりな
る。驚くべきことに、C.jejuni81−176の表面抽出物は
実際にはタンパク質が優勢であった。しかしながら、該
「増強された」細胞抽出物の総炭水化物含量は、通常に
増殖させた細胞に対して増加していた。
該抽出物のタンパク質に対する炭水化物の比率を以下
の表１に示す。
該培地中のDOCの含有量と該細菌からの表面抽出可能
炭水化物の増強されたレベルとの間には直線的関係があ
った（表１）。本発明の方法により培養した細菌では、
表面抽出可能炭水化物は８培以上増加したのに対し、通
常に増殖させた細菌では増加が全く見られなかった。DO
C培地中で培養した細菌細胞の凝集は、該表面抽出物の
成分に起因するようであった。
再水和に際して、該抽出物は水中で高いゲル化能を有
し、これは該溶液を高粘性かつ粘液状にするものであ
り、該凝集細菌と類似の性質であった。該抽出物のこの
機能性はムチン様糖タンパク質に類似していた。
個々の単糖類を分析するために、密閉バイアル中1Nト
リフルオロ酢酸中で抽出物を加水分解した。該サンプル
を窒素下で２時間乾燥し、蒸留水に再懸濁した。Dionex
Corpクロマトグラフィーマトリックスおよび溶媒とし
て３％の0.5N NaOH/97％H2Oよりなる溶媒系を用いるHPL
Cにより糖を分離した。電流滴定検出により分離された
単糖類を定量した。また、フコース、ガラクトサミン、
グルコサミン、ガラクトース、グルコースおよびマンノ
ースよりなる真正単糖類標品をHPLC分析に付して比較し
た。
該加水分解表面抽出物のHPLC分析により、類種の単糖
類の存在が示された（図１）。通常に増殖させたかまた
は上記実施例２の方法により増殖させた細菌からの抽出
物の炭水化物組成に、定性的相違は全くないようであっ
た。しかしながら、主要ではない定量的相違は明らかで
あった。
実施例24 SDS−PAGEおよびウエスタンブロッティングにより細
菌タンパク質を分析した。Lugtenbergら（FEBS Letters
58:254−258,1975）のゲル系を用いた。該ゲル系は、
低アクリルアミド（典型的には４％）スタッキングゲル
（pH6.8）およびより高い割合のアクリルアミド分離ゲ
ル（pH8.8）よりなる不連続ゲルである。両ゲルおよび
用いたすべての緩衝液にSDS（0.1％）が含まれていた。
タンパク質分離は分子の大きさにより行い、８または12
％アクリルアミド分離ゲルを用いた。分離タンパク質の
可視化は固定ゲルの銀染色により、分子の大きさの測定
は標準として用いた公知タンパク質のMr値に基づいて行
った。
SDS−PAGEによりC.jejuni細胞タンパク質を分離し、
銀染色により可視化した。62kDaのタンパク質を含む４
つのタンパク質が、DOCを用いて培養した細胞中で誘導
または増強された（図２）。
実施例25 フェノール抽出によりS.flexneri LPSを分析した。通
常に増殖させたまたは上記実施例９で例示される本発明
により増殖させたS.flexneri細胞を、上記のとおり遠心
分離により培地から収穫した。WestphalおよびJann（R.
Whistler編,Methods in Carbohydrate Chemistry,vol
5;p.83,1965）の方法により、リポ多糖（LPS）を抽出し
た。簡単に言えば、BHI中でまたは上記実施例９で例示
したとおりに培養した細胞を遠心分離により収穫し、PB
S中で１回洗浄した。ついで、水中の45％フェノールを
用いて68℃で15分間、該細胞を抽出した。該抽出物を10
℃に冷却し、遠心分離した。LPS含有上部水相を吸引
し、蒸留水に対して透析した。該保持物質を80,000×
ｇ、４℃、７時間で１回、およびそれぞれ105,000×
ｇ、３時間で３回遠心分離した。該最終ペレットを凍結
乾燥した。分析前に、該LPSを水に再懸濁した（1mg/m
l）。該精製LPSを上記のとおり炭水化物含量に関して、
および下記および図５に示すとおりドデシル硫酸ナトリ
ウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS−PAGE）
により特徴づけした。
この特定のSDS−PAGE系を用いて分析した場合には、
S.flexneriタンパク質プロフィールは、通常培養細胞と
「増強」細胞との間の大きな相違を全く示さなかった。
「増強」細胞からのLPSに対する炭水化物の乾燥重量比
は、BHI細胞からの抽出物と比べて減少した。しかしな
がら、S.flexneri LPSのSDS−PAGEついで酸化および銀
染色により、LPS構造の大きな変化が示された（図
５）。該ゲルのレーン「２」に示されるとおり、「増
強」S.flexneriからのLPSのＯ−抗原画分は、長さが減
少した。この結果は、炭水化物／「増強」細胞からのLP
Sの乾燥重量比の減少という知見を補足するものであっ
た。
これらの結果は、「増強」細胞上のより短いＯ−抗原
側鎖の提示を示唆し、潜在的に該細菌をより疎水性にす
るかもしれない。より疎水性の細菌は、腸管内の疎水性
表面とのより大きな相互作用を有しうる。
実施例26 ウエスタンブロットによりタンパク質の免疫原性を定
量した。通常に増殖させたまたは上記実施例１または５
に例示される本発明方法により増殖させた細菌からのタ
ンパク質をSDS−PAGEにより分離し、ついで電気泳動的
にニトロセルロースまたはPVDF膜に移し、標準ブロッキ
ング剤［３％BSA、50mMトリス（pH8.5）、50mMNaCl、0.
2％TWEEN 20］でブロッキングした。第１抗体をブロッ
キング緩衝液中に適用し、ついで該ブロットを洗浄し、
第２抗体リポーター同族体を適用した。洗浄後、光また
はクロモフォア生成基質で該ブロットを可視化した。用
いたリポーター部分は西洋ワサビペルオキシダーゼまた
はアルカリホスファターゼであった。
図３は、IgA含有免疫ウサギ粘液によるウエスタンブ
ロッティングからのタンパク質を示す。該62kDaタンパ
ク質は主要抗原であったことがわかる。DOCまたは胆汁
を用いて培養した細胞中では、該62kDaタンパク質の抗
原性が非常に増強されていた。また、このタンパク質
は、DOCを用いて培養した細胞の表面抽出物中の優勢抗
原であった。
Campylobacterフラジェリンと交差反応するマウスモ
ノクローナル抗体を用いて、該増強タンパク質はC.jeju
niフラジェリンであることが示された（図４）。C.jeju
niフラジェリンが病原に関与しており該細菌の侵入性に
関連していることが数名の研究者により示されているた
め、これは重要な知見であった。
実施例27 コンゴーレッド染色結合により毒力を測定した。BHI
寒天プレート（0.025％コンゴーレッド含有）上で通常
に増殖させた（BHI）または本発明方法により増殖させ
た（「増強」）腸内細菌を蒸留水に再懸濁し、アセトン
で10分間抽出した。遠心分離により細胞残渣をペレット
化し、40％アセトン、60％水のブランク溶液を用いて該
染料のOD488を測定した。660nmでの該染料の吸光度を該
細胞の吸光度と比較し、OD488/OD660の比率として表し
た。該データを以下の表２に示す。
表２は、本発明方法により培養した数種の腸内細菌の
場合にはコンゴーレッド染色結合が増強されたことを示
す。これらの結果は、本発明のin vitro法が、毒力およ
び他の細菌種に関するin vivo病原性と相関しているこ
とが知られている他の性質を誘導するのに有用であるこ
とを示す。
実施例28 培養上皮細胞への細菌付着を分析した。GalanおよびC
urtiss（Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:6383−6387,198
9）により記載されているとおりに細菌付着をアッセイ
した。組織培養細胞（INT−407またはヘンレ細胞（ATCC
＃CCL6）およびCaCo−２（ATCC＃HTB37）ヒト小腸細胞
系）を24−ウェル組織培養プレート（37℃、５％CO2）
上、60〜80％の密度で培養した。該培地は用いる細胞系
によるが、ヘレン細胞には10％ウシ胎児血清およびそれ
ぞれ50mg/mlのペニシリンＧおよびストレプトマイシン
を含むダルベッコの改良イーグル（Dulbecco's modifie
d Eagle's）培地を使用し、CaCo−２細胞の培養には10
％ウシ胎児血清およびそれぞれ50mg/μｌのペニシリン
Ｇおよびストレプトマイシンを含むRPMI1640培地を使用
した。アッセイの少なくとも３時間前に、該培地を除
き、マグネシウムおよびカルシウムを含むハンクス平衡
塩溶液（HBSS）で該細胞を２回洗浄した。ついで、抗生
物質を含まない増殖培地で単層を重層した。
付着アッセイのために、該細菌を以下のとおり調製し
た。Campylobacter、Helicobacterなどの増殖の遅い腸
内細菌の場合、OD625が0.1になるまで新鮮な前平衡化培
地で該細菌培養密度を希釈し、ついで該アッセイに用い
た。Shigellaおよび他の増殖の速い腸内細菌の場合、OD
625が0.17になるまで新鮮な前平衡化培地で該細菌培養
を希釈し、ついで該アッセイに用いた。飽和を避けるた
めに10細菌／細胞の感染多重度にて該細菌を該上皮細胞
に加えた。該組織培養ウェル中に接種した細菌の数をプ
レート計数により計算した。５％CO2下、Campylobacter
の場合には２時間の、Shigelalの場合には30分間の感染
の後、0.1％デオキシコール酸塩による該単層の溶解お
よび付着測定のためのプレーティングの前にHBSSで洗浄
することにより、非結合細菌を除いた。
通常に増殖させたまたは上記実施例５に例示される本
発明方法により増殖させたC.jejuni 81−176によるINT
−407細胞への付着に対する温度の影響を、以下の表３
に示す。
通常に増殖させたまたは本発明により増殖させたC.je
juniのいくつかの株の付着の相違を、以下の表４に示
す。
パーセント付着は、該単層から回収したコロニー形成
単位（CFU）数を該単層上へ接種したCFU数で割り100倍
した数として表されている。
侵入アッセイでは、付着アッセイについて上記した方
法により上皮細胞を増殖させ調製した。飽和を避けるた
めに10細菌／細胞の感染多重度にて、通常に増殖させた
または本発明方法により増殖させた細菌を該上皮細胞に
加えた。該組織培養ウェル中に接触した細菌の数をプレ
ート計数により計算した。５％CO2下、Campylobacterの
場合には２時間の、Shigellaの場合には30分間の感染の
後、該感染細菌を吸引し、すべての細胞外細菌を殺すた
めゲンタマイシンを含有する増殖培地で該単層を重層し
た。この時点で残っているすべての培養可能細菌は、該
上皮細胞単層に侵入している。C.jejuni感染細胞の集合
には３時間、Shigella感染細胞の場合には1.5時間、CO2
下で該インキュベーションを継続した。単層をHBSSで洗
浄してゲンタマイシンを除き、0.1％デオキシコール酸
塩を加えることにより溶解した。プレート計数により該
ライゼート中の細菌を数え、接種細菌数と比較したゲン
タマイシン耐性細菌の数としてパーセント侵入を表し
た。
侵入は、ゲンタマイシン処理後に該単層から回収した
コロニー形成単位（CFU）数を該単層上へ接種したCFU数
で割り100倍した数として求めた、該単層に侵入する細
胞のパーセントとして表している。
通常に増殖させたまたは上記実施例５の方法により増
殖させたC.jejuni 81−176によるINT−407細胞への侵入
に対する温度の影響を、以下の表５に示す。
通常に増殖させたまたは本発明方法により増殖させた
C.jejuniのいくつかの株によるINT−407細胞への侵入に
おける相違を、以下の表６に示す。
通常に増殖させたまたは上記実施例５の方法により増
殖させたC.jejuni 81−176によるINT−407細胞への付着
および侵入に対するDOCの影響を、以下の表７に示す。
通常に増殖させたまたは上記実施例５の方法により増
殖させたShigellaによるINT−407細胞への付着および侵
入に対するDOCの影響を、以下の表８に示す。
C.jejuni（すなわち81−116、81−176およびHC）のい
くつかのヒト単離物による培養INT−407細胞への付着お
よび侵入は、該培地への胆汁またはデオキシコール酸塩
の添加により非常に増強された（表４および６を参照さ
れたし）。最も効果的なDOC用量は0.1％であった（表
７）。42℃（Campylobacterを通常に増殖させる温度）
でなく37℃で最大反応が得られた（表３および５）。
Shigella flexneriで同様の知見を得た（表８）。本
発明方法により増殖させたShigellaは、非常に増強され
た付着能および侵入能を共に有していた。
これらのデータは、本発明方法が腸内病原体の侵入お
よび付着を増強することを示す。
実施例29 免疫交差反応性を示すために、急速スライド凝集アッ
セイを用いた。通常に増殖させたまたは実施例５に例示
される本発明方法により増殖させたC.jejuni株を、通常
にまたは本発明方法（例、実施例５）のいずれかにより
増殖させたC.jejuni81−176（Lior 5）で免疫した動物
からの血清IgGにさらした。該IgG抗体をプロテインＡコ
ートラテックスビーズ上に固定化した。試験血清型とLi
or 5血清型に対して生成した抗体との間に交差反応エピ
トープがあれば、該細胞のほとんど即時性のクランピン
グ（すなわち凝集）を見ることができる。該反応を短時
間進行させた後、０〜３のスケール（ここで、０は観察
可能なクランピングが全くないことを意味し、３は高度
の凝集を意味する）に基づきこのクランピングを評価し
た。４株の結果を以下の表９に示す。
表９は、増強C.jejuni81−176Lior血清型L5で免疫し
た動物から生成した抗体と交差反応させた４つの試験Li
or血清型（L5,L2,L8,L21）のすべてを示す。IgAよりな
る、C.jejuni81−176に感染させたウサギの腸からの粘
液洗浄物は、Lior 5血清型株に対する抗体と交差反応し
た（以下の表16を参照されたし）、本発明方法により増
殖させたC.jejuniの10個の主要臨床血清型（すなわちヒ
ト病原体）のうちの８個と反応した。この結果は、本発
明方法が、C.jejuniのLior 5血清型株で免疫した動物か
らの抗血清と交差反応するLior血清型の数を有意に増加
させることを示す。
また、通常に増殖させたのでなく本発明方法により増
殖させたShigellaのいくつかの種は、DOCを用いて増殖
させたShigella flexneri 2457Tで免疫した動物からのI
gG抗体と交差反応する。
８ 実施例：ワクチンの効力 実施例30 ヒトで見られる３つの疾病発現のうちの２つがフェレ
ットの感染により再現可能に生じるため、コロニー形成
および／または疾病に対する防御におけるワクチンの効
力を評価するためのモデルとして、Campylobacterの病
原性を調べるためのフェレットモデルを用いることがで
きる。
24匹の７〜９週齢の雄のフェレットを、PBS（対照と
して）、または通常に増殖させた（BHI）または実施例
５の方法により増殖させた（増強）ホルマリン固定C.je
juni81−176株のいずれかで経口的に免疫した。血清を
単離し、ベースラインIgG力価を測定した。アジュバン
トLTの存在下、１週間間隔で２回（０日目および７日
目、「ワクチン接種」）、すべてのワクチンおよびPBS
を投与した。１週間後（14日目）（「ワクチン接種
後」）に血清を集め、IgG抗体力価を測定した。ワクチ
ン接種４週間後（チャレンジ）、該フェレットをACEプ
ロマジン−ケタミンで麻酔し、生きたC.jejuni81−176
（１×1010CFU）を含有する10ml PBS溶液で経口的にチ
ャレンジした。その後毎日、粘液性下痢、菌血症、Camp
ylobacterの糞便放出、体重変化、潜血および糞便白血
球について該動物を監視した。麻酔したフェレットの頸
静脈から１〜2mlの血液を取り、該試料を通気トリプチ
カーゼソイ培地培養中でインキュベーションすることに
より菌血症を検出した。チャレンジ後２、５および７日
目に、血液寒天プレートへの継代培養を行った。免疫前
（ベースライン）、第２免疫の１週間後およびチャレン
ジ時およびチャレンジの１週間後に血清サンプルを集め
てIgG力価を測定した。
糞便材料をヘマカルトカード（hemacult card）上で
調べることにより、潜血を検出した。糞便白血球を検出
するために、糞便材料をスライド上塗抹標本にしメチレ
ンブルーで染色した。Campylobacterの糞便放出は、直
腸スワブからの塗抹をCampylobacter選択性培地プレー
ト（トリプチカーゼソイ寒天、５％ヒツジ血液、トリメ
トプリム、バンコマイシン、ポリミキシンＢ、セファロ
チンおよびアンホテリシンＢ、Remel,Lenexa,KS）上で
培養することにより確認した。これらの実験からの結果
を以下の表10および11に示す。
表10は、生のチャレンジに際して、本発明の不活化全
細胞ワクチンで免疫した動物がコロニー形成および疾病
に対して防御されたことを示す。表11のデータは、通常
に増殖させた腸内細菌（BHI）からよりも一層高いIgG抗
体力価が本発明のワクチン（増強）から得られることを
示す。
これらの結果は、本発明のワクチンにより免疫原性
（表11）および感染からの防御（表10）が得られ、これ
らは、通常に増殖させた細菌を用いて動物にワクチン接
種した場合に見られるものより大きいことを示す。した
がって、本発明方法により生産される細菌は、哺乳動物
を感染から防御するワクチンとして有用である。
実施例31 マウスは、フェレットのように自然にはCampylobacte
rまたはShigella感染症を発症しないが、免疫動物の経
口チャレンジの際の腸コロニー形成に対する抵抗性また
は免疫動物の肺感染による疾病に対する抵抗性を示すた
めに当業者に用いられている。したがって、他の動物や
ヒトで使用するためのワクチンの効力を予測するため
に、マウス鼻腔内接種モデルを用いることができる。こ
のアッセイは、Malletら（Vaccine,11:190−196,1993）
により記載されている。
10匹の約16週齢の雌Balb/cマウスの群をリン酸緩衝生
理食塩水（PBS）、通常に増殖させたC.jejuni（BHI）ま
たは実施例５により増殖させたC.jejuni（増強）によ
り、約107CFUまたは109CFUにて経口的に免疫し、ついで
チャレンジした。各群の小腸内粘液からのIgA力価をELI
SA法で測定した。これを以下の表12に示す。
表12は、本発明方法により増殖させた細菌で免疫した
動物が、通常に増殖させた細菌で免疫した動物より高い
小腸IgA抗体力価を有する（これは応答動物のより大き
いパーセントで示される）ことを示す。
９ 実施例:DOCによる抗原変化または増強の機構 実施例32 本発明がいずれかの特定の作用機構により限定される
ことを意図するものではないが、本発明者らは、デオキ
シコール酸塩（DOC）が腸内細菌の抗原性の変化または
増強で２倍の作用を有するようだと示唆する証拠を得
た。証拠が示すところによれば、DOCはカルシウムに結
合し培地中のカルシウム濃度を低下させるため、DOCの
作用の１つの態様はカルシウム依存性作用により仲介さ
れる。その証拠は以下のとおりである。C.jejuni81−17
6を膜透過性カルシウムキレート剤BAPTA/AMを用い、か
つ、DOCを用いないで培養する場合、INT−407細胞への
その侵入性は約10倍増強される（以下の表13を参照され
たし）。しかしながら、BAPTA/AM処理単独では、C.jeju
ni81−176細胞の免疫交差反応性を増強しない。
表13に示す結果は、0.1％DOCの代わりに25μMBAPTA/A
Mを使用する以外は実施例５に記載したプロトコルに従
い培養したC.jejuni81−176を用いて得た。該侵入アッ
セイは、上記第７節の実施例28に記載のとおりに行い評
価した。
胆汁またはDOCなどの胆汁塩により抗原増強または変
化を受けやすいいくつかの細菌属（例、Campylobacte
r、Shigella、Helicobacter）は、Yersiniaからの低カ
ルシウム応答（lcr）遺伝子と相同な遺伝子を有する。
該lcr座は、低カルシウムレベルに応答してYersiniaの
毒力を調節することが知られている。侵入に必要なフラ
ジェリン発現および組立てに関与している２つのCampyl
obacter遺伝子（flaA,flbA）は、lcr産物により一部調
節されている。通常に増殖させたまたは本発明の毒力増
強条件下で増殖させたCampylobacter flaAおよびflbB突
然変異体の挙動分析により、侵入（コンゴーレッド染料
結合または交差反応性の増加ではなく）はカルシウム依
存的であることが示されている（以下の表14を参照され
たし）。
表14に示す結果は、通常に培養したまたは実施例５で
例示される本発明方法により培養したC.jejuniを用いて
得た。該侵入アッセイは上記実施例28に記載のとおりに
行い評価した。
該C.jejuni flaAおよびflbA突然変異体は、DOCを用い
て培養した場合には、有意に増強されたコンゴーレッド
結合および免疫交差反応性を示さない（それぞれ表15お
よび図６を参照されたし）。表15および図６に示す結果
は、通常に培養したまたは上記実施例５で例示される本
発明方法により培養したC.jejuniを用いて得た。コンゴ
ーレッド染料結合アッセイ（表15にその結果を示す）
は、上記実施例26に記載のとおりに行った。免疫交差反
応性（図６にその結果を示す）は、上記実施例29に記載
のとおりに行った。
該flaA突然変異体は、フラジェリンを発現することが
できない。該flaA突然変異体およびflaA−flaB二重突然
変異体（C.Grant,NIHから得た）は共にDOC処理後であっ
ても非侵入性であり、このことは侵入にはフラジェリン
が必要であることを示す。興味深いこに、これらのfla
突然変異体の同系親株とC.jejuniの他のあるLior血清型
との間で観察された正常に発現された（すなわちDOCで
誘導していない）免疫交差反応性は該突然変異体にはな
い。しかしながら、DOC処理により、これらフラジェリ
ンの無い突然変異体を誘導して、増強された免疫交差反
応性およびコンゴーレッド結合を発現させることができ
る。
これらの知見は、DOCがカルシウム依存的（例、侵入
性）およびカルシウム非依存的（例、コンゴーレッド染
料結合）機構により腸内細菌における毒力機能を調節す
ることを示す。さらに、これらの知見は、DOCにより誘
導される免疫交差反応性およびコンゴーレッド結合の増
強が少なくとも部分的にはフラジェリン非依存的である
ことを示唆する。
10 実施例:DOCは、Campylobacter jejuniの増強された
血清型および種免疫交差反応性を誘導する 実施例33 本発明方法により増殖させたCampylobacter jejuniの
血清型免疫交差反応性を急速スライド凝集アッセイによ
り調べた。このアッセイでは、免疫および非免疫ウサギ
からの小腸粘液を用いて、Campylobacterの非相同株の
交差反応性に対する培養条件の変化の影響を判定した。
通常に増殖させた生きたC.jejuni81−176でウサギを免
疫した。該粘液抗体の凝集活性は、BHI−YE培地中で通
常に増殖させたまたは実施例５で例示される本発明方法
により増殖させた、18の血清型よりなる24のCampylobac
ter株に対して試験した。
該凝集アッセイの結果は、非相同Campylobacter株の
交差凝集は、該株を本発明方法により増殖させた場合に
は通常に増殖させた場合より広く、多くの場合、強いこ
とを示す。特に、非相同的凝集反応性では２倍を越える
増加があった。すなわち、抗81−176免疫粘液におい
て、通常に増殖させた非相同の24株のうちの６株が＋ま
たはそれを越えるレベルで凝集したのに対し、DOC条件
下で増殖させた同じ24株のうちの14株が＋またはそれを
越えるレベルで凝集した。さらに、18株の非相同株は、
通常に増殖させた場合には弱い（±）凝集を示したかま
たは全く凝集を示さなかったが、増強培養条件（例、DO
C含有培地）下で増殖させた場合にはこれらの同じ株の1
1株が増強された凝集応答を示した。
表16は、通常に増殖させた（BHI−YE）または実施例
５の方法により増殖させた（増強）22株よりなる19の非
相同Lior血清型に対する抗81−176免疫ウサギ粘液の交
差反応性を示す。この実験が公知のLior血清型の画分を
アッセイするにすぎない場合であっても、この結果は、
本発明方法がLior血清型間の実質的な免疫交差反応性を
誘導することを示す。この結果はさらに、Campylobacte
rにおけるDOC増強または誘導抗原が、Campylobacterに
よる腸感染に対する抵抗性およびこれからの回復に関連
した分泌IgA応答に重要と思われることを示す。
さらに、Lior血清型８の株が、異なる種であるCampyl
obacter coliであることに注目すべきである。抗81−17
6免疫ウサギ粘液において、この血清型の２株の一方（V
C167）は強く凝集する（３＋）。この結果は、C.jejuni
株（例、Lior 5）由来のワクチンが、同種内のみならず
他のCampylobacter種（例、Campylobacter coli）の非
相同血清型に対しても交差防御することを示す。Lior血
清型１、２、４、９および11が世界的に最も一般的な疾
病関連血清型に挙げられることにも注目する価値があ
る。それらはすべて、このアッセイで検出可能な交差反
応性を示した。
11 実施例:Campylobacterのワクチンの効力の追加的実
験 実施例34 本発明方法により増殖させたホルマリン固定全細胞Ca
mpylobacter jejuniの防御的効力は、Bagar（Infect.＆
Immun.,63:3731−3735,1995）により報告されているマ
ウスコロニー形成モデルを用いて判定した。
C.jejuni81−176は、実施例５に従い増殖させ収穫
し、上記のとおり0.075％ホルマリンにより不活化し
た。105、107または109個の不活化細菌粒子を単独でま
たはE.coliからの25μｇの熱不安定エンテロトキシン
（LT）と共に含有する３経口用量（エンドトキシンを含
まないPBS中0.25ml/用量）を、５匹の６〜８週齢雌Balb
/cマウスの群に投与した。投与は48時間間隔で、および
胃の酸性を中和するために５％炭酸水素ナトリウム溶液
（pH8.5）0.5mlの２用量を15分間隔で投与した直後に行
った。対照として、動物群にPBS単独でまたはLTアジュ
バントと組み合わせてワクチン接種した。第３用量の投
与の約28日後に、ワクチン接種した動物を、通常に増殖
させた生きたC.jejuni81−176の約108のコロニー形成単
位（CFU）で鼻内または経口投与のいずれかでチャレン
ジした。９日間にわたり毎日糞便放出を監視することに
より、腸コロニー形成の持続時間を測定した。糞便材料
を無菌PBS中に乳化し、アリコートをCampylobacter血液
寒天上にプレーティングした。プレートを微好気性条件
（Campylobacter GasPak,BBL）下35℃で３〜５日間イン
キュベーションしてC.jejuniを増殖させた。コロニー形
成の結果は、ある試料採取日にCampylobacter生物を放
出する動物のパーセントで表す。
図７に示すとおり、すべての鼻内チャレンジ動物は免
疫したものも対照も共に、チャレンジ直後（１日目）に
生物を放出した。該対照動物の80〜100％がチャレンジ
後９日間コロニーを形成したままであった。これとは対
照的に、該ワクチン接種群では、その９日間のアッセイ
期間中に生物を放出した動物は有意に少なかった。チャ
レンジ生物のクリアランスの程度および時間は、投与し
たワクチン量に依存していた。低い（105粒子／用量）
および中程度（107粒子／用量）のワクチン用量は、ゆ
るやかで不十分なクリアランス速度を与えた。アジュバ
ントの存在はこれらの用量での防御の程度を増加させ
た。驚くべきことに、試験した最も高い用量（109粒子
／用量）では、匹敵用量をLTアジュバントと共に投与し
た場合に得られるものと同等または若干これを上回る程
度の防御が非アジュバント化ワクチンにより得られた。
経口的にワクチン接種した動物にその後経口的にチャ
レンジした場合に同様の結果が得られた（図８を参照さ
れたし）。これらの結果は、本発明方法により増殖させ
た不活化Campylobacterでの免疫によりその後の生きたC
ampylobacterのチャレンジに対する防御が得られ、アジ
ュバントを用いないで経口的に投与した場合であっても
該免疫が有効であることを示す。
本発明方法（例えば実施例５を参照されたし）により
増殖させたホルマリン固定全細胞Campylobacter jejuni
を腹腔内（IP）投与した場合の防御的効力も評価した。
これらの実験のために、エンドトキシンを含まないPBS
0.5ml中の1.3×1010、2.5×109、5.0×108、1.0×108ま
たは2.0×107個の不活化C.jejuni粒子の単一用量をアジ
ュバントなしで20匹の雌Balb/cマウスの群に投与した。
14日後、生きたC.jejuni81−176（エンドトキシンを含
まないPBS中約1.0×1010CFU）の単一致死用量で該動物
の腹腔内へチャレンジした。４日間毎日、死亡率につい
て動物を監視した。
表17に示すとおり、5.0×108個の不活化C.jejuni粒子
の単一の腹腔内用量により、生きたC.jejuniチャレンジ
に対して動物を防御するのに十分な免疫応答が誘導され
た。
12 実施例:ShigellaのDOC増強侵入性、コンゴーレッド
結合および免疫交差反応性 実施例35 in vitroで増殖させたShigella sp.の侵入性は、培養
の増殖期に影響される。通常に増殖させた（BHI）また
は実施例９で例示される本発明方法により増殖させた
（ここでは、該細胞は初期対数期培養からのものであ
る）（DOC−EL）、または実施例９により増殖させた
（ただし、該細胞を収穫する前に該培養を後期対数期に
到達させた）（DOC−LL）Shigella flexneri2457T細胞
の侵入性を、実施例28に記載の方法により調べた。その
結果は、DOCによる培養が侵入性を増強し、初期対数増
殖期に最大増強が得られることを示す（図９を参照され
たし）。
本発明方法によるDOCを用いた培養は、他のShigella
種であるS.sonneiおよびS.dysentariaeの侵入性も増強
する（図10を参照されたし）。分極上皮細胞では、増強
されたShigellaの侵入性は、該細菌が該上皮細胞に基底
外側で感染した場合にのみ観察された。この知見は、in
vivoで観察される侵入過程と一致する。
比較研究は、本発明方法により増殖させたShigella
が、Popeら（Infect.＆ Immun.,63:3642−3648 1995）
により記載されている方法により調製したShigellaより
約10培高い侵入性を有することを示す。
実施例36 本発明方法により培養したShigellaは増強されたコン
ゴーレッド結合も示す。通常に増殖させた（BHI）また
は実施例９で例示される本発明方法により増殖させたS.
flexneri2457TおよびS.sonneiを、それらの染料結合能
について上記実施例26に記載の方法によりアッセイし
た。その結果は、DOC中の増殖がその２つのShigella種
によるコンゴーレッド結合を10〜20倍増強したことを示
す（表18を参照されたし）。
Shigellaは４つの種および種々の血清型に分けられ
る。本発明方法により増殖させたShigella flexneriの
免疫交差反応性を、実施例28に記載の凝集アッセイによ
り検討した。該アッセイでは、免疫ウサギからの抗血清
を使用して、異なるShigella種の免疫交差反応性に対す
る培養条件の影響を判定した。実施例９の方法により増
殖させたホルマリン固定Shigella flexneri2457Tで該ウ
サギを免疫した。該免疫動物から得たIgG抗体の凝集活
性を、BHI培地中で通常に増殖させたまたは本発明方法
（例、実施例９）により増殖させた４つのShigella種す
べてに対して調べた。該凝集アッセイの結果は、DOCを
用いた増殖が、抗S.flexneri抗体に対する相同Shigella
flexneriの凝集活性ならびに３つの非相同Shigella種
の凝集活性を有意に増強したことを示す（図11を参照さ
れたし）。
13 実施例:Shigellaのワクチン効力 実施例37 本発明方法により増殖させたホルマリン固定全細胞Sh
igella flexneriの防御効力を、C.P.Mallettら（Vaccin
e,11:190−196,1993）により開発されたマウス鼻内チャ
レンジモデルを用いて判定した。簡単に言えば、実施例
９で例示される方法によりShigella flexneriを増殖さ
せ収穫し、実施例30に記載のとおりに0.075％ホルマリ
ンで不活化した。約107個の不活化細菌粒子を用いて、1
4〜16週齢の雌Balb/cマウスにワクチン接種した。エン
ドトキシンを含まない無菌PBSに該不活化S.flexneriを1
08粒子/mlの濃度で懸濁し、この物質35μｌを10匹の軽
く麻酔した動物群に鼻内投与した。14日間隔で合計３回
の免疫を行った。
Shigella全細胞ワクチンの防御能に対するアジュバン
トの影響を調べるために、不活化ワクチンおよびE.coli
からの５μｇの熱不安定エンテロトキシン（LT）を含有
する懸濁液を用いて動物群を免疫した。第３免疫の14日
後に、生きたS.flexneriまたはS.sonneiのいずれかの亜
致死消耗用量（sublethal wasting dose）（105CFU）で
動物を鼻内チャレンジした。該チャレンジ直前および該
チャレンジ後１、２、５、および７日目に動物の体重を
測り、平均群体重を求めた。結果を表19に示す。
本発明方法により増殖させた不活化S.flexneriよりな
るワクチンで免疫したマウスは、生きたS.flexneri生物
によるチャレンジに対して防御されていた。それらのマ
ウスは、ワクチン接種を受けていないマウス（すなち、
擬似対照群）と比べて、体重減少が少なく、体重の回復
が速かった。驚くべきことに、S.flexneriワクチンは、
生きたS.sonneiによるチャレンジに対してもマウスを防
御した。興味深いことに、LTアジュバントなしでワクチ
ンを単独で投与された動物は、アジュバント化ワクチン
を投与された動物と同程度に、相同S.flexneriチャレン
ジに対して防御された。また、S.flexneriワクチンは単
独で、S.sonneiによる非相同チャレンジに対する防御を
与えた。しかしながら、該LTアジュバントを含有させる
ことにより、S.sonneiによるチャレンジに対する防御が
増強されたことは注目に値する。これらの知見は、本発
明方法により調製された不活化Shigellaよりなるワクチ
ンが、認められたShigella疾病モデルに有効であり、種
々のShigella感染を予防または弱めるのにアジュバント
は必要でないことを示す。
14 実施例：動物細胞に対するH.pyloriの付着性に影響
を及ぼす因子 実施例38 H.pyloriの付着は、グリココール酸塩または胆汁中の
増殖により強化される。H.pyloriのNB3−２またはG1−
４株の細胞を、４％子ウシ血清を含むBHI培地へ加え
た。接種後、該フラスコを10％CO2−５％O2−85％N2で
フラッシュし、振盪しながら37℃で22時間インキュベー
ションした。このインキュベーションの後、種々の濃度
（0.025％〜0.2％）のウシ胆汁を含有する４％子ウシ血
清を含むBHI培地１リットルを含有するフラスコへ１〜1
0倍に該培養物を希釈した。これらの培養物を同じ気体
混合物で再度フラッシュし、37℃でインキュベーション
した。18時間までの種々の時点で該細胞を収穫し、実施
例28に記載した方法により、INT−407細胞に対するそれ
らの付着をアッセイした。その結果は、胆汁と共に培養
することにより、INT−407細胞に対するH.pyloriの付着
性が増強されることを示す（図12および13を参照された
し）。NB3−２株の場合、ピーク付着（非増強培養物の
付着に対して４〜６倍の増加）は増殖の約８時間後に生
じた（図12）。G1−４株では、ピーク付着（非増強培養
の付着に対して２〜３倍の増加）は0.2％胆汁中で12〜1
4時間の増殖の間に生じた（図13）。一般に、これらの
「ピーク」時は、各株の培養が対数増殖期にある時期に
対応する。
15 実施例：本発明方法により増殖させたHelicobacter
のワクチン効力 実施例39 本発明方法により増殖させたホルマリン固定全細胞He
licobacter pyloriの防御効力を、Chenら（Lancet,339:
1120−1121,1992）により記載されているマウスHelicob
acter felis胃コロニー形成モデルを用いて判定した。
４％子ウシ血清を含有するBHI培地中、10％CO2、90％空
気下37℃で22時間、Helicobacter pyloriG1−４株を種
培養として増殖させた。この培養物のアリコートを用い
て、0.1％（v/v）ウシ胆汁を含有する10倍容の同じ培地
に接種した。37℃で12〜14時間増殖させた後、該細胞を
遠心分離により収穫し、室温にて原容量の1/10のハンク
ス平衡塩溶液（HBSS）に再懸濁した。細胞を再度遠心分
離し、原容量の1/100のHBSSに再懸濁した。該緩衝化細
胞懸濁液にホルマリンを0.075％の濃度になるまで加
え、該懸濁液を室温で６時間撹拌し次いで該溶液を４℃
で18時間冷却することにより該細胞を不活化した。
Helicobacterを有さない６〜８週齢の雌Balb/cマウス
にこの不活化全細胞ワクチンの３用量を、０、７および
14日目または０、７および21日目に経口投与することに
より、ルーチンに防御潜在性を測定した。１用量あたり
109個の細菌粒子の用量をE.coliの熱不安定エンテロト
キシンと組み合わせて評価した。第３免疫量投与の14日
後に、生きたH.felsの単一用量（107CFU/用量）で動物
を経口チャレンジした。
チャレンジの２週間後に該動物を犠牲にし、ウレアー
ゼ活性に関して洞胃セグメント（antral stomach segme
nt）を分析してH.felisの存在を判定した。ウレアーゼ
活性は、洞組織サンプルをスチュアートウレアーゼ培地
（Remel）0.5ml中室温で４〜24時間インキュベーション
することにより測定した。この時間内に生じた透明から
赤への変色を陽性ウレーゼの結果とみなした。
表20に示すとおり、H.pyloriG1−４株を用いて調製し
た増強Helicobacter全細胞ワクチンの投与により、H.fe
lis経口チャレンジに対して動物が防御された。
これらの実験の結果は、増強された腸内細菌の性質と
in vivo免疫原性との関連性を示す。
本発明の方法は、防御的免疫応答誘導能を有する細菌
を生産するため、ワクチンとして有用である。
16 微生物の寄託 以下の微生物は、American Type Culture Collectio
n,12301 Parklawn Drive,Rockville,Maryland 20852,US
Aに寄託されており、以下に示す受託番号を有する。
微生物 受託番号 寄託日 Helicobacter pylori NB3−２ 1995年９月29日 Helicobacter pylori G1−４ 1995年９月29日 当業者であれば本発明の方法の他の均等物を容易に決
めることができ、かかる均等物も本発明に包含されると
意図される。以上の開示は、特許請求する発明を当業者
が実施するのを可能にするために必須と考えられるすべ
ての情報を含む。該引用特許または刊行物はさらに有用
な情報を提供しうるため、本明細書中に引用した資料は
その全体を出典明示により本明細書の一部とする。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｐ 31/04 Ａ６１Ｐ 31/04 Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｆ (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:19 (Ｃ１２Ｎ 1/20 1:63 Ｃ１２Ｒ 1:63） Ｃ１２Ｒ 1:42 (Ｃ１２Ｎ 1/20 1:01 Ｃ１２Ｒ 1:42） (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:01） (31)優先権主張番号 ０８／５３８，５４５ (32)優先日 平成７年10月３日(1995．10．3) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） 前置審査 (72)発明者 ウォーカー，リチャード，アイ. アメリカ合衆国 20878 メリーランド 州，ゲイザーズバーグ，ブリスコー ス トリート 120 (72)発明者 フレイ，スティーヴン，エム. アメリカ合衆国 20874 メリーランド 州，ジャーマンタウン，クロス リッジ ウェイ 12529 (56)参考文献 Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，Ｖｏｌ. 174，Ｎｏ．１，ｐ．１−７（1992) 94ｔｈ Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍｉｃｒｏｂ ｉｏｌ．Ｍｅｅｔｉｎｇ，ｐ．386，Ａ ｂｓｔｒａｃｔ Ｐ−96（1994) 93ｒｄ Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍｉｃｒｏｂ ｉｏｌ．Ｍｅｅｔｉｎｇ，Ｓｅｓｓｉｏ ｎ 133，Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｂ−147 （1993) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 1/20 ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (4)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】カンピロバクター種（Campylobacter s
    p.）、エルシニア種（Yersinia sp.）、バクテロイデス
    種（Bacteroides sp.）、クレブシェラ種（Klebsiella
    sp.）、ガストロスピリラム種（Gastrospirillum s
    p.）、エンテロバクター種（Enterobacter sp.）、サル
    モネラ種（Salmonella sp.）、アエロモナス種（Aeromo
    nas sp.）、ビブリオ種（Vibrio sp.）、クロストリジ
    ウム種（Clostridium sp.）、エンテロコッカス種（Ent
    erococcus sp.）および腸出血性エシェリキア・コリ（e
    nterohemorrhagic Escherichia coli）よりなる群から
    選ばれる、増強された抗原特性を有する腸内細菌の作出
    方法であって、腸内細菌の培養物をin vitroで、 ａ）約0.05％〜約３％の胆汁、または約0.025％〜約0.6
    ％の１種以上の胆汁酸もしくはその塩； ｂ）約30℃と約42℃の間の温度； ｃ）空気中または微好気性条件下、ここで微好気性条件
    はｉ）約５％〜約20％のCO2と約80％〜約95％の空気、i
    i）約５％〜約20％のCO2と約80％〜約95％のN2、または
    iii）約５％〜約10％のO2と約10％〜約20％のCO2と約70
    ％〜約85％のN2からなる；および ｄ）０〜約100μＭのBAPTA/AM、０〜約10mMのEGTA、お
    よび０〜約100μＭのEGTA/AMよりなる群から選ばれる２
    価カチオンキレート剤； を含む条件の組合せのもとで、該培養物が早期対数期付
    近、早期対数期と定常期の間、または定常期付近の成長
    相に至るように十分な時間成長させることを含んでなる
    方法。
  2. 【請求項２】カンピロバクター種がカンピロバクター・
    ジェジュニ81−176株であり、前記条件の組合せが ａ）約0.1％のデオキシコール酸塩である胆汁塩または
    約0.8％の胆汁； ｂ）約37℃の温度； ｃ）約10％〜約20％のCO2と約80％〜約90％の空気； を含み、前記培養物が定常期に至るように十分な時間該
    培養物を成長させる、請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】カンピロバクター種、エルシニア種、バク
    テロイデス種、クレブシェラ種、ガストロスピリラム
    種、エンテロバクター種、サルモネラ種、アエロモナス
    種、ビブリオ種、クロストリジウム種、エンテロコッカ
    ス種および腸出血性エシェリキア・コリよりなる群から
    選ばれる、増強された抗原特性を有する腸内細菌であっ
    て、 ａ）約0.05％〜約３％の胆汁、または約0.025％〜約0.6
    ％の１種以上の胆汁酸もしくはその塩； ｂ）約30℃と約42℃の間の温度； ｃ）空気中または微好気性条件下、ここで微好気性条件
    はｉ）約５％〜約20％のCO2と約80％〜約95％の空気、i
    i）約５％〜約20％のCO2と約80％〜約95％のN2、または
    iii）約５％〜約10％のO2と約10％〜約20％のCO2と約70
    ％〜約85％のN2からなる；および ｄ）０〜約100μＭのBAPTA/AM、０〜約10mMのEGTA、お
    よび０〜約100μＭのEGTA/AMよりなる群から選ばれる２
    価カチオンキレート剤； を含む条件の組合せのもとでin vitroで成長させた腸内
    細菌の培養物から回収され、該培養物が早期対数期付
    近、早期対数期と定常期の間、または定常期付近にある
    腸内細菌。
  4. 【請求項４】カンピロバクター種がカンピロバクター・
    ジェジュニ81−176であり、前記条件の組合せが ａ）約0.1％のデオキシコール酸塩または約0.8％の胆
    汁； ｂ）約37℃の温度； ｃ）約10％〜約20％のCO2と約80％〜約90％の空気； を含み、前記培養物が定常期にある、請求項３に記載の
    腸内細菌。
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Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SG90030A1 (en) * 1994-10-05 2002-07-23 Microcarb Inc Methods for producing enhanced antigenic helocobacter sp. and vaccines comprising same
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CN109633151B (zh) * 2018-12-26 2022-03-11 西北农林科技大学 一种肠炎沙门氏菌检测方法、试纸条及应用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH06503231A (ja) * 1991-09-18 1994-04-14 アムジエン・インコーポレーテツド 胆汁酸塩を含有するｂ型肝炎ワクチン製剤

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
９３ｒｄ Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｅｔｉｎｇ，Ｓｅｓｓｉｏｎ １３３，Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｂ−１４７（１９９３）
９４ｔｈ Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｅｔｉｎｇ，ｐ．３８６，Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｐ−９６（１９９４）
Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，Ｖｏｌ．１７４，Ｎｏ．１，ｐ．１−７（１９９２）

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