PL182700B1 - Sposób wytwarzania bakterii jelitowej o wzmocnionych właściwościach antygenowych, bakteria jelitowa o wzmocnionych właściwościach antygenowych i szczepionka do pobudzania reakcji odpornościowej - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania bakterii jelitowej o wzmocnionych właściwościach antygenowych, która to bakteria jelitowa wybrana jest z grupy obejmującej Campylobacter sp., Yersinia sp., Bacteroides sp., Klebsiella sp., Gastrospirillum sp., Enterobacter sp.. Salmonella sp., Shigella sp., Aeromonas sp., Vibrio sp., Clostridium sp., Enterococcus sp. i Escherichia coli, polegający na tym, że prowadzi się hodowlę bakterii jelitowej in vitro w kombinacji warunków na które składa się zastosowanie około 0,05-3% żółci albo około 0,025-0,6% jednego lub więcej kwasów żółciowych lub ich soli, w temperaturze 30-42°C; w powietrzu lub w warunkach mikroaerofilowych, przy czym warunki mikroaerofilowe obejmują około 5-20% CO2 i około 80-95% powietrza; około 5-20% CO2 i około 80-95% N3; albo około 5-10% O2, około 10-20% CO2 i około 70-85% N2; oraz ewentualnie środek chelatujący kationy dwuwartościowe wybrany z grupy obejmującej od 0 do około 100 μΜ, BAPTA/AM, od 0 do około 10 μΜ EGTA i od 0 do około 100 μΜ EGTA/AM; przez okres czasu wystarczający do osiągnięcia przez hodowlę fazy wzrostu zbliżonej do wczesnej fazy wykładniczej, pomiędzy wczesną fazą wykładniczą i fazą stacjonarną lub zbliżonej do fazy stacjonarnej.

W korzystnym wykonaniu wynalazku jako sól żółciową stosuje się dezoksycholan lub glikocholan. Korzystnie stosowanymi w sposobie według wynalazku bakteriami są bakterie jelitowe takie jak Campylobacter sp., Campylobacter jejuni lub Campylobacter coli. Jeszcze bardziej korzystnie w sposobie według wynalazku jako Campylobacter jejuni stosuje się szczep Campylobacter jejuni wybrany z grupy obejmującej szczep 81-176, 81-116, i HC. Najbardziej korzystnie Campylobacter jejuni stanowi szczep Campylobacter jejuni 81-176, a kombinacja warunków obejmuje zastosowanie około 0,1% soli żółciowej w postaci dezoksycholanu lub około 0,8% żółci; temperatury około 37°C; atmosfery zawierającej około 1020% CO2 i około 80-90% powietrza, oraz przeprowadzenie hodowli przez okres czasu wystarczający do osiągnięcia przez hodowlę fazy stacjonarnej.

Również korzystnie w sposobie według wynalazku można stosować bakterię jelitową stanowi Shigella sp. Bardziej korzystnie gatunek Shigella wybrany jest z grupy obejmującej flexneri, sonnei, dysenteriae i boydii. Jeszcze bardziej korzystnie Shigella stanowi Shigella flexneri lub Shigella dysenteriae. A najkorzystniej realizacja sposobu według wynalazku może przebiegać przy zastosowaniu Shigella flexneri stanowiącej szczep Shigella flexneri 2457T, a kombinacja warunków obejmuje zastosowanie około 0,1% dezoksycholanu lub około 0,8%

182 700 żółci; temperatury około 37°C; powietrza jako atmosfery oraz hodowlę prowadzi się przez okres czasu wystarczający do osiągnięcia przez hodowlę wczesnej fazy wykładniczej.

W korzystnym wykonaniu wynalazku bakterię jelitową może stanowić także Yersinia sp. lub Escherichia coli.

Bardziej korzystnie w sposobie według wynalazku stosuje się Escherichię coli stanowiącą enterotoksyczny, powodujący krwawienie jelit, entero-patogeniczny lub enteroinwazyjny szczep Escherichia coli. Bardziej korzystnie bakterię jelitową stanowi Vibrio sp.lub Salmonella sp., lub Bacteroides sp., lub Clostridium sp., lub Enterococcus sp., lub Klebsiella sp., lub Enterobacter sp., lub Gastrospirillum sp.

Przedmiotem wynalazku jest także wytwarzanie bakterii jelitowej o wzmocnionych właściwościach antygenowych, która to bakteria jelitowa wybrana jest z grupy obejmującej Campylobacter sp., Yersinia sp., Bacteroides sp., Klebsiella sp., Enterobacter sp., Gastrospirillum sp.. Salmonella sp., Shigella sp., Aeromonas sp., Vibrio sp., Clostridium sp., Enterococcus sp. i Escherichia coli, polegający na tym, że prowadzi się hodowlę bakterii jelitowej in vitro w kombinacji warunków obejmującej zastosowanie środka chelatującego kationy dwuwartościowe wybranego z grupy obejmującej około 1,0-25 μΜ, BAPTA/AM, około 0,510 μΜ EGTA i około 1,0-100 μΜ EGTA/AM; w temperaturze 30-42°C; w powietrzu lub w warunkach mikroaerofilowych, przy czym warunki mikroaerofilowe obejmują około 5-20% CO₂ i około 80-95% powietrza; około 5-20% CO2 i około 80-95% N2; albo około 5-10% O2, około 10-20% CO2 i około 70-85% N2; przez okres czasu wystarczający do osiągnięcia przez hodowlę fazy wzrostu zbliżonej do wczesnej fazy wykładniczej, pomiędzy wczesną fazą wykładniczą i fazą stacjonarną lub zbliżonej do fazy stacjonarnej.

Przedmiotem wynalazku jest także bakteria jelitowa o wzmocnionych właściwościach antygenowych, która to bakteria jelitowa wybrana jest z grupy obejmującej Campylobacter sp., Yersinia sp., Bacteroides sp., Klebsiella sp., Gastrospirillum sp., Enterobacter sp., Salmonella sp., Shigella sp., Aeromonas sp., Vibrio sp., Clostridium sp., Enterococcus sp. i Escherichia coli, charakteryzująca się tym że została zebrana z hodowli bakterii jelitowej prowadzonej in vitro w kombinacji wanmków obejmującej zastosowanie około 0,05-3% żółci albo około 0,025-0,6% jednego lub więcej kwasów żółciowych lub ich soli, w temperaturze 3042°C; w powietrzu lub w warunkach mikroaerofilowych, przy czym warunki mikroaerofilowe obejmują około 5-20% CO2 i około 80-95% powietrza; około 5-20% CO2 i około 80-95% N2; albo około 5-10% CO2, około 10-20% CO2 i około 70-85% N2; oraz ewentualnie środek chelatujący kationy dwuwartościowe wybrany z grupy obejmującej od 0 do około 100 μΜ, BAPTA/AM, od 0 do około 10 μΜ EGTA i od 0 do około 100 μΜ EGTA/AM; przez okres czasu wystarczający do osiągnięcia przez hodowlę fazy wzrostu zbliżonej do wczesnej fazy wykładniczej, pomiędzy wczesną fazą wykładniczą i fazą stacjonarną lub zbliżonej do fazy stacjonarnej. Korzystnie bakteria jelitowa została zebrana z hodowli prowadzonej w warunkach uwzględniających jako sól żółciową - dezoksycholan lub glikocholan. Również korzystnie bakterią jelitową jest bakteria jelitowa stanowiąca Campylobacter sp., a bardziej korzystnie bakteriąjelitowąjest Campylobacter jejuni lub Campylobacter coli. Najbardziej korzystnie bakteria jelitowa Campylobacter jejuni stanowi szczep Campylobacter jejuni wybrany z grupy obejmującej szczep 134, 195, 170, 81-176, 6, 81-116, 35, 52, VC-167, 88, 244, 544, 699, 1180, 910 i HC. Najkorzystniej, bakteria jelitowa Campylobacter jejuni stanowi szczep Campylobacter jejuni 81-176, a kombinacja warunków obejmuje zastosowanie około 0,1% soli żółciowej w postaci dezoksycholanu lub około 0,8% żółci; temperaturę około 37°C; atmosferę zawierającą około 10-20% CO2 i około 80-90% powietrza, oraz hodowlę prowadzi się przez okres czasu wystarczający do osiągnięcia przez hodowlę fazy stacjonarnej.

Korzystnie bakterię jelitową stanowi Shigella sp., albo gatunek Shigella wybrany z grupy obejmującej flexneri, sonnei, dysenteriae i boydii. Bardziej korzystnie bakterię jelitową Shigella stanowi Shigella dysenteriae, lub Shigella flexneri. Najbardziej korzystnie bakterię jelitową - Shigella flexneri stanowi szczep Shigella flexneri 2457T, a kombinacja warunków obejmuje zastosowanie około 0,1% dezoksycholanu lub około 0,8% żółci; temperaturę około 37°C; powietrze jako atmosferę oraz hodowlę prowadzi się przez okres czasu wystarczający do osiągnięcia przez hodowlę wczesnej fazy wykładniczej.

182 700

Również korzystnie bakterię jelitową stanowi Escherichia coli., lub bardziej korzystnie enterotoksyczny, powodujący krwawienie jelit, entero-patogeniczny lub entero-inwazyjny szczep Escherichia coli.

Bakterię jelitową według wynalazku może korzystnie stanowić Vibrio sp. lub Salmonella sp., lub Bacteroides sp., lub Clostridium sp., lub Enterococcus sp., lub Klebsiella sp., lub Enterobacter sp, lub Gastrospirillum sp.

Przedmiotem wynalazku jest bakteria jelitowa o wzmocnionych właściwościach antygenowych, która to bakteria jelitowa wybrana jest z grupy obejmującej Campylobacter sp., Yersinia sp., Bacteroides sp., Klebsiella sp., Gastrospirillum sp., Enterobacter sp.. Salmonella sp., Shigella sp., Aeromonas sp., Vibrio sp., Clostridium sp., Enterococcus sp. i Escherichia coli.

Przedmiotem wynalazku jest także szczepionka do pobudzania reakcji odpornościowej u zwierzęcia, charakteryzująca tym, że zawiera bakterię jelitową o wzmocnionych właściwościach antygenowych lub jej składniki wybrane z grupy obejmującej Campylobacter sp., Yersinia sp., Bacteroides sp., Klebsiella sp., Gastrospirillum sp., Enterobacter sp., Salmonella sp., Shigella sp., Aeromonas sp., Vibrio sp., Clostridium sp., Enterococcus sp. i Escherichia coli, albo ich immunogeniczny fragment lub pochodną o wzmocnionych właściwościach antygenowych oraz ewentualnie farmaceutycznie dopuszczalny nośnik lub rozcieńczalnik.

Korzystnie szczepionka według wynalazku zawiera bakterię jelitową Campylobacter jejuni lub Campylobacter coli., lub bardziej korzystnie jako Campylobacter jejuni zawiera Campylobacter j ej uni 81 -176.

Również korzystnie w szczepionce według wynalazku jako bakterię jelitową stosuje się Shigella sp., lub bardziej korzystnie jako Shigella sp. stosuje się gatunek bakterii wybrany z grupy obejmującej flaxneri, sonnei, dysynteriae i boydii. Można także korzystnie jako Shigella flexneri stosować szczep Shigella flexneri 2457T.

Korzystnym jest także użycie w szczepionce według wynalazku bakterii jelitowej Escherichię coli, a bardziej korzystnie enterotoksycznego, powodującego krwawienie jelit, entero-patogenicznego lub entero-inwazyjnego szczepu Escherichia coli.

W szczepionce tej można także korzystnie stosować bakterię jelitową - Vibrio sp., lub Salmonella sp., lub Bacteroides sp., lub Clostridium sp., lub Enterococcus sp., lub Klebsiella sp., lub Enterobacter sp., lub Gastrosporillum sp. .

Korzystnie szczepionka według wynalazku zawiera bakterię jelitową którą stanowi zdezaktywowana bakteria jelitowa. Korzystnie bakterie jelitowe dezaktywowane są przez obróbkę formaliną. Korzystnie szczepionka może być w postaci do podawania dośluzówkowego lub pozajelitowego, albo dośluzówkowego i pozajelitowego. Szczepionka według wynalazku dodatkowo może zawierać adiuwant.

Tak jak opisano powyżej wynalazek dostarcza określonych warunków hodowli i składników wprowadzanych do ośrodków hodowli bakterii jelitowych w celu indukowania lub wzmacniania obecności czynników wirulencji i innych antygenów. Korzystnie takie antygeny są immunogeniczne. Jeszcze korzystniej występuje korelacja pomiędzy takimi immunogenicznymi antygenami i oznakami zjadliwości.

Bakterie jelitowe hoduje się w warunkach i w obecności składników imitujących pewne warunki in vivo, na jakie organizmy napotykają w naturze. Sposobami według wynalazku uzyskuje się antygenowe wzmocnione bakterie jelitowe ze zmianami fenotypowymi takimi jak zwiększona całkowita ilość białka w komórce, nowe lub występujące w zwiększonej ilości poszczególne białka, zmienione lub występujące w zwiększonej ilości węglowodany powierzchniowe, zmienione powierzchniowe lipopolisacharydy, zwiększone wewnątrzkomórkowe rozszerzanie się bakterii. Ponadto sposoby według wynalazku można przystosować do praktycznego powiększania skali fermentacji przy zastosowaniach przemysłowych. Takie antygenowe wzmocnione bakterie jelitowe można wykorzystywać do wytwarzania ochronnych szczepionek takich jak szczepionki ze zdezaktywowanych pełnych komórek lub ich części, albo w celach diagnostycznych, np. do wytwarzania przeciwciał i wykrywania chorobotwórczych bakterii jelitowych, lub do wytwarzania antybiotyków. Ponadto przeciwciała indukowane przez wzmocnione bakterie jelitowe według wynalazku można zastosować jako szczepionki pasywne.

182 700

Sposób wytwarzania bakterii jelitowych wybranych z grupy obejmującej Campylobacter sp., Yersinia sp., Helicobacter sp., Gastrospirillum sp., Bacteroides sp., Klebsiella sp., Enterobacter sp., Salmonella sp., Shigella sp., Aeromonas sp., Vibrio sp., Clostridium sp., Enterococcus sp. i Escherichia coli o wzmocnionych właściwościach antygenowych, biegnie aż do osiągnięcia fazy wzrostu zbliżonej do wczesnej fazy wykładniczej, pomiędzy wczesną fazą wykładniczą i fazą stacjonarną lub zbliżonej do fazy stacjonarnej, w powietrzu lub w warunkach mikroaerofilowych, np. w obecności 5-20% CO2 i 80-95% powietrza; 5-20% CO2 i 8095% N2; albo 5-10% O2, 10-20% CO2 i 70-85% N2; oraz ewentualnie w obecności środka chelatującego kationy dwuwartościowe, takiego jak, ale nie wyłącznie, 0-100 μΜ, korzystnie 25 μΜ BAPTA/AM, 0-10 μΜ EGTA i 0-100 μΜ EGTA/AM; albo b) w warunkach takich jak w a), ale w obecności środka chelatującego kationy dwuwartościowe, takiego jak, ale nie wyłącznie, 1,0-100 μΜ, korzystnie 25 μΜ BAPTA/AM, 0,5-10 μΜ EGTA lub 1-100 μΜ EGTA/AM, ale bez żółci, kwasów żółciowych lub soli żółciowych.

Według wynalazku stężenia poszczególnych kwasów żółciowych lub ich soli wynoszą 0,025-0,6%, korzystnie 0,05-0,5%, jeszcze korzystniej 0,05-0,2%, a najkorzystniej 0,05-0,1%. Korzystne są sposoby, w których jako kwas żółciowy lub jego sól stosuje się dezoksycholan lub glikocholan.

W wyniku szczepienia szczepionką według wynalazku uzyskuje się przeciwciała (w tym np., ale nie wyłącznie, przeciwsurowice, oczyszczone przeciwciała IgG lub IgA, fragment Fab itp.), które są zdolne do wiązania się z co najmniej jedną antygenową determinantą bakterii jelitowych według wynalazku. Takie poliklonalne i monoklonalne przeciwciała są przydatne jako odczynniki w testach immunologicznych do wykrywania bakterii jelitowych u zwierzęcia lub w pobranej z niego próbce biologicznej. Poliklonalne i monoklonalne przeciwciała są również przydatne jako pasywne szczepionki do stosowania w ochronie przed infekcjami i chorobami powodowanymi przez bakterie jelitowe.

Przy pomocy bakterii jelitowych o wzmocnionych właściwościach antygenowych według wynalazku możliwe jest zrealizowanie sposobu in vitro testowania potencjalnych środków przeciwbakteryjnych, zgodnie z którym kontaktuje się bakterie jelitowe o wzmocnionych właściwościach antygenowych, wybrane z grupy obejmującej Campylobacter sp., Yersinia sp., Helicobacter sp., Gastrospirillum sp., Bacteroides sp., Klebsiella sp., Enterobacfcer sp., Salmonella sp., Shigella sp., Aeromonas sp., Vibrio sp., Clostridium sp., Enterococcus sp. i Escherichia coli, z tymi potencjalnymi środkami oraz testuje się działania bakteriobójcze lub bakteriostatyczne.

Można także w oparciu o bakterie według wynalazku wytworzyć sposób in vitro wykrywania wytwarzania przez gospodarza przeciwciał, albo wykrywania bakterii jelitowych u zwierzęcia lub w pobranej z niego próbce biologicznej, polegający na tym, że kontaktuje się próbkę biologiczną pobraną od gospodarza z bakteriami jelitowymi według wynalazku o wzmocnionych właściwościach antygenowych, wybranymi z grupy obejmującej Campylobacter sp., Yersinia sp., Helicobacter sp., Gastrospirillum sp., Bacteroides sp., Klebsiella sp., Enterobacter sp., Salmonella sp., Shigella sp., Aeromonas sp., Vibrio sp., Clostridium sp., Enterococcus sp. i Escherichia coli, ich antygenami lub przeciwciałami względem nich, oraz przeprowadza się selekcję względem oddziaływań przeciwciało:antygen. Praktycznie wykrywanie wytwarzania przez gospodarza przeciwciał można przeprowadzić przy pomocy zestawu diagnostycznego do wykrywania bakterii jelitowych obejmujących bakterie jelitowe wzmocnionych właściwościach antygenowych, wybrane z grupy obejmującej Campylobacter sp., Yersinia sp., Helicobacter sp., Gastrospirillum sp., Bacteroides sp., Klebsiella sp., Enterobacter sp., Salmonella sp., Shigella sp., Aeromonas sp., Vibrio sp., Clostridium sp., Enterococcus sp. i Escherichia coli, albo przeciwciała względem nich.

Wynalazek oparty jest w części na nieoczekiwanym odkryciu, że antygenowo wzmocnione bakterie jelitowe według wynalazku indukują reakcje odpornościowe, które krzyżowo chronią przed wieloma szczepami lub serotypami tych samych gatunków bakterii, silniejsze niż reakcje indukowane przez te same bakterie jelitowe, ale rosnące w warunkach zwykłej hodowli. Co najmniej w jednym przypadku reakcja odpornościowa indukowana przez antyge12

182 700 nowe wzmocnione bakterie jelitowe według wynalazku chroni krzyżowo przed różnymi gatunkami bakterii jelitowych.

Na fig. ΙΑ, IB i 1C przedstawiono graficznie wyniki wysokosprawnej chromatografii cieczowej monosacharydów z hydrolizatów powierzchniowego ekstraktu C. jejuni 81-176. Figura 1A: Wzorce: Fukoza Fuc, N-acetylogalaktozamina GalNac, N-acetyloglukozamina GIcNac, galaktoza Gal, glukoza Gic, mannoza Mań. Figura IB: ekstrakt powierzchniowy konwencjonalnie hodowanych bakterii BHI. Figura 1C: ekstrakty powierzchniowe bakterii hodowanych sposobami według wynalazku : DOC.

Figura 2 obrazowo przedstawia wyniki elektroforezy na żelu poliakrylamidowym z dodecylosiarczanem sodowym (SDS-PAGE), stanowiące porównanie białek z pełnych komórek (kolumny 1, 2 i 3) lub ekstraktów powierzchniowych (kolumna 5 i 6) C. jejuni 81-176 hodowanych konwencjonalnie BHI lub hodowanych sposobami według wynalazku (0/8% kwasów żółciowych Oxgall OX lub 0,1% dezoksycholanu DOC).

Figura 3 obrazowo przedstawia wyniki analizy metodą blottingu Westema stanowiące porównanie białek związanych przez śluz fretki zawierający Ig A uzyskany przez zainfekowanie pełnymi komórkami C. jejuni 81-176. Pełne komórki C. jejuni 81-176 hodowane konwencjonalnie 1; oraz pełne komórki C. jejuni 81-176 hodowane sposobami według wynalazku: 0,8% kwasów żółciowych Oxgall, 2, 0,1% dezoksycholanu, 3; powierzchniowe ekstrakty C. jejuni 81-176 hodowanych konwencjonalnie 4; oraz powierzchniowe ekstrakty C. jejuni 81-176 hodowanych sposobami według wynalazku, 0,1% dezoksycholanu, 5.

Figura 4 obrazowo przedstawia wyniki analizy metodą blottingu Westema stanowiące porównanie białek związanych przez swoiste względem flagelliny monoklonalne przeciwciało 72c z pełnych komórek C. jejuni 81-176 hodowanych sposobami według wynalazku, 3; hodowanych konwencjonalnie, 2; albo hodowanych w fermentatorze sposobami według wynalazku, 1.

Figura 5 obrazowo przedstawia wyniki SDS-PAGE stanowiące porównanie lipopolisacharydów (LPS) pełnych komórek S. flexneri 2457T hodowanych konwencjonalnie, kolumna 1, albo hodowanych sposobami według wynalazku, 0,1% dezoksycholanu, kolumna 2.

Figura 6 przedstawia graficznie wzmocnienie immunokrzyżowej reaktywności C. jejuni hodowanych sposobami według wynalazku. Komórki C. jejuni 81-176 hodowane konwencjonalnie lub sposobami według wynalazku, np. sposobem według przykładu 5 (DOC) zastosowano do indukowania przeciwciał. Pokazano aktywność aglutynacyjną dwóch typów przeciwciał (czyli anty-C. jejuni 81-176 hodowanych w BHI oraz anty-C. jejuni 81-176 hodowanych w DOC) w stosunku do różnych serotypów C. jejuni. Szczegóły podano w przykładzie 32 w sekcji 9.

Na fig. 7A, 7B i 7C przedstawiono graficznie skuteczność szczepionki zawierającej zdezaktywowane pełne komórki C. jejuni 81-176 w ochronie myszy przed prowokowaniem donosowo podawanymi żywymi komórkami C. jejuni 81-176. Myszy szczepiono roztworem soli buforowanym fosforanem (PBS, linia ciągła) ; PBS z dodatkiem adiuwanta LT (Adiuwant, linie przerywane); zdezaktywowane formaliną pełne komórki C. jejuni 81-176 hodowane i zbierane w sposób podany w przykładzie 5, bez adiuwanta (CWC, puste kółka/linia ciągła) lub z dodatkiem adiuwanta LT (CWC + Adiuwant, pełne kółka/linia ciągła). Skuteczność szczepionek oceniano na podstawie testu kolonizacji jelitowej. Na fig. 7A (górny wykres) przedstawiono wyniki ochrony uzyskiwanej przez zaszczepienie za pomocą 3 doustnych dawek w ilości 10⁵ zdezaktywowanych cząstek bakteryjnych/dawkę. Na fig. 7B (środkowy wykres) przedstawiono wyniki ochrony uzyskiwanej przez zaszczepienie za pomocą 3 doustnych dawek w ilości 10⁷ zdezaktywowanych cząstek bakteryjnych/dawkę. Na fig. 7C (dolny wykres) przedstawiono wyniki ochrony uzyskiwanej przez zaszczepienie za pomocą 3 doustnych dawek w ilości 10⁹ zdezaktywowanych cząstek bakteryjnych/dawkę. Szczegóły podano w przykładzie 34, sekcja 11.

Na fig. 8A, 8B i 8C przedstawiono graficznie skuteczność szczepionki zawierającej zdezaktywowane pełne komórki C. jejuni 81-176 w ochronie myszy przed prowokowaniem doustnie podawanymi żywymi komórkami C. jejuni 81-176. Myszy szczepiono w sposób podany w krótkim opisie do fig. 7A, 7B i 7C. Skuteczność szczepionek oceniano na podsta

182 700 wie testu kolonizacji jelitowej. Na fig. 7A (górny wykres) przedstawiono wyniki ochrony uzyskiwanej przez zaszczepienie za pomocą 3 doustnych dawek w ilości 10⁵ zdezaktywowanych cząstek bakteryjnych/dawkę. Na fig. 7B (środkowy wykres) przedstawiono wyniki ochrony uzyskiwanej przez zaszczepienie za pomocą 3 doustnych dawek w ilości 10⁷ zdezaktywowanych cząstek bakteryjnych/dawkę. Na fig. 7C (dolny wykres) przedstawiono wyniki ochrony uzyskiwanej przez zaszczepienie za pomocą 3 doustnych dawek w ilości 10⁹ zdezaktywowanych cząstek bakteryjnych/dawkę. Szczegóły podano w przykładzie 34, sekcja 9.

Na fig. 9 przedstawiono graficznie wpływ fazy wzrostu hodowli Shigellą flexneri na inwazyjność komórek Shigella flexneri 2457T. Komórki Shigella flexneri 2457T hodowano konwencjonalnie (BHI) lub sposobami według wynalazku, jak to opisano w przykładzie 9 (DOC-EL) - zbierając komórki, gdy hodowla była we wczesnej fazie wykładniczej, albo jak to opisano w przykładzie 9, ale umożliwiając osiągnięcie przez hodowlę późnej fazy wykładniczej przed zebraniem komórek (DOC-LL). Pokazano inwazyjność takich różnych preparatów. Szczegóły podano w przykładzie 35 w sekcji 12.

Na fig. 10 przedstawiono graficznie wzmocnienie inwazyjności komórek Shigella, gdy hoduje się je sposobami według wynalazku. S. sonnei i S. dysenteriae 3818 hodowano konwencjonalnie (BHI) lub sposobem według wynalazku opisanym w przykładzie 9. Pokazano inwazyjność różnych preparatów komórek Shigella względem komórek INT-407. Szczegóły podano w przykładzie 35 w sekcji 12.

Na fig. 12 przedstawiono graficznie wzmocnienie immunokrzyżowej reaktywności Shigella hodowanymi sposobami według wynalazku. S. flexneri 2457T hodowane sposobem według wynalazku opisanym w przykładzie 9 zastosowano do indukowania przeciwciał. Pokazano aktywność aglutynacyjną indukowanych przeciwciał przeciw serotypom S. flexneri, S. sonnei, S. dysenteriae i S. boydii hodowanym konwencjonalnie (BHI) lub sposobami według wynalazku, w przykładzie 9. Szczegóły podano w przykładzie 36 w sekcji 12.

Na fig. 12 przedstawiono graficznie wpływ stężenia żółci oraz fazy wzrostu hodowli Helicobacter pylon na przyczepność komórek Helicobacter pylori NB3-2. Komórki H. pylon NB3-2 hodowano w ośrodku hodowli zawierającym 0%, 0,025%, 0,05% i 0,1% żółci, zbierając je w 8, 10, 12 i 18 godzin po zaszczepieniu. Pokazano inwazyjność tych różnych preparatów komórek H. pylori NB3-2 w stosunku do komórek INT-407. Szczegóły podano w przykładzie 38 w sekcji 14.

Na fig. 13 przedstawiono graficznie wpływ stężenia żółci oraz fazy wzrostu hodowli Helicobacter pylori na przyczepność komórek Helicobacter pylori Gl-4. Komórki H. pylori Gl-4 hodowano w ośrodku hodowli zawierającym 0%, 0,1% lub 0,2% żółci, zbierając je w 6, 8, 10, 12, 14 i 16 godzin po zaszczepieniu. Pokazano inwazyjność tych różnych preparatów komórek H. pylori Gl-4 w stosunku do komórek INT-407. Szczegóły podano w przykładzie 38 w sekcji 15.

5. Szczegółowy opis wynalazku

Sposoby według wynalazku dotyczą hodowania bakterii jelitowych in vitro w pewnej kombinacji warunków z pewnymi składnikami wybranymi tak, aby indukować lub wzmacniać ekspresję antygenów i/lub czynników wilurencji.

W znaczeniu użytym w opisie i w zastrzeżeniach określenie jelitowe odnosi się do bakterii zazwyczaj znajdujących się w dowolnej części przewodu żołądkowo-jelitowego zwierzęcia lub związanych z nią, oraz dowolnych bakterii powodujących infekcję dowolnej części przewodu żołądkowo-jelitowego zwierzęcia. Do takich bakterii jelitowych należą zarówno bakterie Gram-dodatnie jak i Gram-ujemne.

W znaczeniu użytym w opisie i w zastrzeżeniach określenia składniki i warunki dotyczą wielu czynników związanych z naturalnym środowiskiem in vivo bakterii jelitowych, oraz innych czynników. Do takich składników i warunków należą, ale nie wyłącznie, żółć, kwasy żółciowe i ich sole albo ich biologiczni prekursorzy tacy jak cholesterol, pH, stan mikroaerofilowy, osmolamość oraz zbieranie albo zbiór bakterii w pożądanej fazie wzrostu bakteryjnego.

W znaczeniu użytym w opisie i w zastrzeżeniach określenie antygeny oraz związane z nim określenie antygenowy odnoszą się do antygenów lub charakterystyk antygenowych,

182 700 obejmujących, ale nie wyłącznie, makrocząsteczki odgrywające rolę w morfologii komórkowej lub w ruchliwości komórek; białka; w szczególności białka powierzchniowe, lipopolisacharydy i węglowodany. Korzystnie antygeny takie są immunogeniczne.

W znaczeniu użytym w opisie i w zastrzeżeniach określenie immunogeniczny odnosi się do zdolności do indukowania wytwarzania przeciwciał u zwierzęcia po wystawieniu tego zwierzęcia na działanie kompozycji zawierającej całe bakterie wytworzone sposobem według wynalazku lub fragment takiej całej bakterii.

W znaczeniu użytym w opisie i w zastrzeżeniach określenia antygenowe wzmocnione, wzmocnione właściwości antygenowe lub wzmocnione odnoszą się do stanu antygenowego bakterii jelitowych hodowanych sposobami według wynalazku. Bakterie takie wykazują wyższe poziomy pewnych immunogenicznych antygenów i/lub nowe immunogeniczne antygeny, w porównaniu z takimi samymi bakteriami hodowanymi konwencjonalnymi sposobami.

W znaczeniu użytym w opisie i w zastrzeżeniach określenie konwencjonalnie odnosi się do znanego stanu wiedzy.

W znaczeniu użytym w opisie i w zastrzeżeniach określenie warunki mikroaerofilowe odnosi się do warunków anaerobowych lub o zwiększonej zawartości CO2, np. 5-20% CO2 i 80-95% powietrza; 5-20% CO₂ i 80-95% N₂; albo 5-10% O₂, 10-20% CO₂ i 70-85% N₂.

W znaczeniu użytym w opisie i w zastrzeżeniach określenie wirulencja odnosi się do tych czynników bakterii jelitowych związanych ze zdolnością do przyczepiania się do gospodarza i/lub dokonywania inwazji i/lub przetrwania w gospodarzu i/lub powodowania stanu patologicznego.

W znaczeniu użytym w opisie i w zastrzeżeniach określenie immuno-krzyżowo ochronny odnosi się do zdolności humoralnej reakcji odpornościowej indukowanej przez jeden szczep lub serotyp bakteryjny, pełną komórkę lub w inny sposób, do zapobiegania lub osłabiania infekcji tego samego gospodarza przez odmienny bakteryjny szczep, serotyp lub gatunek tego samego rodzaju.

W znaczeniu użytym w opisie i w zastrzeżeniach określenie immuno-krzyżowo reaktywny odnosi się do zdolności humoralnej reakcji odpornościowej (czyli przeciwciał) indukowanej przez szczep lub serotyp bakteryjny, pełną komórkę lub w inny sposób, do krzyżowego reagowania (czyli wiązania przeciwciała) innego bakteryjnego szczepu, serotypu lub gatunku tego samego rodzaju. Immuno-krzyżowa reaktywność jest oznaką zdolności immunogenów bakteryjnych do immuno-krzyżowej ochrony i odwrotnie.

W znaczeniu użytym w opisie i w zastrzeżeniach określenie gospodarz odnosi się in vivo do zwierzęcia lub in vitro do hodowli komórek zwierzęcych. W znaczeniu użytym w opisie i w zastrzeżeniach określenie zwierzę obejmuje, ale nie wyłącznie, wszystkie stworzenia ciepłokrwiste takie jak ssaki i ptaki (np. kurczę, indyka, kaczkę itp.).

Według wynalazku w szczepionce zawierającej antygenowe wzmocnione bakterie jelitowe albo ich immunogeniczne fragmenty lub pochodne, bakterie jelitowe mogą stanowić żywe bakterie lub bakterie zdezaktywowane, a ponadto szczepionka może zawierać adiuwant taki jak, ale nie wyłącznie, ałun, emulsja woda w oleju, nietrwała termicznie toksyna z enterotoksygenicznego E. coli (LT), jej formy nietoksygeniczne (np. mLT) i/lub jej poszczególne podjednostki, Bacille Calmette-Guerin (BCG) lub adiuwant Freunda, a ponadto może zawierać odpowiedni nośnik farmaceutyczny, w tym, ale nie wyłącznie, roztwór soli, dekstrozę lub inny roztwór wodny. Inne odpowiednie nośniki farmaceutyczne opisane są w Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, standardowym tekście źródłowym w tym zakresie. W znaczeniu użytym w opisie i w zastrzeżeniach określenie szczepionka obejmuje także pasywne szczepionki, które zawierają przeciwciała wiążące specyficznie patogeny, przeciw infekcji których lub chorobom pragnie się uzyskać ochronę.

W znaczeniu użytym w opisie i w zastrzeżeniach określenie zdezaktywowane bakterie odnosi się do bakterii jelitowych niezdolnych do infekowania i/lub kolonizacji oraz obejmuje zarówno osłabione jak i uśmiercone bakterie. Osłabione bakterie mogą ulegać replikacji, ale nie mogą powodować infekcji lub choroby. Dezaktywację takich bakterii osiągnąć można sposobami znanymi specjalistom. Tak np. bakterie można dezaktywować chemicznie, np. przez utrwalanie formaliną, albo dezaktywować fizycznie, np. przez ogrzewanie, obróbkę

182 700 ultradźwiękową lub napromieniowanie, tak że osiąga się ich niezdolność do replikacji i/lub infekowania i/lub powodowania choroby.

Należy podawać skuteczną ilość szczepionki, przy czym „skuteczną ilość” określą się jako ilość bakterii jelitowych albo ich immunogenicznego fragmentu lub pochodnej, która jest zdolna do wywołania reakcji odpornościowej u osobnika. Niezbędna ilość będzie się wahać w zależności od antygeniczności stosowanej bakterii, fragmentu lub pochodnej, oraz od gatunku i wagi szczepionego osobnika, z tym że można ją określić znanymi technikami. W korzystnych, nie ograniczających zakresu, rozwiązaniach wynalazku skuteczna ilość szczepionki powoduje podwyższenie miana przeciwbakteryjnego przeciwciała do poziomu co najmniej dwukrotnie większego od miana przeciwciała przed szczepieniem. W korzystnym, nie ograniczającym zakresu, rozwiązaniu według wynalazku podaje się około 10⁷-10^ΊΙ bakterii, korzystnie 10-10¹⁰ bakterii/gospodarza. Korzystne są szczepionki zawierające zdezaktywowane pełne bakterie.

Określenie skuteczna ilość w odniesieniu do pasywnych szczepionek oznacza ilość przeciwciała, która jest zdolna do zapobieżenia bakteryjnej chorobie lub infekcji, albo do jej osłabienia. Niezbędna ilość będzie się wahać w zależności od typu przeciwciała i miana przeciwciała, oraz od gatunku i wagi szczepionego osobnika, z tym że można ją określić znanymi technikami.

Szczepionki według wynalazku można podawać miejscowo i/lub doustrojowo dowolnym znanym sposobem, w tym np., ale nie wyłącznie, dożylnie, podskórnie, domięśniowo, dopochwowo, dootrzewnowe, donosowo, doustnie lub innymi sposobami dośluzówkowymi.

Szczepionki podawać można w odpowiednim, nietoksycznym, farmaceutycznym nośniku, a ponadto mogą być one w mikrokapsułkach i/lub w postaci implantów o przedłużonym uwalnianiu.

Dogodnie szczepionki można podawać szereg razy z przerwami, tak aby utrzymać poziom przeciwciał.

Szczepionki według wynalazku można stosować w połączeniu z innymi sposobami bakteriobójczymi lub bakteriostatycznymi.

Przeciwciała według wynalazku wytwarzać można dowolnym konwencjonalnym sposobem znanym specjalistom, takim jak np., ale nie wyłącznie, sposoby opisane a Antibodies. A Laboratory Manuał (E. Harlow, D. Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Zazwyczaj zwierzę (wykorzystać można wiele różnych gatunków kręgowców, przy czym najczęściej są to myszy, szczury, świnki morskie, chomiki i króliki) immunizuje się pełnymi komórkami albo immunogenicznym fragmentem albo pochodną antygenowo wzmocnionych bakterii jelitowych według wynalazku bez stosowania lub w obecności adiuwanta albo dowolnego innego środka, który mógłby wzmocnić skuteczność immunogenów, powtarzając to następnie w regularnych odstępach czasu. Surowicę zwierzęcia bada się w celu ustalenia obecności pożądanych przeciwciał dowolnym znanym sposobem. Surowicę lub krew zwierzęcia można zastosować jako źródło poliklonalnych przeciwciał.

W przypadku monoklonalnych przeciwciał zwierzęta traktuje się w sposób opisany powyżej. Po wykryciu dopuszczalnego miana przeciwciała zwierzęta uśmierca się i w warunkach aseptycznych usuwa się śledzionę w celu wykonania fuzji. Komórki śledziony miesza się ze specyficznie wybraną linią nieśmiertelnych komórek szpiczaka, po czym uzyskaną mieszaninę wystawia się na działanie środka, zazwyczaj glikolu polietylenowego itp., ułatwiającego fuzję komórek. W warunkach tych fuzja przebiega na drodze przypadkowej selekcji, tak że uzyskany produkt stanowi mieszanina komórek, które uległy fuzji wraz z komórkami każdego typu, które nie uległy fuzji. Linie komórek szpiczaka, które stosuje się w celu doprowadzenia do fuzji, dobiera się specyficznie tak, aby w wyniku zastosowania selekcyjnego ośrodka takiego jak HAT: hipoksantyna, aminopteryna i tymidyna, jedynymi komórkami, które pozostaną w hodowli mieszaniny fuzyjnej były te, które stanowią hybrydy komórek pochodzących od immunizowanego donora i komórek szpiczaka. Po fuzji komórki rozcieńcza się i hoduje w selektywnych ośrodkach. Ośrodek hodowli selekcjonuje się pod względem obecności przeciwciała o pożądanej swoistości względem wybranego antygenu. Te hodowle, które zawierają wybrane przeciwciało, klonuje się metodą ograniczonego rozcieńczania do mo

182 700 mentu, aż można będzie uznać, że hodowla komórek pochodzi od pojedynczej komórki. Przeciwciała według wynalazku znajdują zastosowanie jako pasywne szczepionki przeciw infekcjom i chorobom powodowanym przez bakterie jelitowe.

Do sposobów wykrywania przeciwciał lub wymienionych bakterii u gospodarza należą testy immunologiczne. Do znanych testów należą, ale nie wyłącznie, testy radioimmunologiczne (RIA), enzymatyczny test immunosorpcyjny (ELISA), fluorescencyjne testy immunologiczne oraz testy immunologiczne z polaryzacją fluorescencji (FPIA).

W innym wykonaniu przedmiotem wynalazku są zestawy diagnostyczne zawierające wszystkie podstawowe odczynniki niezbędne do przeprowadzenia pożądanego testu immunologicznego według wynalazku. Zestaw diagnostyczny może być w postaci pakietu zawierającego jeden lub więcej pojemników z niezbędnymi odczynnikami. Zestaw taki zawiera bakterie jelitowe według wynalazku i/lub monoklonalne albo poliklonalne przeciwciało według wynalazku, w kombinacji z szeregiem konwencjonalnych składników zestawu. Konwencjonalne składniki zestawu są łatwe do ustalenia dla specjalistów i podane są w licznych publikacjach, w tym w Antibodies. A Laboratory Manuał (E. Harlow, D. Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Do konwencjonalnych składników zestawu należeć mogą takie elementy jak np. płytki microtiter, bufory w celu utrzymania pH mieszanki testowej (takie jak np., ale nie wyłącznie, Tris, HEPES itp.), skoniugowane drugie przeciwciała takie jak skoniugowane z peroksydazą przeciwmysie IgG (lub dowolne przeciw-IgG względem zwierzęcia, z którego pochodzi pierwsze przeciwciało) itp., oraz inne standardowe odczynniki.

Sposoby według wynalazku obejmują hodowanie bakterii jelitowych w odpowiednim bazowym podstawowym ośrodku hodowli, takim jak np., ale nie wyłącznie, dostępny w handlu infiizyjny bulion mózgowo-sercowy BHI, bulion Luria LB, agar z krwią owcy SBA, bulion Brucella, bulion Meullera-Hintona, bulion w postaci bydlęcego ekstraktu proteozowo-peptonowego itp., w różnych warunkach i z różnymi składnikami obejmującymi, ale nie wyłącznie, 0,05-3% żółci albo 0,025-0,6% jednego lub więcej kwasów żółciowych lub ich soli albo prekursorów biologicznych takich jak cholesterol, w temperaturze 30-42°C aż do osiągnięcia fazy wzrostu zbliżonej do wczesnej fazy wykładniczej, pomiędzy wczesną fazą wykładniczą i fazą stacjonarną lub zbliżonej do fazy stacjonarnej, w powietrzu lub w warunkach mikroaerofilowych, np. w obecności 5-20% CO₂ i 80-95% powietrza; 5-20% CO₂ i 80-95% N₂; albo 5-10% O₂, 10-20% CO₂ i 70-85% N₂; oraz ewentualnie w obecności środka chelatującego kationy dwuwartościowe, takiego jak, ale nie wyłącznie, 0-100 μΜ, korzystnie 25 μΜ BAPTA/AM (estru acetoksymetylowego kwasu 2'-(etylenodioksy)dianilino-N/N/N',N'-tetraoctowego; Molecular Probes, Eugene, OR), 0-10 μΜ EGTA (kwasu etyleno-bis(oksyetylenonitrilo)tetraoctowego; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) i 0-100 μΜ EGTA/AM (estru acetoksymetylowego kwasu etylenobis(oksyetylenonitrilo)tetraoctowego; Molecular Probes, Eugene, OR); uzyskując kombinację warunków i składników zapewniającą wytwarzanie antygenowo wzmocnionych bakterii jelitowych.

Zgodnie z innym wykonaniem sposoby według wynalazku obejmują również hodowanie bakterii jelitowych w warunkach opisanych bezpośrednio powyżej, w obecności środka chelatującego kationy dwuwartościowe, takiego jak, ale nie wyłącznie, 1,0-100 μΜ, korzystnie 25 μΜ BAPTA/AM, 0,5-10 μΜ EGTA lub 1-100 μΜ EGTA/AM, ale bez żółci, kwasów żółciowych lub soli żółciowych.

Według wynalazku przydatną żółć lub kwasy żółciowe albo ich sole stanowi dowolny naturalny związek żółciowy wydzielany przez wątrobę oraz normalnie zatężany w pęcherzyku żółciowym, a także syntetyczne kwasy żółciowe znane specjalistom, takie jak np., ale nie wyłącznie, OXGALL (Difco Laboratories, Detroit, Michigan), żółć bydlęca (Sigma Chemicals, St. Louis, Missouri) albo inne dostępne w handlu preparaty, kwasy żółciowe, dezoksycholowe, taurocholowe i glikocholowe. Korzystnym środkiem jest dezoksycholan (DOC), dostępny w handlu kwas żółciowy obecny in vivo w dystalnym jelicie cienkim oraz w częściach jelita grubego kolonizowanych przez pewne bakterie jelitowe. Korzystny jest również glikocholan (GC).

Według wynalazku hodowle bakterii jelitowych wybranych z grupy obejmującej Campylobacter sp., Yersinia sp., Helicobacter sp., Gastrospirillum sp., Bacteroides sp., Klebsiella

182 700 sp., Enterobacter sp., Salmonella sp., Shigella sp., Aeromonas sp., Vibrio sp., Clostridium sp., Enterococcus sp. i Escherichia coli wytwarzać możną w postaci zamrożonych hodowli podstawowych sposobami znanymi specjalistom i przetrzymywać w -80°C do późniejszego wykorzystania. Tak np. podstawowe hodowle Campylobacter jejuni wytwarzać można przez hodowlę organizmów na agarze sojowym z tryptykazą, zawierającym 5% odwłóknionych erytrocytów owczych (SBA) w 37°C w atmosferze z 5% O2, 10% CO2 i 85% N2 (środowisko mikroaerofilowe, MC) przez 20 godzin. Hodowle podstawowe Escherichia coli. Salmonella typhimurium, Helicobacter pylon i Shigella flexneri otrzymać można hodując organizmy w mózgowo-sercowym bulionie infiizyjnym (BHI). Bakterie można zebrać do zamrażania dowolnym znanym sposobem, np. za pomocą pędzelka, po czym zawiesza się je ponownie z BHI zawierającym 30% gliceryny. Hodowle do eksperymentów analitycznych lub do prowadzenia fermentacji produkcyjnej wytworzyć można dowolnym znanym sposobem takim jak hodowanie organizmów na BHI z 1,5% agaru w 37°C w warunkach MC lub atmosferycznych, a następnie przeniesienie pojedynczej kolonii do bulionu i prowadzenie hodowli sposobami według wynalazku ujawnionymi w opisie. Bakterie można zbierać do wykorzystania dowolnym sposobem znanym specjalistom, np. przez odwirowanie.

W korzystnych rozwiązaniach antygenowe wzmocnione komórki Campylobacter sp., korzystnie gatunki jejuni lub coli, a najkorzystniej szczep jejuni 81-176, hoduje się w bazowym podstawowym ośrodku hodowli, korzystnie w bulionie BHI zawierającym dodatkowo około 0,1% DOC lub około 0,8% żółci w 37°C w mieszaninie około 10-20% CO2 i około 8090% powietrza; zbiór przeprowadza się po osiągnięciu przez rosnącą hodowlę fazy wzrostu zbliżonej do wczesnej fazy wykładniczej, zazwyczaj w około 30 minut po zaszczepieniu hodowli, czyli w fazie odpowiadającej od wczesnej do średniej wykładniczej fazy wzrostu.

W kolejnych korzystnych wykonaniach antygenowo wzmocnione komórki Helicobacter pylori, korzystnie szczep ATCC 49503, NB3-2 lub Gl-4, hoduje się w bazowym podstawowym ośrodku hodowli, korzystnie w bulionie BHI zawierającym dodatkowo około 0,05-0,2% żółci lub około 0,05% glikocholanu (GC) w 37°C w mieszaninie około 5-20% CO2 z około 80-95% powietrza, albo około 10% CO2 i około 5% O2 z około 85% N2; zbiór przeprowadza się po osiągnięciu przez rosnącą hodowlę fazy wzrostu zbliżonej do fazy wykładniczej lub zbliżonej do fazy stacjonarnej. W jeszcze korzystniejszym wykonaniu komórki zbiera się po osiągnięciu przez hodowlę stanu zbliżonego do fazy wykładniczej.

Bakterie jelitowe hodowane sposobami według wynalazku wykazują zmienione morfologie i/lub ruchliwość komórek i/lub wytwarzają pewne nowe białka, lipopolisacharydy i/lub węglowodany i/lub zawierają takie makrocząsteczki w zmienionych ilościach w porównaniu z komórkami hodowanymi w samym ośrodku bazowym. Zidentyfikować można optymalne warunki hodowli zwiększające wydajność komórek i oznaki patogeniczności. Wykorzystując takie warunki hodowli zidentyfikować można wzmocnione lub indukowane antygeny związane z wirulencją.

Ruchliwość i makroskopowe zmiany morfologiczne możną dostrzec obserwując pod mikroskopem nie poddane obróbce lub zabarwione bakterie. Istnieje możliwość, że w wyniku zastosowania sposobów według wynalazku zajść mogą inne zmiany morfologiczne, które można zaobserwować przy wykorzystaniu mikroskopii elektronowej lub mikroskopii fluorescencyjnej.

Morfologia i śluzo-podobna charakterystyka bakterii jelitowych hodowanych z wykorzystaniem sposobów według wynalazku sugeruje, że mogła zajść indukcja ekspresji otoczki i/lub warstwy powierzchniowej. W celu sprawdzenia, czy powstała otoczka, przygotować można fenolowe ekstrakty składników powierzchniowych takich jak białka, węglowodany i lipopolisacharydy. Zwiększoną ilość węglowodanów stwierdzić można na podstawie wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej (HPLC).

Profile białkowe zewnętrznych błon wypreparowanych z bakterii jelitowych hodowanych w warunkach wzrostu wzmacniających wirulencję według wynalazku można scharakteryzować metodą elektroforezy na żelu poliakrylamidowym z dodecylosiarczanem sodowym (SDS-PAGE) przez porównanie z wynikami dla organizmów hodowanych w konwencjonalnych warunkach. SDS-PAGE wykonuje się, aby ocenić zmiany wywołane w wyekstrahowanych

182 700 bakteryjnych białkach komórkowych w reakcji na warunki wzmacniające lub zmieniające antygen. Dane te dostarczająjakościowych i ilościowych informacji dotyczących zmian powierzchniowych związanych ze zwiększoną inwazyjnościąlub zmienioną antygenicznością.

Potencjał immunogeniczny indukowanych lub zmienionych antygenów białkowych można zidentyfikować wykonując blotting Westema. Immunogeniczność indukowanych lub zmienionych białek bakteryjnych zidentyfikowanych metodą SDS-PAGE można ocenić powszechnie wykorzystywanymi technikami blottingu Westema w sposób opisany poniżej. Zastosować można dowolne źródło przeciwciał takie jak surowice ozdrowiałego, uodpornionego królika lub fretki (źródła przeciwciał od zwierząt zainfekowanych doustnie żywymi organizmami wyhodowanymi w sposób konwencjonalny lub sposobami według wynalazku), śluz jelitowy (źródło przeciwciała IgA), przeciwsurowice poliklonalne lub przeciwciała monoklonalne, np. krzyżowo reagujące z flagelliną C. jejuni, w celu zbadania bakteryjnych antygenów.

Zwiększone wytwarzanie szeregu z tych bakteryjnych antygenów towarzyszy wzmocnieniu właściwości związanych z wirulencją. Do właściwości tych należy przyczepianie się i infekowanie hodowanych ludzkich komórek nabłonka jelita oraz wiązanie czerwonego barwnika Kongo. Test wiązania czerwonego barwnika Kongo stanowi ogólnie przyjętą metodę przewidywania wirulencji; jest on opisany poniżej oraz w pracach Andrewsa i innych (Infect. Immun., 60:3287-3295, 1992); i Yodera (Avian Dis., 33:502-505, 1989). Wiązanie przez bakterie czerwieni Kongo oznaczą zdolność do wiązania heminy, a taka zdolność do wiązania heminy koreluje z wirulencją. Istnieje również korelacja między wiązaniem czerwieni Kongo i wzmożoną inwazją komórek nabłonkowych przez bakterie.

Uprzednio wykazano, że większość konwencjonalnie hodowanych serotypów Lior C. jejuni nie wykazuje immuno-krzyżowej reaktywności. Na podstawie takiej informacji konieczne byłoby przygotowanie i podawanie szeregu szczepionek różnych szczepów serotypu Lior, albo kombinacyjnej szczepionki w celu uzyskania uogólnionej ochrony przed Campylobacter. Antygenowo wzmocnione Campylobacter wytworzone sposobami według wynalazku wykazują immuno-krzyżową reaktywność względem szerszego zakresu serotypów Lior niż Campylobacter wyhodowane w warunkach konwencjonalnych. Również antygenowo wzmocnione Shigella wytworzone sposobami według wynalazku są immuno-krzyżowo reaktywne i immuno-krzyzowo ochronne względem szerszego zakresu gatunków Shigella niż bakterie wyhodowane w warunkach konwencjonalnych. O takich immuno-krzyżowo reaktywnych i immuno-krzyżowo ochronnych właściwościach świadczą wyniki testów aglutynacji oraz badania szczepionek opisane poniżej.

Sposoby wytwarzania antygenowe wzmocnionych bakterii jelitowych według wynalazku korelują z wzmocnioną wirulencją, w przypadku modelowych małych zwierząt. Szereg zwierząt domowych wykorzystać możną jako modele choroby Campylobacter u ludzi. Najdokładniej przebadaną z punktu widzenia skuteczności immunizacji jest odwracalna biegunka dorosłego królika z podwiązanym jelitem (model RITARD), patrz Caldwell i inni (Infect. Immun., 42:1176-1182, 1983). Model ten wykazał również powiązanie serotypów Lior z immuno-krzyżową ochroną. Jednakże wykorzystując taki model mierzy się raczej odporność na kolonizację niż odporność na chorobę. Model fretki Bella i innych (Infect. Immun., 58:18481852, 1990) może być bardziej przydatnym modelem, gdyż u zwierzęcia rozwijają się objawy choroby podobne do objawów choroby Campylobacter u ludzi. Nowszym modelem jest model kolonizacji myszy Bagera (Infection and Immunity, 63:3731-3735, 1995). Model ten obejmuje immunizację, a następnie donosowe lub doustne prowokowanie żywymi bakteriami Campylobacter immunizowanej myszy oraz badanie kolonizacji w jelicie na podstawie śledzenia obecności Campylobacter w odchodach. W przypadku Shigella test donosowego prowokowania myszy opisany przez Malletta i innych (patrz poniżej, sekcja 13) zastosowano do oceny wirulencji i skuteczności szczepionki. W przypadku Helicobacter pylori model kolonizacji żołądka przez Helicobacter felis, opisany przez Chena i innych (Lancet, 339:1120-1121, 1992) zastosowano do oceny skuteczności szczepionki H. pylori wytworzonej sposobami według wynalazku.

182 700

Istnieją inne modele zwierzęce podatne na inwazję i infekcję przez bakterie jelitowe, tak że można je wykorzystać do badania skuteczności szczepionek z wzmocnionych bakterie jelitowe, wytworzonych sposobami według wynalazku.

Antygenowe wzmocnione bakterie jelitowe wytworzone sposobami według wynalazku są stosowane do przygotowywania prototypowych szczepionek z uśmierconych pełnych komórek lub ich fragmentów. Można wykazać, że przy podawaniu zwierzętom szczepionki takie indukują przeciwciała, co z kolei umożliwia ustalenie zdolności ochronnej szczepionek. W wyniku podwyższenia lub indukowania takich antygenów w komórkach bakteryjnych uzyskuje się komórki dające skuteczniejsze szczepionki.

Potencjalne preparaty szczepionkowe wytworzone sposobami według wynalazku zastosować można do indukowania jelitowej reakcji odpornościowej przy wykorzystaniu różnych strategii immunizacji śluzówki. Zapewniające powodzenie procedury immunizacji można następnie wykorzystać do ochrony zwierząt prowokowanych patogenami o wzmocnionej antygeniczności lub takimi, które jej nie wykazują. Szczepionki można również przyrządzać do badań w postaci szczepionek kombinowanych; tak np. komórki Shigella i Campylobacter lub ich składniki można połączyć jako pojedynczą szczepionkę.

Opisane poniżej procedury eksperymentalne umożliwiają wykrywanie zmian w powierzchniowych antygenach oraz innych charakterystyk związanych ze wzmocnioną inwazyjnością. Zmiany te są zarówno jakościowe jak i ilościowe. Najważniejsze jednak jest to, że doświadczenia te potwierdziły, iż sposoby według wynalazku wzmacniają inwazyjność i indukują antygeny związane z immunogenicznością. Takie antygenowe wzmocnione bakterie indukują reakcję immunogeniczną zapewniającą ochronę przed zainfekowaniem przez szerszy zakres szczepów, serotypów i/lub gatunków bakterii, tak że stanowią one skuteczniejsze szczepionki w porównaniu z bakteriami hodowanymi w sposób konwencjonalny.

Istnieje szereg dobrze zdefiniowanych modeli, ogólnie znanych specjalistom, tak że można je wykorzystać do oceny wzmocnionych właściwości antygenowych, wirulencji bakterii oraz skuteczności szczepionek, w sposób opisany poniżej.

Poniżej przedstawiono przykłady wynalazku nie ograniczające jego istoty.

6. Przykłady: Sposoby wytwarzania wzmocnionych bakterii jelitowych

Przykład 1. Campylobacter jejuni, szczep 81-176, rozsmarowano na płytkach agarowych z krwią (zawierających agar z tryptykazą sojową i 5% odwłóknionych erytrocytów owczych), po czym prowadzono inkubację w mikroaerofilowym słoju GasPar (BBL, Cockeysville, MD) przez 20 godzin w 37°C. Placki bakteryjne zdjęto za pomocą pędzelka i zastosowano do zaszczepiania kolb zawierających 1 litr ośrodka BHI wstępnie doprowadzonego do równowagi z atmosferą 10% CO2 + 90% powietrza, z 0,8% OXGALL (Difco, Detroit, MI). Hodowle inkubowano przez 20 godzin z wytrząsaniem, w 37°C, w zamkniętej kolbie w atmosferze z 10% CO2, 90% powietrza, po czym przeprowadzono zbiór w sposób opisany powyżej.

Przykład 2. Campylobacter jejuni, szczep 81-176, rozsmarowano na płytkach agarowych z krwią (zawierających agar z tryptykazą sojową i 5% odwłóknionych erytrocytów owczych), po czym prowadzono inkubację w mikroaerofilowym słoju GasPar (BBL, Cockeysville, MD) przez 20 godzin w 37°C. Placki bakteryjne zdjęto za pomocą pędzelka i zastosowano do zaszczepiania kolb zawierających 1 litr ośrodka BHI wstępnie doprowadzonego do równowagi z atmosferą zawierającą 10% CO2, z 0,01- 0,1% dezoksycholanu sodowego (DOC). (Bardzo ważne jest, aby przygotować osobno i autoklawować DOC jako roztwór podstawowy, który dodaje się w warunkach aseptycznych do ośrodka BHI do uzyskania ostatecznego stężenia 0,01-0,1% tuż przed zaszczepieniem bakteriami). Hodowle inkubowano przez różne okresy czasu do 20 godzin z wytrząsaniem, w 37°C, w zamkniętej kolbie w atmosferze z 5% O2, 10% CO2, 85% N2, po czym przeprowadzono zbiór w sposób opisany powyżej.

Przykład 3. Campylobacter jejuni, szczep 81-176, rozsmarowano na płytkach agarowych z krwią (zawierających agar z tryptykazą sojową i 5% odwłóknionych erytrocytów owczych), po czym prowadzono inkubację w mikroaerofilowym słoju GasPar (BBL, Cockeysville, MD) przez 20 godzin w 37°C. Placki bakteryjne zdjęto za pomocą pędzelka i zastosowano do zaszczepiania kolb zawierających 1 litr bulionu Brucełla wstępnie doprowadzonego

182 700 do równowagi z atmosferą zawierającą 10% CO₂, z 0,01-0,1% dezoksycholanu sodowego. Hodowle inkubowano przez 20 godzin z wytrząsaniem, w 37°C, w zamkniętej kolbie w atmosferze z 5% O₂, 10% CO₂, 85% N₂, po czym przeprowadzono zbiór w sposób opisany powyżej.

Przykład 4. Campylobacter jejuni, szczep 81-176, rozsmarowano na płytkach agarowych z krwią (zawierających agar z tryptykazą sojową i 5% odwłóknionych erytrocytów owczych), po czym prowadzono inkubację w mikroaerofilowym słoju GasPar (BBL, Cockeysville, MD) przez 20 godzin w 37°C. Placki bakteryjne zdjęto za pomocą pędzelka i zastosowano do zaszczepiania kolb zawierających 1 litr bulionu Muellera-Hintona, wstępnie doprowadzonego do równowagi z atmosferą zawierającą 10% CO₂, z 0,01-0,1% dezoksycholanu sodowego. Hodowle inkubowano przez 20 godzin z wytrząsaniem, w 37°C, w zamkniętej kolbie w atmosferze z 5% O₂, 10% CO₂, 85% N₂, po czym przeprowadzono zbiór w sposób opisany powyżej.

Przykład 5. Campylobacter jejuni, szczep 81-176, rozsmarowano na płytkach agarowych z lówią (zawierających agar z tryptykazą sojową i 5% odwłóknionych erytrocytów owczych), po czym prowadzono inkubację w mikroaerofilowym słoju GasPar (BBL, Cockeysville, MD) przez 20 godzin w 37°C. Placki bakteryjne zdjęto za pomocą pędzelka i zastosowano do zaszczepiania kolb zawierających 1 litr ośrodka BHI wstępnie doprowadzonego do równowagi z atmosferą 10% CO₂ + 90% powietrza, z 0,1% dezoksycholanu sodowego. Hodowle inkubowano przez 20 godzin z wytrząsaniem, w 37°C, w zamkniętej kolbie w atmosferze z 10% CO₂, 90% powietrza, po czym przeprowadzono zbiór w sposób opisany powyżej.

Przykład 6. Vibrio cholerae rozsmarowano na płytkach agarowych z krwią (zawierających agar z tryptykazą sojową i 5% odwłóknionych erytrocytów owczych), po czym inkubowano w atmosferze powietrza przez 20 godzin w 37°C. Placki bakteryjne zdjęto za pomocą pędzelka i zastosowano do zaszczepiania kolb zawierających 1 litr ośrodka BHI z 0,1% dezoksycholanu sodowego. Hodowle inkubowano przez 20 godzin z wytrząsaniem, w 37°C w atmosferze powietrza, po czym przeprowadzono zbiór w sposób opisany powyżej.

Przykład 7. Salmonella cholerasius rozsmarowano na płytkach agarowych z BHI i inkubowano w atmosferze powietrza przez 20 godzin w 37°C. Placki bakteryjne zdjęto za pomocą pędzelka i zastosowano do zaszczepiania kolb zawierających 1 litr ośrodka BHI z 0,1% dezoksycholanu sodowego. Hodowle inkubowano przez 20 godzin z wytrząsaniem, w 37°C w atmosferze powietrza, po czym przeprowadzono zbiór w sposób opisany powyżej.

Przykład 8. Salmonella typhimurium rozsmarowano na płytkach agarowych z bulionem Luria i inkubowano w atmosferze powietrza przez 20 godzin w 37°C. Placki bakteryjne zastosowano do zaszczepiania kolb zawierających 1 litr ośrodka BHI z 0,1% dezoksycholanu sodowego. Hodowle inkubowano przez 20 godzin z wytrząsaniem, w 37°C w atmosferze 10% CO₂, 90% powietrza. Jedną kolonię przeniesiono do 1 litra LB zawierającego 0,1% DOC i inkubowano w zamkniętej od góiy kolbie w 37°C z powolnym wytrząsaniem. Po 12 godzinach 60 ml hodowli rozcieńczono do 1 litra tym samym świeżym, podgrzanym ośrodkiem, inkubowano przez kolejne 30 minut, po czym przeprowadzono zbiór w sposób opisany powyżej.

Przykład 9. Shigella flexneri 2457T rozsmarowano na płytkach agarowych z czerwienią Kongo i inkubowano przez 20 godzin w 37°C, w atmosferze powietrza. Jedną czerwoną kolonię zastosowano do zaszczepienia kolby zawierającej 1 litr ośrodka BHI i inkubowano z wytrząsaniem przez 12 godzin. 50 ml tej hodowli zastosowano do zaszczepienia 250 ml podgrzanego BHI zawierającego 0,1% dezoksycholanu sodowego. Hodowlę inkubowano z wytrząsaniem przez 4 godziny w 37°C, w atmosferze powietrza. Hodowlę rozcieńczono do uzyskania gęstości optycznej ODćoo około 0,17 podgrzanym BHI zawierającym 0,1% DOC i inkubowano przez 30 minut z wytrząsaniem w 37°C, w atmosferze powietrza, po czym przeprowadzono zbiór w sposób opisany powyżej.

Przykład 10. Campylobacter jejuni 81-176, 81-116 lub HC (w BHI z 30% gliceryny) szybko odmrożono i wysiano na agar z krwią owczą (SBA, 0,1 ml/płytkę). Zaszczepione płytki inkubowano w słoju GasPar z generatorem mikroaerofilowego środowiska (BBL, Cockeysville, MD) przez 20 godzin w 37°C. Placek bakteryjny usunięto z płytek za pomocą pędzelka, po czym bakterie zawieszono w 10 ml BHI. Zawiesiną bakterii zaszczepiono 1 litr bulionu

182 700

BHI, samego lub zawierającego 0,1% DOC, doprowadzono wstępnie do równowagi w atmosferze 10% CO₂,90% powietrza, w 2-litrowych kolbach. Inokulum dodano do doprowadzonego wstępnie do równowagi ośrodka, do osiągnięcia OD₆₂₅ 0,05. W zaszczepionych kolbach przywrócono atmosferę 10% CO₂, 90% powietrza i ich zawartość powoli mieszano przez 20 godziny w 37°C. Wówczas przeprowadzono zbiór bakterii w sposób opisany powyżej.

Przykład 11. Helicobacter pylori dodano do bulionu BHI z 4% płodowej surowicy bydlęcej. Po zaszczepieniu kolby przedmuchano mieszaninę 5% O₂, 10% CO₂, 85% N₂ i inkubowano przez 22 godziny w 37°C z wytrząsaniem. Po inkubacji 2,5 ml hodowli przeniesiono do kolby zawierającej bulion BHI z 4% płodowej surowicy bydlęcej lub ten sam ośrodek dodatkowo zawierający 0,05% glikocholanu sodowego. Hodowle te ponownie przedmuchano mikroaerofilową mieszaniną gazów (5% O₂, 10% CO₂, 85% N₂) i inkubowano 20-24 godziny w 37°C. Komórki zebrano w sposób opisany powyżej.

Przykład 12. Salmonella typhimurium (w LB z 30% gliceryny) rozsmarowano na płytce agarowej LB i prowadzono hodowlę przez 18-20 godzin w 37°C, w atmosferze powietrza. Jedną kolonię zebrano i przeniesiono do 1 litra LB lub LB zawierającego 0,1% DOC w kolbach, które przedmuchano mieszaniną 10% CO₂, 5% CO₂, 85% N₂, zamknięto i inkubowano przez 12 godzin w 37°C z wytrząsaniem. Bakterie rozcieńczono następnie tym samym ośrodkiem do ODóoo 0,17 i inkubowano w identycznych warunkach aż do osiągnięcia przez hodowlę wczesnej fazy wykładniczej wzrostu, zazwyczaj przez 30 minut po rozcieńczeniu. Komórki zebrano w sposób opisany powyżej.

Przykład 13. Salmonella typhimurium rozsmarowano na płytce agarowej LB i prowadzono hodowlę przez 18-20 godzin w 37°C, w atmosferze powietrza. Jedną kolonię zebrano i przeniesiono do 1 litra LB lub LB zawierającego 0,1% DOC w kolbach i inkubowano przez 12 godzin w 37°C w atmosferze powietrza. Hodowle rozcieńczono następnie (1/5) tym samym świeżym ośrodkiem i inkubowano przez kolejne 4 godziny w tych samych warunkach. Hodowle rozcieńczono tym samym świeżym ośrodkiem do ODćoo 0,17 i inkubowano w identycznych warunkach aż do osiągnięcia przez hodowlę wczesnej fazy wykładniczej wzrostu, zazwyczaj przez 30 minut po rozcieńczeniu. Komórki zebrano w sposób opisany powyżej.

Przykład 14. Klebsiella pneumoniae rozsmarowano na płytce agarowej BHI i inkubowano 18-20 g w 37°C, w atmosferze powietrza. Jedną kolonię zebrano i zastosowano do zaszczepienia 1 litra BHI lub BHI zawierającego 0,1% DOC i hodowle wytrząsano przez 12 godzin w 37°C, w atmosferze powietrza. Bakterie rozcieńczono tym samym ośrodkiem do ODćoo 0,17, prowadzono hodowlę przez kolejnych 30 minut, po czym przeprowadzono zbiór w sposób opisany powyżej.

Przykład 15. Enterobacter cloacae rozsmarowano na płytce agarowej BHI i inkubowano 18-20 g w 37°C, w atmosferze powietrza. Jedną kolonię zastosowano do zaszczepienia 1 litra BHI lub BHI zawierającego 0,1% DOC i hodowle wytrząsano przez 12 godzin w 37°C. Bakterie rozcieńczono tym samym ośrodkiem do ODćoo 0,17, prowadzono hodowlę przez kolejnych 30 minut, po czym przeprowadzono zbiór w sposób opisany powyżej.

Przykład 16. Escherichia coli, szczep 0157:H7 rozsmarowano na płytce agarowej z krwią owcy i inkubowano 18-20 g w 37°C, w atmosferze powietrza. Jedną kolonię zebrano i zastosowano do zaszczepienia 1 litra BHI lub BHI zawierającego 0,1-0,2% DOC i hodowle wytrząsano przez 12 godzin w 37°C.

Bakterie rozcieńczono tym samym ośrodkiem do ODóoo 0,17, prowadzono hodowlę przez kolejnych 30 minut, po czym przeprowadzono zbiór w sposób opisany powyżej.

Przykład 17. Enterococcus faecalis rozsmarowano na płytce agarowej z krwią owcy i inkubowano 18-20 g w 37°C, w atmosferze powietrza. Jedną kolonię zebrano i zastosowano do zaszczepienia 1 litra BHI lub BHI zawierającego 0,1% DOC i hodowle wytrząsano przez 12 godzin w 37°C. Bakterie rozcieńczono tym samym ośrodkiem do ODóoo 0,17 prowadzono hodowlę przez kolejnych 30 minut, po czym przeprowadzono zbiór w sposób opisany powyżej.

Prz ykład 18. Clostridium difficile (zmodyfikowany ośrodek z siekanego mięsa z 30% gliceryny) rozsmarowano na płytce z pożywką dla anaerobów, z wątrobą bydlęcą zawierającą 1,5% agaru, po czym prowadzono hodowlę w warunkach mikroaerofilowych (5%

182 700

CC>2, 95% N2). Jedną kolonię przeniesiono do 1 litra modyfikowanego ośrodka z siekanym mięsem lub tego samego ośrodka zawierającego 0,1% DOC. Bakterie hodowano w warunkach mikroaerofilowych w 37°C przez 12 godzin, po czym przeprowadzono zbiór w sposób opisany powyżej.

Przykład 19. Bacteroides fragilis (zmodyfikowany ośrodek z siekanego mięsa z 30% gliceryny) rozsmarowano na płytce agarowej z modyfikowanym ośrodkiem zawierającym siekane mięso, po czym prowadzono hodowlę w warunkach mikroaerofilowych (5% CO2, 95% N2). Jedną kolonię przeniesiono do 1 litra modyfikowanego ośrodka z siekanym mięsem lub tego samego ośrodka zawierającego 0,1% DOC. Bakterie hodowano w warunkach mikroaerofilowych w 37°C przez 12 godzin, po czym przeprowadzono zbiór w sposób opisany powyżej.

Przykład 20. Yersinia pseudotuberculosis (bulion Luria zawierający 30% gliceryny) rozsmarowano na płytce agarowej z bulionem Luria i prowadzono inkubację w 30°C. Jedną kolonię przeniesiono do 1 litra LB i inkubowano przez 12 godzin w 30°C. Hodowlę tą rozcieńczono (1/5) ośrodkiem LB lub LB zawierającym 0,1% DOC i prowadzono inkubację przez 4 godziny w 37°C. Następnie hodowle rozcieńczono tymi samymi ośrodkami do ODóoo 0,17 prowadzono hodowlę przez kolejnych 30 minut, po czym przeprowadzono zbiór w sposób opisany powyżej.

Przykład 21. Helicobacter pylori dodano do bulionu BHI z 4% płodowej surowicy bydlęcej. Po zaszczepieniu kolby przedmuchano mieszaninę 5% O2, 10% CO2, 85% N2 i inkubowano przez 22 godziny w 37°C z wytrząsaniem. Po inkubacji 2,5 ml hodowli przeniesiono do kolby zawierającej bulion BHI z 4% płodowej surowicy bydlęcej lub ten sam ośrodek dodatkowo zawierający około 0,1-0,2% żółci bydlęcej. Hodowle te ponownie przedmuchano mikroaerofilową mieszaniną gazów (5% O2, 10% CO2, 85% N2) i inkubowano 20-24 godziny w 37°C. Komórki zebrano w sposób opisany powyżej.

7. Przykłady: Wzmocniono antygenowo bakterie

Przykład 22. Mikroskopowe badanie osadzonych wilgotnych bakterii wykorzystano do obserwacji ruchliwości i makroskopowej morfologii. Warstwy powierzchniowe obserwowano po zabarwieniu otoczki tuszem (nigrozyną). Po wysuszeniu na powietrzu komórki przebarwiono fioletem krystalicznym. Wszystkich obserwacji dokonywano przy powiększeniu 1000 x.

Morfologia bakterii hodowanych zgodnie ze sposobami według wynalazku (poniżej określanych jako bakterie WZMOCNIONE) była zmieniona w porównaniu z bakteriami hodowanymi w samym ośrodku bazowym (hodowla konwencjonalna). Tak np. WZMOCNIONE C. jejuni ulegają agregacji i tworzą duże grudki komórek, podczas gdy komórki hodowane konwencjonalnie były w przeważającej części samotne. Z barwienia otoczki (nie pokazanego) wyraźnie wynika, że hodowla z wykorzystaniem sposobów według wynalazku prowadzi do zmian w powierzchni bakterii. W rzeczywistości takie zmiany powierzchniowe powodują wzrost wiązania przez komórki WZMOCNIONE cząstek nigrozyny z roztworu barwiącego. Bakterie WZMOCNIONE pozostają znacząco ruchliwe.

Przykład 23. Zanalizowano składniki powierzchni C. jejuni po ekstrakcji fenolem. Wykonano ekstrakty z C. jejuni 81-176 hodowanych konwencjonalnie lub w sposób opisany powyżej w przykładzie 2. Komórki C. jejuni zebrano z ośrodka hodowli przez odwirowanie, w sposób opisany powyżej. Osad komórkowy wyekstrahowano przez 2 godziny w temperaturze pokojowej 1% roztworem fenolu. Nienaruszone komórki oddzielono od 'wyekstrahowanych materiałów prowadząc wirowanie przez 45 minut. Supematant zawierający wyekstrahowane powierzchniowe składniki bakterii dializowano przez noc względem wody destylowanej. Retentat odwirowano przy 105 000 x g przez 3 godziny w 4°C. Osad z ekstraktu rozpuszczono w 10% NaCl i wytrącono 2 objętościami zimnego 95% etanolu. Wytrącanie powtórzono, po czym próbkę liofilizowano. Następnie próbkę rozpuszczono w wodzie w stężeniu 1 mg/ml w celu wykonania dalszej analizy.

Zawartość węglowodanów w ekstrakcie oznaczano powszechnie przyjętą metodą z fenolem i kwasem siarkowym, stosując glukozę jako wzorzec. Zawartość kwasu uronowego w ekstrakcie oznaczono metodą Dische stosując odczynnik karbazolowy. Całkowitą zawar

182 700 tość białka w ekstrakcie fenolowym oznaczono za pomocą zestawu testowego z kwasem bikcychinowym (Pierce Chem. Co., Rockford, IL).

Należy podkreślić, ze ekstrakty nie zawierały kwasu uronowego. Wiele typowych otoczek bakteryjnych składa się z polimerów kwasu uronowego. Nieoczekiwanie okazało się, ze powierzchniowe ekstrakty C. jejuni 81-176 zawierały głównie białko. Jednakże całkowita zawartość węglowodanów w komórkach WZMOCNIONYCH była wyzsza w porównaniu z komórkami hodowanymi konwencjonalnie.

Stosunek węglowodanu do białka w ekstraktach podano poniżej w tabeli 1.

Tabela 1: Stosunek węglowodanu do białka w ekstraktach powierzchni komórek C. jejuni hodowanych konwencjonalnie (BHI) lub sposobem według przykładu 2 (WZMOCNIONE)

Czas po dodaniu (godziny)	BHI	WZMOCNIONE
1	0,02	0,02
2	0,02	0,10
4	0,02	0,15
6	0, 03	0,29

Występuje bezpośrednia zależność pomiędzy dodaniem DOC do ośrodka hodowli i zwiększonym poziomem węglowodanów ekstrahowanych z powierzchni bakterii (tabela 1). Ilość ekstrahowanych z powierzchni węglowodanów zwiększyła się ponad 8-krotnie w bakteriach hodowanych zgodnie ze sposobami według wynalazku; nie zaobserwowano wzrostu w przypadku bakterii hodowanych konwencjonalnie. Okazało się, że agregację komórek bakteryjnych hodowanych w ośrodki DOC przypisać można składnikom ekstraktu powierzchniowego.

Po ponownym uwodnieniu ekstrakt wykazuje wysoką zdolność żelowania w wodzie tworząc roztwór bardzo lepki i śluzo-podobny, zbliżony charakterem do zagregowanych bakterii. Pod względem funkcyjności ekstrakt przypominał mucyno-podobne glikoproteiny.

W celu oznaczenia poszczególnych monosacharydów ekstrakty zhydrolizowano IN kwasem trifluorooctowym w zamkniętych fiolkach. Próbki suszono w atmosferze azotu przez 2 godziny, po czym ponownie zawieszono w wodzie destylowanej. Cukry rozdzielono metodą HPLC stosując matrycę chromatograficzną Dionex Corp. oraz układ rozpuszczalników zawierający 3% 0,5N NaOH/97% H2O jako rozpuszczalnik. Detekcję amperometryczną zastosowano do pomiaru rozdzielonych monosacharydów. Dla porównania analizie HPLC poddano także autentyczny wzorzec monosacharydów zawierający fukozę, galaktozaminę, glukozaminę, galaktozę, glukozę i mannozę.

Analiza HPLC hydrolizowanego ekstraktu powierzchniowego potwierdziła obecność szeregu monosacharydów (fig. 1). Wyraźnie brak jest jakościowej różnicy w składzie węglowodanów ekstraktów bakterii hodowanych konwencjonalnie i sposobem opisanym powyżej w przykładzie 2. Widoczne są natomiast niewielkie różnice ilościowe.

Przykład 24. Białka bakteryjne zanalizowano metodą SDS-PAGE i blottingu Westema. Zastosowano układ żelu Lugtenberga i innych (FEBS Letters 58:254-258, 1975). Układ żelu stanowił nieciągły żel składający się z żelu podstawowego o pH 6,7, o niskiej zawartości akrylamidu (zazwyczaj 4%), oraz żel rozdzielający o pH 8,8, o wyższej zawartości akrylamidu. SDS (0/1%) zawarty był w obydwu żelach oraz we wszystkich stosowanych buforach. Białka rozdzielano pod względem wielkości stosując żele rozdzielające o zawartości 8 i 12% akrylamidu. Rozdzielone białka wizualizowano przez barwienie srebrem utrwalonych żeli, a wielkość cząsteczek określano na podstawie wielkości M_r znanych białek stosowanych jako wzorce.

Białka komórkowe C. jejuni rozdzielono metodą SDS-PAGE i wizualizowano przez barwienie srebrem. 4 białka, w tym białko o 62 kDa, zostały zaindukowane lub wzmocnione w komórkach hodowanych z DOC (fig. 2).

182 700

Przykład 25. S. flexneri LPS zanalizowano metodą ekstrakcji fenolem. Komórki S. flexneri hodowane konwencjonalnie lub sposobem według wynalazku opisanym powyżej w przykładzie 9 zebrano z ośrodka hodowli przez odwirowanie w sposób opisany powyżej. Lipopolisacharydy (LPS) wyekstrahowano metodą Westphala i Janna (w: E. Whistler, red., Methods in Carbohydrate Chemistry, t. 5; str. 83, 1965). W skrócie komórki hodowane w BHI lub w sposób opisany powyżej w przykładzie 9 zebrano przez odwirowanie i przemyło jednorazowo PBS. Komórki ekstrahowano następnie przez 15 minut w 68°C 45% fenolem w wodzie. Ekstrakt schłodzono do 10°C i odwirowano. Górną fazę wodną zawierającą LPS odciągnięto i dializowano względem wody destylowanej. Retentat wirowano przez 7 godzin przy 80 000 x g, raz w 4°C, a następnie 3 razy po 3 godziny przy 105 000 x g. Ostateczny osad liofilizowano. Przed analizą LPS zawieszono w wodzie. W oczyszczonym LPS oznaczono zawartość węglowodanów w sposób opisany powyżej, oraz wykonano elektroforezę na żelu poliakrylamidowym z dodecylosiarczanem sodowym (SDS-PAGE) w sposób opisany poniżej i przedstawiony na fig. 5.

Profile białek S. flexneri potwierdziły, ze nie występują znaczące różnice pomiędzy komórkami hodowanymi konwencjonalnie i WZMOCNIONYMI, co wynika z analizy przeprowadzonej z wykorzystaniem określonego układu SDS-PAGE. Stosunek węglowodanów do suchej masy w LPS z komórek WZMOCNIONYCH był niższy w porównaniu z ekstraktami z komórek BHI. Jednakże SDS-PAGE po utlenianiu i barwieniu srebrem LPS S. flexneri wykazała znaczącą zmianę w strukturze LPS (fig. 5) . Jak to widać na ścieżce 2 żelu nastąpiło zmniejszenie długości frakcji 0-ąntygenu w LPS z WZMOCNIONYCH komórek S. flexneri. Wynik ten jest zgodny z ustaleniem odnośnie obniżonego stosunku węglowodanów/suchej masy w LPS z komórek WZMOCNIONYCH.

Wyniki te sugerują, że na komórkach WZMOCNIONYCH występują krótsze Oantygenowe łańcuchy boczne, co potencjalnie może nadawać bakteriom większą hydrofobowość. Bardziej hydrofobowa bakteria może silniej oddziaływać z hydrofobowymi powierzchniami w jelicie.

Przykład 26. Immunogeniczność białek oznaczono metodą blottingu Westema. Białka z bakterii hodowanych konwencjonalnie lub sposobami według wynalazku opisanymi w powyżej w przykładach 1 lub 5 rozdzielono metodą SDS-PAGE, po czym przeniesiono elektroforetycznie na membrany z nitrocelulozy lub PVDF i zablokowano standardowym środkiem blokującym [3% BSA, 50 mM Tris (pH 8,5), 50 mM NaCl, 0,2% TWEEN 20], Przeciwciało pierwotne naniesiono w buforze blokującym, po czym błot przemyto i naniesiono drugie wykrywające, rozpoznające przeciwciało. Po przemyciu błot wizualizowąno za pomocą światła lub substratów tworzących chromofor. Jako grupę wykrywającą zastosowano peroksydazę chrzanową lub fosfatazę alkaliczną.

Na fig. 3 pokazano białka z blottingu Westema ze śluzem uodpornionego królika zawierającym IgA. Jak to można stwierdzić, białko 62 kDa stanowiło immunodominantowy antygen. Antygeniczność białka 62 kDa była znacząco wzmocniona w komórkach hodowanych z DOC lub żółcią. Białko to było również dominującym antygenem w powierzchniowych ekstraktach komórek hodowanych z DOC.

Stosując mysie monoklonalne przeciwciało reagujące krzyżowo z flagelliną Campylobacter wykazano, że wzmocnione białko stanowi flagellina C. jejuni (fig. 4). Było to znaczące odkrycie, gdyż różni badacze wykazali, iż flagellina C. jejuni odgrywa rolę w patogenezie i związana jest z inwazyjną charakterystyką bakterii.

Przykład 27. Wiązanie barwnika czerwieni Kongo zastosowano do pomiaru wirulencji. Bakterie jelitowe hodowane konwencjonalnie (BHI) lub sposobami według wynalazku (WZMOCNIONE) na płytkach agarowych BHI zawierających 0,025% czerwieni Kongo zawieszono w wodzie destylowanej i wyekstrahowano acetonem przez 10 minut. Osad komórkowy odwirowano, po czym OD488 barwnika zmierzono względem ślepego roztworu z 40% acetonu i 60% wody. Absorbancję barwnika porównano z absorbancją komórek przy 660 nm podając wynik jako stosunek OD488/OD660· Wyniki podano poniżej w tabeli 2.

182 700

2S

Tabela 2. Wiązanie czerwieni Kongo przez chorobotwórcze bakterie jelitowe hodowane konwencjonalnie (BHI) i sposobami według wynalazku (WZMOCNIONE)

Szczep	Absorbancja barwnika
BHI	WZMOCNIONE
C jejuni 81-176	0,07	0,49
C. jejuni 81-116	0,6	0,49
S. typhimurium SR11	0,05	0,30
S. flexneri 2457T	0,02	0,13
V. cholerae 569b	0,70	2,00

Z tabeli 2 wynika, że w przypadku szeregu gatunków bakterii jelitowych hodowanych sposobami według wynalazku występuje wzmocnione wiązanie czerwieni Kongo. Wyniki te wskazują, że sposoby in vitro według wynalazku są przydatne w indukowaniu wirulencji oraz innych charakterystyk, dla których znana jest korelacja z patogenezą in vivo innych gatunków bakterii.

Przykład 28. Zbadano przyczepność bakterii do hodowanych komórek nabłonkowych. Przyczepność bakterii oceniano w sposób opisany przez Galana i Curtissa (Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86:6383-6387, 1989). Komórki z hodowli tkankowych (INT-407 lub komórki Henie (ATCC nr CCL6) i CaCo-2 (ATCC nr HTB37) (linie ludzkich komórek jelitowych) hodowano na płytkach do hodowli tkankowych z 24 zagłębieniami) (37°C, 5% CO2) do zlania w 60-80%. Stosowany ośrodek zależał od użytej linii komórek, tak że ośrodek Eagle'a z modyfikacją Dulbecco, z 10% płodowej surowicy bydlęcej i po 50 mg/ml penicyliny G i H streptomycyny zastosowano w przypadku komórek Henie, a ośrodek RPMI 1640 z 10% płodowej surowicy bydlęcej i po 50 mg/ml penicyliny G i streptomycyny zastosowano w przypadku komórek CaCo-2. Na co najmniej 3 godziny przed testem ośrodek hodowli usuwano i komórki przemywano dwukrotnie zrównoważonym roztworem soli Hanksa (HBSS) z magnezem i wapniem. Następnie nanoszono monowarstwy na ośrodek wzrostu pozbawiony antybiotyków.

W celu wykonania testów przyczepności bakterie preparowano w sposób następujący. W przypadku powoli rosnących bakterii jelitowych, takich jak Campylobacter i Helicobacter, hodowlę bakteryjną rozcieńczano do OD625 0,1 świeżym, doprowadzonym wstępnie do równowagi ośrodkiem, po czym stosowano w teście. W przypadku Shigella i innych szybko rosnących bakterii jelitowych hodowlę bakteryjną rozcieńczano do OD625 0,17 świeżym, doprowadzonym wstępnie do równowagi ośrodkiem, po czym stosowano w teście. Bakterie dodawano do komórek nabłonkowych przy krotności infekcji 10 bakterii/komórkę, aby uniknąć nasycenia. Liczbę bakterii zaszczepiających dodawanych do zagłębienia z hodowlą tkankową wyliczano przez zliczanie płytki. Po infekowaniu przez 2 godziny przy 5% CO2 w przypadku Campylobacter oraz przez 30 minut w przypadku Shigella nie związane bakterie usuwano przez przemywanie HBSS przed lizą monowarstwy 0,1% dezoksycholanu i posiewem w celu określenia przyczepności.

WphAv temperatury na przyczepność do komórek INT-407 dla C. jejuni hodowanych konwencjonalnie lub sposobami według wynalazku opisanymi powyżej w przykładzie 5 podano poniżej w tabeli 3.

Różnice w przyczepności dla szeregu szczepów C. jejuni hodowanych konwencjonalnie lub sposobami według wynalazku przedstawiono poniżej w tabeli 4.

Przyczepność w procentach wyrażano jako liczbę jednostek tworzących kolonie (CFU) odzyskanych z monowarstwy, podzieloną przez liczbę CFU zaszczepionych na monowarstwie, pomnożoną przez 100.

182 700

Tabela 3. Wpływ temperatury na przyczepność do komórek ΓΝΤ-407 dla C. jejuni hodowanych konwencjonalnie (BHI) lub sposobami według wynalazku (WZMOCNIONYCH)

Temperatura	BHI (% przyczepności)	WZMOCNIONE (% przyczepności)
37°C	5,5	62,3
42°C	5,5	11,2

Tabela 4. Przyczepność (krotność wzrostu) do ΓΝΤ-407 dla różnych szczepów C jejuni hodowanych konwencjonalnie (BHI) lub sposobami według wynalazku (WZMOCNIONYCH)

Szczep	BHI	WZMOCNIONE
81-176	1,0	8,4
81-116	1,0	12,5
HC	1,0	28,2

W testach inwazji komórki nabłonkowe hodowano i preparowano sposobami opisanymi powyżej dla testu przyczepności. Bakterie hodowane konwencjonalnie lub sposobami według wynalazku dodawano do komórek nabłonkowych przy krotności infekcji 10 bakterii/komórkę, aby uniknąć nasycenia. Liczbę bakterii zaszczepiających dodawanych do zagłębienia z hodowlą tkankową wyliczano przez zliczanie płytki. Po infekowaniu przez 2 godziny przy 5% CO2 w przypadku Campylobacter oraz przez 30 minut w przypadku Shigella bakterie infekujące odciągano, a monowarstwę nanoszono na ośrodek wzrostu zawierający gentamycyną zawierającą jakiekolwiek pozakomórkowe bakterie. Jakiekolwiek bakterie w hodowli pozostające w tym momencie dokonały inwazji mono warstwy komórek nabłonkowych. Inkubację prowadzono w atmosferze CO2 przez 3 godziny w przypadku komórek zainfekowanych przez C. jejuni oraz przez 1,5 godziny Shigella. Monowarstwy przemyto HBSS w celu usunięcia gentamycyny, po czym poddano lizie przez dodanie 0,1% dezoksycholanu. Bakterie w lizatach policzono przez zliczanie płytek wyrażając procent inwazji jako liczbę bakterii odpornych na gentamycynę w porównaniu do liczby bakterii w inokulum.

Inwazję wyrażą się jako procent komórek wchodzących do monowarstwy i wylicza się jako liczbę jednostek tworzących kolonie (CFU) odzyskanych z monowarstwy po obróbce gentamycyną, podzieloną przez liczbę CFU zaszczepionych na monowarstwie, pomnożoną przez 100.

Wpływ temperatury na inwazję komórek INT-407 przez C. jejuni 81-176 hodowane konwencjonalnie lub sposobami opisanymi powyżej w przykładzie 5 przedstawiono poniżej w tabeli 5.

Różnice w inwazji komórek INT-407 przez różne szczepy C. jejuni 81-176 hodowane konwencjonalnie lub sposobami według wynalazku przedstawiono poniżej w tabeli 6.

Wpływ DOC na przyczepność i inwazję komórek INT-407 przez C. jejuni 81-176 hodowane konwencjonalnie lub sposobami opisanymi powyżej w przykładzie 5 przedstawiono poniżej w tabeli 7.

Wpływ DOC na przyczepność i inwazję komórek INT-407 przez Shigella hodowane konwencjonalnie lub sposobami opisanymi powyżej w przykładzie 5 przedstawiono poniżej w tabeli 7.

182 700

Tabela 5: Wpływ temperatury na inwazję komórek INT-407 przez C. jejuni 81-176 hodowane konwencjonalnie (BHI) lub sposobami według wynalazku (WZMOCNIONE)

Temperatura	BHI (% inwazji)	WZMOCNIONE (% inwazji)
37°C	2,5	49,5
42°C	4,0	7,1

Tabela 6. Inwazja (krotność wzrostu) komórek INT-407 przez różne szczepy C jejuni 81-176 hodowane konwencjonalnie (BHI lub sposobami według wynalazku (WZMOCNIONE)

Szczep	BHI	WZMOCNIONE
81-176	1,0	9,2
81-116	1,0	10,0
HC	l,o	26,7

Tabela 7. Wpływ stężenia DOC na przyczepność i inwazję komórek INT-407 przez

C. jejuni 81-176 hodowane konwencjonalnie (BHI) lub sposobami według wynalazku (WZMOCNIONE)

Obróbka	% przyczepności	% inwazji
BHI	9,3	6,3
WZMOCNIONE, 0,025% DOC	18,2	17,4
WZMOCNIONE, 0,1% DOC	52,6	37,0

Tabela 8. Wpływ DOC na inwazję (%) i przyczepność (%) S flexneri do komórek INT-407, hodowanych konwencjonalnie (BHI) lub sposobami według wynalazku (WZMOCNIONYCH)

Charakterystyka	BHI	WZMOCNIONE
Przyczepność	1,0	140,0a
Inwazja	1,0	94,4

^a Odzyskano więcej bakterii niz dodano na początku z uwagi na wzrost bakterii podczas testu.

Adhezja i inwazja hodowanych komórek INT-407 przez różne ludzkie izolaty C. jejuni (81-116, 81-176 i HC) została znacznie wzmocniona w wyniku dodania żółci lub dezoksycholanu do ośrodka hodowli (patrz tabele 4 i 6). Najskuteczniejsza dawka DOC wynosi 0,1% (tabela 7). Najsilniejszą reakcję uzyskano w 37°C, a nie w 42°C (w temperaturze, w której Campylobacter hoduje się konwencjonalnie) (tabele 3 i 5).

Podobne wyniki uzyskano w przypadku Shigella flexneri (tabela 8). Shigella hodowana sposobami według wynalazku wykazuje znacznie zwiększoną zdolność do przyczepiania się i inwazji.

Wyniki te wskazują, że sposoby według wynalazku wzmacniają inwazję i przyczepność jelitowych patogenów.

Przykład 29. Test szybkiej slajdowej aglutynacji wykorzystano do stwierdzenia immuno-krzyżowej reaktywności. Szczepy C. jejuni hodowane konwencjonalnie lub sposobami według wynalazku opisanymi w przykładzie 5, wystawiono na działanie surowiczego IgG ze zwierząt immunizowanych C. jejuni 81-176 (Lior %) hodowanym konwencjonalnie lub sposobami według wynalazku (np. według przykładu 5). Przeciwciała IgG unieruchomiono na perełkach lateksowych pokrytych białkiem A. Gdy występują reagujące krzyżowo epitopy pomiędzy badanym serotypem

182 700 i przeciwciałami wytworzonymi przeciw serotypowi Lior 5, to prawie natychmiast zaobserwować można zbrylanie się (czyli aglutynację) komórek. Zbrylanie to oceniano w skali od 0 do 3 po prowadzeniu reakcji przez krótki okres czasu, przy czym 0 oznacza, że nie zaobserwowano zbrylania, a 3 oznacza wysoki stopień aglutynacji. Wyniki dla 4 szczepów przedstawiono poniżej w tabeli 9.

Tabela 9. Reaktywność krzyżowa serotypów Lior hodowanych konwencjonalnie (BHI) lub sposobami według wynalazku (WZMOCNIONE)
Hodowla	Warunki wzrostu	Perełki	Reaktywność
81-176 (L5)	BHI	Anty-BHP	1
n	Ił	Anty-EHNb	2
II	WZMOCNIONE	Anty-BHI	2
II	II	Anty-EHN	2,5
L2	BHI	Anty-BHI	1
n	II	Anty-EHN	1,5
w	WZMOCNIONE	Anty-BHI	0
II	Ił	Anty-EHN	1,5
L8	BHI	Anty-BHI	2
Ił	łl	Anty-EHN	1
Ił	WZMOCNIONE	Anty-BHI	1
Ił	łł	Anty-EHN	2,5
L21	BHI	Anty-BHI	0
II	II	Anty-EHN	2
Ił	DOC	Anty-BHI	0
II	II	Anty-EHN	2
Ośrodek	BHI	Anty-BHI	0
		Anty-EHN	0
a Przeciwciała indukowane przez 81-176 hodowane konwencjonalnie b Przeciwciała indukowane przez 81-176 hodowane sposobami według wynalazku, opisanymi

w przykładzie 5.

Z tabeli 9 wynika, że wszystkie zbadane serotypy Lior (L5, L2, L8 i L21) reagują krzyżowo z przeciwciałem wytworzonym przez zwierzęta immunizowane wzmocnionym serotypem L5 C. jejuni 81-176. Płukanki śluzowe z jelit królików zainfekowanych C. jejuni 81-176, zawierające IgA, reagują z ośmioma spośród 10 głównych klinicznych serotypów (czyli ludzkich patogenów) C. jejuni hodowanych sposobami według wynalazku, poddanymi reakcji krzyżowej z przeciwciałami szczepu serotypu Lior 5 (patrz tabela 16, poniżej). Wyniki wskazują, że sposoby według wynalazku znacząco zwiększają liczbę serotypów Lior, które reagują krzyżowo z przeciwsurowicą zwierząt immunizowanych serotypem Lior 5 szczepu S. jejuni.

Również szereg gatunków Shigella hodowanych sposobami według wynalazku, ale nie gatunków hodowanych konwencjonalnie, reaguje krzyżowo z przeciwciałami IgG ze zwierząt immunizowanych Shigella flexneri 2457T hodowanym z DOC.

8. Przykłady: Skuteczność szczepionek

Przykład 30. Model fretki do badania patogenezy Campylobacter można wykorzystać jako model w ocenie skuteczności szczepionek w ochronie przed kolonizacją i/lub choro

182 700 bą gdyż infekowanie fretek odwracalnie wywołuje dwa spośród 3 objawów choroby obserwowanych u ludzi.

samce fretki w wieku 7-9 tygodni immunizowano doustnie PBS (grupa kontrolna) lub utrwalonym formaliną szczepem C. jejuni 81-178 hodowanym konwencjonalnie (BHI) lub sposobami z przykładu 5 (WZMOCNIONYM). Wydzielono surowicę w celu określenia podstawowego miana IgG. Wszystkie szczepiony i PBS podawano w obecności adiuwanta LT, dwa razy w odstępie tygodniowym (dzień 0 i 7, szczepienie). Surowicę zebrano w tydzień później (dzień 13) (po szczepieniu) w celu oznaczenia mian przeciwciała IgG. W 4 tygodnie po zaszczepieniu (prowokowanie) fretki uśpiono ACE promazynąketaminą i wykonano prowokowanie doustne 10 ml roztworu PBS zawierającego żywe C. jejuni 81-176 (1 x 10^ra CFU). Następnie zwierzęta doglądano codziennie w celu stwierdzenia biegunki śluzowej, bakteremii, wydalania Campylobacter z kałem, zmian wagi, utajonego krwawienia oraz obecności leukocytów w kale. Bakteremię wykrywano pobierając 1-2 ml krwi z żyły szyjnej uśpionych fretek oraz prowadząc inkubację próbki w wietrzonej hodowli w tryptazowym bulionie sojowym. Podhodowle do nanoszenia na płytki agarowe z krwią pobierano w 2, 5 i 7 dniu po prowokowaniu. Próbki surowicy zbierano przed immunizacją (poziom podstawowy), w tydzień po drugiej immunizacji oraz w czasie prowokowania i w tydzień po prowokowaniu, w celu określenia mian IgG.

Utajone krwawienie wykrywano badając kał na karcie Hema-cult. Kał rozsmarowywano na szkiełku i barwiono błękitem metylowym w celu wykrycia leukocytów w kale. Wydalanie Campylobacter z kałem oceniano hodując rozmazy z wymazów odbytowych na płytkach z ośrodkiem selektywnym względem Campylobacter (tryptykazowy agar sojowy, 5% owczej krwi, trimetoprim, wankomycyna, polimiksyna B, cefalotyna i amfoterycyna B, Remel, Lenexa, KS). Wyniki tych doświadczeń przedstawiono poniżej w tabelach 10 i 11.

Tabela 10* Szczepienia chronią fretki przed C. jejuni 81-176

Szczepionka	Dodatnia kolonizacja, 5 dzień po prowokowaniu8	Chorobab
PBS	6/6	1/6
BHI	0/6	2/6
WZMOCNIONE	0/5c	0/6

^fl Liczba dodatnich kolonizacji/liczba badanych osobników ^b Objaw: zielony śluz/bezkształtny/wodnisty stolec ^c Jedno zwierzę w grupie padło po ustaleniu stanu chorobowego, ale przed oceną kolonizacji

Tabela 11. Średnia geometryczna miana IgG w surowicy fterek

Grupa	Poziom podstawowy	1 tydzień po szczepieniu	Podczas prowokowania	Tydzień po prowokowaniu
PBS	6,4	4,9	6,4	1380,4
BHI	6,4	94,0	94,0	26505,3
WZMOCNIONY	6,8	234,4	1621,8	56234,1“

^a Średnie miano z 5 zwierząt, które przeżyły

Z tabeli 10 wynika, że po prowokowaniu żywymi bakteriami zwierzęta immunizowane szczepionką z uśmierconych pełnych komórek według wynalazku są chronione przed kolonizacją i chorobą Wyniki w tabeli 11 wskazują, że o wiele wyzsze miano przeciwciała IgG uzyskuje się ze szczepionek według wynalazku (WZMOCNIONYCH) niz z bakterii jelitowych hodowanych konwencjonalnie.

182 700

Wyniki te wskazują, że immunogeniczność (tabela 11) oraz ochronę przed infekcją (tabela 10) uzyskano dzięki szczepionkom według wynalazku, oraz że była ona skuteczniejsza od obserwowanej w przypadku, gdy zwierzęta szczepiono bakteriami hodowanymi konwencjonalnie. Z tego względu bakterie wytwarzane sposobami według wynalazku są przydatne jako szczepionki chroniące ssaki przed infekcją.

Przykład 31.U myszy w warunkach naturalnych nie rozwijają się infekcje Campylobacter lub Shigella takie jak u fretek, ale wykorzystywane są one przez specjalistów do wykazania odporności na kolonizację jelitową po doustnym prowokowaniu immunizowanych zwierząt lub odporności na zachorowanie przy infekowaniu płuc immunizowanych zwierząt. Mysi model donosowego zaszczepiania można następnie wykorzystać do przewidywania skuteczności szczepionek w przypadku innych zwierząt oraz ludzi. Test taki opisali Mallet i inni (Vaccine, 11:190-196,1993).

Grupę 10 samic myszy Balb/c w wieku około 16 tygodni immunizowano doustnie roztworem soli buforowanym fosforanem (PBS), C. jejuni hodowanym konwencjonalnie (BHI) lub C. jejuni hodowanym w sposób opisany w przykładzie 5 (WZMOCNIONYM) w dawkach około 10' CFU lub 10⁹ CFU, po czym wykonano prowokację. Miana IgA ze śluzu jelitowego dla każdej grupy oznaczono metodą ELISA, a wyniki przedstawiono poniżej w tabeli 12.

Tabela 12. Reakcje IgA po doustnej immunizacji myszy szczepionkami z pełnych komórek Campylobacter w dawce 10⁷ lub 10⁹.

Immunizacja	Miano IgAa w płukance	% odpowiadających0
PBS	23	14
WZMOCNIONY (107)	114	75
WZMOCNIONY (109)	78	75
BHI(107)	40	25
BHI(K)9)	32	12

^a Miano w płukance oznacza średnie miano przeciw-C. jejuni IgA uzyskane dla każdej z poszczególnych grup myszy ^b Jako odpowiadające określa się te zwierzęta, dla których ostateczne miana przewyższają o ponad 2 odchylenia standardowe średnią dla zwierząt, którym podano tylko PBS.

Z tabeli 12 wynika, że zwierzęta immunizowane bakteriami hodowanymi sposobami według wynalazku wykazują·wyższe miano jelitowego przeciwciała IgA, o czym świadczy wyższy procent odpowiadających niż u zwierząt immunizowanych bakteriami hodowanymi konwencjonalnie.

9. Przykład: Mechanizm antygenowej zmiany lub wzmacniania przez DOC

Przykład 32. Jakkolwiek nie jest zamierzone ograniczanie wynalazku do jakiegokolwiek określonego mechanizmu działania, uzyskano potwierdzenie, które pozwala sugerować iż dezoksycholan (DOC) wykazuje dwukierunkowe działanie w zmienianiu lub wzmacnianiu antygenowości bakterii jelitowych. Dowody te wskazują, że jeden z aspektów oddziaływania DOC związany jest z efektami zależnymi od wapnia, gdyż DOC wiąże wapń i w związku z tym obniża stężenie wapnia w ośrodku. Potwierdzają to następujące wyniki. Gdy C. jejuni 81-176 hoduje się z przechodzącym przez błonę związkiem chelatującym wapń, BAPTA/AM, .ale bez DOC, jego inwazyjność względem komórek INT-407 zwiększa się około 10-krotnie (patrz tabela 13 poniżej). Obróbka samym ΒΑΡΤΑ/AM nie wzmacnia jednak reaktywności immuno-krzyżowej komórek C. jejuni 81-176. ·

Wyniki przedstawione w tabeli 13 uzyskano stosując C. jejuni 81-176 hodowany zgodnie z procedurą opisaną w przykładzie 5, z tym że zamiast 0,1% DOC zastosowano 25 μΜ BAPTA/AM. Testy inwazyjności oraz obliczenia wykonano w sposób opisany powyżej w przykładzie 28 w sekcji 7.

182 700

Tabela 13. Inwazja komórek INT-407 przez C. jejuni 81-176 hodowane konwencjonalnie (BHI) oraz z BAPTA/AM

Szczep	Stan hodowli
BHI	BAP TA/AM
C. jejuni 81-176	3,0	36,9

Szereg rodzajów bakterii, które są podatne na antygenowe wzmocnienie lub zmiany przez żółć lub sole żółciowe takie jak DOC 98(np. Campylobacter, Shigella, Helicobacter) zawiera geny homologiczne z genami niskiej reakcji wapniowej (lcr) z Yersinia. Wiadomo, że locus lcr steruje wirulencją Yersinia w odpowiedzi na niskie poziomy wapnia. Dwa geny Campylobacter odgrywające rolę w ekspresji flagelliny i zestawu wymaganego do zajścia inwazji (flaA, flbA) są częściowo sterowane przez produkt lcr. Analizą zachowania się mutantów Campylobacter flaA. i flbB hodowanych konwencjonalnie lub we wzmacniających wirulencję warunkach według wynalazku wykazują, że inwazja, a nie wiązanie czerwieni Kongo lub zwiększona reaktywność krzyżowa, jest zależna od wapnia (patrz tabela 14 poniżej).

Wyniki przedstawione w tabeli 14 uzyskano stosując C. jejuni hodowany konwencjonalnie lub sposobami według wynalazku, opisanymi w przykładzie 5. Testy inwazyjności oraz obliczenia wykonano w sposób opisany powyżej w przykładzie 28.

Tabela 14. Inwazja komórek INT-407 przez mutanty C. jejuni hodowane konwencjonalnie (BHI) oraz sposobami według wynalazku (WZMOCNIONE)

Szczep	Stan hodowli
BHI	BAPTA/AM
C. jejuni 81-176	3,5	40,8
C. jejuni flaA	0,05	0,05
C. jejuni flbA	0,01	0,04

Mutanty C. jejuni fla i flbA wykazują znacząco silniejsze wiązanie czerwieni Kongo i reaktywność immuno-krzyżową, gdy hodowane są z DOC (patrz odpowiednio tabela 15 i fig. 6)Wyniki przedstawione w tabeli 15 i na fig. 6 uzyskano stosując C. jejuni hodowany konwencjonalnie lub sposobami według wynalazku, np. w sposób opisany powyżej w przykładzie 5. Testy wiązania czerwieni Kongo, których wyniki zamieszczono w tabeli 15, przeprowadzono w sposób opisany powyżej w przykładzie 26. Test reaktywności immuno-krzyżowej, którego wyniki przedstawiono na fig. 6, przeprowadzono w sposób opisany powyżej w przykładzie 29.

Tabela 15: Wiązanie czerwieni Kongo przez mutanty C. jejuni hodowane konwencjonalnie (BHI) oraz sposobami według wynalazku (WZMOCNIONE)

Szczep	Stan hodowli
BHI	BAP TA/AM
C. jejuni 81-176	0,07	1,68
C. jejuni flaA	0,10	1,60
C. jejuni flbA	0,12	0,80

182 700

Mutant flaA nie jest zdolny do ekspresji flagelliny. Mutant flaA oraz podwójny mutant flaA-flaB (otrzymany od C Granta, NIH) są nieinwazyjne nawet po obróbce DOC, co wskazuje, że flagellina jest niezbędna do zajścia inwazji. Należy podkreślić, że wykazywana normalnie (czyli bez indukowania DOC) reaktywność immuno-krzyżowa obserwowana pomiędzy izogenicznym macierzystym szczepem tych mutantów fla oraz pewnymi innymi serotypami Lior C. jejuni, nie występuje w mutantach. Natomiast obróbka za pomocą DOC może w tych mutantach nie zawierających flagelliny zwiększoną reaktywność immunokrzyżowa oraz wiązanie czerwieni Kongo.

Odkrycia te wskazują, że DOC reguluje wirulencję w bakteriach jelitowych według mechanizmów zależnych od wapnia (np. inwazyjność) oraz niezależnych od wapnia (np. wiązanie czerwieni Kongo). Odkrycia te sugerują ponadto, że wzmocniona reaktywność immuno-krzyżowa oraz wiązanie czerwieni Kongo, indukowana przez DOC, jest co najmniej w części niezależna od flagelliny.

10. Przykład: DOC indukuje wzmocnioną serotypową i gatunkową reaktywność immuno-krzyżową Campylobacter jejuni

Przykład 33. Serotypową reaktywność immuno-krzyżową Campylobacter jejuni hodowanego sposobami według wynalazku zbadano przy wykorzystaniu testu szybkiej aglutynacji na slajdach. W teście wykorzystano śluz jelitowy z immunizowanych i nie immunizowanych królików w celu ustalenia wpływu zmiany warunków hodowli na reaktywność krzyżową heterologicznych szczepów Campylobacter. Króliki immunizowano żywym C. jejuni 81-176 hodowanym konwencjonalnie. Aktywność aglutynacyjną przeciwciał śluzowych zbadano w stosunku do 24 szczepów Campylobacter obejmujących 18 serotypów, hodowanych konwencjonalnie w ośrodku BHI-YE lub sposobami według wynalazku, np. sposobem z przykładu 5.

Wyniki testów aglutynacji wykazują, ze aglutynacja krzyżowa heterologicznych szczepów Campylobacter jest szersza oraz, w wielu przypadkach, silniejsza, gdy szczepy hoduje się sposobami według wynalazku, niż wtedy, gdy hoduje się je konwencjonalnie. W szczególności nastąpił ponad dwukrotny wzrost heterologicznej reaktywności aglutynacyjnej: 6 spośród 24 konwencjonalnie hodowanych heterologicznych szczepów aglutynowało z poziomem + lub wyzszym w uodpornionym śluzie przeciw-81-176, podczas gry 14 spośród tych samych 24 szczepów hodowanych w warunkach DOC aglutynowało z poziomem + lub wyzszym. Ponadto, podczas gdy 18 heterologicznych szczepów wykazywało słabą (±) aglutynację lub nie wykazywało jej wcale, to 11 tych samych szczepów wykazywało zwiększoną reakcję aglutynacyjną, gdy hodowano je w warunkach hodowli WZMOCNIONEJ [czyli, w ośrodku zawierającym DOC).

W tabeli 16 zilustrowano reaktywność krzyżową przeciw-81-176 śluzu uodpornionego królika wobec 19 heterologicznym serotypom Lior obejmującym 22 szczepu hodowane konwencjonalnie (BHI-YE) lub sposobem według przykładu 5 (WZMOCNIONYM). Nawet mimo iż w testach tych oceniano jedynie część znanych serotypów Lior, wyniki wskazują, że sposoby według wynalazku indukują znaczącą reaktywność immuno-krzyżową pomiędzy sero-typami Lior. Wyniki wskazują ponadto, że fakt iż DOC wzmacnia lub indukuje antygeny w Campylobacter, odgrywa ważną rolę w reakcji wydzielniczego IgA związanej z odpornością na infekcję jelitową przez Campylobacter oraz wychodzeniem z niej.

Należy także podkreślić, że szczepy serotypu Lior 5 należą do odrębnych gatunków, Campylobacter coli. Jeden z dwóch szczepów (VC167) tego serotypu silnie aglutynował (3+) w śluzie przeciw-81-176 uodpornionego królika. Wynik ten wskazuje, że szczepionka pochodząca ze szczepu C. jejuni (np. Lior 5) może nie tylko zapewniać krzyżową ochronę przeciw heterologicznym serotypom w ramach tego samego gatunku, ale również przeciw innym gatunkom Campylobacter (np. Campylobacter coli) . Warto także podkreślić, że serotypy Lior 1, 2, 4, 9 i 11 należą do najbardziej rozpowszechnionych w świecie serotypów związanych z chorobą. Wszystkie one wykazały wykrywalną reaktywność krzyżową w tym teście.

182 700

Tabela 16: Reakcja aglutynacyjna 20 serotypów Campylobacter hodowanych konwencjonalnie (BHI-YE) lub sposobami według wynalazku (WZMOCNIONYMI) względem śluzu nie uodpornionego⁶ lub przeciw-81176^a uodpornionego królika.

Szczep	Serotyp Lior	Reakcją aglutynacyjna®
Śluz nie uodporniony	Śluz uodporniony
BHI-YE	WZMOCNIONY	BHI-YE	WZMOCNIONY
134	1	—	—	—	++
195	2	—	—	—	+
1	4	—	—	—	++
170	5	—	—	+++	4-+++
81-176	5	—	—	++++	++-H+
6	6	—	—	++++	+4-+
81-116	6	—		-+	++
35	7	-	-	-	+
52	8	—	+	+
VC-167	8	—	—	+	+++
VC-159	8	—	—	±	—
88	9	—	—	—	±
244	11	—	—	±	+++
556	17	—	—	+	—
563	18	—	—	—	—
544	19	—	++	—	4-+
699	21	—	—	±	++
1180	28	—	—	+	+++
1982	29	—	—	—	—
910	32	—	4-+	—	-H-
2074	36	—	—	—	—
HC	36	—	+	—	+
2984	46	—	—	—	—
79171	72	-	-	-	-

^a Śluz przeciw-81-176 otrzymano z królików zainfekowanych żywym C. jejuni 81-176, hodowanym konwencjonalnie ^b Nie-uodpomiony śluz otrzymano z nie zainfekowanych królików ^c Reakcja aglutynacyjna zmienia się w zakresie od ujemnej (-) poprzez bardzo słabą (+) do bardzo silnej (-hi i i).

182 700

11. Przykład: Dodatkowe eksperymenty dotyczące skuteczności szczepionki Campylobacter

Przykład 34. Skuteczność ochronną utrwalonych formaliną pełnych komórek Campylobacter jejuni hodowanych sposobami według wynalazku zbadano z wykorzystaniem modelu kolonizacji myszy, opisanego przez Baquara (Infect. & Immun., 63:37313735, 1995).

C. jejuni 81-176 hodowano i zebrano w sposób opisany w przykładzie 5, po czym zdezaktywowano 0,075% formaliną w sposób opisany powyżej. Grupom składających się z 5 dorosłych samic myszy Balb/c w wieku 6-8 tygodni podano 3 doustne dawki (0,25 ml/dawkę w PBS wolnym od endotoksyn) zawierające 10⁵, 10⁷ lub 10⁹ zdezaktywowanych cząstek bakteryjnych, samych lub w kombinacji z 25 pg wrażliwej na ciepło endotoksyny z E. coli (LT). Dawki stosowano w odstępach 48-godzinnych; natychmiast potem stosowano dwie dawki po 0,25 ml 5% roztworu wodorowęglanu sodowego (pH 8,5) w odstępach 15minutowych, w celu zobojętnienia kwasowości żołądka. Kontrolną grupę myszy szczepiono samym PBS lub jego kombinacją z adiuwantem LT. W około 28 dni po podaniu trzeciej dawki wykonano prowokowanie zaszczepionych zwierząt podając donosowo lub doustnie około 10⁸ tworzących kolonie jednostek (CFU) żywych, hodowanych konwencjonalnie C. jejuni 81-176. Czas trwania jelitowej kolonizacji oznaczano śledząc codziennie wydalanie bakterii z kałem przez 9 dni. Kał emulgowano w sterylnym PBS i próbki nanoszono na płytki agarowe z krwią Campylobacter. Płytki inkubowano w 35°C w warunkach mikroaerofilowych (Campylobacter GasPak, BBL) przez 3-5 dni, tak aby umożliwić wzrost C. jejuni. Wyniki badań kolonizacji wyrażano jako procent zwierząt wydalających organizmy Campylobacter dla danej próbki w danym dniu.

Jak to pokazano na fig. 7, wszystkie zwierzęta prowokowane donosowo, zarówno immunizowane jak i kontrolne, wydalały organizmy natychmiast po prowokowaniu (dzień 1). 8-100% zwierząt kontrolnych pozostało skolonizowanych w 9 dniu po prowokowaniu. Natomiast znacznie mniej zwierząt w grupach szczepionych wydalało organizmy z kałem w okresie 9 dni testu. Zarówno stopień jak i czas do osiągnięcia klirensu organizmów prowokujących były zależne od ilości podanej szczepionki. Niskie (10⁵ cząstek/dawkę) i średnie (10^r cząstek/dawkę) dawki szczepionki powodowały stopniowy i niepełny klirens. Obecność adiuwanta zwiększała stopień ochrony przy takich dawkach. Nieoczekiwanie przy najwyższej badanej dawce (10⁹ cząstek/dawkę) szczepionka bez adiuwanta zapewniała poziom ochrony taki sam lub nieznacznie wyższy od uzyskiwanego przy podawaniu porównywalnej dawki z adiuwantem LT.

Podobne wyniki uzyskano, gdy doustnie szczepione zwierzęta prowokowano następnie doustnie (fig. 8). Wyniki te wskazują, że immunizacjązdezaktywowanymi organizmami Campylobacter hodowanymi sposobami według wynalazku zapewnia ochronę przed wykonywaną następnie prowokacją żywymi organizmami Campylobacter, oraz że immunizacja jest skuteczna nawet wtedy, gdy szczepionka podawana jest doustnie bez zastosowania adiuwanta.

Oceniono także skuteczność ochronną utrwalonych formaliną pełnych komórek Campylobacter jejuni hodowanych sposobami według wynalazku (patrz np. przykład 5), podawanych dootrzewnowe (IP). W takich doświadczeniach grupom po 20 samic myszy Balb/c podawano pojedynczą dawkę 1,3 χ 10¹⁰, 2,5 χ 10⁹, 5,0 χ 10⁸, 1,0 χ 10⁸ lub 2,0 χ 10⁷ zdezaktywowanych cząstek C. jejuni w 0,5 ml PBS wolnego od endotoksyn, bez adiuwanta. Zwierzęta prowokowano po 14 dniach pojedynczą śmiertelną dawką żywych C. jejuni 81176 (około 1,0 x 10¹⁰ CFU w PBS wolnym od endotoksyn), podawaną dootrzewnowo. Sprawdzano śmiertelność przez 4 dni.

Jak to wynika z tabeli 17, pojedyncza dootrzewnowa dawka 5,0 x 10°C zdezaktywowanych cząstek C. jejuni wywołuje reakcję immunologiczną wystarczającą do ochrony zwierząt przed prowokowaniem żywymi C. jejuni.

182 700

Tabela 17. Ochrona zapewniana przez podawanie dootrzewnowe zdezaktywowanych formaliną C. jejuni wytworzonych sposobami według wynalazku

Dawka Dzień	Śmiertelność	Przetrwanie
1	2	3	4
1,3 χ 1010	0	4	0	0	16
2,5 χ 109	0	0	0	0	20
5,0 χ 108	0	0	0	0	20
1,0 χ 108	11	7	0	0	2
5,0 χ 107	10	6	2	0	2
Kontrolna PBS	4	3	2	0	1

12. Przykłady: Wzmacnianie przez DOC inwazyjności, wiązania czerwieni Kongo i reaktywności immuno-krzyzowej Shigel-la

Przykład 35. Na inwazyjność Shigella sp. hodowanych in vitro wpływa faza wzrostu hodowli. Inwazyjność komórek Shigella flexneri 2457T hodowanych konwencjonalnie (BHI) lub sposobami według wynalazku, np. według przykładu 9 (DOC-EL) (gdy komórki pochodzą z hodowli we wczesnej wykładniczej fazie wzrostu), albo według przykładu 9, ale przy doprowadzeniu hodowli do późnej wykładniczej fazy wzrostu przed zebraniem komórek (DOC-LL) zbadano w sposób opisany w przykładzie 28. Wyniki wskazują, że hodowanie z DOC wzmacnia inwazyjność, oraz że maksimum wzmocnienia uzyskuje się podczas wczesnej wykładniczej fazy wzrostu.

Hodowanie z DOC sposobami według wynalazku wzmacnia także inwazyjność innych gatunków Shigella, S. sonnei i S. dysentariae (patrz fig. 10). W spolaryzowanych komórkach nabłonkowych wzmocnioną inwazyjność obserwowano tylko wtedy, gdy komórki nabłonkowe zostały zainfekowane boczno-podstawnie przez bakterie. Ustalenie to jest zgodne z procesem inwazji obserwowanym in vivo.

Badania porównawcze wykazały, że Shigella hodowane sposobami według wynalazku są prawie 10 razy bardziej inwazyjne niż Shigella otrzymane sposobem opisanym przez Pope'a i innych (Infect. & Immun., 63:3642-3648,1995).

Przykład 36. Shigella hodowane sposobami według wynalazku wykazują również wzmocnione wiązanie czerwieni Kongo. S. flexneri 2457T i S. connei hodowane konwencjonalnie (BHI) lub sposobami według wynalazku, np. według przykładu 9, zbadano pod względem zdolności wiązania barwnika z wykorzystaniem procedury opisanej powyżej w przykładzie 26. Wyniki wskazują, że wzrost w DOC zwiększa 10-20 razy wiązanie czerwieni Kongo przez 2 gatunki Shigella (patrz tabela 18).

Tabela 18: Wiązanie czerwieni Kongo przez S. flexnen i S. sonnei hodowane konwencjonalnie (BHI) lub sposobami według wynalazku (WZMOCNIONE)

Szczep	Stan hodowli
BHI	BAP TA/AM
S. flexneri 2457T	0,04	0,44
S. sonnei	0,02	0,40

Shigella dzieli się na 4 gatunki i różne serotypy. Zbadano rektywność immunokrzyżową Shigella flexneri hodowanej sposobami według wynalazku z wykorzystaniem testu aglutynacji opisanego w przykładzie 28. W teście wykorzystano przeciwsurowice z immuni

182 700 zowanych królików w celu ustalenia wpływu warunków hodowli na rektywność immunokrzyżową różnych gatunków Shigella. Króliki immunizowano utrwaloną formaliną Shigella flexneri 2457T hodowaną sposobem według przykładu 9. Aktywność aglutynacyjną przeciwciał IgG uzyskanych z immunizowanych zwierząt zbadano w stosunku do wszystkich 4 gatunków Shigella hodowanych konwencjonalnie w ośrodku BHI lub sposobami według wynalazku (np. jak w przykładzie 9). Wyniki testów aglutynacji wskazują, że wzrost w obecności DOC znacznie zwiększa aktywność aglutynacyjną homologicznych Shigella flexneri, a także 3 heterologicznych gatunków Shigella w odniesieniu do przeciwciała przeciw S. flexneri (patrz fig. 11).

13. Przykład: Skuteczność szczepionki Shigella

Przykład 37. Skuteczność ochronną utrwalonych formaliną pełnych komórek Shigella flexneri hodowanych sposobami według wynalazku określono z wykorzystaniem modelu donosowego prowokowania myszy opracowanego przez C.P. Malletta i innych (Vaccine, 11:190-196, 1993). W skrócie Shigella flexneri hodowano i zebrano w sposób opisany w przykładzie 9, a następnie zdezaktywowano 0,075% formaliną w sposób opisany w przykładzie 30. Około 10⁷ zdezaktywowanych cząstek bakteryjnych zastosowano do szczepienia 14-16 tygodniowych samic myszy Balb/c. Zdezaktywowaną S. flexneri zawieszono w sterylnym, wolnym od endotoksyn PBS w stężeniu 10⁸ cząstek/ml i 35 μΐ tego materiału podano donosowo grupom po 10 lekko uśpionych zwierząt. Łącznie wykonano 3 immunizacje w odstępach 14-dniowych.

W celu zbadania wpływu adiuwanta na skuteczność ochronną szczepionki z pełnych komórek Shigella, grupy zwierząt immunizowano stosując zawiesinę, która zawierała zdezaktywowaną szczepionkę oraz 5 pg wrażliwej na ciepło endotoksyny z E. coli (LT). 14 dni po trzeciej immunizacji przeprowadzono donosowo prowokowanie zwierząt podśmiertelną, wyniszczającą dawką (10⁵ CFU) żywych S. flexneri lub S. sonnei. Bezpośrednio przedtem oraz w 1, 2, 5 i 7 dniu po prowokowaniu zwierzęta ważono i wyznaczano średnią wagę w grupie. Wyniki przedstawiono w tabeli 19.

Tabela 19’ Szczepionka ze zdezaktywowanych pełnych komórek Shigella flexneri chroni myszy przed donosowym prowokowaniem żywymi S. flexneri lub S. sonnei

Organizm prowokujący	Szczepienie	Procentowa zmiana wagi po prowokowaniu
Dzień 1	Dzień 2	Dzień 5	Dzień 7
S. flexneri	PBS	-8,1	-18,2	-17,7	-18,3
	Szczepionka	-5,4	-2,9	-2,5	-1,6
	Szczepionka + adiuwant	-7,0	-2,0	-1,5	1,5
S. sonnei	PBS	-8,1	-17,5	-9,3	-6,4
	Szczepionka	-6,7	-11,3	-6,5	-6 0
	Szczepionka + adiuwant	-6,4	-5,2	-1,3	-2,1

myszy w każdej grupie immunizowano 3 x donosowo szczepionką zawierającą 10⁷ zdezaktywowanych S. flexneri hodowanych w sposób opisanych w przykładzie 9.

Myszy immunizowane szczepionką zawierającą zdezaktywowane S. flexneri hodowane sposobami według wynalazku były chronione przed prowokowaniem żywymi organizmami S. flexneri. U myszy tych nastąpił mniejszy spadek wagi oraz szybsze odzyskiwanie wagi w porównaniu z myszami nie szczepionymi, czyli grupie kontrolnej rzekomo szczepionej PBS. Nieoczekiwanie szczepionka S. flexneri chroni również myszy przed prowokowaniem żywymi S. sonnei. Należy podkreślić, że zwierzęta, którym podano samą szczepionkę bez adiuwanta LT, były równie dobrze chronione przed prowokowaniem homologicznymi S. flexneri jak zwierzęta, którym podano szczepionkę z adiuwantem. Sama szczepionka

182 700

S. flexneri również zapewnia ochronę przed heterologicznym prowokowaniem S. sonnei. Jednakże dodanie adiuwanta LT znacząco wzmacnia ochronę przed prowokowaniem S. sonnei. Ustalenia te wskazują, że szczepionka zawierająca zdezaktywowane Shigella wytworzona sposobami według wynalazku skutecznie rozpoznaje model choroby Shigella i nie wymaga adiuwanta w zapobieganiu lub osłabianiu różnych infekcji Shigella .

14. Przykład: Czynniki wpływające na przyczepność H. pylori do komórek zwierzęcych

Przykład 38. Przyczepność H. pylori zwiększa się, gdy hodowlę prowadzi się w glikocholanie lub w żółci. Komórki szczepu H. pylori NB3-2 lub Gl-4 dodano do bulionu BHI z dodatkiem 4% surowicy cielęcej. Po zaszczepieniu kolby przedmuchano mieszaniną 10% CO2-5% 02-85% N2 i prowadzono inkubację przez 22 godziny w 37°C z wytrząsaniem. Po inkubacji hodowlę rozcieńczono w stosunku 1:10 w kolbie zawierającej 1 litr ośrodka BHI z 4% surowicy cielęcej i żółć bydlęcą w różnych stężeniach (od 0,025 do 0,2%). Hodowle ponownie przedmuchano tą samą mieszanką gazową i inkubowano w 37°C. Komórki zbierano w różnych okresach, do 18 godzin, po czym ich przyczepność do komórek INT-407 oceniano sposobami opisanymi w przykładzie 28. Wyniki wskazują że hodowanie za żółcią zwiększa przyczepność H. pylori do komórek INT-407 (patrz fig. 12 i 13). W przypadku szczepu NB3-2 szczyt przyczepności, 4-6-krotny wzrost w stosunku do hodowli nie wzmacnianej wystąpił po około 8 godzinach wzrostu (fig. 12). W przypadku szczepu Gl-4 szczyt przyczepności, 2-3-krotny wzrost w stosunku do hodowli nie wzmacnianej wystąpił pomiędzy 12 i 14 godziną wzrostu w 0,2% żółci (fig. 13). Te piki czasowe zazwyczaj odpowiadają okresowi, w którym hodowla każdego szczepu osiąga wykładniczą fazę wzrostu.

15. Przykład: Skuteczność szczepionki Helicobacter hodowanych sposobami według wynalazku

Przykład 39. Skuteczność ochronną utrwalonych formaliną pełnych komórek Helicobacter pylori hodowanych sposobami według wynalazku określono z wykorzystaniem modelu kolonizacji żołądkowej Helicobacter felis u myszy, opisanego przez Chena i innych (Lancet, 339:11201121, 1992) Szczep Helicobacter pylori Gl-4 hodowano jako zaszczep przez około 22 godziny w 37°C w atmosferze 10% CO2, 90% powietrza, w ośrodku BHI zawierającym 4% surowicy cielęcej. Próbkę tej hodowli zastosowano do zaszczepienia 10krotnej objętości tego samego ośrodka zawierającego 0,1% objętościowych żółci bydlęcej. Po 12-14 godzinach wzrostu w 37°C komórki zebrano przez odwirowanie i zawieszono w 1/10 wyjściowej objętości zrównoważonego roztworu soli Hanka (HBSS) w temperaturze pokojowej. Komórki ponownie odwirowano, a następnie zawieszono w 1/100 wyjściowej objętości HBSS. Do buforowanej zawiesiny komórek dodano formalinę do uzyskania stężenia 0/075% i komórki zdezaktywowano mieszając zawiesinę w temperaturze pokojowej przez 6 godzin, po czym schłodzono roztwór do 4°C na 18 godzin.

Zdolność ochronną oznaczano rutynowo stosując doustnie 3 dawki szczepionki z tych zdezaktywowanych pełnych komórek 6-8 tygodniowym samicom myszy Balb/c wolnych od Helicobacter w dniach 0, 7 i 14 lub 0, 7 i 21. Dawki 10⁹ cząstek bakteryjnych stosowano w połączeniu z wrażliwą na ciepło endotoksyną E. coli. W 14 dniu po trzeciej dawce immunizacyjnej wykonano prowokowanie doustne podając jedną dawkę (10⁷ CFU/dawkę) żywych H. felis.

W 2 tygodnie po prowokowaniu zwierzęta uśmiercono i jamowe segmenty żołądka poddano analizie na aktywność ureazowąw celu ustalenia obecności H. felis. Aktywność ureazową oznaczano prowadząc inkubację próbek tkanki jamowej w 0,5 ml bulionu ureazowego Stuarta (Remel) w temperaturze pokojowej przez 4-24 godziny. Zmianę zabarwienia z klarownego na czerwony zachodzącą w tym okresie przyjmowano jako dodatni wynik testu ureazowego.

Jak to podano w tabeli 20, podawanie szczepionki z wzmocnionych pełnych komórek Helicobacter wytworzonej przy zastosowaniu szczepu H. pylori Gl-4 chroni zwierzęta przed doustnym prowokowaniem H. felis.

182 700

Tabela 20· Ochrona przed infekcjami Helicobacter za pomocą szczepionek zawierających zdezaktywowane H. pylori hodowane sposobami wedhig wynalazku.

Czynnik immunizujący8	Organizmy prowokujące (107CFU)	Skolonizowane/łącznie	% ochrony
Doświadczenie i
H. pylorib	H. felis	4/13	71
PBS + LT	H felis	9/9	0
Doświadczenie 2
H. pylorib	H. felis	2/15	87
PBS + LT	H. felis	10/10	0

Wszystkie środki podawano z 10 pg adiuwanta LT (nietrwałej toksyny z ETEC) w 3 doustnych dawkach w odstępach 7-dniowych ^b Podano jako 1 χ 10⁹ CFU szczepu Cl-4 w dawce 0,25 ml

Wyniki tych doświadczeń wskazują na udział wzmocnionych właściwości bakterii jelitowych w immunogeniczności in vivo.

Sposobami według wynalazku wytwarza się bakterie zdolne do indukowania chroniącej reakcji immunogenicznej, a w związku z tym przydatne jako szczepionki.

16. Depozyt drobnoustrojów

Następujące drobnoustroje zostały zdeponowane w American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA, gdzie nadano im wskazane numery akcesyjne:

Drobnoustrój	nr akcesyjny	Data zdeponowania
Helicobacter pylori NB3-2		29 września 1995
Helicobacter pylori G1-4		29 września 1995

Inne rozwiązania będące odpowiednikami sposobów według wynalazku mogą być łatwo ustalone przez specjalistów i takie równoważne rozwiązania uważa się za objęte zakresem wynalazku. Powyższe ujawnienie zawiera wszelkie informacje zasadniczo niezbędne dla specjalistów do zrealizowania zastrzeżonego wynalazku. Z uwagi na to, że cytowane patenty i publikacje mogą dostarczyć dodatkowych użytecznych informacji, wszystkie cytowane materiały wprowadza się w całości jako źródła.

182 700

FIG . 2

BHI ΟΧ DOC BHI DOC STD

182 700

FIG. 3

2 3 4 5

Ścieżka 1 kultura bakterii BHI

Ścieżka 2 * kultura BHI + 0,8% oxygall

Ścieżka 3 = kultura BHI +0,1% DOC

Ścieżka 4 = ekstrakt powierzchniowy kultury bakterii BHI

Ścieżka 5 = ekstrakt powierzchniowy kultury bakterii

BHI-DOC

Ścieżka 1 =» Fermentor kultury (wynal.)

Ścieżka 2 = Kolba kultury (konvenc )

Ścieżka 3 = Kolba kultury (wynal )

182 700

FIG

FIG. 6

Serotyp □ przeciw-C. jejuni 81-176 hodowane w BHI

EJ przeciw-C. jejuni 81-176 hodowane w DOC

182 700

Szczepienie doustne - Prowwokowanie donosowe

Dzień po prowokowaniu

182 700

Szczepienie doustne - Prowokowanie doustbe

Dzień po prowokowaniu

182 700

FIG. 9

Stan hodowli

FIG. 10

182 700

FIG. 11

FIG. 12

FIG. 13

Przyczepność (% Inokulum)

Czas (godziny)

Czas (godziny)

182 700

Minuty

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz.

Cena 6,00 zł

Claims (64)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wytwarzania bakterii jelitowej o wzmocnionych właściwościach antygenowych, która to bakteria jelitowa wybrana jest z grupy obejmującej Campylobacter sp., Yersinia sp., Bacteroides sp., Klebsiella sp., Gastrospirillum sp., Enterobacter sp., Salmonella sp., Shigella sp., Aeromonas sp., Vibrio sp., Clostridium sp., Enterococcus sp. i Escherichia coli, znamienny tym, że prowadzi się hodowlę bakterii jelitowej in vitro w kombinacji warunków obejmującej:

   a) zastosowanie około 0,05-3% żółci albo około 0,025-0,6% jednego lub więcej kwasów żółciowych lub ich soli;

   b) w temperaturze 30-42°C;

   c) w powietrzu lub w warunkach mikroaerofilowych, przy czym warunki mikroaerofilowe obejmują i) około 5-20% CO₂ i około 80-95% powietrza; ii) około 5-20% CO₂ i około 80-95% N₂; albo iii) około 5-10% O₂, około 10-20% CO₂ i około 70-85% N₂; oraz

   d) ewentualnie środek chelatujący kationy dwuwartościowe wybrany z grupy obejmującej od 0 do około 100 μΜ, BAPTA/AM, od 0 do około 10 μΜ EGTA i od 0 do około 100 μΜ EGTA/AM;

   przez okres czasu wystarczający do osiągnięcia przez hodowlę fazy wzrostu zbliżonej do wczesnej fazy wykładniczej, pomiędzy wczesną fazą wykładniczą i fazą stacjonarną lub zbliżonej do fazy stacjonarnej.
2. 2. Sposób według ząstrz. 1, znamienny tym, że jako sól żółciową stosuje się dezoksycholan lub glikocholan.
3. 3. Sposób według ząstrz. 1, znamienny tym, że bakterię jelitową stanowi Campylobacter sp.
4. 4. Sposób według ząstrz. 3, znamienny tym, że bakterię jelitową stanowi Campylobacter jejuni lub Campylobacter coli.
5. 5. Sposób według ząstrz. 4, znamienny tym, że Campylobacter jejuni stanowi szczep Campylobacter jejuni wybrany z grupy obejmującej szczep 81-176, 81-116, i HC.
6. 6. Sposób według ząstrz. 5, znamienny tym, że Campylobacter jejuni stanowi szczep Campylobacter jejuni 81-176, a kombinacja warunków obejmuje:

   a) zastosowanie około 0,1% soli żółciowej w postaci dezoksycholanu lub około 0,8% żółci;

   b) temperaturę około 37°C;

   c) atmosferę zawierającą około 10-20% CO₂ i około 80-90% powietrza, oraz hodowlę prowadzi się przez okres czasu wystarczający do osiągnięcia przez hodowlę fazy stacjonarnej.
7. 7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że bakterię jelitową stanowi Shigella sp.
8. 8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że bakterię jelitową stanowi gatunek Shigella wybrany z grupy obejmującej flexneri, sonnei, dysenteriae i boydii.
9. 9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, ze Shigella stanowi Shigella flexneri lub Shigella dysenteriae.
10. 10. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że Shigella flexneri stanowi szczep Shigella flexneri 2457T, a kombinacja warunków obejmuje:

    a) zastosowanie około 0,1% dezoksycholanu lub około 0,8% żółci;

    b) temperaturę około 37°C;

    c) powietrze jako atmosferę oraz hodowlę prowadzi się przez okres czasu wystarczający do osiągnięcia przez hodowlę wczesnej fazy wykładniczej.

    182 700
11. 11. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, ze bakterię jelitową stanowi Yersinia sp.
12. 12. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że bakterię jelitową stanowi Escherichia coli.
13. 13. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, ze Escherichia coli stanowi enterotoksyczny, powodujący krwawienie jelit, entero-patogeniczny lub entero-inwązyjny szczep Escherichia coli.
14. 14. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, ze bakterię jelitową stanowi Vibrio sp.
15. 15. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że bakterię jelitową stanowi Salmonella sp.
16. 16. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że bakterię jelitową stanowi Bacteroides sp.
17. 17. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że bakterię jelitową stanowi Clostridium sp.
18. 18. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że bakterię jelitową stanowi Enterococcus sp.
19. 19. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że bakterię jelitową stanowi Klebsiella sp.
20. 20. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że bakterię jelitową stanowi Enterobactęr sp.
21. 21. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, ze bakterię jelitową stanowi Gastrospirillum sp.
22. 22. Sposób wytwarzania bakterii jelitowej o wzmocnionych właściwościach antygenowych, która to bakteria jelitowa wybrana jest z grupy obejmującej Campylobacter sp., Yersinia sp., Bacteroides sp., Klebsiella sp., Enterobacter sp., Gastrospirillum sp., Salmonella sp., Shigella sp., Aeromonas sp., Vibrio sp., Clostridium sp., Enterococcus sp. i Escherichia coli, znamienny tym, że prowadzi się hodowlę bakterii jelitowej in vitro w kombinacji warunków obejmującej:

    a) zastosowania środka chelatującego kationy dwuwartościowe wybranego z grupy obejmującej około 1,0-25 μΜ, BAPTA/AM, około 0,5-10 μΜ EGTA i około 1,0-100 μΜ EGTA/AM;

    b) w temperaturze 30-42°C;

    c) w powietrzu lub w warunkach mikroaerofilowych, przy czym warunki mikroaerofilowe obejmują i) około 5-20% CO₂ i około 80-95% powietrza; ii) około 5-20% CO₂ i około 80-95% N₂; albo iii) około 5-10% O₂, około 10-20% CO₂iokoło 70-85% N₂;

    przez okres czasu wystarczający do osiągnięcia przez hodowlę fazy wzrostu zbliżonej do wczesnej fazy wykładniczej, pomiędzy wczesną fazą wykładniczą i fazą stacjonarną lub zbliżonej do fazy stacjonarnej.
23. 23. Bakteria jelitowa o wzmocnionych właściwościach antygenowych, która to bakteria jelitowa wybrana jest z grupy obejmującej Campylobacter sp., Yersinia sp., Bacteroides sp., Klebsiella sp., Gastrospirillum sp., Enterobacter sp., Salmonella sp., Shigella sp., Aeromonas sp., Vibrio sp., Clostridium sp., Enterococcus sp. i Escherichia coli, znamienna tym, że została zebrana z hodowli bakterii jelitowej prowadzonej in vitro w kombinacji warunków obejmującej:

    a) zastosowanie około 0,05-3% żółci albo około 0,025-0,6% jednego lub więcej kwasów żółciowych lub ich soli,

    b) w temperaturze 30-42°C;

    c) w powietrzu lub w warunkach mikroaerofilowych, przy czym warunki mikroaerofilowe obejmują i) około 5-20% CO₂ i około 80-95% powietrza; ii) około 5-20% CO₂ i około 80-95% N₂; albo iii) około 5-10% O₂, około 10-20% CO₂ i około 70-85% N₂; oraz

    d) ewentualnie środek chelatujący kationy dwuwartościowe wybrany z grupy obejmującej od 0 do około 100 μΜ, BAPTA/AM, od 0 do około 10 μΜ EGTA i od 0 do około 100 μΜ EGTA/AM;

    przez okres czasu wystarczający do osiągnięcia przez hodowlę fazy wzrostu zbliżonej do wczesnej fazy wykładniczej, pomiędzy wczesną fazą wykładniczą i fazą stacjonarną lub zbliżonej do fazy stacjonarnej.
24. 24. Bakteria jelitowa według zastrz. 23, znamienna tym, że jako sól żółciową stosuje się dezoksycholan lub glikocholan.
25. 25. Bakteria jelitowa według zastrz. 23, znamienna tym, że bakterię jelitową stanowi Campylobacter sp.
26. 26. Bakteria jelitowa według zastrz. 25, znamienna tym, że bakterię jelitową stanowi Campylobacter jejuni lub Campylobacter coli.

    182 700
27. 27. Bakteria jelitowa według zastrz. 26, znamienna tym, że Campylobacter jejuni stanowi szczep Campylobacter jejuni wybrany z grupy obejmującej szczep 134, 195, 170, 81176, 6, 81-116, 35, 52, VC-167, 88, 244, 544, 699,1180, 910 i HC.
28. 28. Bakteria jelitowa według zastrz. 27, znamienna tym, że Campylobacter jejuni stanowi szczep Campylobacter jejuni 81-176, a kombinacja warunków obejmuje:

    a) zastosowanie około 0,1% soli żółciowej w postaci dezoksycholanu lub około 0,8% żółci;

    b) temperaturę około 37°C;

    c) atmosferę zawierającą około 10-20% CO2 i około 80-90% powietrza, oraz hodowlę prowadzi się przez okres czasu wystarczający do osiągnięcia przez hodowlę fazy stacjonarnej.
29. 29. Bakteria jelitowa według zastrz. 23, znamienna tym, że bakterię jelitową stanowi Shigella sp.
30. 30. Bakteria jelitowa według zastrz. 29, znamienna tym, że bakterię jelitową stanowi gatunek Shigella wybrany z grupy obejmującej flexneri, sonnei, dysenteriae i boydii.
31. 31. Bakteria jelitowa według zastrz. 30, znamienna tym, że Shigella stanowi Shigella dysenteriae.
32. 32. Bakteria jelitowa według zastrz. 30, znamienna tym, że Shigella stanowi Shigella flexneri.
33. 33. Bakteria jelitowa według zastrz. 32, znamienna tym, ze Shigella flexneri stanowi szczep Shigella flexneri 2457T, a kombinacja warunków obejmuje:

    a) zastosowanie około 0,1% dezoksycholanu lub około 0,8% żółci;

    b) temperaturę około 37°C;

    c) powietrze jako atmosferę oraz hodowlę prowadzi się przez okres czasu wystarczający do osiągnięcia przez hodowlę wczesnej fazy wykładniczej.
34. 34. Bakteria jelitowa według zastrz. 23, znamienna tym, że bakterię jelitową stanowi Escherichia coli.
35. 35. Bakteria jelitowa według zastrz. 34, znamienna tym, że Escherichia coli stanowi enterotoksyczny, powodujący krwawienie jelit, entero-pątogeniczny lub entero-inwazyjny szczep Escherichia coli.
36. 36. Bakteria jelitowa według zastrz. 23, znamienna tym, że bakterię jelitową stanowi Vibrio sp.
37. 37. Bakteria jelitowa według zastrz. 23, znamienna tym, że bakterię jelitową stanowi Salmonella sp.
38. 38. Bakteria jelitowa według zastrz. 23, znamienna tym, że bakterię jelitową stanowi Bacteroides sp.
39. 39. Bakteria jelitowa według zastrz. 23, znamienna tym, ze bakterię jelitową stanowi Clostridium sp.
40. 40. Bakteria jelitowa według zastrz. 23, znamienna tym, ze bakterię jelitową stanowi Enterococcus sp.
41. 41. Bakteria jelitowa według zastrz. 23, znamienna tym, że bakterię jelitową stanowi Klebsiella sp.
42. 42. Bakteria jelitowa według zastrz. 23, znamienna tym, że bakterię jelitową stanowi Enterobacter sp.
43. 43. Bakteria jelitowa według zastrz. 23, znamienna tym, że bakterię jelitową stanowi Gastrospirillum sp.
44. 44. Bakteria jelitowa o wzmocnionych właściwościach antygenowych, która to bakteria jelitowa wybrana jest z grupy obejmującej Campylobacter sp., Yersinia sp., Bacteroides sp., Klebsiella sp., Gąstrospirillum sp., Enterobacter sp., Salmonella sp., Shigella sp., Aeromonas sp., Vibrio sp., Clostridium sp., Enterococcus sp. i Escherichia coli.
45. 45. Szczepionka do pobudzania reakcji odpornościowej u zwierzęcia, znamienna tym, ze zawiera bakterię jelitową o wzmocnionych właściwościach antygenowych lub jej składniki wybrane z grupy obejmującej Campylobacter sp., Yersinia sp., Bacteroides sp., Klebsiella sp.,

    182 700

    Gastrospirillum sp., Enterobacter sp., Salmonella sp., Shigella sp., Aeromonas sp., Vibrio sp., Clostridium sp., Enterococcus sp. i Escherichia coli, albo ich immunogeniczny fragment lub pochodną o wzmocnionych właściwościach antygenowych oraz ewentualnie farmaceutycznie dopuszczalny nośnik lub rozcieńczalnik.
46. 46. Szczepionka według zastrz. 45, znamienna tym, że jako bakterię jelitową zawiera Campylobacter jejuni lub Campylobacter coli.
47. 47. Szczepionka według zastrz. 46, znamienna tym, że jako Campylobacter jejuni zawiera Campylobacter jejuni 81-176.
48. 48. Szczepionka według zastrz. 45, znamienna tym, że jako bakterię jelitową zawiera Shigella sp.
49. 49. Szczepionka według zastrz. 48, znamienna tym, że jako Shigella sp. zawiera gatunek bakterii wybrany z grupy obejmującej flaxneri, sonnei, dysynteriae i boydii.
50. 50. Szczepionka według zastrz. 49, znamienna tym, że Shigella flexneri stanowi szczep Shigella flexneri 2457T.
51. 51. Szczepionka według zastrz. 45, znamienna tym, że jako bakterię jelitową zawiera Escherichię coli.
52. 52. Szczepionka według zastrz. 51, znamienna tym, że Escherichię coli stanowi enterotoksyczny, powodujący krwawienie jelit, entero-patogeniczny lub entero-inwazyjny szczep Escherichia coli.
53. 53. Szczepionka według zastrz. 45, znamienna tym, że jako bakterię jelitową zawiera Vibrio sp.
54. 54. Szczepionka według zastrz. 45, znamienna tym, że jako bakterię jelitową zawiera Salmonella sp.
55. 55. Szczepionka według zastrz. 45, znamienna tym, ze jako bakterię jelitową zawiera Bacteroides sp.
56. 56. Szczepionka według ząstrz. 45, znamienna tym, że jako bakterię jelitową zawiera Clostridium sp.
57. 57. Szczepionka według ząstrz. 45, znamienna tym, ze jako bakterię jelitową zawiera Enterococcus sp.
58. 58. Szczepionka według zastrz. 45, znamienna tym, że jako bakterię jelitową zawiera Klebsiella sp.
59. 59. Szczepionka według zastrz. 45, znamienna tym, ze jako bakterię jelitową zawiera Enterobacter sp.
60. 60. Szczepionka według zastrz. 45, znamienna tym, że jako bakterię jelitową zawiera Gastrosporillum sp.
61. 61. Szczepionka według zastrz. 45, znamienna tym, że jako bakterię jelitową zawiera zdezaktywowaną bakterię jelitową.
62. 62. Szczepionka według zastrz. 61, znamienna tym, że bakteria jelitowa jest zdezaktywowana przez obróbkę formaliną.
63. 63. Szczepionka według zastrz. 45, znamienna tym, ze jest w postaci do podawania dośluzówkowego lub pozajelitowego, albo dośluzówkowego i pozajelitowego.
64. 64. Szczepionka według zastrz. 45, znamienna tym, że dodatkowo zawiera adiuwant.

    * * *

    Wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania bakterii jelitowej o wzmocnionych właściwościach antygenowych, bakterii jelitowej o wzmocnionych właściwościach antygenowych i szczepionki do pobudzania reakcji odpornościowej. Ogólnie, wynalazek dotyczy sposobów in vitro indukowania lub wzmacniania ekspresji antygenów bakterii jelitowych i/lub czynników wirulencji, a tym samym wytwarzania antygenowo wzmocnionych bakterii jelitowych oraz szczepionek zawierających antygenowo wzmocnione bakterie jelitowe.

    Powszechnie wiadomo, że bakterie hodowane in vitro przy wykorzystaniu zwykłych ośrodków i warunków wykazują charakterystyki, które różnią się od charakterystyk wykazy

    182 700 wanych podczas wzrostu w naturalnych warunkach, które obejmują wzrost in vivo normalnej mikroflory lub patogenów w gospodarzu zwierzęcym. Z tego względu takie hodowane in vitro bakterie chorobotwórcze mogą nie być odpowiednie do stosowania jako składniki szczepionek. Gdyby można było określić warunki, które wyzwalają lub wzmacniają ekspresję czynników wirulencji, istotne cechy fizjologiczne oraz antygeny, w tym antygeny zewnętrznej powierzchni, wówczas możnaby było szybko zidentyfikować istotne produkty i leki (np. nowe antygeny do szczepionek, nowe cele dla antybiotyków oraz nowe charakterystyki bakteryjne do zastosowań diagnostycznych).

    Zidentyfikowano szereg czynników środowiskowych, które wpływają na ekspresję determinant wirulencji w bakteriach (Mekalanos J.J., J. Bacteriol. 174:1-7, 1992). Tak np. od dawna znane są badania nad zależnością pomiędzy żelazem i wirulencją bakterii, zwłaszcza Shigella (Payne, Mol. MicroBiol., 3:1301-1306, 1989), Neisseria (Payne i Finkelstein, J. Clin. Microbiol., 6:293-297, 1977) oraz Pasteurella (Gilmour i inni, Vaccine, 9:137-140, 1991).

    Do innych sygnałów środowiskowych, które, jak to wykazano, kontrolują ekspresję koordynacyjnie regulowanych determinant wirulencji wielu różnych bakterii w roślinach i zwierzętach należą związki fenolowe, monocukry, aminokwasy, temperatura, osmolamość, oraz inne jony (Mekalanos, J. Bacteriol., 174:1-7,1992).

    Patogeny bakteryjne, które wchodzą do gospodarza zwierzęcego przez jelita (np. drogą doustną), napotykają różne składniki środowiska gospodarza i warunki, które mogą wpływać na fizjologię bakteryjną i ekspresję czynników wirulencji. Do takich składników i warunków należy żółć, kwasy lub sole żółciowe, pH w żołądku, warunki mikroaerofilowe (jelito zawiera więcej CO2, a mniej O2), osmolamość oraz wiele innych czynników, dotychczas nie zidentyfikowanych. Inwazyjne patogeny jelitowe wymagają syntezy białka de novo, aby mogła zajść internalizacja (Headley i Payne, Proc. NatL Acad. Sci., USA, 87:4179-4183, 1990) . Z tego względu bakterie mogą wytwarzać te inwazyjne czynniki tylko w reakcji na pewne sygnały środowiskowe, zazwyczaj nie występujące in vitro. Hipotezę tą wspiera najnowszy raport, w którym podano, że przeciwsurowice wyhodowane przeciw C. jejuni hodowanej w zwykłych warunkach wywierają jedynie minimalny wpływ na blokowanie internalizacji in vitro (Konkel i inni, J. Infect. Dis., 168:948-954, 1993). Natomiast w wyniku immunizacji królików ekstraktami Campylobacter hodowanych w obecności monowarstw komórek nabłonkowych, w stanie wzmagającym inwazyjność, uzyskuje się przeciwsurowicę, która znacząco hamuje internalizację bakterii.

    Naukowcy badają wzrost bakterii w środowisku jelita w celu zidentyfikowania istotnych czynników wirulencji. Tak np. w Campylobacter, szczep 81-176, hodowanym w pętlach krętniczych królika zachodzi ekspresja białek, która nie zachodzi w warunkach zwykłej hodowli laboratoryjnej in vitro (Panigrahi i inni, Infect. Immun., 60:4938-4944, 1992). Nową lub wzmocnioną syntezę białek zaobserwowano w Campylobacter hodowanych z monowarstwami komórek INT 407 w porównaniu z bakteriami hodowanymi bez obecności komórek nabłonkowych (Konkel i inni, J. Infect. Dis., 164:948-954, 1993). Ponadto zmiany takie były przejściowo związane ze zwiększoną inwązyjnością C. jejuni. Inne zmiany takie jak morfologia komórkowa, utrata wici, ekspresja nowego białka na zewnątrz błony oraz zmiany w węglowodanach na powierzchni komórek zostały wywołane w niezjadliwym szczepie C. jejuni, gdy przepuszczono go dożylnie i przez kosmówkę omoczniową przez embriony kurczaka (Field i inni, J. Med. Microbiol., 38:293-300,1993).

    Wiadomo, że inne składniki jelitowe takie jak kwasy lub sole żółciowe, hamują rozwój pewnych bakterii, z tym że kwasy żółciowe mogą również odgrywać inną rolę wpływając na ekspresję wirulencji przez bakterię.

    Pope i Payne (93 Am. Soc. Microbiol., B-147, 1993) donieśli, że Shigella Flexneri hodowana w bulionie zawierającym chenodezoksycholan sodowy wykazywała 3-5-krotny wzrost infekcyjności w stosunku do monowarstw komórek HeLa. Jednakże podali oni, że inne sole żółciowe i detergenty, np. cholan, glikocholan, taurodezoskycholan, seria CHAPS, digitonina oraz Triton XI00, oraz ich sole sodowe, nie wywierają wpływu na infekcyjność S. flexneri. Ponadto ich bulion zawierający chenodezoksycholan nie wywierał również wpływu na inwazyjność E. coli lub innych niezjadliwych szczepów Shigella.

    182 700

    Synteza nowych białek przez S. flexneri jest również indukowana przez zmianę pH, temperatury oraz jonowego składu ośrodka wzrostu (Mekalanos, J. Bacteriol., 174:1-7, 1992).

    W publikacji zgłoszenia patentowego PCT nr WO 93/22423, opublikowanej 11 listopada 1993 ujawniono sposoby hodowania bakterii na lipidach takich jak fosfatydyloseryna, albo na śluzie, oraz wydzielania białek, których ekspresja ulega wzmocnieniu na skutek wzrostu w obecności fosfatydyloseryny. W publikacji tej_nie ujawniono, ani nie zasugerowano sposobów według wynalazku dotyczących wytwarzania bakterii jelitowych o wzmocnionej wirulencji lub właściwościach antygenowych.

    Szczepionki przeciw wielu patogenom jelitowym, takim jak Campylobacter i Shigella, nie są jeszcze dostępne, z tym że epidemiologia takich czynników chorobowych uważa opracowanie takich szczepionek za ważny cel. Zakażenie pałeczkami Shigella jest chorobą endemiczną w całym świecie, a w krajach rozwijających szacuje się, że co roku 10% spośród 5 milionów dzieci umiera na biegunkę. Campylobacter, choć dopiero niedawno zidentyfikowany jako jelitowy patogen, obecnie uważany jest za jedną z podstawowych przyczyn choroby biegunkowej zarówno w rozwiniętych jak i w nierozwiniętych krajach. Szacuje się, że corocznie występuje 400-500 milionów przypadków biegunki Campylobacter, w tym ponad 2 miliony przypadków w USA.

    Zakażenie pałeczkami Shigella jest spowodowana inwazją bakteryjną śluzówki okrężniczej. Inwazja związana jest z obecnością plazmidu, który znaleziono we wszystkich izolatach inwazyjnych (Sansonetti i inni, Infect. Immun., 35:852-860, 1982) . Fragment tego plazmidu zawiera geny antygenu plazmidu inwazyjnego (Ipa), Ipa A, B, C i D. Białka Ipa B, C i D odgrywają decydującą rolę w całym procesie (Baudry i inni, J. Gen. Microbiol., 133:3403-3413, 1987).

    Białka Ipa są logicznymi kandydatami do wytwarzania szczepionek, choć ich skuteczność w działaniu ochronnym nie została wyraźnie ustalona. Ipa B i Ipa C są białkami immunodominantowymi (Hale i inni., Infect. Immunol., 50:620-629, 1985). Ponadto białko Ipa B o 62 kDa (inwazyna, która inicjuje wejście do komórki oraz uczestniczy w lizie związanej z błoną wakuoli fagocytowej (High i inni, EMBO J., 11:1991-1999, 1992) jest w znaczącym stopniu zachowane wśród różnych gatunków Shigella. Przedłużanie się choroby obserwowane u źle odżywianych dzieci, które nie mają znaczących przeciwciał śluzówkowych przeciw Ipa Shigella sugeruje, że obecność śluzówkowych przeciwciał przeciw Ipa może ograniczyć rozprzestrzenianie się infekcji i jej ostrość.

    Jakkolwiek wiele potencjalnych szczepionek przeciw Shigella zbadano na zwierzętach i ludziach, nie znaleziono w pełni zadowalającej. Pomimo potencjalnego znaczenia białek Ipa w zjadliwości większość potencjalnych szczepionek opracowanych przeciw zakażeniu pałeczkami Shigella oparta jest na antygenie lipopolisacharydowym, który przenosi determinanty właściwe dla serotypu. Opracowano także podawaną pozaj elitowo szczepionkę w postaci koniugatu polisacharydowo-białkowego, z tym że dotychczas wykazano jej działanie ochronne w stosunku do zwierząt (Robbins i inni, Rev. Inf. Dis., 13:S362-365, 1991). Podobnie podawana szczepionka rybosomowa indukuje odporność śluzówki, z tym że jej skuteczność w działaniu ochronnym w dalszym ciągu nie została potwierdzona (Levenson i inni, Arch. Allergy Appl. Immunol., 87:25-31, 1988).

    Patogeneza infekcji Campylobacter nie została tak dobrze poznana jak patogeneza infekcji Shigella. Badania inwazji komórek in vitro (Konkel i inni, J. Infect. Dis., 168:948-954, 1993) oraz badania histopatologiczne (Russell i inni, J. Infect. Dis., 168:210-215, 1993) sugerują, że ważną role odgrywa również inwazja okrężnicza. Wniosek ten zgodny jest z obserwacjami, zgodnie z którymi biegunka powodowana przez Campylobacter może być ostra i przebiegać z obecnością krwi w stolcu. Aktywności te mogą być związane z immunodominantowym białkiem flagelliną o 62 kDa. Najnowsze doniesienia wskazują, że obecność wici jest niezbędna, aby Campylobacter przeszła przez spolaryzowane monowarstwy komórek nabłonkowych (Grant i inni, Infect. Immun., 61:1764-1771, 1993).

    Nie ustalono działania ochronnego żadnego ze specyficznych antygenów Campylobacter. Jednakże uważa się, że pewną nadzieję w tym zakresie należy wiązać z białkami o niskim ciężarze cząsteczkowym (28-31 kDa) lub białkami PEB, oraz z immunodominantowym biał

    182 700 kiem wiciowym (Pavlovskis i inni, Infect. Immun., 59:2259-2264, 1992; Blaser i Gotschilch, J. Bio. Chem., 265:14529-14535, 1990). Znaczenie białka wiciowego potwierdza jego związek z kolonizacją jelita oraz z krzyżową ochroną szczepu przed infekcją podgrupami Lior (Pavlovskis i inni, Infect. Immun., 59:2259-2264, 1992). Jednakże szczepionka Campylobacter oparta na białku wiciowym będzie musiała zawierać antygen białka wiciowego z 8-10 grup serologicznych Lior o największym znaczeniu klinicznym.

    W związku z tym do celów wynalazku należą: 1) warunki hodowli in vitro do hodowania lub obróbki bakterii jelitowych, które optymalnie indukują lub wzmacniają inwazyjne aktywności i/lub pewne charakterystyki komórkowe, w tym powierzchniowe charakterystyki komórek; 2) zmieniona w sposób skorelowany inwazyjność lub charakterystyki komórkowe, w tym powierzchniowe charakterystyki komórek ze zmianami w profilach antygenowych; 3) zwiększona zjadliwość tych organizmów w stosunku do modelowych małych zwierząt; oraz 4) przeciwsurowice przeciw organizmom o zwiększonej inwazyjności lub zmienionej charakterystyce, w tym powierzchniowej charakteiystyce, bardziej skuteczne w neutralizowaniu żywych organizmów stosowanych do prowokowania in vitro lub in vivo niz przeciwsurowice wytworzone przeciw normalnie rosnącym bakteriom. Wynalazek dotyczy tych i innych celów.

    W żadnej z wymienionych powyżej publikacji nie ujawniono ani nie zasugerowano sposobów in vitro według wynalazku, ani też szczepionek według wynalazku zawierających antygenowe wzmocnione bakterie jelitowe. Cytowanie lub wymienienie jakiejkolwiek z publikacji w tej części lub w jakiejkolwiek innej części zgłoszenia nie może być uznawane za wskazówkę, że źródło takie jest dostępne jako znany stan wiedzy w stosunku do wynalazku.