CN1168693A

CN1168693A - 用于生产具有提高的抗原性的肠细菌的方法及包含此种细菌的疫苗

Info

Publication number: CN1168693A
Application number: CN95196589A
Authority: CN
Inventors: J·L·佩斯; R·I·沃克; S·M·弗拉
Original assignee: Microcarb Inc
Current assignee: Emergent Product Development Gaithersburg Inc
Priority date: 1994-10-05
Filing date: 1995-10-04
Publication date: 1997-12-24
Also published as: AU3956195A; SG73509A1; FI971403A0; HUT77876A; WO1996011258A1; FI971403A; NO971519L; NZ295907A; PL182700B1; NO971519D0; AU704283B2; IL115521A0; EP0804542A4; EP0804542A1; CZ104397A3; JPH10507347A; PL319580A1; CA2202027A1; SG73510A1; JP3394047B2

Abstract

公开了用于诱导或提高肠细菌抗原或毒力因子的体外进程的方法。也公开使用抗原性提高的细菌的方法，以及含有肠杆菌的疫苗，具体地，卷旋杆菌提供了其完整的肠细菌或组分。且有其它可用于本发明的肠细菌。图述了一个典型空肠弯曲杆菌，显示了空肠弯曲杆菌的表面提取物水解物的单糖的高效液相色谱结果。

Description

用于生产具有提高的抗原性的肠细菌的方法及包含此种细菌的疫苗

本发明是1994年10月5日提交的共同未决的系列申请08/318,409的部分后继。

1.发明领域

本发明总体上涉及诱导或提高肠细菌抗原和/或毒性因子的表达因而产生抗原性提高的肠道细菌的体外方法，涉及使用抗原性提高的肠道细菌的方法，涉及含有抗原性提高的肠细菌的疫苗。

2.发明背景

普遍认为，使用常规培养基和培养条件体外培养的细菌，其表达的特征不同于在其自然的生活环境，包括在动物宿主的正常微生物体系和病原体体内生长，生长过程中所表达的特征。因而，这种体外生长的病原菌不宜用作疫苗组分。然而，假如能够确定引发或提高毒性因子的表达，相关生理学，或包括外表面抗原的抗原的条件，那么重要的产品和治疗学(如，疫苗的新抗原，抗生素的新靶点，和用于诊断应用的新的细菌特征)能够被快速地确定。

已经确定了几种影响细菌中毒性决定簇的表达的环境因子(Mekalanos，J.J.，J.Bacteriol.174：1-7，1992)。例如，对于铁和细菌，特别是志贺氏菌属(Payne，Mol.MicroBiol.，3：1301-1306，1989)，奈瑟氏球菌属(Payne and Finhelstein，J.Clin.Microbiol.，6：293-297，1977)和巴斯德氏菌属(Gilmour，et al.，Vaccine，9：137-140，1991)细菌的毒性之间关系的研究已进行了很长时间。

其它环境因子亦显示出在植物和动物中控制多种细菌的协同调节的毒性决定簇的表达，包括酚类化合物，单糖，氨基酸，温度，克分子渗透压浓度，和其他离子(Mekalanos，J.Bacteriol.174：1-7，1992)。

通过肠道(即，口途径)进入动物宿主的细菌病原体遭遇多种宿主环境成份和条件，这些都可能影响细菌病理学和毒性因子表达。这些成份和条件包括胆汁，胆汁酸或盐，胃pH，微需氧的条件(肠道内CO₂较高，O₂较低)，克分子渗透压浓度和其它尚未确定的因素。侵袭性肠病原菌需要从头蛋白质合成以完成内在化(internalization)(Headley and Payne，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87：4179-4183，1990)。因而，细菌可仅在应答普通情况下体外不存在的某些环境信号时最佳地产生这些侵袭因子。这些假说被最近的报道所支持：针对常规生长的空肠弯曲杆菌制备的抗血清在阻断体外内在化上仅有边缘效应(Konkel，et al.，J.Infect.Dis.，168：948-954，1993)。然而，用在上皮细胞单层出现，一种提高侵袭力，的条件下生长的弯曲杆菌提取物免疫兔，引起能明显抑制细菌内在化的抗血清的产生。

研究人员一直在研究在肠道环境下的细菌生长以确定相关毒性因子。例如，生长于兔回肠环的弯曲杆菌菌株81-176表达了在实验室常规体外培养条件下不表达的蛋白质(Panigrahi，et al.，Infect.Immun.60：4938-4944，1992)。用INT 407细胞单层培养的弯曲杆菌，与没有上皮细胞条件下培养的细菌相比，出现了新的，或提高的蛋白质的合成(Konkel，et al.，J.Infect.Dis.168：948-954，1993)。而且，这些变化暂时地与空肠弯曲杆菌增加的侵袭力相关。在静脉内或绒毛尿囊鸡胚传代时，空肠弯曲杆菌的无毒株的一些变化被诱导和增加，如细胞形态，鞭毛失去，新的外层膜蛋白的表达和细胞表面碳水化合物的改变(Field，etal.，J.Med. Microbiol.，38：293-300，1993)。

其他肠道组分，例如胆汁酸或盐，已知能抑制某些细菌，但是胆汁酸通过影响细菌毒性表达而起到其他作用。

Pope和Payne(93rd Am Soc.Microbiol.，B-147，1993)报道培养在含有鹅脱氧胆酸钠肉汤中培养的弗氏志贺氏菌被证明具有提高3-5倍的对Hela细胞单层的侵染力。然而，他们报道，其他胆汁酸和去垢剂，包括胆酸盐，甘氨胆酸盐，牛磺脱氧胆酸、CHAPS系列，毛地黄皂苷和Triton X 100和其钠盐，对于弗氏志贺氏菌的侵袭力没有作用。而且，含有鹅脱氧胆酸的肉汤对于大肠杆菌或其它志贺氏无毒菌株的侵袭力没有作用。

弗氏志贺氏菌的新的蛋白的合成亦被生长培养基中改变的pH，温度，和离子组成诱导。(Mekalanos，J.Bacteriol.，174：1-7，1992)。

公开于1993年11月11日的公开号为WO 93/22423的PCT申请，公开了用于在脂质，例如磷脂酰丝氨酸，或粘液上生长细菌的方法，及由于在磷脂酰丝氨酸出现的情况下生长而提高其表达的蛋白分离。这一参考文献既未公开也未揭示本发明的用于产生具有提高的毒性或抗原特性的肠细菌的方法。

针对许多肠道病原体例如弯曲杆菌属细菌和志贺氏菌属细菌的疫苗，还未有得到，但是这些病因的流行病学使这些疫苗成为重要的目标。志贺氏菌病是全球性流行病，在发展中国家是每年因腹泻而死亡的500万儿重中的10％的死因。弯曲杆菌虽然只是在最近才被鉴定为肠病原菌，现在被认为发达国家和不发达国家的腹泻病症的一个主要原因。估计每年发生4,000至5,000万例弯曲杆菌腹泻，且多于20万例发生在美国。

志贺氏菌病是结肠粘膜细菌侵袭的后果。这种侵袭与发现于所有侵袭性分离物中的质粒相关(Sansonetti等.，Infect.Immun.35：852-860，1982)。该质粒的一个片段含有侵袭质粒抗原(Ipa)基因，Ipa A，-B，-C，和-D。Ipa B，-C和-D蛋白质是进入过程所必须的(Baudryet al.，J.Gen.Microbiol.，133：3403-3413，1987)。

虽然其预防效应尚未明确确立，但Ipa蛋白是合乎逻辑的疫苗候选者。Ipa B和Ipa C是免疫显性蛋白(Hale.等.，Infect.Immun.，50：620-629，1985)。而且，62kDa Ipa B蛋白(开始细胞进入和在膜结合噬细胞液泡的溶胞中起作用的侵袭素)(High，et al.，EMBOJ.，11：1991-1999，1992)在志贺氏菌属内高度保守。在没有明显的针对志贺氏Ipa的粘膜抗体的营养不良的儿童中所观察到的久治不愈的病症提示：针对Ipa的粘膜抗体的出现可能限制感染的传播和严重性。

虽然在动物和人类中试验了一些志贺氏菌疫苗候选者，但未发现成功的一个。尽管Ipa蛋白的潜在的显著毒性，多数被研究用来针对志贺氏菌病的多数疫苗候选者基于脂多糖抗原，它载有血清型特异的决定簇。已经研制了非经肠施用的多糖-蛋白结合疫苗，但是只是在动物中显示出明显的保护作用(Robbins等，Rev.Inf.Dis.13：S362-365，1991)。一种类似施用的核糖体疫苗的确诱导粘膜免疫，但是其保护效力尚待证实(Levenson等.，Arch.Allergy Appl.Immunol.，87：25-31，1988)。

弯曲杆菌感染的致病机制没能象志贺氏感染的致病机制那样被深入研究。体外细胞侵袭研究(Konkel，等，J.Infect.Dis.，168：948-954，1993)和组织病理学检查(Russell，等，J.Infect.Dis.，168：210-215，1993)提示结肠侵袭是很重要的。这一结论亦同以下观察一致：由弯曲杆菌引起的腹泻与母株中的血相关，且是严重的。这一活性与免疫显性62kDa鞭示蛋白相关。最近的报道表明：鞭毛的出现对于弯曲杆菌跨越板化的上皮细胞的单层(Grant et al.，Infect.Immun.，61：1764-1771，1993)是必需的。

没有具体的弯曲杆菌抗原被研制用于保护。然而，低分子量(28-31kDa)蛋白，或PEB蛋白，和免疫显性鞭毛蛋白被认为是在此领域内大有作为的(Pavlovskis et al.，Infect.Immun.，59：2259-2264，1992；Blaser and Gotschich，J.Bio.Chem.265：14529-14535，1990)。鞭毛蛋白与肠的移生，以及针对在Lior亚群范围内感染的交叉菌株的保护的关系表明了鞭毛蛋白的重要性(Pavlovskis et al.，Infect.Immun.，59：2259-2264，1992)。然而，基于鞭毛蛋白的弯曲杆菌疫苗可能包括来自8-10个最为临床相关Lior血清群的鞭毛蛋白抗原。

因此，本发明的目的包括1)用于培养和处理肠细菌的体外培养条件，此培养条件可以最佳地诱导或提高侵染活性和/或包括细胞表面特性的某性细胞特性；2)相关的改变的侵袭力或细胞特性，其中包括抗原分布(profile)改变的表面特征；3)这些生物体在小动物模型中提高的毒力；和4)用于体内或体外攻击时，与制备用于抗传统地生长的细菌的抗血清相比，具有提高的侵袭力或改变的特性包括表面特性，因而更有效地中和活的生物体的抗生物体抗血清。本发明涉及这些需要及其他。

以上讨论的文献均未教导或提示本发明的体外方法，亦不涉及本发明的包含抗原性提高的肠细菌的疫苗。在本申请的这一章节或任何其他章节中，引述或肯定任一文献，不应被解释为表明这一文献可能作为本发明的先有技术。

3.发明概述

本发明提供了肠细菌的明确的培养条件和加入培养介质的成分，以诱导或提高毒力因子和其他抗原的呈现。优选的，这一抗原是致免疫的。更优选地，这一致免疫的抗原与毒力的指征相关。

肠细菌生长于模拟生物体在体内天然所处的某些条件的条件和组分。本发明的方法产生了抗原性提高的肠细菌，该细菌具有表型改变，例如每细胞中增加的总蛋白，新的或增加的个别蛋白，改变的或增加的表面碳水化合物，改变的表面脂多糖，提高的粘附性能，提高的侵袭性能和/或提高的细胞内群游现象。而且，本发明的方法适应于商业应用的实际上的大规模发酵。

所述抗原性提高的肠细菌可以用于产生保护性疫苗，例如灭活的完整细胞或亚单位疫苗，或者出于诊断目的例如用于生产抗体和探测病原性肠细菌或用于生产抗生素。另外，本发明的改进的肠细菌所诱导的抗体可以用作被动疫苗。

因此，本发明的一个目的是产生具有提高的抗原性的肠细菌的方法，这些肠细菌选自：弯曲杆菌属，耶尔森氏菌属，卷旋杆菌属，Gastrospirillum sp.，类杆菌属，克雷白氏杆菌属，肠杆菌属，沙门氏菌属，志贺氏菌属，气单胞菌属，弧菌属，梭状芽胞杆菌属，肠球菌属，和大肠杆菌，包括：将肠细菌在体外于下列条件的组合之下生长，包括：a)0.05％至3％胆汁或0.025％至0.6％一种或多种胆汁酸或其盐，在-30℃至42℃之间的温度，直至生长期在大约早对数期，在早对数期和稳定期之间，或大约在稳定期，在空气中或在一微需氧的条件下，例如5％至20％CO₂和80％至95％空气，5％至20％CO₂和80％至95％N₂；或5％至10％O₂，10％至20％CO₂，和70％至85％N₂；和任选存在的二价阳离子螯合剂，例如，但不限于0至100μM，优选25μMBAPTA/AM，0至10mM EGTA，和0至100μM EGTA/AM；或者是b)，如a)中所述，除了存在二价阳离子螯合剂，例如1.0至100μM，优选25μMBAPTA/AM，0.5至10mM EGTA，或1至100μM EGTA/AM。而且没有胆汁，胆汁酸或胆汁盐。

根据本发明，任何各别的胆汁酸或其盐的浓度包括0.025％至0.6％，优选0.05％至0.5％，更优选0.05％至0.2％，最优选0.05％或0.1％。优选的方法中，所述胆汁酸或其盐包括脱氧胆酸盐或糖胆酸盐。

本发明的另一目的是肠道杆菌，它选自：弯曲杆菌属，耶尔森氏菌属，卷旋杆菌属，Gastrospirillum sp.，类杆菌属，克雷白氏杆菌属，肠杆菌属，沙门氏菌属，志贺氏菌属，气单胞菌属，弧菌属，梭状芽胞杆菌属，肠球菌属，和大肠杆菌，其中所述肠细菌在体外在一些条件的组合下生长，以促进提高的抗原特性，所述的条件包括：a)0.05％至3％胆汁或0.025％至0.6％一种或多种胆汁酸或其盐，在30℃至42℃之间的温度，直至生长期在大约早对数期。在早对数期和稳定期之间，或大约在稳定期，在空气中或在一微需氧的条件下，例如5％至20％CO₂和80％至95％空气，5％至20％CO₂和80％至95％N₂；或5％至10％O₂，10％至20％CO₂，和70％至85％N₂；和任选存在的二价阳离子螯合剂，例如，但不限于0至100μM，优选25μM BAPTA/AM，0至10mA EGTA，和0至100μM EGTA/AM；或者是b)，如a)中所述，除了存在二价阳离子螯合剂，例如1.0至100μM，优选25μMBAPTA/AM，0.5至10mM EGTA，或1至100μM EGTA/AM。而且没有胆汁，胆汁酸或胆汁盐。

本发明的另一目的是含有完整肠细菌或其组分的疫苗，所述肠细菌选自：弯曲杆菌属，耶尔森氏菌属，卷旋杆菌属，Gastrospirillum sp.，类杆菌属，克雷白氏杆菌属，肠杆菌属，沙门氏菌属，志贺氏菌属，气单胞菌属，弧菌属，梭状芽胞杆菌属，肠球菌属，和大肠杆菌，或其致免疫性片段或其衍生物，该疫苗具有提高的抗原特性；和任选地含有可药用载体或稀释剂。

优选的疫苗包含完整的，灭活的，抗原性提高的肠细菌。本发明的另一目的是进一步包含一种佐剂的疫苗。

本发明的另一目的涉及能够特异性地结合于本发明的肠细菌的至少一种抗原决定簇的抗体(包括但不限于抗血清，纯化的IgG或IgA抗体，Fab片段，等)。这样的单克隆和多克隆抗体可用作免疫试剂，以检测动物中或由其衍生的生物学样品中的肠细菌。本发明的单克隆或多克隆抗体亦可用作被动疫苗，以用于预防肠细菌感染和疾病。

本发明的另一目的是一种用于测试潜在的抗微生物剂的体外方法，包括步骤：将具有提高的抗原特性的肠细菌和所述的潜在的化学剂接触，且分析其杀细菌和制菌作用效能。其中，肠细菌选自：弯曲杆菌属，耶尔森氏菌属，卷旋杆菌属，Gastrospirillum sp.，类杆菌属，克雷白氏杆菌属，肠杆菌属，沙门氏菌属，志贺氏菌属，气单胞菌属，弧菌属，梭状芽胞杆菌属，肠球菌属，和大肠杆菌。

本发明的又一目的，是一种用于检测宿主的抗体产生或检测动物中或由此衍生的生物学样品中的肠细菌的体外方法，包括步骤：将来自宿主的生物学样品与本发明的具有提高的抗原特性的肠细菌，其抗原或其抗体相接触。然后筛选抗体：抗原相互作用，其中，所述肠细菌选自：弯曲杆菌属，耶尔森氏菌属，卷旋杆菌属，Gastrospirillum sp.，类杆菌属，克雷白氏杆菌属，肠杆菌属，沙门氏菌属，志贺氏菌属，气单胞菌属，弧菌属，梭状芽胞杆菌属，肠球菌属，和大肠杆菌。

本发明的另一目的涉及用于检测宿主的抗肠细菌的抗体的产生，或用于检测肠细菌的诊断试剂盒，具有提高的抗原特性的肠细菌，或其抗体，和所有其他必需的试剂盒组分，其中，所述肠细菌选自：弯曲杆菌属，耶尔森氏菌属，卷旋杆菌属，Gastrospirillum sp.，类杆菌属，克雷白氏杆菌属，肠杆菌属，沙门氏菌属，志贺氏菌属，气单胞菌属，弧菌属，梭状芽胞杆菌属，肠球菌属，和大肠杆菌。

本发明的各方面所优选涉及的肠细菌是空肠弯曲杆菌(Campylobacterjejuni.)，大肠弯曲杆菌(Campylobacter Coli)，小肠结肠炎耶尔森氏菌，鼠疫耶尔森氏菌，假结核耶尔森氏菌，大肠杆菌，弗氏志贺氏菌，宋内氏志贺氏菌，痢疾志贺氏菌，鲍地氏志贺氏菌，Helicobacter pylori，Helicobacter felis Gastrospirillum hominus，霍乱弧菌，副溶血弧菌，Vibrio vulnificus，脆弱类杆菌，难辨梭状芽孢杆菌，鼠伤寒沙门氏菌，伤寒沙门氏菌，鸡伤寒沙门氏菌，雏白痢沙门氏菌，猪霍乱沙门氏菌，肠炎沙门氏菌，肺炎克雷白氏杆菌，阴沟肠杆菌，和Enterococcus faecalis。优选的大肠杆菌包括但不限于肠毒素性，肠溶血性，肠侵袭性，肠致病性或其他菌株。

本发明部分地基于这一令人惊讶的发现：本发明的抗原性提高的肠细菌诱导的免疫应答，与由生长于传统培养条件下的同一肠细菌诱导的免疫应答相比，其交叉保护针对同种细菌的更广范围的株或血清型。在至少一种情况下，本发明的抗原性提高的肠细菌诱导的免疫反应交叉保护肠细菌的不同种。

附图简述

图1A，1B和1C是来自空肠弯曲杆菌81-176的表面提取物水解物的单糖的高效液相色谱的结果的图示说明。图1A：标准：岩藻糖为“Fuc”，N-乙酰-半乳糖胺“GalNac”，N-乙酰-葡萄糖胺“GlcNac”，半乳糖“Gal”，葡萄糖“Glc”，甘露糖“Man”。图1B：传统生长的细菌“BHI”的表面提取物。图1C：按照本发明的方法生长的细菌“DOC”的表面提取物。

图2图示了十二烷基硫酸钠-聚丙烯凝胶电泳(SDS-PAGE)的结果，显示了传统生长的空肠弯曲杆菌81-176“BHI”和按照本发明的方法生长的空肠弯曲杆菌81-176(0.8％牛胆汁胆汁酸“OX”或0.1％脱氧胆酸“DOC”的完整细胞蛋白(泳道1，2，3)或表面提取物(泳道5和6)的比较结果。

图3图示Westem印迹分析的结果，展示了与白鼬含IgA的粘液结合的蛋白比较结果，该粘液由用完整空肠弯曲杆菌81-176细胞感染而制得。传统生长的完整空肠弯曲杆菌81-176细胞，“1”；或根据本发明的方法生长的完整空肠弯曲杆菌81-176细胞：0.8％牛胆汁胆汁酸，“2”；或0.1％脱氧胆酸，“3”；或传统生长的空肠弯曲杆菌81-176的表面提取物，“4”；或根据本发明的方法，且0.1％脱氧胆酸生长的空肠弯曲杆菌81-176表面提取物，“5”。

图4.图示了Westem印迹分析的结果，展示了与鞭毛蛋白特异性单克隆抗体72C结合的蛋白的比较结果，该抗体来自：按照本发明的方法生长的完整细胞空肠弯曲杆菌81-176，“3”；传统生长的“2”；或按照本发明的方法，生长于发酵罐里的，“1”。

图5，图示了SDS-PAGE的结果，展示了完整的弗氏志贺氏菌2457T细胞的脂多糖的比较，传统生长的，泳道“1”，或按照本发明的方法生长的，在0.1％脱氧胆酸存在下泳道“2”。

图6，图示按照本发明的方法生长的空肠弯曲杆菌的免疫交叉反应性的提高。传统生长的及如实施例5(DOC)例举的根据本发明的方法生长的空肠弯曲杆菌81-176细胞被用于诱导抗体。展示了这两类抗体(即：抗BHI中培养的空肠弯曲杆菌81-176与抗DOC中培养的空肠弯曲杆菌81-176)对于不同的空肠弯曲杆菌血清型的凝集活性。详见第9部分实施例32。

图7A，7B和7C图示了含有灭活的空肠弯曲杆菌81-176完整细胞的疫苗在保护小鼠免受鼻腔递送的活空肠弯曲杆菌81-176细胞的攻击中的效力。以磷酸盐缓冲液(PBS；实线)，PBS加L7佐剂(佐剂；虚线)，福尔马林灭活的按照实施例5生长和收获的空肠弯曲杆菌81-176完整细胞不加佐剂(CWC；空心圈/实线)，或加入LT佐剂(CWC+佐剂；实心圈/实线)接种小鼠。使用肠道移生实验检测疫苗效力。图7A(上图)显示了每剂量使用3个10⁵灭活细菌颗粒的口服剂量进行接种所提供的预防结果。图7B(中图)显示了每剂量使用3个10⁷灭活细菌颗粒的口服剂量进行接种所提供的预防结果。图7C(下图)显示了每剂量使用3个10⁹灭活细菌颗粒的口服剂量进行接种所提供的预防结果。详见11部分实施例34。

图8A，8B和8C图示了含有灭活的空肠弯曲杆菌81-176完整细胞的疫苗在保护小鼠免受鼻腔递送的活空肠弯曲杆菌81-176细胞的攻击中的效力。如图7A，7B和7C的简述所描述的那样接种小鼠。使用肠道移生实验检测疫苗效力。图8A(上图)显示了每剂量使用3个10⁵灭活细菌颗粒的口服剂量进行接种所提供的预防结果。图8B(中图)显示了每剂量使用3个10⁷灭活细菌颗粒的口服剂量进行接种所提供的预防结果。图8C(下图)显示了每剂量使用3个10⁹灭活细菌颗粒的口服剂量进行接种所提供的预防结果。详见9部分实施例34。

图9图示了当弗氏志贺氏菌2457T细胞侵袭时的弗氏志贺氏菌培养物生长期的效应。传统生长的弗氏志贺氏菌2457T(BHI)，或按照如实施例9所例举的本发明的方法所生长的(DOC-EL)-当培养物处于对数早期时收获细胞，或按照实施例9，但是在收获细胞前，让培养物达到对数晚期(DOC-LL)。显示了这些不同的细胞制备物的侵袭力。详见12部分实施例35。

图10图示了当按照本发明的方法培养时，弗氏志贺氏菌细胞侵袭力的提高。宋内氏志贺氏菌和痢疾志贺氏菌按传统方法培养(BHI)或如实施例9所例举的本发明的方法培养。显示了这些志贺氏菌细胞的不同制备物对于INT-407细胞的侵袭力。详见12部分实施例35。

图11图示了按照本发明的方法生长的志贺氏菌交叉免疫反应的提高。按照如实施例9例举的本发明的方法生长的弗氏志贺氏菌2457T用于诱导抗体。图示了，诱导对于传统生长的(BHI)，或根据如实施例9例举的本发明的方法生长的弗氏志贺氏菌，宋内氏志贺氏菌，痢疾志贺氏菌和鲍地氏志贺氏菌的血清型的抗体凝集活力，详见12部分实施例36。

图12图示了当Helicobacter pylori NB3-2细胞粘附时，Helicobacterpylori培养物的胆汁浓度的效应，和生长期。H.pylori NB3-2细胞生长在含有0％，0.025％，0.05％或0.1％胆汁的培养基中，和在接种后8，10，12和18小时收获。显示了这些不同的H.pylori NB3-2制备物对于INT-407细胞的侵袭力，详见14部分实施例38。

图13图示了当Helicobacter pylori G1-4细胞粘附时，Helicobacterpylori培养物的胆汁浓度的效应，和生长期。H.pylori G1-4细胞生长在含有0％，0.1％或0.2％胆汁的培养基中，和在接种后6，8，10，12，14和16小时收获。显示了这些不同的H.pylori G1-4制备物对于INT-407细胞的侵袭力，详见15部分实施例38。

发明详述

本发明的方法涉及在选择用于诱导或提高抗原和/或毒力因子表达的某些条件和某些组分的组合之下，体外生长肠细菌。

在此和在权利要求中所用的术语“肠”指正常地在动物胃肠道的任何部分发现或与之相关的细菌和引起动物胃肠道的任何部分感染的任何细菌。这样的肠细菌包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。

在此和在权利要求中所用术语“组分”和“条件”涉及与肠细菌自然体内环境相关的许多因素和其它因素。这些“组分”和“条件”包括但不限于、胆汁、胆汁酸或其盐或其生物学前体如胆甾醇，pH，微需氧条件，渗透压，和在期望的细菌生长期收获和收集细菌。

在此和在权利要求中所用术语“抗原”和其相关术语“抗原的”包括抗原或抗原特性，包括，但不限于，有助于细胞形态学或细胞运送性的大分子；蛋白质；更具体的是表面蛋白，脂多糖和碳水化合物。优选地，所述抗原是免疫原性的。

在此和在权利要求中所用术语“免疫原性”是指当所述动物暴露于包含本发明产生的完整细菌或完整细菌的片段的组合物后，能够在动物中诱导抗体产生的能力。

在此和在权利要求中所用术语“抗原性提高的”或“提高的抗原特性”或“提高的”，是指按本发明的方法生长的肠细菌的抗原状态。与传统方法生长的同一细胞相比，具有某些免疫原性抗原的较高水平和/或新的免疫原性抗原。

在此和在权利要求中所用术语“传统的”涉及先有技术中已知的。

在此和在权利要求中所用术语“微需氧条件”指厌氧条件或提高的CO₂水平，例如5％至20％CO₂和80％至95％的空气，5％至20％CO₂和80％至95％N₂；或5％至10％O₂和10％至20％CO₂和70％至85％N₂。

在此和在权利要求中所用术语“毒力”是指肠细菌的那些与粘附和/或侵袭和/或在宿主中存活和/或引起病理状况的因子。

在此和在权利要求中所用术语“免疫交叉保护”是指由一种细菌菌株或血清型，以完整细胞或其他形式，诱导免疫应答以保护或减弱同一宿主被不同细菌菌株，血清型，或同属的种的感染的能力。

在此和在权利要求中所用术语“免疫交叉反应”是指由一种细菌菌株或血清型，以完整细胞或其他形式，诱导体液免疫应答，和不同细菌菌株，血清型，或同属的种交叉反应(即，抗体结合)能力。免疫交叉反应性是细菌免疫原免疫交叉保护潜能的指征。反之亦然。

在此和在权利要求中所用术语“宿主”是指在体内，为动物，在体外为动物细胞培养物。在此和在权利要求中所用术语“动物”包括但不限于所有热血生物例如哺乳动物和鸟类(e.g.，鸡，火鸡，鸭等)。

根据本发明，在一包含抗原性提高的肠细菌或其免疫片段或其衍生物的疫苗中，肠细菌可以是活细菌或可以是灭活的，可以还包括一种佐剂，例如，但不限于，铝，油-水乳剂，来自于肠毒性大肠杆菌非毒性形式(如mLT)的热不稳定毒素和/或其单个亚基，卡介菌(BCG)，或弗氏佐剂，还可以包括一种合适的药用载体包括但不限于盐水，萄聚糖或其他水溶液。其他合适的药用载体在Mack出版公司出版的Remington′sPharmaceutical Sciences中描述，这是该领域的一本标准参考书。在此和在权利要求中，术语“疫苗”也包括“被动疫苗”，包含与所寻求其感染或疾病保护的病原体特异性结合的抗体。

在此和在权利要求中所用术语“灭活细菌”，是指不能够感染和/或移生的肠细菌，包括减毒和杀死的细菌。减毒的细菌可以复制但不能引起感染或疾病。所述病毒的灭活可以本领域技术人员已知的任何方法完成。例如，细菌可以化学灭活，例如通过福尔马林固定，或物理灭活，例如通过热，超声或辐射，这样，造成它们不能够复制和/或感染和/或引起疾病。

应施用有效量的疫苗，其中“有效量”被定义为肠细菌或其免疫原性片段或其衍生物的能够在受试者体内引起免疫应答的量。所需的量随所使用的细菌，片段，或衍生物的抗原性，和待接种的受试者的种和体重而变化，但可用标准技术来确定。在本发明的一个优选的，非限制性实施方案中，有效量的疫苗造成至少是接种前抗体滴度两倍的抗细菌抗体滴度的提高。在一优选的、具体的、非限制性的本发明实施方案中，给宿主施用大约10⁷至10¹¹，优选10⁸至10¹⁰细菌。优选的是包含灭活的完整细菌的疫苗。

术语“有效量”用于被动疫苗时，是能够阻止或减弱一种细菌疾病或感染的抗体的量。所需的量随抗体的种类和抗体的滴度，和待接种的受试者的种和体重而变动，但可用标准技术确定。

本发明的疫苗可以用本领域已知任何方式局部或全身施用，包括但不限于，静脉，皮下，肌肉，阴道内，腹膜内，鼻内，口服或其他粘膜途径。

疫苗可以在一合适的，非毒性药用载体内给药，可以包含于微胶囊中，和/或是含于缓释植入物中。

合意地，疫苗在几个时间点施用，以维持抗体水平。

本发明的疫苗可以同其他杀菌或制菌方法共同使用。

本发明的抗体可以任何本领域技术人员已知的传统方法获得，例如，但不限于Antibodies A Laboratory Manual(E Harlow，D，Lane，冷泉港出版社。1989)。一般说来，用本发明的抗原性提高的肠细菌的完整细胞或其免疫原性片段或其衍生物，在有或没有一种佐剂或将提高免疫原效力的任何化学剂的条件下，免疫动物(可以使用很大范围的脊椎动物种，最常见的是小鼠，大鼠，豚鼠，仓鼠和兔)，在定期的时间间隔加强免疫。以任何便利的方法测试动物血清中所期望抗体的存在。所述动物的血清或血可以用作多克隆抗体的来源。

就单克隆抗体而言，以上述方法处理动物。检测到可接受的抗体滴度后，将动物实行安死术，无菌取脾以用于融合。脾细胞与特别选择的永生化骨髓瘤细胞系混合，将混合物暴露于能够促进细胞融合的化学剂，典型地是聚乙二醇等。在这一环境下，融合随机地发生，融合的细胞和每一种未融合的细胞的混合物是生成的产物，用于融合的骨髓瘤细胞系是特别选择的，这样，通用使用选择性培养基，例如HAT：次黄嘌呤、氨基蝶呤、和胸腺嘧啶，在培养物中，来自于融合混和物的能够持续存在的仅有的细胞是那些衍生自免疫供体的细胞和骨髓瘤细胞之间的杂种细胞，融合之后，将细胞稀释，在选择性培养基培养。培养基用于筛选对于选定的抗原有期望的特异性的抗体的出现。通过有限稀释将含有选择的抗体的培养物克隆，直至可以推定细胞培养物是单细胞来源的。本发明的抗体可以用作肠细菌感染和疾病的被动疫苗。

用于在宿主体内检测抗体或所述细菌的方法包括免疫反应。这些免疫反应是本领域已知的，包括但不限于放免实验(RIA)，酶联免疫吸附实验(ELISA)，荧光免疫实验，和荧光极性化免疫实验(FPIA)。

另一实施方案包括一种诊断试剂盒，其中包含进行根据本发明的所期待的免疫实验所需的所有必需试剂。诊断试剂盒可以商业化包装形式存在，是一个或多个装有必需试剂的容器的组合。这样一个试剂盒包含本发明的肠道杆菌，和/或本发明的单克隆或多克隆抗体，以及几种传统的试剂盒组分。传统的试剂盒组分对本领域技术人员是显而易见的，公开于多种出版物中、包括Antibodies A Laboratory Manual(E.Harlow.D.Lane，冷泉港实验室出版社，1989)。传统的试剂盒组分可以包括这些物品，例如，微滴度板，用于保持实验混合物的pH的缓冲液(例如，但不限于Tris，HEPES，等)。结合的第二抗体，如过氧化物酶结合的抗鼠IgG(或任何抗第一抗体衍生来源动物的抗-IgG)等，和其他标准试剂。

本发明的方法包括将肠细菌在一合适的基础必需培养基生长，例如，但不限于可商购的脑心浸液肉汤“BHI”，Laria肉汤“LB”，羊血琼脂“SBA”，Brucella肉汤，Meuller-Hinton肉汤，牛提取物蛋白酶水解胨肉汤，等。以及各种条件和组分，包括但不限于0.05％至3％胆汁或0.025％至0.6％的一种或多种胆汁酸或其盐，或其生物学前体，例如胆甾醇，在30℃至42℃温度下，直到其生长期处于大约早对数期，早对数期和稳定期之间，或大约在稳定期，在空气中或微需氧条件下，例如5％至20％CO₂和80％至95％空气；5％至20％CO₂和80％至95％N₂；或5％至10％O₂和10％至20％CO₂和70％至85％N₂；和任选的二价阳离子螯合剂的出现，例如，但不限于0至100μM，优选25μM BAPTA/AM(2′(亚乙基二氧基)二亚氨n，n.n′，n′-四乙酸/乙酰氧甲基酯；分子探针，Engene，OR)，0至10mM EGTA(亚乙基二(氧亚乙基次氮基)-四乙酸；西格玛化学公司，St.Lovis，MO)，0至100μMEGTTA/AM(亚乙基二(氧亚乙基次氮基)-四乙酸/乙酰氧甲基酯，分子探针，Eugeme，OR)；这样条件和组分的组合产生了抗原提高的肠细菌。

根据另一实验方案，本发明的方法亦包括将肠细菌生长于以上描述的条件，只有一点不同：即在二价阳离子螯合剂出现的情况下生长，例如，但不限于1.0至100μM，优选25μM BAPTA/AM，0.5至10mMEGTA、或1.0至100μM EGTA/AM，但是没有胆汁，胆汁酸或胆汁盐。

可用于本发明的胆汁或胆汁酸或其盐包括任何由肝分泌正常情况下积聚于胆囊中的天然胆汁化合物，以及本领域技术人员熟知的那些合成胆汁酸，例如但不限于“OXGALL”(Difco实验室底特律，密西根)，牛胆汁(Sigma Chemicals，St Louis，密苏里)或其他可商购的制备物，胆酸，脱氧胆酸(DOC)，牛磺胆酸和甘氨胆酸。优选的是脱氧胆酸，它是可商购的胆汁酸，在体内出现在被某些肠细菌移生的小肠远侧和大肠的位点。同样优选的有甘氨胆酸(GC)。

根据本发明选自：弯曲杆菌属，耶尔森氏菌属，卷旋杆菌属，Gastrospirillumsp.，类杆菌属，克雷白氏杆菌属，肠杆菌属，沙门氏菌属，志贺氏菌属，气单胞菌属，弧菌属，梭状芽胞杆菌属，肠球菌属，和大肠杆菌的肠细菌培养物可以用本领域技术人员熟知的方法制备成冷冻原种，于-80℃保藏备用。例如，可以通过在含有5％去纤维蛋白绵羊红细胞(SBA)的胰酶水解大豆琼脂上，于37℃，在5％O₂，10％CO₂，85％N₂微需氧环境，“MC”将生物体生长20小时。来获得空肠弯曲杆菌原种。可以通过在脑心浸液肉汤(“BHI”)生长生物体而制备大肠杆菌，鼠伤寒沙门氏菌，Helicobacter pylori和弗氏志贺氏菌的原种。可用任何已知方式收获细菌用于冷冻，例如拭取培养物重悬于含30％甘油的BHI中。

用于分析实验及用于发酵生产的培养物可以用任何已知的方法制备，例如将生物体于37℃，在含1.5％琼脂的BHI，于MC或大气条件下培养，然后将单菌落转移到肉汤之中，按本发明描述的方法培养。用任何本领域专业人员熟知的方法例如离心收获细菌备用。

在一优选实施方案中，弯曲杆菌属细菌，优选的是空肠或大肠，最优选是空肠81-176的抗原性提高的细胞，生长于基础必需培养基，优选BHI肉汤，附加地包括大约0.1％DOC或大约0.8％胆汁，于37℃，大约10％至20％CO₂与大约80％-90％空气的混合物中，当培养物的生长达到晚对数期至稳定期，典型地是接种后20h之后收获。

在另一优选实施方案中，志贺氏菌属细菌，优选的是弗氏或痢疾，最优选的是弗氏2457T菌株的抗原提高的细胞，生长与基础必需培养基，优选BHI肉汤，附加地包括大约0.1％DOC或大约0.8％胆汁，于37℃，空气中，当培养物的生长达到约早对数期后，典型地是接种早至中对数期培养物后30min之后收获。

在另一优选实施方案中，Helicobacter pylori，优选的是ATCC49503，NB3-2或G1-4的抗原性提高的细胞，生长于基础必需培养基，优选BHI肉汤，附加地包括大约0.05％至大约0.2％胆汁或大约0.05％甘氨胆酸(GC)，于37℃，大约5％至20％CO₂与大约80％-95％空气或大约10％CO₂和约5％O₂和85％N₂的混合物中，当培养物的生长达到大约对数期至大约稳定期收获。在一更优选的实施方案中，在培养物大约达到对数期时收获。

根据本发明的方法培养的肠细菌具有改变的形态，和/或细胞游动性和/或产生一些新蛋白。脂多糖和/或碳水化合物和/或与单用基础培养基培养的细胞相比，具有水平改变的大分子。可以确定提高细胞产量的最佳培养条件，和病原性的指征。采用这些培养条件可以确定提高的或诱导的毒力-相关抗原。

通过镜检未处理的或染色的细菌，看到游动性和肉眼可视的形态学改变。很可能其他的、可能由本发明的方法引起的形态学改变可以用电镜和荧光显微镜看到。

根据本发明的方法培养的肠细菌的形态学和粘液样特征提示：可能诱导了荚膜和/或表面层的表达。为了检测荚膜的产生，可以制备表面组分的苯酚提取物，如蛋白，碳水化合物和脂多糖。通过高压液相色谱(HPLC)看到提高的碳水化合物。

从在本发明的毒力提高的生长条件下生长的肠细菌制备的外膜的蛋白分布(profile)可以通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳表征，并与来自于生长在传统培养基的生物体的外膜蛋白分布相比较。进行SDS-PAGE以评价响应抗原性提高或改变条件在细菌细胞的和提取的蛋白中诱导的变化。这些数据提供了涉及提高的侵袭力或改变的抗原性相关的表面变化的定性和定量信息。

诱导的或改变的蛋白抗原的免疫潜能可由Western Blotting确定。由SDS-PAGE确定的诱导的或改变的细菌蛋白抗原的免疫原性可由如下所述且普遍接受的Western Blotting技术来评价。任何来源的抗体均可用于测定细菌抗原，例如恢复期免疫兔或白鼬血清(来自于用传统生长或根据本发明的方法生长的活生物体口服感染的动物的抗体来源)，肠道粘液(IgA抗体来源)，多克隆抗血清，或单克隆抗体，例如一个与空肠弯曲杆菌鞭毛抗原交叉反应的单抗。

几种这些细菌抗原的提高的产生伴随着毒力相关特性的提高。这些特性包括培养的人肠道上皮细胞粘附和侵袭性，和刚果红染料结合。刚果红染料结合试验是一普遍接受的方法，预言毒力，在下面Andrews等.(Infect.Immun60：3287-3295，1992)，和Yoder(Avian Dis.33：502-505，1989)中有所描述。细菌结合刚果红表明结合氯化血红素的能力，这种结合血红素的能力与毒力相关。刚果红结合亦相关于提高的上皮细胞的细菌侵袭。

已前已证实多数传统生长的空肠弯曲杆菌Lior血清型不是免疫交叉反应性的。基于此信息，制备和施用几种Lior血清型菌株的多种疫苗或复合疫苗以获得对于弯曲杆菌的普遍保护是必需的。根据本发明的方法产生的抗原性提高的弯曲杆菌与那些传统生长获得的弯曲杆菌相比，是针对更广范围的Lior血清型免疫-交叉反应性的。同样的，根据本发明的方法产生的抗原性提高的志贺氏菌，与那些传统生长获得的志贺氏菌相比，针对更广范围的志贺氏菌菌种是免疫-交叉反应性的，和免疫-交叉保护性的。这些免疫-交叉反应性和免疫-交叉保护性的特性为下述凝集反应和疫苗研究的结果所证明。

用于产生抗原性提高的肠细菌的本发明的方法关系到小动物模型中提高的毒力。几种驯养的动物可以用作人类弯曲杆菌疾病的模型。大多数立足于免疫效力的研究是Caldwell等人(Infect.Immun.，42：1176-1182，1983)的可逆性肠结，成年兔腹泻(RITARD Model)。这一模型也证明了Lior血清型和交叉-菌株保护之间的联系。然而，这一模型用来测量对移生的抗性，而不是对于疾病的抗性。Bell等人(Infect.Immun.，58：1848-1852，1990)的白鼬模型可能是一更有用的模型，因为该动物确实出现如人类弯曲杆菌疾病的疾病症状。一个更新的模型是Bagar(感染和免疫，63：3731-3755，1995)的小鼠移生模型。该模型涉及免疫法，然后用活的弯曲杆菌鼻腔或口服攻击免疫小鼠，然后经监测粪样中弯曲杆菌的出现而检查肠移生。就志贺氏菌来说，如Mallett等人(见下面13部分)描述的小鼠鼻攻击实验被用于评价毒力和疫苗效力。就Helicobacter pylori，陈等(柳叶刀，339：1120-1121，1992)描述的Helicobacter felis胃移生模型被用于评价由本发明的方法产生的H.pylori疫苗潜能。

还有涉及肠细菌侵袭和感染的其他动物模型，它们可用于测试按本发明的方法产生的提高的肠细菌的疫苗效力。

按本发明的方法产生的抗原性提高的肠道杆菌用于制备原型死的完整细胞或亚单位疫苗。当施用于动物时，这些疫苗可显示出诱导抗体因而建立了疫苗保护性潜能。在一个细菌细胞中这些抗原的提高或诱导产生了制成更有效力疫苗的细胞。

用本发明的方法产生的疫苗候选者制剂可用于多种粘膜免疫战略以诱导肠免疫应答。成功的免疫法方案可以用于保护用有或没有提高的免疫原性的病原体攻击的动物。疫苗亦可作为复合疫苗配制和检测，例如，志贺氏菌和弯曲杆菌或其组分可以复合成一个单一疫苗。

下面描述的实验性探索使检测与提高的侵袭力相关的表面抗原和其他特性的改变成为可能。这些变化既是质的又是量的。最重要的，这些实验证实了，本发明的方法提高了侵袭力，诱导了免疫原性相关抗原。这样的抗原性提高的细菌诱导了与传统生长细菌相比，保护免受更广范围的细菌菌株，血清型和/或种的细菌感染的免疫应答，因而可用作有效的疫苗。

已有几种完善建立的，本领域技术人员熟知的模型，并如下所述，可用于评价提高的抗原特性，细菌毒力和疫苗效力。

下面描述了非限制性实施例。

实施例：产生提高的抗原细菌的方法实施例1。空肠弯曲杆菌81-176株在血琼脂平板上划线(含有胰酶水解大豆琼脂，加5％去纤维蛋白绵羊红细胞)在微需氧Gas Pak(BBLCockeysville，MD)发酵罐中于37℃温孵20小时。拭取细菌层，接种至盛有1升在10％CO₂，90％空气中预平衡的、含有0.8％OXGALL(Difco，Detroit，MI)BHI培养基的三角瓶中。培养物在一密封瓶中，在l0％CO₂，90％空气中，于37℃振摇温孵20小时，然后如上述收获。实施例2。空肠弯曲杆菌81-176株在血琼脂平板上划线(含有胰酶水解大豆琼脂，加5％去纤维蛋白绵羊红细胞)在微需氧Gas Pak(BBLCockeysville，MD)发酵罐中于37℃温孵20小时。拭取细菌层，接种至盛有1升在10％CO₂中预平衡的、含有0.01％-0.1％脱氧胆酸钠(DOC)BHI培养基的三角瓶中(将DOC作为与BHI培养基分开的母液而配制和高压灭菌，并且在接种之前将其无菌地加至BHI培养基，使其终浓度为0.01％-0.1％是至关重要的)。培养物在5％O₂，10％CO₂，85％N₂中，于37℃振摇温孵不同时间，最多达20小时，然后如上述收获。实施例3。空肠弯曲杆菌81-176株在血琼脂平板上划线(含有胰酶水解大豆琼脂，加5％去纤维蛋白绵羊红细胞)在微需氧Gas Pak(BBLCockeysville，MD)发酵罐中于37℃温孵20小时。拭取细菌层，接种至盛有1升在10％CO₂中预平衡的、含有0.01％至0.1％脱氧胆酸钠的Brucella肉肠的三角瓶中。培养物在5％O₂，10％CO₂，85％N₂中，于37℃振摇温孵20小时，然后如上述收获。实施例4。空肠弯曲杆菌81-176株在血琼脂平板上划线(含有胰酶水解大豆琼脂，加5％去纤维蛋白绵羊红细胞)在微需氧Gas Pak(BBLCockeysville，MD)发酵罐中于37℃温孵20小时。拭取细菌层，接种至盛有1升在10％CO₂中预平衡的、含有0.01％至0.1％脱氧胆酸钠的Mueller-Hinton肉汤的三角瓶中。培养物在5％O₂，10％CO₂，85％N₂中，于37℃振摇温孵20小时，然后如上述收获。实施例5。空肠弯曲杆菌81-176株在血琼脂平板上划线(含有胰酶水解大豆琼脂，加5％去纤维蛋白绵羊红细胞)在微需氧Gas Pak(BBL Cockeysville，MD)发酵罐中于37℃温孵20小时。拭取细菌层，接种至盛有1升在10％CO₂中预平衡的、含有0.1％脱氧胆酸钠的BHI培养基的三角瓶中。培养物在10％CO₂，90％空气中，于37℃缓慢振摇20小时，然后如上述收获。实施例6。霍乱弧菌在BHI琼脂平板上划线在空气中于37℃温孵20小时。拭取细菌层，接种至盛有1升含有0.1％脱氧胆酸的BHI培养基的三角瓶中。培养物在空气中，于37℃振摇温孵20小时，然后如上述收获。实施例7。霍乱沙门氏菌在BHI琼脂平板上划线

在空气中于37℃温孵20小时。拭取细菌层，接种至盛有1升含有0.1％脱氧胆酸的BHI培养基的三角瓶中。培养物在空气中，于37℃振摇温孵20小时，然后如上述收获。实施例8。鼠伤寒沙门菌在LB琼脂平板上划线，在空气中于37℃温孵20小时。拭取细菌层，接种至盛有1升含有0.1％脱氧胆酸钠的BHI培养基的三角瓶中。培养物在10％CO₂，90％空气中，于37℃振摇温孵20小时，将一个菌落转移至1升含有0.1％脱氧胆酸钠的LB培养基然后在密封瓶中于37℃缓慢振摇温孵，12小时后，将60mL培养物稀释至1升同种新鲜预热培养基中，再温孵30分钟，然后如上述收获。实施例9。弗氏志贺氏菌在刚果红琼脂平板上划线，在空气中于37℃温孵20小时。将一红色菌落接种至盛有1升BHI培养基的三角瓶中。振摇温孵12小时，50mL这种培养物用于接种250mL预热的含有0.1％脱氧胆酸钠的BHI培养基。培养物在空气中于37℃振摇4小时。这种培养物用预热含有0.1％DOC的BHI稀释至OD₆₀₀为大约0.17，在空气中于37℃振摇30分钟，然后如上述收获。实施例10。空肠弯杆菌81-176，81-116或HC株(在含有30％甘油的BHI中)快速解冻，在羊血琼脂平板上划线(SBA每板0.1mL)。接种平板在备有CampyPak Plus微需氧环境发生器的Gas Pak(BBL Cockeysville，MD)发酵罐中于37℃温孵20小时。拭取细菌层，细菌重悬于10ml BHI培养基中，接种至盛有1升在10％CO₂，90％空气中预平衡的、含有或不含有0.1％DOC的BHI培养基的2L三角瓶中。培养物加入预平衡的培养基中，直到OD₆₂₅等于0.05。接种瓶返回10％CO₂，90％空气中，于37℃缓慢振摇温孵20小时，然后如上述收获。实施例11。Helicobacter pylori加入加了4％小牛血清的BHI。接种后，三角瓶中充入5％O₂，10％CO₂，85％N₂，于37℃振摇温孵22h。温孵后，2.5mL培养物转移到盛有含4％小牛血清的BHI培养基，或盛有与上述相同，另外还含0.05％甘氨胆酸钠的培养基的三角瓶中，这些培养物再充入微需氧气体混合物(5％O₂，10％CO₂，85％N₂)。于37℃温孵20-24小时，细菌如上述收获。实施例12。鼠伤寒沙门氏菌(在带有30％甘油的LB中)在LB琼脂板上划线，在空气中于37℃培养18-20h挑取一个菌落，转移到三角瓶中的1升LB或含0.1％DOC的LB中，三角瓶中充入10％CO₂，5％CO₂，85％N₂，密封于37℃，振摇温孵12h。该细菌然后用同一培养基稀释至OD₆₀₀为0.17，在同样条件下温孵到对数早期，典型地，是稀释后30分钟，细菌如上述收获。实施例13。鼠伤寒沙门氏菌在LB琼脂平板上划线，于37℃空气中温孵18-20小时。挑取一个菌落转至1LLB或含有0.1％DOC的LB中，于37℃空气中温孵12小时。培养物用同一新鲜培养基稀释(1/5)，在相同条件下温孵4小时。培养物再用同一新鲜培养基稀释，至OD₆₀₀为大约0.17，在相同条件下温孵，直到培养物达到对数期，典型地，是稀释后30分钟，然后如上述收获细胞。实施例14。肺炎克雷白氏菌在BHI琼脂平板上划线，于37℃空气中温孵18-20小时。挑取一个菌落转移至1L BHI或含有0.1％DOC的BHI中，于37℃空气中温孵12小时。培养物用同一新鲜培养基稀释至OD₆₀₀为大约0.17，再生长30分钟，然后如上述收获。实施例15。Enterobacter cloacae在BHI琼脂平板上划线，于37℃空气中温孵18-20小时。挑取一个菌落转移至1L BHI或含有0.1％DOC的BHI中，于37℃空气中温孵12小时。培养物用同一新鲜培养基稀释至OD₆₀₀为大约0.17，再生长30分钟，然后如上述收获。实施例16。大肠杆菌0157：H7在绵羊血琼脂平板上划线，于37℃空气中温孵18-20小时。挑取一个菌落接种至1L BHI或含有0.1％～0.2％DOC的BHI的三角瓶中，于37℃振摇12小时。培养物稀释至OD₆₀₀为大约0.17，再生长30分钟，然后如上述收获。实施例17。Enterococcus faecalis在绵羊血琼脂平板上划线，于37℃振摇18-20小时。挑取一个菌落接种至1L BHI或含有0.1％DOC的BHI的三角瓶中，于37℃空气中温孵12小时。培养物稀释至OD₆₀₀为大约0.17，再生长30分钟，然后如上述收获。实施例18。难辨梭状芽孢杆菌(在含30％甘油的改进碎肉培养基上)在含1.5％琼脂的用于厌氧的牛肝培养基平板上划线，于37℃在微需氧(5％CO₂，95％N₂)条件下培养。挑取一个菌落转移至1L含有或不含有0.1％DOC的改进碎肉培养基中，细菌于37℃微需氧条件下温孵12小时。然后如上述收获。实施例19。脆弱类杆菌(在含30％甘油的改进碎肉培养基上)在改进的碎肉培养基琼脂平板上划线，于37℃在微需氧(5％CO₂，95％N₂)条件下培养。挑取一个菌落转移至1L含有或不含有0.1％DOC的改进碎肉培养基中，细菌于37℃微需氧条件下温孵12小时。然后如上述收获。实施例20。假结核耶尔森氏菌(在含30％甘油的LB培养基)在LB琼脂平板上划线于30℃温孵。将一个菌落转移至1L LB中于30℃温孵12小时。培养物用含有或不含有0.1％DOC的LB稀释(1/5)，在37℃下温孵4小时。培养物再用同一个新鲜培养基稀释，至OD₆₀₀为大约0.17，再温孵30分钟，然后如上述收获细胞。

实施例21。Helicobacter pylori加至加有4％牛血清的BHI肉汤中。接种后，将三角瓶充入5％O₂、10％CO₂，85％N₂于37℃振摇温孵22h。温孵后，将2.5ml此种培养物转移至盛有含4％牛血清的BHI的，或另外含有约0.1％至约0.2％牛胆汁的同样培养基的三角瓶中。这些培养物再充入微需氧气体混合物(5％O₂，10％CO₂，85％N₂)，于37℃温孵20-24h。细胞如上述收获。

7.实施例：提高抗原性的细菌

实施例22。细菌湿制片镜检被用于观察游动性和肉眼可见形态学。可通过印度墨水(苯胺墨)中染色荚膜来观察表面层。空气干燥后，细胞用结晶紫复染计数。所有观察均在1000X放在倍数下观察。

与那些在单独的基础培养基中(传统生长的)培养的相比，按照本发明的方法培养的细菌(此后称作“提高的”细菌)形态已改变。例如，“提高的”空肠弯曲杆菌聚生且形成大的细胞团块，而传统生长的细胞主要是单生的。从荚膜染色(资料未给出)明显地看出：使用本发明的方法进行培养，完成了细菌表面的改变。这种表面改变确实引起了“提高的”细胞对于来自于染料的苯胺黑颗粒的增长的结合。“提高的细菌”保持高度的游动性。

实施例23：用苯酚提取分析空肠弯曲杆菌表面组分。提取物由传统生长的或按上述实施例2培养的空肠弯曲杆菌81-176制得。空肠弯曲杆菌细胞用上述离心技术从培养基中收集。细胞沉淀物在室温下用1％苯酚提取2h。离心45分钟从提取物中分离完整细胞。含有提取的细胞表面组分的上清液用蒸馏水透析过夜。保留物在4℃105,000xg离心3h。提取的沉淀重新溶解于10％Nacl用两倍体积的冷95％乙醇沉淀。重复沉淀，并冷干样品。然后，样品以1mg/ml溶于水，用于进一步分析。

采用葡萄糖作为标准物，用普遍接受的苯酚-硫酸法分析提取物的碳水化合物含量。糖醛酸含量系用咔唑试剂以Dische方法测定。苯酚提取物的总蛋白含量用biccichinoic酸试剂盒(Pierce Chem.Co，Rocrford，IL)测定。

值得注意的是，提取物中无糖醛酸。许多典型的细菌荚膜由糖醛酸聚合物构成。令人惊讶地，空肠弯曲杆菌81-176表面提取物主要由蛋白构成。然而“提高”的细胞的总碳水化合物含量高于传统生长的细胞。

提取物的碳水化合物与蛋白质的比率在表1中表述。

表1：传统生长的(BHI)或根据实施例2的方法生长的(提高的)空肠

弯曲杆菌表面提取物的碳水化合物：蛋白质比率

加入后时间(h) BHI 提高的

1 0.02 0.02

2 0.02 0.10

4 0.02 0.15

6 0.03 0.29

在培养基中含有DOC和可提取的细菌表面碳水化合物提高的水平之间有直接的联系(表1)。根据本发明的方法培养的细菌，其表面可提取碳水化合物增加了多于8倍，而传统生长细菌未见增加。在DOC培养基中培养的细菌细胞的群生现象看来应归因于表面提取物的组分。

再水合时，提取物在水中具有很高的成胶能力，使溶液高度粘稠且粘蛋白样，在特性上同群生细菌一样。提取物的函数性一致于粘蛋白样糖蛋白。

为了分析各个单糖，将提取物在密封容器里，在1N三氟乙酸中水解。样品在氮气中干燥2h，重悬于蒸馏水中。采用Dionex公司色谱基质和由3％0.5N.NaOH/97％H₂O作为溶剂的溶剂系统进行HPLC来分离蔗糖。使用电流检测法测量分离的单糖。一种人工的单糖标准物，其由果糖半乳糖胺，葡萄糖胺，半乳糖，葡萄糖，和甘露糖构成，也经受HPLC分析以供比较。

水解表面提取物的HPLC分析揭示了几种单糖的存在(图1)。看来来自于传统生长的和从按实施例2的方法生长的细菌的提取物的碳水化合物组成，未见质的差别，但是出现了微小的量的差别。

实施例24。用SDS-PAGE和Western Blotting分析细菌蛋白。采用Lugtenberg等人的凝胶系统(FEBS Letters 58，254-258，1975)。该凝胶体系是不连续凝胶，由低含量丙烯酰胺(典型地4％)，pH6.8浓缩胶，和较高百分比丙烯酰胺，pH8.8分离胶构成，两种胶都含有0.1％SDS，都使用缓冲液。按照分子大小进行蛋白质分离，采用8或12％丙烯酰胺分离胶。银染固定的凝胶使分离的蛋白质可视化，分子大小的确定基于用作标准物的已知蛋白的Mr值。

SDS-PAGE分离空肠弯曲杆菌细胞蛋白，银染使之可视。在用DOC培养的细胞中，包括62kD₂的蛋白在内的四种蛋白质被诱导或提高(图2)。

实施例25。通过苯酚提取分析弗氏志贺氏菌LPS。如上所述，通过离心从培养基中收获传统生长和或如实施例9中例举的根据本发明生长的弗氏志贺氏菌。用Westphal和Jann(In：R.Whistler，ed.，Methods inCarbohvdrate Chemistry，vol 5：p.83，1965)的方法提取脂多糖(CPS)。简言之，培养于BHI或如上面实施例9例举的细胞通过离心收集，在PBS中洗一遍。然后，在68℃用在水中的45％苯酚提取细胞15分钟，提取物冷却至10℃，并离心。吸出含有LPS上层水相，用蒸馏水透析。保留物于4℃，80,000xg离心7h，于105,000xg离心三次，每次3h。冻干终沉淀。分析之前，LPS重悬于水(1mg/ml)。如上述对于碳水化合物那样，表征纯化LPS，以及如下所述通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，如图5所示，表征纯化LPS。

使用这一具体的SDS-PAGE系统进行分析，在传统生长的与“提高”的细胞之间，未见弗氏志贺氏菌蛋白分布显示出重大差别。与BHI细胞提取物相比，来自于“提高的”细胞的碳水化合物与LPS干重之比降低了。然而，弗氏志贺氏菌LPS经SDS-PAGE，然后氧化和银染证明了LPS结构上的一个主要改变(图5)。如，见凝胶上泳道“2”，来自于“提高的”弗氏志贺氏菌的LPS的O-抗原部分在其长度削减了。这一结果补充了来自于“提高的”细胞的碳水化合物/LPS干重比降低的这一发现。

这一结果提示在“提高的”细胞上出现了更短的O-抗原侧链，潜在地，可能使细菌更为疏水。在肠道中，更疏水的细菌可能与疏水表面有更强的相互作用。

实施例26。通过Western Blotting确定蛋白质免疫原性。来源于传统生长的或根据如上述实施例1或5例举的本发明的方法生长的细菌的蛋白质通过SDS-PAGE分离，然后电转移至硝酸纤维素或PVDF膜且用标准封闭剂封闭[3％BSA，50mM Tris(pH8.5)，50mM NaCl，0.2％TWEEN 20]。第一抗体加入封闭剂中，然后洗涤印渍加入第二抗体报告关联物(cognate)。洗涤后，印渍是借助于光可视的，或借助于发色团严生底物可视。所用报告半体是辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。

图3图示了来自于用含IgA的免疫兔粘液进行的Western Blotting的蛋白。正如所看到的，62kDa蛋白是免疫显性蛋白。在用DOC或胆汁培养的细胞中，62kDa蛋白的抗原性极大地提高。该蛋白亦是用DOC培养的细胞表面提取物中的主要抗原。

使用与弯曲杆菌鞭毛蛋白交叉反应的鼠单克隆抗体，证明这一提高的蛋白是空肠弯曲杆菌鞭毛蛋白(图4)。这是一个意义重大的发现，因为几个研究者证明：空肠弯曲杆菌鞭毛蛋白参予了发病机制，并与细菌的侵袭特性相关。

实施例27。用刚果红染料结合试验测定毒力。生长于含0.025％刚果红的BHI琼脂平板的传统生长的(BHI)或根据本发明的方法(“提高”)生长的肠细菌重悬于蒸馏水，并用丙酮提取10分钟。离心沉淀细胞碎片，用40％丙酮，60％水的空白溶液测定染料OD₄₈₈。染料吸光度与660nm处细胞吸光度相比，表达为OD₄₈₈/OD₆₆₀。数据显示于表2。

表2.传统生长(BHI)或按照本发明的方法(提高的)生长的肠致病菌

刚果红染料结合

染料吸光率

菌株 BHI ENHANCED空肠弯曲杆菌81-176 0.07 0.49空肠弯曲杆菌81-116 0.06 0.49鼠伤寒沙门氏菌 0.05 0.30弗氏沙门氏菌 0.02 0.13霍乱弧杆菌 0.70 2.00

表2显示了对于几种按照本发明的方法培养的肠细菌，刚果红染料结合提高了。这些结果表明：本发明的体外方法有用于诱导毒力，及其他已知对于其他细菌种体内发病机制相关的特性。

实施例28。分析了细菌对于培养的上皮细胞的粘附。细菌粘附如Galen和Curtiss(美国国家科学院院报86：6383-6387，1989)中所描述的进行测定。组织培养细胞(INT-407或Henle细胞(ATCC#CCL6)，和CaCo-2(ATCC#HTB37)人肠细胞系)在24孔板中(37℃，5％CO2)培养，至60-80％铺满。培养基取决于所用细胞系，但是含有10％胎牛血清和50mg/ml的青霉素G和50mg/μl链霉素的Dulbecco′s改进Eagle′s培养基被用于Henle细胞，含有10％胎牛血清和50mg/ml青霉素G和50mg/μl链霉素的RPMI 1640培养基被用于培养CaCo-2细胞。在实验前至少3小时，培养基被移去，细胞在含钙镁的Hank′s平衡盐溶液(HBSS)中洗两遍。然后用不含抗生素的培养基涂覆单层。

就粘附实验而言，细菌如下制备。对于生长缓慢的肠细菌，如弯曲杆菌和卷旋杆菌，用新鲜的，预平衡的培养基将细菌培养物密度稀释到OD₆₂₅为0.1，然后用于测定，对于志贺氏菌和其他生长快的肠细菌，用新鲜的，预平衡的培养基将细菌培养物稀释到OD₆₂₅为0.17，然后用于实验。细菌以每细胞10个细菌的感染倍数加入上皮细胞以避免饱和。接种到细胞培养孔中的细菌数量通过平板计数来确定。在5％CO₂之下，对于弯曲杆菌为感染2h，志贺氏菌是30分钟，在用0.1％胆酸裂解单层之前，用HBSS洗涤移去未结合细菌，用铺板来确定粘附。

下面表3中显示了温度对于空肠弯曲杆菌81-176粘附INT-407细胞的作用，其中空肠弯曲杆菌81-176是传统生长的，或如实施例5所例举的本发明的方法培养的。

下面表4中显示了几株空肠弯曲杆菌粘附的差异，其中，空肠弯曲杆菌是传统生长的，或如本发明的方法培养的。

粘附百分比被表达为：从单层中回收的集落形成单位(CFU)数目除以接种到单层中的CFU数目乘以100。

表3：温度对于传统生长的(BHI)或按照本发明的方法(提高的)生长

的空肠弯曲杆菌粘附INT-407的影响

BHI 提高的温度 (％粘附) (％粘附)37℃ 5.5 62.342℃ 5.5 11.2表4：传统生长的(BHI)或按照本发明的方法生长的(提高的)不同空

肠弯曲杆菌菌株对于INT-407的粘附(提高倍数)菌株 BHI 提高的81-176 1.0 8.481-176 1.0 12.5HC 1.0 28.2

在侵袭试验中，上皮细胞按上述用于粘附实验的方法生长和制备。传统生长的或按照本发明的方法生长的细菌以每细胞10个细菌的感染倍数加入上皮细胞中，以避免饱和。接种到组织培养孔中的细菌数目通过平板计数来计算。在5％CO₂下，对于弯曲杆菌是感染2h，志贺氏菌是30分钟，吸出正在感染的细菌，用含有庆大霉素的生长培养基涂盖单层，以杀死任何细胞外细菌。任何在这时保留的可培养的细菌已经侵入上皮细胞单层。在CO₂气氛之下，就空肠弯曲杆菌感染细胞而言，继续温孵3小时，就志贺氏感染细胞而言，是1.5h。用HBSS洗涤单层以移去庆大霉素，加入0.1％脱氧胆酸以裂解单层。平板计数以计数裂解物中的细菌，侵袭百分比表示为庆大霉素抗性细菌数除以接种细菌数目。

侵袭被表达为进入细胞的细菌的百分比，通过将从庆大霉素处理过的单层中回收的克隆形成单位(CFU)除以接种到单层中CFU的数目再乘以100而确定。

下面表5中显示了温度对于空肠弯曲杆菌81-176侵袭INT-407细胞的影响，其中，空肠弯曲杆菌是传统生长的，或者按上面实施例5的方法生长的。

下面表6中显示了几种不同空肠弯曲杆菌菌株对于INT-407细胞侵袭的差异，其中空肠弯曲杆菌菌株是传统生长的，或按本发明的方法生长的。

下面表7中显示了DOC对于空肠弯曲杆菌81-176粘附和侵袭INT-407细胞的影响，其中，空肠弯曲杆菌细胞是传统生长的，或者按上面实施例5的方法生长的。

下面表8中显示了DOC对于志贺氏粘附和侵袭INT-407细胞的影响，其中，志贺氏细胞是传统生长的，或者按上面实施例5的方法生长的。

表5：温度对于传统生长的(BHI)或按照本发明的方法(提高的)生长

的空肠弯曲杆菌81-176侵袭INT-407细胞的影响

BHI 提高的温度 (％侵袭) (％侵袭)37℃ 2.5 49.542℃ 4.0 7.1表6：传统生长的(BHI)或按照本发明的方法(提高的)生长的不同空

肠弯曲杆菌菌株对于INT-407细胞的侵袭(提高倍数)菌株 BHI 提高的81-176 1.0 9.281-116 1.0 10.0HC 1.0 26.7

表7：DOC浓度对于传统生长的(BHI)或按照本发明的方法(提高

的)空肠弯曲杆菌81-176粘附和侵袭的影响

处理粘附(％) 侵袭(％)

BHI 9.3 6.3提高的；0.025％DOC 18.3 17.4提高的；0.1％DOC 52.6 37.0

表8：DOC对于传统生长的(BHI)或按本发明(提高的)方法生长的弗氏志贺氏菌侵袭(百分比)或粘附(百分比)INT-407细胞的影响

性质 BHI 提高的

粘附 1.0 140.0^a

侵袭 1.0 94.4

a由于在实验过程中，细菌的生长，回收了多于最初加入的细菌

向培养基中加入胆汁或脱氧胆酸，极大地提高了几种空肠弯曲杆菌的人分离物(即：81-116，81，176和HC)对于培养的INT-407细胞的粘附和侵袭(见表4和6)。最有效的DOC剂量是0.1％(表7)，最大应答在37℃，而不是在42℃获得(弯曲杆菌传统生长所处温度)(表3和表5)。

对于弗氏志贺氏菌也有类似发现(表8)。根据本发明的方法生长的志贺氏菌，其粘附和侵袭能力都极大提高。

这些数据表明，本发明的方法提高了肠道病原菌的侵袭和粘附力。

实施例29。快速玻片凝集反应被用于显示免疫交叉反应。传统生长的，和按如实施例5例举的本发明的方法生长的空肠弯曲杆菌菌株暴露于血清IgG。该IgG来自用传统生长或按照本发明生长(例，实施例5)的空肠弯曲杆菌81-176(Lior5)免疫的动物。IgG抗体固定化在蛋白A包被的胶乳珠上。假如在待测血清型和产生用来抗Lior5血清型的抗体之间有交叉反应表位，则几乎立即可以看见细胞簇集(即，凝集)。这种簇集在反应进行一段很短的时间后，基于0至3的尺度来衡量，其中，0意味着无可见簇集，而3意味着高度凝集。四种菌株的结果在下面表9中给出。

表9：传统生长的或按本发明的方法(提高的)生长的Lior血清型的

交叉反应性

培养物	生长条件	珠	反应性
培养物	生长条件	珠	反应性	81-176(L5)	BHI	Anti-BHI^a	1
81-176(L5)	BHI	Anti-EHN^b	2	81-176(L5)	BHI	Anti-BHI^a	1
81-176(L5)	BHI	Anti-EHN^b	2	81-176(L5)	提高的	Anti-BHI	2
81-176(L5)	提高的	Anti-EHN	2.5	81-176(L5)	提高的	Anti-BHI	2
81-176(L5)	提高的	Anti-EHN	2.5	L2	BHI	Anti-BHI	1
L2	BHI	Anti-EHN	1.5	L2	BHI	Anti-BHI	1
L2	BHI	Anti-EHN	1.5	L2	提高的	Anti-BHI	0
L2	提高的	Anti-EHN	1.5	L2	提高的	Anti-BHI	0
L2	提高的	Anti-EHN	1.5	L8	BHI	Anti-BHI	2
L8	BHI	Anti-EHN	1	L8	BHI	Anti-BHI	2
L8	BHI	Anti-EHN	1	L8	提高的	Anti-BHI	1
L8	提高的	Anti-EHN	2.5	L8	提高的	Anti-BHI	1
L8	提高的	Anti-EHN	2.5	L21	BHI	Anti-BHI	0
L21	BHI	Anti-EHN	2	L21	BHI	Anti-BHI	0
L21	BHI	Anti-EHN	2	L21	DOC	Anti-BHI	0
L21	DOC	Anti-EHN	2	L21	DOC	Anti-BHI	0
L21	DOC	Anti-EHN	2	Media	BHI	Anti-BHI	0
	BHI	Anti-EHN	0	Media	BHI	Anti-BHI	0

a传统生长的81-176诱导的抗体b按照如实施例5例举的本发明的方法生长的81-176诱导的抗体

表9表明所有四种待测的Lior血清型(L5，L2，L8，L21)均与产生于用提高的空肠弯曲杆菌81-176 Lior血清型L5免疫的动物的抗体交叉反应。用空肠弯曲杆菌81-176感染的兔的肠灌洗粘液含有IgA，与按照本发明的方法生长的空肠弯曲杆菌的10种主要临床血清型(即，人病原体)中的8个反应，与抗Lior5血清型菌株(见下面表16)的抗体交叉反应。该结果表明，本发明的方法极大地扩展了与来自于用空肠弯曲杆菌的Lior5血清型免疫的动物的抗血清交叉反应的Lior血清型的数目。

而且，按照本发明的方法，而不是传统生长的志贺氏菌的几个种与来自于用生长于有DOC的环境的弗氏志贺氏菌2457T免疫的动物的IgG抗体交叉反应。

8.实施例：疫苗效力

实施例30。用于研究弯曲杆菌致病机制的白鼬模型可以用作评价保护免受移生和/或疾病的疫苗效力的模型，因为感染白鼬可重复地产生三种见于人类的疾病现象中的两种。

二十四只7至9周龄雄性白鼬分别用PBS(作对照)，福尔马林固定的传统生长的(BHI)或按实施例5的方法(提高的)生长的空肠弯曲杆菌81-176菌株进行口服免疫。分离血清以确定基线Ig滴度。所有的疫苗和PBS均在佐剂LT的出现下施用，相隔一周，施用两次(0天和7天“接种”)。一周后收集血清(14天，“接种后”)以确定IgG抗体滴度。接种后四周(攻击)，用ACE丙嗪氯胺酮麻醉白鼬，并用含有活空肠弯曲杆菌81-176(1×10¹⁰CFU)的10ml PBS溶液口服攻击。其后，每日监测动物的粘液样腹泻，菌血症，弯曲杆菌从粪便里排出，体重改变，潜血和粪便白血球。从麻醉白鼬颈静脉中抽取1至2ml血，并将样品在一通气的(vented)胰酶水解大豆肉汤培养基中培养，以检测菌血症。在攻击后2，5，7天进行血琼脂平板的亚培养。免疫前收集血清样品(基线)。第二次免疫后一周，在攻击时，和在攻击后一周测定IgG滴定。

通过在一个Hemacult卡上测试粪便材料来检测潜血。粪便材料涂布在玻片上用亚甲基蓝染色以检测粪便白血球。在弯曲杆菌选择性培养基平板(胰酶水解大豆琼脂，5％绵羊血、三甲氧苄二胺嘧啶，万古霉素，多粘菌素B、头孢菌素I，和两性霉素B，Remel，Lenexa，ks)上培养来自直肠拭子的涂片，以确定弯曲杆菌以粪便中排出。实验结果见下面表10和11。

表10：在白鼬申接种、保护免受空肠弯曲杆菌81-176

疫苗攻击后5天，阳性集落形成^a 疾病^b

PBS 6/6 1/6

BHI 0/6 2/6

提高的 0/5^c 0/6

a阳性移生数/测试数

b出现绿色粘液/未形成/水样便

c疾病状态确定之后，移生计数之前，本组中有一只动物死亡

表11：白鼬血清IgG几何平均滴度

组基线接种后一周攻击时攻击后一周

PBS 6.4 4.9 6.4 1380.4

BHI 6.4 94.0 94.0 265053ENHANCED 6.8 234.4 1621.8 56234.1^a

a五只存活动物的平均值

表10显示出当活体(live)攻击时，用本发明的杀死的完整细胞疫苗的动物被保护免受移生和疾病。表11中的数据表明，由本发明的疫苗(提高的)引起的IgG抗体滴度比起传统生长的肠细菌(BHI)所引起的要大得多。

这些结果证明：用本发明的疫苗可以获得免疫原性(表11)和保护免受感染(表10)，而且比当用传统生长细菌进行接种动物时所见的要强烈。因此本发明的方法形成的细菌可以有用地作为疫苗。保护哺乳动物免于感染。

实施例31。与白鼬不同，小鼠不会自然地发生弯曲杆菌或志贺氏菌感染。但是它们被本领域技术人员用来展示当口服攻击免疫动物时的对于肠移生的抗性，或通过肺感染免疫动物的疾病的抗性。鼠鼻内接种模型可用于预言疫苗用于其他动物或人类时的效力。该实验为Mallet等人描述(疫苗，11：190-196，1993)。

几组约16周龄雌性Balblc小鼠，每组10只，用磷酸盐缓冲液(PBS)，传统生长的空肠弯曲杆菌(BHI)或按照实施例5生长的空肠弯曲杆菌(提高的)，其剂量是大约10⁷ CFU或10⁹ CFU口服免疫，然后攻击。每组肠粘液的IgA滴度用ELISA测定，在下面表12中给出。

表12：小鼠中，用(10⁷或10⁹)弯曲杆菌完整细胞疫苗口服免疫后IgA

应答

免疫灌洗液IgA滴度^a ％应答者^b

PBS 23 14

提高的(10⁷) 114 75

提高的(10⁹) 78 75

BHI(10⁷) 40 25

BHI(10⁹) 32 12

a灌洗液滴度表示从每组小鼠的每一个体中获得的抗空肠弯曲杆菌

IgA滴度平均值。

b应答者被定义为其终点滴度比单独接受PBS的动物的平均值超出

2倍标准差的动物。

表12表明：用按照本发明的方法生长的细菌免疫的动物，比用传统生长的细菌免疫的动物，具有被较高百分比的应答者递呈的较高的肠IgA抗体滴度。

9.实施例：DOC引起的抗原改变或提高的机制

虽然并不试图将本发明限制于任何具体的作用机制，本发明者获得了一些证据，提示脱氧胆酸(DOC)看来在改变或提高肠细菌抗原性上有两重作用。证据表明DOC作用的一个方面是通过钙依赖作用介导的，因为DOC结合钙，因而降低了培养基中钙浓度。证据如下。当空肠弯曲杆菌81-176在具有可透膜的钙螯合剂BAPTA/AM和不具有DOC的情况下培养时，其对于INT-407细胞的侵袭性提高了接近10倍(见下表13)。然而，用BAPTA/AM处理不提高空肠弯曲杆菌81-176细胞的免疫交叉反应性。

表13中所示结果是使用按照实施例5中描述的方案，除了以25μMBAPTA/AM替代了0.1％DOC外，培养的空肠弯曲杆菌81-176获得的。侵袭试验如下面7部分实施例28中所述的进行且评价。

表13 传统生长的(BHI)或带有BAPTA/AM生长的空肠弯曲杆菌

对于INT-407细胞的侵袭

培养条件菌株 BHI BAPTA/AM空肠弯曲杆菌81-176 3.0 36.9

几个易感由胆汁和胆汁盐例如DOC引起的抗原性提高或改变的细菌属(如，弯曲杆菌，志贺氏菌，卷旋杆菌)与来自耶尔森菌的低钙应答(lcr)基因有基因同源性。已知lcr座位调节应答低钙水平时耶尔森氏菌的毒力。两个参予侵袭所必需的鞭毛蛋白(flaA，flbA)的表达和装配的弯曲杆菌基因部分地受lcr产物的调节。传统生长的或在本发明的毒力提高的条件下生长的弯曲杆菌flaA和flaB突变体行为的分析表明：侵袭，但不是刚果红染料结合或提高的交叉反应性，是钙依赖的(见下面表14)。

表14所示的结果是采用传统培养的或如实施例5中例举的本发明的方法培养的空肠弯曲杆菌获得的。侵袭试验如实施例28中描述而进行和评价。

表14：传统生长(BHI)的或按照本发明的方法(提高的)空肠弯曲杆菌

突变株侵袭INT-407细胞

培养条件菌株 BHI 提高的空肠弯曲杆菌81- 3.5 40.8176空肠弯曲杆菌flaA 0.05 0.05空肠弯曲杆菌flbA 0.01 0.04

当用DOC培养时，空肠弯曲杆菌fla和flbA突变株确实展示了明显提高的刚果红结合和免疫交叉反应性(分别见表15和图6)。表15和图6所示的结果采用传统生长的，或如实施例5例举的本发明的方法生长的空肠弯曲杆菌获得。刚果红染料结合试验。其结果如表15所示，如实施例26所述内容进行。免疫交叉反应性，其结果如图6所示，如实施例29所述而完成。

表15：传统生长的(BHI)或按照本发明的方法(提高的)空肠弯曲杆菌

突变株的刚果红染料结合

培养条件菌株 BHI 提高的空肠弯曲杆菌81- 0.07 1.68176空肠弯曲杆菌flaA 0.10 1.60空肠弯曲杆菌flbA 0.12 0.80flaA突变株不能表达鞭毛蛋白。甚至用DOC处理之后，FLAa突变株和flaA-flaB双突变株(由C.Grant，NIH惠赠)都是非侵袭性的，表明鞭毛蛋白是侵袭所必需的。令人感兴趣的是，在这些突变株中，没有正常展示即非DOC诱导的出来的这些fla突变株的同基因亲本株和一些其他空肠弯曲杆菌Lior血清型之间的免疫交叉反应性。然而，DOC处理可诱导这些鞭毛蛋白较少的突变株展示出提高的免疫交叉反应性和刚果红结合。

这些发现表明：DOC通过钙依赖(如侵袭性)和非钙依赖(如刚果红染料结合)机制在肠细菌中调节毒力功能。这些发现进一步提示：由DOC诱导的提高的免疫交叉反应性和刚果红结合是至少部分地鞭毛蛋白依赖的。

10实施例：DOC诱导提高的血清型和

种空肠弯曲杆菌的免疫交叉反应性

实施例33。用快速被片凝集反应来检测根据本发明的方法生长的空肠弯曲杆菌的血清型免疫交叉反应性。该反应使用来自免疫的和非免疫兔的肠粘液来确定改变的培养条件在弯曲杆菌异源菌株的交叉反应性上的影响。兔用活的传统生长的空肠弯曲杆菌81-176免疫。测定粘液抗体对于二十四种弯曲杆菌菌株的凝集活性。包括18种血清型，传统地生长在BHI-YE培养基或按照如实施例5所例举的本发明的方法生长。

凝集反应的结果表明：当菌株用本发明的方法培养时，比起它们传统生长时，异源弯曲杆菌菌株的交叉凝集更广泛，在许多情况下，也更强。具体地，在异源凝集反应性上有超过两倍增长：在抗-81-176免疫粘液中。24个传统生长的异源菌株中的6个以+水平或更高凝集水平，而在DOC条件下生长的同样24个菌株中的14个以+水平或更高凝集水平。另外，当在传统生长时，异源菌株中的18个被证明是微弱(±)或不凝集，当在“提高的”培养条件下(如，含DOC的培养基)生长时，这些菌株中的11个显示了增强的凝集应答。

表16说明了抗-81-176免疫兔粘液对于19个异源Lior血清型的交叉反应性。这些血清型包含22个传统生长(BHI-YE)的，或采用实施例5(提高的)方法生长的菌株。虽然这一实验仅分析了已知Lior血清型(VC/67)的一部分，结果表明，本发明的方法诱导了Lior血清型之间巨大的免疫交叉反应。这一结果还进一步表明：弯曲杆菌中DOC诱导或提高的抗原在分泌型IgA应答中看来是重要的，这种应答与弯曲杆菌引起的肠感染的抗性和恢复相关。

另外还需注意：Lior血清型8菌株是不同种，大肠弯曲杆菌。在抗-81-176免疫兔粘液中，这个血清型中的2个菌株强烈地凝集(3+)，这一结果表明：衍生于空肠弯曲杆菌菌株(如Lior5)的疫苗不仅在同一种同内而且也在弯曲杆菌属的其他种(如大肠弯曲杆菌)，针对异源血清型交叉保护。同样值得注意的是：Lior血清型1，2，4，9和11都处于世界范围内最流行的疾病相关血清型之中。在该实验中，它们都被证明了可测得的交叉反应性。

表16.20个传统生长的(BHI-YE)或按照本发明的方法(提高的)生

长的弯曲杆菌血清型对非-免疫^b或抗-81-176^a免疫兔

粘液的凝集应答

凝集应答 c

非免疫粘液免疫粘液

Lior

菌株血清型 BHI-YE 提高的 BHI-YE 提高的

134 1 - - - ++

195 2 - - - ±

1 4 - - - +++

170 5 - - +++ ++++

81-176 5 - - ++++ ++++

6 6 - - ++++ +++

81-116 6 - - + ++

35 7 - - - +

52 8 - + + ++

VC-167 8 - - + +++

VC-159 8 - - ± -

88 9 - - - ±

244 11 - - ± +++

556 17 - - + -

563 18 - - - -

544 19 - ++ - ++

699 21 - - ± ++

1180 28 - - + +++

1982 29 - - - -

910 32 - ++ - ++

2074 36 - - - -

HC 36 - + - +

2984 46 - - - -

79171 72 - - - -

a抗-81-176粘液从用传统生长的活空肠弯曲杆菌81-176感染兔得到。

b非免疫粘液从未感染兔获得

c凝集应答分为阴性(一)，很弱(±)，至很强(+++)

11实施例：弯曲杆菌疫苗效力的其他实验

实施例34。采用Baqar(Infect&Immun.，63：3731-3735，1995)报道的小鼠移生模型，确定按本发明的方法生长的福尔马林固定的完整空肠弯曲杆菌细胞的保护效力。

按照实施例5生长和收获空肠弯曲杆菌81-176，并如上述用0.075％福尔马林灭活。几组5只6至8周龄雌性Balb/c鼠被施用三个口服剂量(0.25ml剂量，于不含内毒素的PBS中)，每剂量各自单独含有10⁵，10⁷或10⁹灭活细菌颗粒，或与25ug大肠杆菌热不稳定肠毒素组合(LT)。以48小时间隔给予剂量，随即在15分钟间隔时给予两剂0.5ml 5％碳酸氢钠溶液(pH8.5)，以中和胃酸。对照组的动物单独用PBS接种或与LT佐剂组合接种。大约在施用第三剂量后的28天，接种动物用大约10⁸集落形成单位(CFU)的活的传统生长的空肠弯曲杆菌81-176经鼻或口服攻击。在9天时期内，每天监测粪便排出以确定肠移生的持续时间。在无菌PBS内乳化粪便材料，将等份于弯曲杆菌血琼脂平板上涂平板。平板在微需氧条件(Campylobacter Gaspak，BBL)下于35℃温孵3-5天，使空肠弯曲杆菌生长。移生结果表达为在给定的取样天，排出弯曲杆菌生物体的动物的百分比。

如图7所示，免疫的和对照的所有鼻攻击的动物，攻击后立即(第1天)排出生物体。攻击后，80％对照组动物保持移生9天。相反，在实验的9天之内，接种组中排出生物体的动物明显较少。清除攻击生物体的程度和时间依赖于施用疫苗的数量。低(10⁵颗粒/剂量)和中疫苗剂量(10⁷颗粒/剂量)给出一个渐进的、不完全的清除速率。佐剂的出现提高了在这些剂量下的保护程度。令人惊讶的，在测试的最高剂量(10⁹颗粒/剂量)，无佐剂的疫苗，与施用带有LT佐剂的可比剂量时相比，产生了相等的、或略高的保护水平。

当口服接种动物，并接着口服攻击时也获得了相似的结果(见图8)。这些结果表明：用按照本发明的方法生长的、灭活的弯曲杆菌免疫动物，提供了针对于随后攻击的活弯曲杆菌的保护。甚至不与佐剂一起口服施用时，这种免疫仍然是有效的。

腹膜内(IP)施用按照本发明的方法生长的(见实施例5)福尔马林固定的完整空肠弯曲杆菌细胞的保护效力也得到评价。就这些实验而言，几组20只雌性Balb/c小鼠被施用单一剂量：1.3×10¹⁰，2.5×10⁹，5.0×10⁸，1.0×10⁸或2.0×10⁷在0.5ml无内毒素PBS中，无佐剂的灭活空肠弯曲杆菌颗粒。14天后，腹膜内输送一单一致死剂量的活空肠弯曲杆菌81-176(约1.0×10¹⁰CFU于无内毒素PBS中)以攻击动物。每日监测动物死亡，持续4天。

如表17所示，一个单一腹膜内5.0×10⁸灭活空肠弯曲杆菌颗粒剂量诱导了足以保护动物免受活的空肠弯曲杆菌攻击的免疫应答。

表17：按本发明的方法制备的、V2灭活的、IP输送的空肠弯曲杆

菌提供的保护剂量死亡存活者

天 1 2 3 41.3×10¹⁰ 0 4 0 0 162.5×10⁹ 0 0 0 0 205.0×10⁸ 0 0 0 0 201.0×10⁸ 11 7 0 0 25.0×10⁷ 10 6 2 0 2PBS对照 4 3 2 0 1

12实施例：志贺氏菌的DOC提高的侵袭力，

刚果红结合和免疫交叉反应性

实施例35，体外生长的志贺氏菌的侵袭力受培养物生长期的影响。按照实施例28所描述的方法，测定传统生长的(BHI)，或按照实施例9例举的本发明的方法(DOC-EL)生长的(其中细胞来自于对数早期培养物)，或按照实施例9但在收获细胞前让培养物达到对数晚期(DOC-LL)的弗氏志贺氏菌2457T细胞的侵袭性。结果表明用DOC培养提高了侵袭力，而且最大的提高是在生长的对数早期达到的(见图9)。

按照本发明的方法，用DOC培养也提高其他志贺氏菌的种，宋内氏志贺氏菌，和痢疾志贺氏菌(见图10)的侵袭力。在板化上皮细胞内，仅当上皮细胞被细菌basolaterally感染时，才能观察到提高的志贺氏菌的侵袭力。这一发现与体内观察的侵袭过程一致。

比较性研究表明：按照本发明的方法生长的志贺氏菌，其侵袭力几乎是按照Pofe等人(Infect.&Immun.，63：3642-3648 1995)描述方法制备的志贺氏菌的侵袭力的10倍多。

实施例36。按照本发明的方法培养的志贺氏菌也显示出提高的刚果红结合。传统生长的(BHI)或如实施例9所例举的本发明的方法生长的弗氏志贺氏菌2457T和宋内氏志贺氏菌。被用上面实施例26描述的方法分析其染料结合能力。结果显示，在DOC中生长，这两种志贺氏菌的种的刚果红结合提高了10至20倍(见表18)。

表18：传统生长的(BHI)或按照本发明的方法生长的(提高的)弗氏志

贺氏菌和宋内氏志贺氏菌的刚果红结合

培养条件

菌株 BHI 提高的

弗氏志贺氏菌 0.04 0.44

宋内氏志贺氏菌 0.02 0.40

志贺氏菌被分为四个种和多个血清型。如实施例28所述，用凝集试验测试按本发明的方法生长的弗氏志贺氏菌的免疫交叉反应性。实验采用来自免疫兔的抗血清，以确定培养条件对不同志贺氏菌的种的免疫交叉反应性上的影响。兔用按实施例9的方法生长的、用福尔马林固定的弗氏志贺氏菌2457T免疫。针对于传统生长于BHI培养基的，或按照本发明的方法生长的(如，实施例9)的所有4种志贺氏菌的种，测试了从免疫动物获得的IgG抗体的凝集活性。凝集实验的结果表明：具有DOC的生长极大地提高了异源弗氏志贺氏菌的凝集活性，和三种异源志贺氏菌对于抗-弗氏志贺氏菌抗体的凝集活性(见图11)。

13实施例：志贺氏菌的疫苗效力

实施例37。用C.P.Mallett等人(免疫，11：190-196，1993)等人建立的小鼠鼻攻击模型确定了根据本发明的方法生长的、福尔马林固定的完整弗氏志贺氏细胞的保护效力。简言之，弗氏志贺氏菌按照实施例9例举的方法生长和收获，并按实施例30的说明用0.075％福尔马林灭活。大约10⁷灭活的细菌颗粒被用于接种14-16周龄雌性Balb/c小鼠。灭活的弗氏志贺氏菌悬于无菌的不含内毒素的PBS中，其浓度是10⁸颗粒/ml，35μl该物质被经鼻施用于几组10只轻度麻醉动物。以14天为间隔，总共免疫三次。

为了检测佐剂在完整志贺氏细胞疫苗的保护性能力的效力，几组动物用含有灭活的疫苗和5μg大肠杆菌热不稳定肠毒素(LT)的悬液免疫。第三次免疫后的14天、动物经鼻攻击亚致死消瘦剂量(10⁵CFU)的活弗氏志贺氏菌或宋内氏志贺氏菌攻击之前和攻击后于1，2，5和7天，将动物称重，确定平均小组重量。结果见表19。

表19：灭活的弗氏志贺氏菌保护小鼠免受活的弗氏志贺氏菌或宋内

氏志贺氏菌的经鼻攻击攻击生物体接种攻击后体重改变百分比

天1 天2 天5 天7弗氏志贺氏菌 PBS -8.1 -18.2 -17.7 -18.3

疫苗 -5.4 -2.9 -2.5 -1.6

疫苗+ -7.0 -2.0 -1.5 1.5

佐剂宋内氏志贺氏菌 PBS -8.1 -17.5 -9.3 -6.4

疫苗 -6.7 -11.3 -6.5 -6.0

疫苗+ -6.4 -5.2 -1.3 -2.1

佐剂

每组10只小鼠用含107灭活的按实施例9生长的弗氏志贺氏菌疫苗经鼻免疫3次。

用含有灭活的，按本发明的方法生长的弗氏志贺氏菌的疫苗免疫的小鼠，被保护免受活的弗氏志贺氏生物体攻击。与未接种小鼠，即PBS赝品(sham)对照组相比，这些小鼠较少体重降低，且体重恢复也较快。令人惊讶的，弗氏志贺氏菌疫苗也保护小鼠免受活宋内氏菌攻击。令人感兴趣的是，单独接受疫苗，没有LT佐剂的小鼠与接受佐剂化疫苗的动物被一样有效地保护免受同源弗氏志贺氏菌攻击。单独的弗氏志贺氏菌疫苗也提供对于宋内氏志贺氏菌的异源攻击的保护。然而，含有的LT佐剂极大地提高了由宋内氏志贺氏菌攻击的保护。这些发现表明：含有按本发明的方法制备的灭活的志贺氏菌的疫苗在一承认的志贺氏菌疾病模型中是有效的，且在预防或减弱多种志贺氏菌的感染中不需佐剂。

14影响H.PYLORI对于动物细胞粘附的因素

实施例38。在甘胆酸盐或胆汁上生长可以提高H.pylori的粘附。H.pylori菌株NB3-2或G1-4被加入到加了4％小牛血清的BHI肉汤中。接种后，三角瓶充入10％CO₂-5％O₂-85％N₂，37℃振荡温孵22h。温孵后，培养物被1：10稀释至一个盛有1升加有4％小牛血清、含有不同浓度牛胆汁(0.025％至0.2％)的BHI培养基的三角瓶中。这些培养物再次用同样的气体混合物充满，于37℃温孵。在不同的时间，最多可达18h收获细胞，用实施例28中描述的方法分析其对INT-407细胞的粘附。结果表明：用胆汁培养提高了H.pylori对于INT-407细胞的粘附(见图12和13)。就NB3-2菌株而言，比起非提高的培养物增长2至3倍的峰值粘附，发生于生长后约8h(图12)。就G1-4菌株而言，比起非提高的培养物增长2至3倍的峰值粘附，发生于在0.2％胆汁中生长12-14小时之间。这些“峰值”时间一般对应于每一菌株的培养物处于对数期生长的阶段。

15实施例。根据本发明的方法生长的卷旋

杆菌的疫苗效力

实施例39.用陈等描述的小鼠Helicobacter felis胃移生模型(柳叶刀，339：1120-1121，1992)确定按照本发明的方法生长的、福尔马林固定的完整细胞Helicobacter polyri的保护效力。Helicobacter polyri菌株G1-4作为种子培养物，于37℃，在10％CO₂，90％空气，在含有4％小牛血清的BHI中生长22h。一小份这种培养物被用于接种10倍体积的、含有0.1％(v/v)牛胆汁的同一培养基。37℃生长12-14小时后，离心收获细胞，于室温重悬于1/10初始体积的Hank′s平衡盐溶液(HBSS)中。细胞再离心，再重悬于1/100初始体积的HBSS中。向缓冲的细胞悬液中，加入福尔马林，使其浓度达0.075％通过室温下搅拌悬液6h，然后将溶液冷却至4℃18小时而灭活细胞。

在0，7和14天或在0，7和21天，向6-8周龄雌性Balb/c无卷旋杆菌小鼠口服施用3个剂量的这种灭活的完整细胞疫苗来日常地测量保护潜能。评价了与大肠杆菌热不稳定肠毒素组合的10⁹细菌颗粒/剂的剂量。第三次免疫剂量后的14天，动物用单剂量(10⁷CFU/剂量)活H.felis口服攻击。

攻击后两周，处死动物，窦胃节用于分析脲酶活性以确定H.felis的出现。通过于室温下将窦组织样品于0.5ml Stuart′s脲酶肉汤(Remel)中温孵4-24小时来确定脲酶活性。发生于此阶段内的由澄清至红色的颜色转变作为阳性脲酶结果。

如表20所示，施用由H.pylori菌株G1-4制备的提高的卷旋杆菌完整细胞疫苗保护动物免受H.felis口服攻击。

表20：用含有按本发明的方法生长的，灭活的H.pylori的疫苗保护

免受卷旋杆菌感染免疫剂攻击生物体(10CFU) 移生/总数保护百分比实验1H.pylori^b H.felis 4/13 71PBS+LT H.felis 9/9 0实验2H.pylori^b H.felis 2/15 87PBS+LT H.felis 10/10 0

a.所有的化学剂以7天的间隔，3个口服剂量，和10μgLT(ETEC的热不稳定毒素)给予

b.以0.25ml剂量申1×10⁹CFU的G1-4菌株给予。

这些实验的结果表明了提高的肠细菌特性和体内免疫原性的相关性。

本发明的方法产生了能够诱导保护性的免疫原性应答，因而可以用作疫苗的细菌。

16.微生物保藏

下列微生物已保藏于美国典型培养物保藏中心，12301 ParklawnDrive，Rockville，马里兰州20852，美国，具有如下保藏号：

微生物保藏号保藏日期Helicobacter Pylori NB3-2 1995年9月29日Helicobacter Pylori G1-4 1995年9月29日

本发明的方法的其他等价物可以被本领域技术人员轻而易举地确定，本发明试图包括这些等价物。以上的公开内容包括本领域技术人员实现权利要求的发明所确实必需的所有信息。因为引用的专利或出版物可能提供其他有用信息，所有引述的资料在此全文引入作为参考。

Claims

1.一种产生具有提高的抗原特性的肠细菌的方法，其中肠细菌选自：弯曲杆菌属，耶尔森氏菌属，类杆菌属，克雷白氏杆菌属，Gastrospirillumsp.，肠杆菌属，沙门氏菌属，志贺氏菌属，气单胞菌属，弧菌属，梭状芽胞杆菌属，肠球菌属，和大肠杆菌，该方法包括在体外在一些条件的组合之下生长肠细菌的培养物，这些条件包括：

a)大约0.05％至大约3％胆汁或大约0.025％至大约0.6％一种或多

种胆汁酸或其盐；

b)温度在大约30℃至大约42℃之间；

c)在空气中或在微需氧条件下，其中微需氧条件包括i)大约5％至大

约20％CO₂和大约80％至大约95％空气；ii)大约5％至大约20％

CO₂和大约80％至大约95％N₂；或iii)大约5％至大约10％O₂

和大约10％至大约20％CO₂和大约70％至大约85％N₂；

和

d)一种二价阳离子螯合剂，选自：0至100μM的BAPTA/AM，0

至大约10mM的EGTA，和0至大约100μM的EGTA/AM，生长一段足够的时间，这样，培养物处于一个在大约是对数早期，在对数早期和稳定期之间，或在大约是稳定期的生长期。

2.权利要求1的方法，其中所述胆汁盐或酸包括脱氧胆酸盐或甘胆酸盐。

3.权利要求1的方法，其中所述肠细菌是弯曲杆菌属的种。

4.权利要求3的方法，其中所述肠细菌是空肠弯曲杆菌或大肠弯曲杆菌。

5.权利要求4的方法，其中所述空肠弯曲杆菌是这样的空肠弯曲杆菌菌株，它选自：134，195，170，81-176，6，81-116，35，52，VC-167，88，244，544，699，1180，910，和HC。

6.权利要求5的方法，其中所述空肠弯曲杆菌是空肠弯曲杆菌菌株81-176条件组合包括：

a)大约0.1％胆汁盐，它是脱氧胆酸盐或大约0.8％胆汁；

b)温度是大约37℃；

c)在大约10％至大约20％CO₂和大约80％至大约90％空气，和培养物生长一段足够时间，这样，培养物处于稳定期。

7.权利要求1的方法，其中所述肠细菌是志贺氏菌属的细菌。

8.权利要求7的方法，其中所述肠细菌是志贺氏菌属的种，选自弗氏，宋内氏，痢疾和鲍地氏志贺氏菌。

9.权利要求8的方法，其中所述志贺氏菌是弗氏志贺氏菌或痢疾志贺氏菌。

10.权利要求9的方法，其中所述弗氏志贺氏菌是弗氏志贺氏菌2457T，条件的组合包括：

a)大约0.1％脱氧胆酸盐或大约0.8％胆汁；

b)温度是大约37℃；

c)在空气中；而且

培养物生长一段充分的时间，这样使培养物处于对数早期。

11.权利要求1的方法，其中所述肠细菌是耶尔森氏菌。

12.权利要求1的方法，其中所述肠细菌是大肠杆菌。

13.权利要求12的方法，其中所述大肠杆菌是肠毒性的，肠溶血性的，肠病原性的，或肠侵袭性大肠杆菌菌株。

14.权利要求1的方法，其中所述肠细菌是弧菌。

15.权利要求1的方法，其中所述肠细菌是沙门氏菌。

16.权利要求1的方法，其中所述肠细菌是类杆菌。

17.权利要求1的方法，其中所述肠细菌是梭状芽胞杆菌。

18.权利要求1的方法，其中所述肠细菌是肠球菌。

19.权利要求1的方法，其中所述肠细菌是克雷白氏菌。

20.权利要求1的方法，其中所述肠细菌是肠杆菌。

21.权利要求1的方法，其中所述肠细菌是Gastrospirillum sp。

22.一种产生具有提高的抗原特性的肠细菌的方法，其中肠杆菌选自：弯曲杆菌属，耶尔森氏菌属，类杆菌属，克雷白氏杆菌属，肠杆菌属，Gastrospirillum sp.，沙门氏菌属，志贺氏菌属，气单胞菌属，弧菌属，梭状芽胞杆菌属，肠球菌属，和大肠杆菌，该方法包括在体外在一些条件的组合之下生长肠细菌的培养物，这些条件包括：

a)一种二价阳离子螯合剂，选自：1.0至25μM的BAPTA/AM，0.5

至大约10mM的EGTA，和1.0至大约100μM的EGTA/AM；

b)温度在大约30℃至大约42℃之间；和

约20％CO₂和大约80％至95％空气；ii)大约5％至大约20％

CO₂和大约80％至大约95％N₂；或iii)大约5％至大约10％O₂

和大约10％至大约20％CO₂和大约70％至大约85％N₂；生长一段足够的时间，这样，培养物处于一个在大约是对数早期，在对数早期和稳定期之间，或在大约是稳定期的生长期。

23.一种具有提高的抗原特性的肠细菌，其中肠细菌选自：弯曲杆菌属，耶尔森氏菌属，类杆菌属，克雷白氏杆菌属，肠杆菌属，Gastrospirillumsp.，沙门氏菌属，志贺氏菌属，气单胞菌属，弧菌属，梭状芽胞杆菌属，肠球菌属，和大肠杆菌，它是从在体外，在以下条件组合之下生长的肠细菌培养物中收获的，条件组合包括：

a)大约0.05％至大约3％胆汁或大约0.025％至大约0.6％一种或多

种胆汁酸或其盐；

b)温度在大约30℃至大约42℃之间；

约20％CO₂和大约80％至95％空气；ii)大约5％至大约20％

CO₂和大约80％至大约95％N₂；或iii)大约5％至大约10％O₂和大约10％至大约20％CO₂和大约70％至大约85％N₂；和

d)一种二价阳离子螯合剂，选自：0至100μM的BAPTA/AM，0

至大约10mM的EGTA，和0至大约100μM的EGTA/AM，其中所述肠杆菌培养物处于一个在大约是对数早期，在对数早期和稳定期之间，或在大约是稳定期的生长期。

24.权利要求23的肠细菌，其中所述胆汁盐包括脱氧胆酸盐或甘胆酸盐。

25.权利要求23的肠细菌，其中所述肠细菌是弯曲杆菌。

26.权利要求25的肠细菌，其中所述弯曲杆菌是空肠弯曲杆菌，大肠弯曲杆菌。

27.权利要求26的肠细菌，其中所述空肠弯曲杆菌是这样的空肠弯曲杆菌菌株，它选自：134，195，170，81-176，6，81-116，35，52，VC-167，88，244，544，699，1180，910，和HC。

28.权利要求27的肠细菌，其中所述空肠弯曲杆菌菌株是81-176，而且条件组合包括：

a)大约0.1％脱氧胆酸或大约0.8％胆汁；

b)温度是大约37℃；

c)在大约10％至20％CO₂和大约80％至大约90％空气，和肠细菌培养物处于稳定期。

29.权利要求23的肠细菌，其中所述肠细菌是志贺氏菌。

30.权利要求29的肠细菌，其中所述志贺氏菌选自弗氏、宋内氏、痢疾、和鲍地氏志贺氏菌。

31.权利要求30的肠细菌，其中所述肠细菌是痢疾志贺氏菌。

32.权利要求30的肠细菌，其中所述肠细菌是弗氏志贺氏菌。

33.权利要求32的肠细菌，其中所述弗氏志贺氏菌是弗氏志贺氏菌2457T，而且条件组合包括：

a)大约0.1％脱氧胆酸或大约0.8％胆汁；

b)温度是大约37℃，

c)在空气中：和培养物处于对数早期。

34.权利要求23的肠细菌，其中所述肠细菌是大肠杆菌。

35.权利要求34的肠细菌，其中所述大肠杆菌是肠毒性、肠溶血性、肠致病性、或肠侵袭性大肠杆菌菌株。

36.权利要求23的肠细菌，其中所述肠细菌是弧菌。

37.权利要求23的肠细菌，其中所述肠细菌是沙门氏菌。

38.权利要求23的肠细菌，其中所述肠细菌是类杆菌。

39.权利要求23的肠细菌，其中所述肠细菌是梭状芽胞杆菌。

40.权利要求23的肠细菌，其中所述肠细菌是肠球菌。

41.权利要求23的肠细菌，其中所述肠细菌是克雷白氏菌。

42.权利要求23的肠细菌，其中所述肠细菌是肠杆菌。

43.权利要求23的肠细菌，其中所述肠细菌是Gastrospirillum sp。

44.一种产生具有提高的抗原特性的肠细菌的方法，所述肠细菌选自：弯曲杆菌属，耶尔森氏菌属，类杆菌属，克雷白氏杆菌属，Gastrospirillum sp.，肠杆菌属，沙门氏菌属，志贺氏菌属，气单胞菌属，弧菌属，梭状芽胞杆菌属，肠球菌属，和大肠杆菌，该其中肠细菌从在体外在一些条件的组合之下生长肠细菌的培养物收获，这些条件包括：

a)一种二价阳离子螯合剂，选自：1.0至25μM的BAPTA/AM，0.5

至大约10mM的EGTA，和1.0至大约100μM的EGTA/AM；

b)温度在大约30℃至大约42℃之间；和

约20％CO₂和大约80％至95％空气；ii)大约5％至大约20％

CO₂和大约80％至大约95％N₂；或iii)大约5％至大约10％O₂

和大约10％至大约20％CO₂和大约70％至大约85％N₂；其中肠细菌培养物处于对数早期和稳定期之间。

45.一种包含权利要求23，26，28，29，30，或33-44的肠细菌，或其免疫原性片段或其衍生物的疫苗。

46.权利要求45的疫苗，还包含可药用载体或稀释剂。

47.权利要求45的疫苗，其中所述肠细菌是灭活的。

48.权利要求47的疫苗，其中所述肠细菌是经福尔马林处理而灭活的。

49.权利要求45的疫苗，其中所述疫苗适于粘膜或胃肠外或粘膜和胃肠外施用。

50.权利要求45的疫苗，还包含一种佐剂。

51.一种用于测试潜在的抗微生物剂的方法包括，将权利要求23，26，28，29，30或33-44的肠细菌与所述化学剂(agent)接触，当测试所述化学剂对于肠细菌的杀菌或制菌作用。

52.一种用于检测动物体内或由其衍生的生物学样品中的宿主的抗肠细菌的抗体的方法，包括步骤a)将所述生物学样品与权利要求23，26，28，29，30或33-44的肠细菌或其片段接触，和b)筛选与肠细菌或其片段结合的抗体。

53.一种用于检测动物体内或由其衍生的生物学样品中肠细菌的方法，包括步骤a)将所述样品与和权利要求23，26，28，29，30或33-44的肠细菌或其片段结合的抗体接触和b)筛选与肠细菌或其片段结合的抗体。

54.一种用于检测宿主产生抗肠细菌抗体或检测肠细菌的诊断免疫试验试剂盒，包括权利要求23，26，28，29，30或33-44的肠细菌或其抗体，和进行所期望的免疫实验所需要的其他所有必需的试剂盒组分。

55.一种用于在动物中产生抗肠细菌抗体的方法，包括用有效量的含有权利要求23，26，28，29，30或33-44的肠细菌的免疫原免疫动物，其中，抗肠细菌抗体结合所述肠细菌或其组分。

56.一种在动物中刺激免疫应答的方法，包括向动物施用有效量的含有权利要求23，26，28，29，30或33-44的肠细菌的免疫原，其中所述免疫应答保护，减弱或治愈动物中由选自弯曲杆菌属，耶尔森氏菌属，类杆菌属，克雷白氏杆菌属，Gastrospirillum sp.，肠杆菌属，沙门氏菌属，志贺氏菌属，气单胞菌属，弧菌属，梭状芽胞杆菌属，肠球菌属，和大肠杆菌的肠细菌引起的感染或疾病。