CN104198734B - 一种金黄色葡萄球菌的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种金黄色葡萄球菌的检测方法，包括以下步骤：配制金黄色葡萄球菌培养液I；将待测样品加入上述培养液I中并进行富集培养，作为培养液II备用；光纤生物传感器的制备，将金黄色葡萄球菌A蛋白特异性抗体I通过疏水力、分子间作用力或共价键固定在光纤生物传感器上；制备空白检测液及待检测液，所述空白检测液包括培养液I与缓冲液，所述待检测液包括培养液II与缓冲液；先将上述制备的光纤生物传感器没入所述空白检测液进行平衡处理，接着没入所述待检测液进行检测。较现有技术的检测方法具有实时检测、检测时间短、操作方便等优势，具有良好的应用前景。

Description

一种金黄色葡萄球菌的检测方法
技术领域
本发明涉及生物医学检测技术领域，具体涉及一种金黄色葡萄球菌的检测方法。
背景技术
金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）属于葡萄球菌属（Staphylococcus），是一种常见的革兰氏阳性菌，在自然界分布极其广泛，存在于空气、水、土壤、灰尘及人和动物的排泄物中，是一种条件性致病菌。由于金黄色葡萄球菌广泛存在于周围环境中，因而食品很容易遭受金黄色葡萄球菌污染，误食受金黄色葡萄球菌污染的食物会引发人和动物皮肤软组织感染、败血症、乳房炎、心内膜炎、肺炎、肠炎、脑膜炎、骨髓炎、筋膜炎、关节炎、中毒性休克综合征等。由金黄色葡萄球菌引发的中毒在北美及欧洲等发达国家最为多见。据相关数据统计每年由金葡菌引起的食物中毒病例数量仅次于由沙门氏菌引起的食物中毒病例数量。据统计，在美国由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒事件占到整个细菌性食物中毒事件的33%，在加拿的统计中更是达到45%。在我国每年由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒事件也屡有报道。
金黄色葡萄球菌A蛋白(StaphylococcalProteinA，简称SPA)是金黄色葡萄球菌细胞壁抗原的主要成分，几乎90%以上的金黄色葡萄球菌菌株均含有这种成分，但不同的菌株含量差别十分悬殊。SPA是一种蛋白质,由亮、缬、脯、丙、苏、甘、丝、谷丙、天门冬及赖氨酸等十种氨基酸组成。由于不含有胱氨酸及半胱氨酸，所以无二硫键。紫外光谱和吸收系数为A275nm%=1.65，等电点为PH值5.1。SPA十分稳定，用4mol/L尿素、硫氰盐酸、6mol/L的盐酸胍和PH值2.5的酸性条件，以及加热煮沸均不影响其活性。
传统的金黄色葡萄球菌多采用分离培养、生化检定和血衆凝固酶实验相结合的检测方法，这种方法不仅耗时长、操作繁琐、成本高、要求检测人员经验丰富。随着生物技术的不断发展，分子生物学检测方法被广泛应用于微生物的检测，但是分子生物学检测同样依赖于专业技术人员、特殊的环境设施、昂贵的设备。
上世纪90年代初，一种简便快速的检测方法被开发出来，迅速成为检测领域中的研究热点，它就是免疫层析技术。免疫层析技术具有简便快速、费用低廉、易于操作等优势得到广泛认可。如今，免疫层析技术已经广泛应用于食品安全检测、临床检测等领域。在金黄色葡萄球菌检测方面，免疫层析检测也得到了广泛应用，大大加快了金黄色葡萄球菌的检测速度，降低了检测工作量。如有报道（Goldnanoparticle-basedimmunochromatographicassayforthedetectionofStaphylococcusaureus，Su-HuaHuang，SensorsandActuatorsB:Chemical，Volume127,Issue2,15November2007,Pages335–340）采用免疫层析试纸条可在25小时内，检测出食品中污染浓度达到25CFU/g以上的金黄色葡萄球菌。
发明内容
为了解决上述现有技术的问题，本发明提供了一种金黄色葡萄球菌的检测方法，利用金黄色葡萄球菌生长过程中分泌的A蛋白（SPA）与检测抗体发生结合的特性，通过固定有检测抗体的光纤生物传感器对待测样品中SPA进行检测，引起光电信号发生变化进而推知金黄色葡萄球菌的存在，生物膜干涉技术（Bio-LayerInterferometry，BLI）检测金黄色葡萄球菌较现有技术的检测方法具有无需标记、实时检测、检测时间短、操作方便等优势，具有良好的应用前景。
一种金黄色葡萄球菌的检测方法，包括以下步骤：
a．配制金黄色葡萄球菌培养液I；
b．将待测样品加入步骤a的培养液I中并进行富集培养，离心，取上清，作为培养液II备用；
c．将金黄色葡萄球菌A蛋白特异性抗体I固定在光纤生物传感器上；
d．制备空白检测液及待检测液，所述空白检测液包括培养液I与缓冲液，所述待检测液包括培养液II与缓冲液；
e．先将步骤c制备的光纤生物传感器没入所述空白检测液进行平衡处理，接着没入所述待检测液中检测。
优选地，述培养液I为PH值7.4的7.5%氯化钠肉汤、PH值7.3的10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤、与葡萄球菌选择性肉汤SSB的任一种，所述7.5%氯化钠肉汤配制方法为10g蛋白胨、5g牛肉浸粉与75g氯化钠加水定容至1000ml，121℃高压灭菌15min，再加入磺胺二甲嘧啶0.005g；所述10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤配制方法为7g胰蛋白胨、3g大豆蛋白胨、100g氯化钠、2.5g磷酸氢二钾、10g丙酮酸钠、2.5g葡萄糖加水定容至1000ml，121℃高压灭菌15min，再加入磺胺二甲嘧啶0.005g；所述葡萄球菌选择性肉汤SSB配制方法为：15g胰蛋白胨,10g丙酮酸钠,12g甘氨酸,5g氯化锂,3g酵母提取物、0.02g磺胺二甲嘧啶加水定容到1000ml，121℃高压灭菌15min，再加入磺胺二甲嘧啶0.005g。
优选地，步骤c所采用的固定方法为疏水力、分子间作用力或共价键。
优选地，所述步骤b的培养温度为25℃至39℃。
优选地，步骤d中所述待检测液还包括金黄色葡萄球菌A蛋白特异性抗体II，所述金黄色葡萄球菌A蛋白特异性抗体II与所述金黄色葡萄球菌A蛋白特异性抗体I相同或不同。
优选地，步骤d中所述空白检测液还包括金磁颗粒标记的BSA或纳米金颗粒，所述金黄色葡萄球菌A蛋白特异性抗体II标记有金磁颗粒或纳米金颗粒。
优选地，金磁颗粒标记所述金黄色葡萄球菌A蛋白特异性抗体II的制备方法为：取1mg/ml的金磁颗粒1ml，加入2μg金黄色葡萄球菌A蛋白特异性抗体II，混匀，室温静置15min；加入100μL10%BSA，混匀，室温静置15min，置于磁场中1min，去掉上清；再加入100μL复溶液重悬颗粒，备用；
所述金磁颗粒标记BSA的制备方法为：取1mg/ml的金磁颗粒1ml，加入100μL10%BSA，混匀，室温静置15min，置于磁场中1min，去掉上清；再加入100μL复溶液重悬颗粒，备用；
优选地，纳米金颗粒标记金黄色葡萄球菌A蛋白特异性抗体II的方法为：取粒径5nm~50nm的纳米金颗粒1ml，加入1~5μg金黄色葡萄球菌A蛋白特异性抗体II，混匀，室温静置15min；加入100μL10%BSA，混匀，室温静置15min，10000rpm离心10min，去掉上清；加入100μL复溶液重悬颗粒；
纳米金颗粒标记BSA的方法：取粒径5nm~50nm的纳米金颗粒1ml，加入100μL10%BSA，混匀，室温静置15min，10000rpm离心10min，去掉上清；加入100μL复溶液重悬颗粒；
优选地，所述复溶液由100mMPH值为7.5的Tris-HCl缓冲液、0.5%Tween20、5%海藻糖组成。
优选地，所述待检测液制备方法如下：取5ml所述培养液II，并加入5μL金磁颗粒标记金黄色葡萄球菌A蛋白特异性抗体II，置于37℃下300rpm振荡孵育30min，置于磁场中1min，弃掉上清液；再加入200μL缓冲液，作为待检测液备用。
优选地，所述金黄色葡萄球菌A蛋白特异性抗体I及金黄色葡萄球菌A蛋白特异性抗体II均为鼠、兔、马、羊、牛中的任一种抗体，所述金黄色葡萄球菌A蛋白特异性抗体I及金黄色葡萄球菌A蛋白特异性抗体II均为单克隆抗体或多克隆抗体。
优选地，所述缓冲液由100mMPH值7.5的Tris-HCl缓冲液、1%BSA、20mMNaCl、及0.5%Tween20组成。
本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：
1）利用生物膜干涉技术（Bio-LayerInterferometry，BLI）检测待测金黄色葡萄球菌分泌的金黄色葡萄球菌A蛋白（SPA），与现有技术相比具有无需标记、实时检测、检测稳定性好、检测简单快速等优点；
2）采用双抗体夹心方式进行BLI检测，可以有效提高BLI检测的灵敏性；
3）利用金磁颗粒或纳米金颗粒标记检测抗体，且进行双抗体夹心方式的BLI检测，可以进一步提高BLI检测的灵敏性。
附图说明
图1是不同培养液I进行无标记BLI检测结果；
图2是SSB培养液I、不同培养时间进行无标记BLI检测结果；
图3是SSB培养液I、不同培养温度进行金磁颗粒标记且双抗体夹心（富集浓缩）BLI检测结果；
图4是不同BLI检测方法的检测结果；
图5是特异性检测结果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供了一种金黄色葡萄球菌的检测方法，采用生物膜干涉技术（BLI）检测出金黄色葡萄球菌分泌的A蛋白（SPA），其具体过程为：所述金黄色葡萄球菌A蛋白特异性抗体I（SPA特异性抗体I）通过疏水力、分子间作用力或共价键固定在光纤生物传感器上，在检测过程中，所述待检测液中待测样品的SPA会与所述光纤生物传感器上的SPA特异性抗体I发生结合，从而引起BLI光电信号发生变化。
一种金黄色葡萄球菌的检测方法，包括以下步骤：
a．配制金黄色葡萄球菌培养液I，培养液I可以是氯化钠肉汤、氯化钠胰酪胨大豆肉汤、及葡萄球菌选择性肉汤SSB等任一种；
b．将待测样品加入步骤a的培养液I中并进行富集培养，离心，取上清作为培养液II备用；
c．光纤生物传感器的制备，将SPA特异性抗体I通过疏水力、分子间作用力或共价键固定在光纤生物传感器上，所述SPA特异性抗体I用于与待测样品中的SPA发生结合；
d．制备空白检测液及待检测液，所述空白检测液包括200μL培养液I与50μL缓冲液，所述待检测液包括200μL培养液II与50μL缓冲液，所述缓冲液由100mMPH值7.5的Tris-HCl缓冲液、1%BSA、20mMNaCl、及0.5%Tween20配制组成；
e．BLI检测：先将步骤c制备的光纤生物传感器没入所述空白检测液进行平衡处理，接着没入所述待检测液中检测。
上述培养液I按照如下配方配制：
（1）PH值7.4±0.1、7.5%氯化钠肉汤：蛋白胨10.0g、牛肉浸粉5.0g、氯化钠75.0g，加水定容至1000ml，121℃高压灭菌15min，加入磺胺二甲嘧啶0.005g，备用；
（2）PH值7.3±0.2、10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤：胰蛋白胨7.0g、大豆蛋白胨3.0g、氯化钠100.0g、磷酸氢二钾2.5g、丙酮酸钠10.0g、葡萄糖2.5g，加水定容至1000ml，121℃高压灭菌15min，加入磺胺二甲嘧啶0.005g，备用；
（3）SSB：胰蛋白胨15.0g,丙酮酸钠10.0g,甘氨酸10.0g,氯化锂5.0g,酵母提取物3.0g、加水定容到1000ml，121℃高压灭菌15min，加入磺胺二甲嘧啶0.005g，备用。
所述SPA特异性抗体I为单克隆抗体或多克隆抗体，可以是鼠、兔、马、羊、牛中的任一种抗体。所述SPA特异性抗体I通过疏水力、分子间作用力或共价键固定在光纤生物传感器制备固定有所述SPA特异性抗体I的光纤生物传感器，其具体方法如下：
（1）疏水力：将所述光纤生物传感器没入浓度为40μg/ml的SPA特异性抗体I中1min。取出，0.01M磷酸盐缓冲液（PBS，PH7.0）洗涤2次，没入15%蔗糖溶液中1min，取出，室温干燥2h，置于4℃保存，备用。（疏水力（hydrophobiebonds)在蛋白质多肽链的空间折叠、生物膜的形成、生物大分子之间的相互作用以及酶对底物分子的催化过程中常常起着关键的作用。非极性分子之间或分子的非极性基团之间在水环境中相互吸引并聚集在一起，而把原来处在非极性基团附近的水分子排挤出去，结果使周围水分子的熵值增加。）
（2）分子间作用力：将所述SPA特异性抗体I进行生物素化标记，标记之后再与亲和素传感器进行反应，获得固定有所述SPA特异性抗体I的光纤生物传感器。
（3）共价键：将表面修饰有羧基的传感器置于0.1mg/ml的EDC溶液（双功能偶联剂、PH6.0）中20min。取出，用0.01M磷酸盐缓冲液（PBS，PH7.0）洗涤2次。没入浓度为20μg/ml的SPA特异性抗体I中120min。取出，没入浓度为1%牛血清白蛋白（BSA）中120min。取出，0.01M磷酸盐缓冲液（PBS,PH7.0）洗涤2次，没入15%蔗糖溶液中1min，取出，室温干燥2h，置于4℃保存，备用。（共价键本质是原子轨道重叠后，高概率地出现在两个原子核之间的电子与两个原子核之间的电性作用。）
无标记的BLI检测过程如下：
S11、富集培养：取25g待测样品于225ml所述培养液I中，均质培养，3000rpm转速下离心5min，取上清作为培养液II；
S12、BLI检测：所述空白检测液由200μL培养液I、50μL缓冲液组成，所述待检测液由200μL培养液II、50μL缓冲液组成。将固定有所述SPA特异性抗体I的光纤生物传感器末端没入所述空白检测液中60s~180s进行平衡处理，再将该光纤生物传感器末端没入所述待检测液中180s~600s进行检测。
本发明还采用双抗体夹心的方式检测SPA，具体过程为：所述SPA特异性抗体I通过疏水力、分子间作用力或共价键固定在所述光纤生物传感器上，所述待检测液中的金黄色葡萄球菌A蛋白特异性抗体II（SPA特异性抗体II）与所述待检测液中待检样品的SPA发生结合，再与所述光纤生物传感器上的检测抗体发生结合，从而引起BLI光电信号发生变化。所述SPA特异性抗体II与SPA特异性抗体I可以相同或不同，所述SPA特异性抗体II可以是鼠、兔、马、羊、牛中的任一种的多克隆抗体或单克隆抗体。
无标记的双抗体夹心BLI检测过程如下：
S21、富集培养：取25g待测样品于225ml所述培养液I中，均质培养，3000rpm转速下离心5min，取上清作为培养液II；
S22、BLI检测：所述空白检测液由200μL培养液I、50μL缓冲液组成，所述待检测液由200μL培养液II、50μL缓冲液、及2μg所述SPA特异性抗体II组成。将固定有所述SPA特异性抗体I的光纤生物传感器末端没入所述空白检测液中60s~180s进行平衡处理，再将该光纤生物传感器末端没入所述待检测液中180s~600s进行检测。
本发明还采用金磁颗粒或纳米金颗粒标记所述SPA特异性抗体II进行双抗体夹心方式检测SPA，其中SPA特异性抗体I通过疏水力、分子间作用力或共价键固定在所述光纤生物传感器上，所述SPA特异性抗体II被金磁颗粒所标记（即金磁颗粒-SPA特异性抗体II）。所述SPA特异性抗体II与SPA特异性抗体I可以相同或不同，所述SPA特异性抗体II可以是鼠、兔、马、羊、牛中的任一种的多克隆抗体或单克隆抗体。
金磁颗粒标记且双抗体夹心的BLI检测过程如下：
S311、富集培养：取25g待测样品于225ml所述培养液I中，均质培养，3000rpm转速下离心5min，取上清作为培养液II；
S312、金磁颗粒标记SPA特异性抗体II（金磁颗粒-SPA特异性抗体II）制备过程：取1mg/ml的金磁颗粒1ml，加入2μgSPA特异性抗体II，混匀，室温静置15min；加入100μL10%BSA，混匀，室温静置15min，置于磁场中1min，去掉上清；加入100μL复溶液（100mMPH值7.5的Tris-HCl缓冲液、0.5%Tween20、5%海藻糖）；
金磁颗粒标记BSA（金磁颗粒-BSA）制备过程：取1mg/ml的金磁颗粒1ml，加入100μL10%BSA，混匀，室温静置15min，置于磁场中1min，去掉上清；加入100μL复溶液（100mMPH值7.5的Tris-HCl缓冲液、0.5%Tween20、5%海藻糖）；
S313、BLI检测：所述空白检测液由200μL培养液I、50μL缓冲液、及5μL金磁颗粒标记的BSA组成，所述待检测液由200μL培养液II、50μL缓冲液、及5μL金磁颗粒-SPA特异性抗体II组成。将固定有所述SPA特异性抗体I的光纤生物传感器末端没入所述空白检测液中60s~180s进行平衡处理，再将该光纤生物传感器末端没入所述待检测液中180s~600s。
纳米金颗粒标记且双抗体夹心的BLI检测过程如下：
S321、富集培养：取25g待测样品于225ml所述培养液I中，均质培养，作为培养液II；
S322、纳米金颗粒标记SPA特异性抗体II（纳米金颗粒-SPA特异性抗体II）的工艺：取纳米金颗粒（粒径：5nm~50nm）1ml，加入1~5μgSPA特异性抗体II，混匀，室温静置15min；加入100μL10%BSA，混匀，室温静置15min，10000rpm离心10min，去掉上清；加入100μL复溶液（100mMPH7.5的Tris-HCl缓冲液、0.5%Tween20、5%海藻糖）；
纳米金颗粒标记BSA工艺：取纳米金颗粒（粒径：5nm~50nm）1ml，加入100μL10%BSA，混匀，室温静置15min，10000rpm离心10min，去掉上清；加入100μL复溶液（100mMPH7.5的Tris-HCl缓冲液、0.5%Tween20、5%海藻糖）；
S323、BLI检测：所述空白检测液由200μL培养液I、50μL缓冲液、及5μL纳米金颗粒标记的BSA组成，所述待检测液由200μL培养液II、50μL缓冲液、及2~5μL纳米金颗粒-SPA特异性抗体II组成。将固定有所述SPA特异性抗体I的光纤生物传感器末端没入所述空白检测液中60s~180s进行平衡处理，再将该光纤生物传感器末端没入所述待检测液中180s~600s。
金磁颗粒标记且双抗体夹心的BLI检测还可以在富集培养之后，对液体中的SPA进行富集浓缩，然后再进行BLI检测，即金磁颗粒-SPA特异性抗体II首先与所述待检液中待检样品的SPA发生结合，获得金磁颗粒-SPA特异性抗体II-SPA复合物；在磁场作用下，金磁颗粒-SPA特异性抗体II-SPA复合物被分离出来；金磁颗粒-SPA特异性抗体II-SPA复合物再与所述光纤生物传感器上的SPA特异性抗体I发生结合，从而引起BLI光电信号发生变化。所述SPA特异性抗体II与SPA特异性抗体I可以相同或不同，所述SPA特异性抗体II可以是鼠、兔、马、羊、牛中的任一种的多克隆抗体或单克隆抗体。其具体过程如下：
S41、金磁颗粒标记SPA特异性抗体II（金磁颗粒-SPA特异性抗体II）制备过程：取1mg/ml的金磁颗粒1ml，加入2μgSPA特异性抗体II，混匀，室温静置15min；加入100μL10%BSA，混匀，室温静置15min，置于磁场中1min，去掉上清；加入100μL复溶液（100mMPH值7.5的Tris-HCl缓冲液、0.5%Tween20、5%海藻糖）；
金磁颗粒标记BSA（金磁颗粒-BSA）制备过程：取1mg/ml的金磁颗粒1ml，加入100μL10%BSA，混匀，室温静置15min，置于磁场中1min，去掉上清；加入100μL复溶液（100mMPH值7.5的Tris-HCl缓冲液、0.5%Tween20、5%海藻糖）；
S42、富集浓缩：取25g待测样品于225ml所述培养液I中，均质，培养，3000rpm转速下离心5min，取上清作为培养液II；取5ml所述培养液II，并加入5μL金磁颗粒-SPA特异性抗体II，置于37℃下振荡（300rpm）孵育30min，置于磁场中1min，弃掉上清液。加入200μL缓冲液，作为待检测液备用。
S43、BLI检测：所述空白检测液由200μL培养液I、50μL缓冲液、及5μL金磁颗粒标记的BSA组成。将固定有所述SPA特异性抗体I的光纤生物传感器末端没入所述空白检测液中60s~180s进行平衡处理，再将该光纤生物传感器末端没入步骤S42中获得的待检测液中180s~600s。
本发明实施例具体检测过程如下：
S51、配制金黄色葡萄球菌培养液I，从PH值为7.4的7.5%氯化钠肉汤、PH值为7.3的10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤、与葡萄球菌选择性肉汤SSB中选择一种作为培养液I；
S52、取25g待测样品于225ml所述培养液I中，均质培养，3000rpm转速下离心5min，取上清作为培养液II；
S53、将所述SPA特异性抗体I通过疏水力、分子间作用力或共价键固定在所述光纤生物传感器上；
S54、BLI检测：无标记BLI检测、双抗体夹心的无标记BLI检测、双抗体夹心且金磁颗粒标记BLI检测、双抗体夹心且金磁颗粒标记（富集浓缩）BLI检测、纳米金颗粒标记且双抗体夹心BLI检测中的任一种。
不同培养液I进行富集培养2至48h，再进行多次重复无标记BLI检测，所述待测样品为牛奶，所述SPA特异性抗体I为鼠单克隆抗体，共计3组试验，检测结果如表1、图1和图2所示。图1为不同培养液I进行富集培养6h，再进行无标记BLI检测的检测结果；图2为培养液I为BBS、不同培养时间进行无标记BLI检测的检测结果。
不同温度下富集培养12h，再进行多次重复双抗体夹心且金磁颗粒标记（富集浓缩）BLI检测，所述测待测样品为肉包，所述SPA特异性抗体I为马多克隆抗体，所述SPA特异性抗体II为鼠源单克隆抗体，共计27组试验，检测结果如表2、图3所示。图3为培养液I为SSB、不同温度下富集培养12h，进行双抗体夹心且金磁颗粒标记（富集浓缩）BLI检测的检测结果。
针对不同的所述SPA特异性抗体I或/和SPA特异性抗体II，梯度添加金黄色葡萄球菌标准菌株（105~10-1CFU/g）至SSB配制培养液I，富集培养后分别进行无标记BLI检测、双抗体夹心的无标记BLI检测、双抗体夹心且金磁颗粒标记BLI检测、双抗体夹心且金磁颗粒标记（富集浓缩）BLI检测、双抗体夹心且纳米金颗粒标记BLI检测，共计5组试验，检测结果如表3、图4所示。图4为菌种浓度102CFU/g、培养液I为SSB，不同BLI检测方法的检测结果。
特异性试验
分别用空肠弯曲杆菌、粪肠球菌、绿脓杆菌、志贺氏菌、霍乱孤菌、阪崎杆菌、沙门氏菌、单增李斯特氏菌、大肠杆菌、腐生酵母菌接种空白样品（即金黄色葡萄球菌阴性样品），采用本发明的BLI检测方法（双抗体夹心且金磁颗粒标记（富集浓缩）BLI检测）检测接种后的样品，以评价该方法的特异性，共计1组实验，检测结果如表5、图5所示。图5为不同菌种在SSB培养液富集培养12h，进行双抗体夹心且金磁颗粒标记（富集浓缩）BLI检测300s的检测结果。
对比试验
在空白样品中梯度添加金黄色葡萄球菌标准菌株（ATCC6538、105~10-1CFU/g），采用标准方法（GB4789.10-2010，第一法）进行检测，共计6组试验，检测结果如表4所示。
1、稳定性及优化过程的检测结果
（1）将待测样品（牛奶）置于不同培养液I进行富集培养2至48h，再进行BLI检测（无标记BLI检测），检测结果如表1所示。由表1可以看出在相同条件下，采用SSB配制的培养液I培养效果最好。
表1为不同培养液I不同培养时间的检测结果
时间（h） 7.5%氯化钠肉汤 10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤 SSB
2 0/5 0/5 0/5
4 0/5 0/5 1/5
6 2/5 0/5 4/57 -->
8 3/5 4/5 5/5
12 5/5 4/5 5/5
18 5/5 5/5 5/5
24 5/5 5/5 5/5
36 5/5 5/5 5/5
48 5/5 5/5 5/5
其中，分母为检测次数，分子为该平行检测下显示阳性的次数，如：2/5表示平行检测了5次，其中两次为阳性。检测结果显示阳性为待测样品中含有金黄色葡萄球菌。
（2）将待测样品（肉包）在不同温度下富集培养12h，再进行BLI检测，BLI检测为双抗体夹心且金磁颗粒标记（富集浓缩），检测结果如表2所示，从表2中可以看出33℃~37℃培养温度下，采用SSB配制培养液I，其检测最为灵敏。
表2为不同培养液I不同培养温度的检测结果
温度（°C） 7.5%氯化钠肉汤 10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤 SSB
25 0/5 0/5 1/5
27 0/5 0/5 1/5
29 0/5 0/5 1/5
31 3/5 3/5 4/5
33 4/5 3/5 5/5
35 4/5 4/5 5/5
37 3/5 4/5 5/5
39 2/5 2/5 3/5
41 0/5 0/5 1/5
其中，分母为检测次数，分子为该平行检测下显示阳性的次数，如：2/5表示平行检测了5次，其中两次为阳性。检测结果显示阳性为待测样品中含有金黄色葡萄球菌。
（3）往不同的空白样品中加入不同浓度的金黄色葡萄球菌，取25g于225mlSSB中，35°C培养12h±1h，BLI检测，检测结果如表3所示。从表3可以看出，金磁颗粒或纳米金颗粒标记能够明显提高检测的灵敏性。富集培养中对所述SPA特异性抗体II进行金磁颗粒标记后，BLI检测灵敏性会得到进一步提高。
表3为无标记及金磁颗粒标记的BLI检测对不同浓度的金黄色葡萄球菌的检测结果
其中，分母为检测次数，分子为该平行检测下显示阳性的次数，如：2/5表示平行检测了5次，其中两次为阳性。检测结果显示阳性为待测样品中含有金黄色葡萄球菌。
2、灵敏性的检测结果
在空白样品中梯度添加金黄色葡萄球菌标准菌株（ATCC6538、105~10-1CFU/g），富集培养后并分别采用本发明的BLI检测方法和标准方法（GB4789.10-2010，第一法）进行检测，比较不同检测方法的灵敏性，检测灵敏性如下表4所示。从表4中可知，本申请公开的方法具有良好的灵敏性，特别是金磁颗粒富集浓缩方法的灵敏性更好。标准方法虽然可以检测出菌浓度为100CFU/g，但其所需时间为45~48h，而本申请所公开的方法所需时间6~8h，灵敏度达到了10-1CFU/g，较标准方法检测时间更短，操作更简便。
表4为不同检测方法的检测结果
3、特异性的检测结果
用本发明的检测方法特异性良好，与其他的菌无交叉反应。其他菌可以是空肠弯曲杆菌、粪肠球菌、绿脓杆菌、志贺氏菌、霍乱孤菌、阪崎杆菌、沙门氏菌、单增李斯特氏菌、大肠杆菌、腐生酵母菌等。
在空白样品中添加103CFU/g的空肠弯曲杆菌、粪肠球菌、绿脓杆菌、志贺氏菌、O139霍乱孤菌、阪崎杆菌、沙门氏菌、单增李斯特氏菌、大肠杆菌、腐生酵母菌，富集培养后并分别采用本发明的BLI检测方法，BLI检测为双抗体夹心且金磁颗粒标记（富集浓缩），检测结果如表5所示。从表5可以看出，用本发明的检测方法特异性良好，与其他的菌无交叉反应。
表5为特异性检测结果
菌种 菌种浓度（CFU/g） BLI检测结果
金黄色葡萄球菌 103 5/5
空肠弯曲杆菌 103 0/5
粪肠球菌 103 0/5
绿脓杆菌 103 0/5
志贺氏菌 103 0/5
O139霍乱孤菌 103 0/5
阪崎杆菌 103 0/5
沙门氏菌 103 0/5
单增李斯特氏菌 103 0/5
大肠杆菌 103 0/5
腐生酵母菌 103 0/5
其中，分母为检测次数，分子为该平行检测下显示阳性的次数，如：2/5表示平行检测了5次，其中两次为阳性。检测结果显示阳性为待测样品中含有金黄色葡萄球菌。
以上对本发明实施例所提供的一种金黄色葡萄球菌的检测方法，进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

Claims (8)

1.一种金黄色葡萄球菌的检测方法，包括以下步骤：
a、配制金黄色葡萄球菌培养液I；
b、将待测样品加入步骤a的培养液I中并进行富集培养，离心，取上清，作为培养液II备用；
c、将金黄色葡萄球菌A蛋白特异性抗体I固定在光纤生物传感器上；
d、制备空白检测液及待检测液，所述空白检测液包括培养液I与缓冲液，所述待检测液包括培养液II与缓冲液；
e、先将步骤c制备的光纤生物传感器没入所述空白检测液进行平衡处理，接着没入所述待检测液中检测；
其中，
步骤d中所述待检测液还包括金黄色葡萄球菌A蛋白特异性抗体II，所述金黄色葡萄球菌A蛋白特异性抗体II与所述金黄色葡萄球菌A蛋白特异性抗体I相同或不同；
所述培养液I为PH值为7.4的7.5%氯化钠肉汤、PH值为7.3的10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤、与葡萄球菌选择性肉汤SSB的任一种，所述7.5%氯化钠肉汤配制方法为10g蛋白胨、5g牛肉浸粉与75g氯化钠加水定容至1000ml，121℃高压灭菌15min，再加入磺胺二甲嘧啶0.005g；所述10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤配制方法为7g胰蛋白胨、3g大豆蛋白胨、100g氯化钠、2.5g磷酸氢二钾、10g丙酮酸钠、2.5g葡萄糖加水定容至1000ml，121℃高压灭菌15min，再加入磺胺二甲嘧啶0.005g；所述葡萄球菌选择性肉汤SSB配制方法为：15g胰蛋白胨,10g丙酮酸钠,12g甘氨酸,5g氯化锂,3g酵母提取物、0.02g磺胺二甲嘧啶加水定容到1000ml，121℃高压灭菌15min，再加入磺胺二甲嘧啶0.005g；
所述步骤b具体包括以下步骤：取25g待测样品于225ml所述培养液I中，均质培养，3000rpm转速下离心5min，取上清作为培养液II；
所述步骤e具体包括以下步骤：将固定有所述金黄色葡萄球菌特异性抗体I的光纤生物传感器末端没入所述空白检测液中60s~180s进行平衡处理，再将该光纤生物传感器末端没入所述待检测液中180s~600s进行检测，所述空白检测液由200μL培养液I、50μL缓冲液组成，所述待检测液由200μL培养液II、50μL缓冲液、及2μg所述金黄色葡萄球菌特异性抗体II组成。
2.根据权利要求1所述的金黄色葡萄球菌的检测方法，其特征在于，步骤d中所述空白检测液还包括金磁颗粒或纳米金颗粒标记的BSA，所述金黄色葡萄球菌A蛋白特异性抗体II标记有金磁颗粒或纳米金颗粒。
3.根据权利要求2所述的金黄色葡萄球菌的检测方法，其特征在于，金磁颗粒标记所述金黄色葡萄球菌A蛋白特异性抗体II的制备方法为：取1mg/ml的金磁颗粒1ml，加入2μg金黄色葡萄球菌A蛋白特异性抗体II，混匀，室温高压灭菌15min；加入100μL10%BSA，混匀，室温高压灭菌15min，置于磁场中1min，去掉上清；再加入100μL复溶液重悬颗粒，备用；
所述金磁颗粒标记BSA的制备方法为：取1mg/ml的金磁颗粒1ml，加入100μL10%BSA，混匀，室温高压灭菌15min，置于磁场中1min，去掉上清；再加入100μL复溶液重悬颗粒，备用；
所述复溶液由100mMPH值为7.5的Tris-HCl缓冲液、0.5%Tween20、5%海藻糖组成。
4.根据权利要求2所述的金黄色葡萄球菌的检测方法，其特征在于，纳米金颗粒标记金黄色葡萄球菌A蛋白特异性抗体II的方法为：取1ml粒径5~50nm的纳米金颗粒，加入1~5μg金黄色葡萄球菌A蛋白特异性抗体II，混匀，室温静置15min；加入100μL10%BSA，混匀，室温静置15min，10000rpm离心10min，去掉上清；加入100μL复溶液重悬颗粒；
纳米金颗粒标记BSA的方法：取1ml粒径5nm~50nm的纳米金颗粒，加入100μL10%BSA，混匀，室温静置15min，10000rpm离心10min，去掉上清；加入100μL复溶液重悬颗粒；
所述复溶液由100mMPH值为7.5的Tris-HCl缓冲液、0.5%Tween20、5%海藻糖组成。
5.根据权利要求2所述的金黄色葡萄球菌的检测方法，其特征在于，所述待检测液制备方法如下：取5ml所述培养液II，并加入5μL金磁颗粒标记金黄色葡萄球菌A蛋白特异性抗体II，置于37℃下300rpm振荡孵育30min，置于磁场中1min，弃掉上清液；再加入200μL缓冲液，作为待检测液备用。
6.根据权利要求1所述的金黄色葡萄球菌的检测方法，其特征在于，所述金黄色葡萄球菌A蛋白特异性抗体I及金黄色葡萄球菌A蛋白特异性抗体II均为鼠、兔、马、羊、牛中的任一种抗体，所述金黄色葡萄球菌A蛋白特异性抗体I及金黄色葡萄球菌A蛋白特异性抗体II为单克隆抗体或多克隆抗体。
7.根据权利要求1所述的金黄色葡萄球菌的检测方法，其特征在于，步骤c所采用的固定方法为疏水力、分子间作用力或共价键。
8.根据权利要求1所述的金黄色葡萄球菌的检测方法，其特征在于，所述步骤b的培养温度为25℃至39℃。
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