CN101514988A - 一种葡萄球菌肠毒素探测方法 - Google Patents
一种葡萄球菌肠毒素探测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101514988A CN101514988A CNA2009100781927A CN200910078192A CN101514988A CN 101514988 A CN101514988 A CN 101514988A CN A2009100781927 A CNA2009100781927 A CN A2009100781927A CN 200910078192 A CN200910078192 A CN 200910078192A CN 101514988 A CN101514988 A CN 101514988A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- chip
- detection
- staphylococcal enterotoxin
- detection method
- enterotoxin
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Landscapes
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Abstract
一种葡萄球菌肠毒素探测方法，其特征在于包含以下步骤：(1)制备葡萄球菌肠毒素LSPR探测芯片；(2)对芯片金属结构表面进行活化，形成特异性生物分子膜；(3)测试该芯片的消光谱获得结合前的基准值；(4)然后滴上待测样品，待其充分反应后，放入LSPR传感器中进行测试，利用抗原—抗体分子间的特异性反应，观察光谱移动状况，判断待测样品中是否含有葡萄球菌肠毒素，达到无标记、高灵敏度、快速检测。本发明方法不需要复杂设备、不需要使用放射性同位素、酶或荧光等做为标识物，具有快速、高灵敏度、应用范围广、安全、稳定性高等显著特点，为快速检测葡萄球菌肠毒素提供一种简单实用的新方法。
Description
技术领域
本发明属于生化探测领域，涉及一种新型的葡萄球菌肠毒素探测方法，特别涉及一种利用LSPR技术的快速高灵敏度葡萄球菌肠毒素探测方法。
背景技术
快速检测并确定生物病菌的种类是各国发展检测手段的主要目的，面对多种类型的生化战剂，基于各种原理的探测方法相继问世，即便是对于同一病菌来说，也出现了多种检测方法。以B型葡萄球菌肠毒素(SEB)为例，它是金黄色葡萄球菌肠毒素系列(SEA～SEE)之一，具有极强的耐热性和抗药性，检测方法主要有酶联免疫吸附法(ELISA)、聚合酶链反应法(PCR)等。ELISA法是检测SEB最常用的方法，优点是操作简便、检测方法标准化，所需试剂易得，目前商用的ELISA试剂盒检测水平普遍为1～20ng/mL，但其主要缺点是检测时间较长(约4小时)，需用试剂较多。PCR反应检测优点是对于活体和死体均能检测，能检测多个样品，缺点是易污染，极其微量的污染即可造成假阳性的产生，导致结果的误判，此外还需使用扩增仪等专业仪器，普及化的检验工作带来困难。目前PCR分析技术检测限为检测水平小于1ng/mL左右，检测时间根据实验方法和对象在2～5小时不等，同样不能满足短时间内检测的需求。迫切需要发展一种快速高灵敏度的检测方法，该方法不仅可以应用于金葡萄球菌感染检测和食品检测中，而且在对病菌的抗药性、耐热性分析中都有重要应用。
发明内容
本发明要解决的问题是：克服现有葡萄球菌肠毒素探测需要特殊设备、探测时间长等缺点，利用LSRP(局域表面等离子体技术)及生化分子间的特异性反应，通过观察光谱移动实现葡萄球菌肠毒素快速、高灵敏度、免标记探测。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种葡萄球菌肠毒素探测方法，其特征在于包含以下步骤：
(1)制备葡萄球菌肠毒素LSPR探测芯片；
(2)对芯片金属结构表面进行活化，形成特异性生物分子膜；
(3)测试该芯片的消光谱获得结合前的基准值；
(4)然后滴上待测样品，待其充分反应后，放入LSPR传感器中进行测试，利用抗原-抗体分子间的特异性反应，观察光谱移动状况，判断待测样品中是否含有葡萄球菌肠毒素。
所述的探测芯片上可附带的探测对象为金黄色葡萄球菌肠毒素系列SEA～SEE中的一种、或多种；所述的葡萄球菌肠毒素浓度探测下限可优于1ng/ml。
所述探测芯片的通过以下步骤制备：
(a)选用探测芯片基底、清洗并作亲水处理；
(b)在基底表面通过纳米球自组装、或光刻、或纳米压印制作出纳米结构；
(c)将纳米结构金属化，获得在基底表面有纳米金属结构的探测芯片。
上述所述步骤(a)中的芯片基底的材料为玻璃、或石英、或硅、或锗。
所述探测构芯的结构可以根据探测对象的特点设计、制作成三角形、或菱形、或五角星形、或圆柱形、或双层复合结构；其中将纳米结构金属化所采用的金属材料为金、或银、或银表面复合金。
所述的探测芯片为阵列化芯片，其结构特征尺寸为30nm～1000nm；列阵数从1×1～10×10，通过点样等方式针对不同种类的葡萄球菌肠毒素活化不同子单元，实现高效、多通道并行检测。
所述步骤(2)中的活化步骤如下：首先采用亚二硫基二乙酸活化金属结构表面；然后采用乙基碳二亚胺盐酸盐EDC与羟基硫代琥铂酰亚胺NHS混合溶液活化羧基基团，使金属表面带上活性的羧基基团；最后通入抗葡萄球菌肠毒素羊单克隆抗体IgG，并且利用乙醇胺水溶液封闭多余的活性酯基团，完成整个芯片的活化过程。
所述步骤(4)中的检测环境为大气环境下，同时温度在-50℃～80℃。
所述步骤(4)中的待测物反应时间为1分钟到1小时。
所述的分析光谱移动状况是指光谱谱峰位置移动量大于10nm。
本发明与现有技术相比所具有的优点是：本方法具有不需要复杂设备、不需要使用放射性同位素、酶或荧光等做为标识物，芯片制备完成后，可长时间放置，所需的探测时间短。具有快速、高灵敏度、应用范围广、安全、稳定性高等显著特点，为快速检测葡萄球菌肠毒素提供一种简单实用的新方法。
附图说明
图1是本发明快速高灵敏度葡萄球菌肠毒素测试的流程示意图；
图2是本发明实施例1中芯片活化的测试所得的基准值；
图3是本发明实施例1中浓度为10μg/ml的SEB的检测结果示意图；
图4是本发明实施例2中浓度为0.1μg/ml的SEB的检测结果示意图；
图5是是本发明实施例3中浓度为1ng/ml的SEB的检测结果示意图；
具体实施方式
下面结合附图及具体实施方式详细介绍本发明。
本发明的葡萄球菌肠毒素探测方法，其具体探测流程图如图1所示；包含以下步骤：
(1)制备葡萄球菌肠毒素LSPR探测芯片；
(2)对芯片金属结构表面进行活化，形成特异性生物分子膜；
(3)测试该芯片的消光谱获得结合前的基准值；
(4)然后滴上待测样品，待其充分反应后，放入LSPR传感器中进行测试，利用抗原-抗体分子间的特异性反应，观察光谱移动状况，判断待测样品中是否含有葡萄球菌肠毒素。
实施例1
本实施例是采用石英材料基底上，特征尺寸为1000nm的金属银结构的探测芯片，采用本发明的葡萄球菌肠毒素探测方法实现对浓度为10μg/ml的SEB的探测。
首先采用石英材料作为芯片基底、清洗并作亲水处理；在基底表面通过光刻制作出面积约10mm×10mm，特征尺寸为1000nm，列阵数为10×10的圆柱形结构；通过镀金，将纳米结构金属化，获得在基底表面有纳米金结构的芯片。然后将2mM的亚二巯基二乙酸水溶液滴加在样片表面，反应20min；将0.4M的乙基碳二亚胺盐酸盐EDC与0.1M的羟基硫代琥铂酰亚胺NHS混合溶液滴加在探测芯片表面，活化羧基基团20min；然后用0.01M磷酸盐PBS缓冲液进行彻底冲洗，用高压氮气吹干；滴加10μg/ml的抗SEB的羊单克隆抗体IgG在基底表面，IgG通过碱性氨基酸(Arg和Lys)侧链上的氨基基团与活化的羧基反应，从而被固定在膜上；然后1M乙醇胺水溶液封闭多余的活性酯基团；最后用缓冲液清洗备用。在室温大气环境内，测试出该芯片的基准光谱峰值为608nm，滴加浓度为10μg/ml的SEB溶液200μl在芯片表面，反应20min后，用高压氮气吹干。放入LSPR传感器中进行测试，利用抗原-抗体分子间的特异性反应，在室温大气环境内，观察光谱移动状况，测试出反应后的芯片光谱峰值为582nm，如图3所示。光谱峰值移动大于10nm。
实施例2
本实施例是采用锗材料基底上，特征尺寸为500nm金银复合结构的探测芯片，采用本发明的葡萄球菌肠毒素探测方法实现对浓度为0.1μg/ml的SEB的探测。
首先采用锗材料作为芯片基底、清洗并作亲水处理；在基底表面通过纳米压印制作出面积约500μm×500μm，特征尺寸为500nm，列阵数为4×4的五角星形结构；通过镀银将纳米结构金属化，获得在基底表面有纳米银结构的芯片；然后，再结构上蒸镀一层10nm厚的金，形成双层复合结构。然后将2mM的亚二巯基二乙酸水溶液滴加在样片表面，反应20min；将0.4M的乙基碳二亚胺盐酸盐EDC与0.1M的羟基硫代琥铂酰亚胺NHS混合溶液滴加在探测芯片表面，活化羧基基团20min；然后用0.01M磷酸盐PBS缓冲液进行彻底冲洗，用高压氮气吹干；滴加10μg/ml的抗SEB的羊单克隆抗体IgG在基底表面，IgG通过碱性氨基酸(Arg和Lys)侧链上的氨基基团与活化的羧基反应，从而被固定在膜上；然后1M乙醇胺水溶液封闭多余的活性酯基团；最后用缓冲液清洗，形成特异性生物分子膜。在-10℃的大气环境下，测试芯片的基准光谱峰值为611nm，滴加浓度为0.1μg/ml的SEB溶液反应后，芯片光谱峰值为528nm，如图4所示。
实施例3
本实施例是采用硅材料基底上，特征尺寸为30nm的金结构的探测芯片，采用本发明的葡萄球菌肠毒素探测方法实现对浓度为1ng/ml的SEB的探测。
首先采用硅材料作为芯片基底、清洗并作亲水处理；在基底表面通过纳米球自组装制作出面积约20μm×20μm，特征尺寸为30nm，列阵数为1×1的四边形排布的菱形纳米结构；通过镀银将纳米结构金属化，获得在基底表面有纳米金属结构的芯片。然后将2mM的亚二巯基二乙酸水溶液滴加在样片表面，反应20min；将0.4M的乙基碳二业胺盐酸盐EDC与0.1M的羟基硫代琥铂酰亚胺NHS混合溶液滴加在探测芯片表面，活化羧基基团20min；然后用0.01M磷酸盐PBS缓冲液进行彻底冲洗，用高压氮气吹干；滴加10μg/ml的抗SEB的羊单克隆抗体IgG在基底表面，IgG通过碱性氨基酸(Arg和Lys)侧链上的氨基基团与活化的羧基反应，从而被固定在膜上；然后1M乙醇胺水溶液封闭多余的活性酯基团；最后用缓冲液清洗，形成特异性生物分子膜。经测试，芯片的基准光谱峰值为539nm。滴加浓度为1ng/ml的SEB溶液反应后，待其充分反应后，放入LSPR传感器中进行测试，利用抗原-抗体分子间的特异性反应，观察光谱移动状况，芯片光谱峰值为573nm，如图5所示。光谱峰值移动大于10nm。
实施例4
本实施例是采用玻璃基底上的阵列芯片，采用本发明的葡萄球菌肠毒素探测方法对不同类型的葡萄球菌肠毒素进行探测。
首先采用玻璃作为芯片基底、清洗并作亲水处理；通过光刻分区的方法在玻璃基底上制作出7×7多孔阵列芯片，根据探测对象的不同，每个子单元内的纳米结构可以各不相同，然后通过镀膜将结构金属化。采用5mM的亚二硫基二乙酸对金属金表面进行活化，然后将乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)(0.8M)与羟基硫代琥铂酰亚胺(NHS)(0.3M)混合溶液活化羧基基团，使金属表面带上活性的羧基基团，羧基基团可以与生物分子的活性成分发生反应，以固定生物分子。通入抗葡萄球菌肠毒素抗体，利用乙醇胺水溶液(1M)封闭多余的活性酯基团，完成整个芯片的活化过程。在大气环境下，测试芯片各列阵单元的基准值。然后通过点样的方法在不同的列阵单元中引入待测的不同类型的肠毒素。不同类型的肠毒素反应时间约在1分钟到1小时。待其充分反应后，在大气环境下，放入LSPR传感器中进行测试，利用抗原-抗体分子间的特异性反应，通过扫描的方式，测试不同子单元的光谱峰值，如果与前面测试所得的基准值相比较光谱峰值移动量大于10nm，则可以判断待测样品中的抗原与其抗体间发生特异性反应，待测样品含有相应的肠毒素成分。
Claims (10)
1、一种葡萄球菌肠毒素探测方法，其特征在于包含以下步骤：
(1)制备葡萄球菌肠毒素LSPR探测芯片；
(2)对芯片金属结构表面进行活化，形成特异性生物分子膜；
(3)测试该芯片的消光谱获得结合前的基准值；
(4)然后滴上待测样品，待其充分反应后，放入LSPR传感器中进行检测，利用抗原-抗体分子间的特异性反应，观察光谱移动状况，判断待测样品中是否含有葡萄球菌肠毒素。
2、根据权利要求1所述的一种葡萄球菌肠毒素探测方法，其特征在于：所述的探测芯片上可附带的探测对象为金黄色葡萄球菌肠毒素系列SEA～SEE中的一种、或多种；所述的葡萄球菌肠毒素浓度探测下限可优于1ng/ml。
3、根据权利要求1所述的一种葡萄球菌肠毒素探测方法，其特征在于：所述探测芯片的通过以下步骤制备：
(a)选用探测芯片基底、清洗并作亲水处理；
(b)在基底表面通过纳米球自组装、或光刻、或纳米压印制作出纳米结构；
(c)将纳米结构金属化，获得在基底表面有纳米金属结构的探测芯片。
4、根据权利要求3所述的探测芯片，其特征在于：所述步骤(a)中的芯片基底的材料为玻璃、或石英、或硅、或锗。
5、根据权利要求3所述的探测芯片，其特征在于：所述探测构芯的结构可以根据探测对象的特点设计、制作成三角形、或菱形、或五角星形、或圆柱形、或双层复合结构；其中将纳米结构金属化所采用的金属材料为金、或银、或银表面复合金。
6、根据权利要求3所述的探测芯片，其特征在于：所述的探测芯片为阵列化芯片，其结构特征尺寸为30nm～1000nm；列阵数从1×1～10×10，通过点样等方式针对不同种类的葡萄球菌肠毒素活化不同子单元，实现高效、多通道并行检测。
7、根据权利要求1所述的一种葡萄球菌肠毒素探测方法，其特征在于：所述步骤(2)中的活化步骤如下：首先采用亚二硫基二乙酸活化金属结构表面；然后采用乙基碳二亚胺盐酸盐EDC与羟基硫代琥铂酰亚胺NHS混合溶液活化羧基基团，使金属表面带上活性的羧基基团；最后通入抗葡萄球菌肠毒素羊单克隆抗体IgG，并且利用乙醇胺水溶液封闭多余的活性酯基团，完成整个芯片的活化过程。
8、根据权利要求1所述的一种葡萄球菌肠毒素探测方法，其特征在于：所述步骤(4)中的检测环境为大气环境下，同时温度在-50℃～80℃。
9、根据权利要求1所述的一种葡萄球菌肠毒素探测方法，其特征在于：所述步骤(4)中的待测物反应时间为1分钟到1小时。
10、根据权利要求1所述的一种葡萄球菌肠毒素探测方法，其特征在于：所述的分析光谱移动状况是指光谱谱峰位置移动量大于10nm。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNA2009100781927A CN101514988A (zh) | 2009-02-26 | 2009-02-26 | 一种葡萄球菌肠毒素探测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNA2009100781927A CN101514988A (zh) | 2009-02-26 | 2009-02-26 | 一种葡萄球菌肠毒素探测方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101514988A true CN101514988A (zh) | 2009-08-26 |
Family
ID=41039528
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CNA2009100781927A Pending CN101514988A (zh) | 2009-02-26 | 2009-02-26 | 一种葡萄球菌肠毒素探测方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN101514988A (zh) |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102081095A (zh) * | 2011-01-04 | 2011-06-01 | 长沙理工大学 | 用于检测含致癌基因C-myc抗原片段的质粒DNA的LSPR传感芯片 |
| CN102455356A (zh) * | 2010-10-29 | 2012-05-16 | 中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所 | 一种葡萄球菌肠毒素和伏马菌素的免疫芯片检测方法 |
| CN103792368A (zh) * | 2014-01-27 | 2014-05-14 | 暨南大学 | 一种表面等离子体共振免疫传感芯片及其制备方法与应用 |
| CN104198734A (zh) * | 2014-09-01 | 2014-12-10 | 深圳出入境检验检疫局食品检验检疫技术中心 | 一种金黄色葡萄球菌的检测方法 |
| CN104777136A (zh) * | 2015-03-25 | 2015-07-15 | 深圳市前海安测信息技术有限公司 | 基于表面等离子共振技术的生物标志物检测方法与系统 |
| CN105277710A (zh) * | 2014-07-16 | 2016-01-27 | 林宽锯 | 高灵敏度lspr生化感测套组及其应用方法 |
| WO2021093220A1 (zh) * | 2019-11-14 | 2021-05-20 | 量准（上海）医疗器械有限公司 | 一种采用金纳米孔阵列芯片的生物检测装置及检测方法 |
-
2009
- 2009-02-26 CN CNA2009100781927A patent/CN101514988A/zh active Pending
Cited By (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102455356A (zh) * | 2010-10-29 | 2012-05-16 | 中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所 | 一种葡萄球菌肠毒素和伏马菌素的免疫芯片检测方法 |
| CN102081095A (zh) * | 2011-01-04 | 2011-06-01 | 长沙理工大学 | 用于检测含致癌基因C-myc抗原片段的质粒DNA的LSPR传感芯片 |
| CN103792368A (zh) * | 2014-01-27 | 2014-05-14 | 暨南大学 | 一种表面等离子体共振免疫传感芯片及其制备方法与应用 |
| CN103792368B (zh) * | 2014-01-27 | 2015-10-07 | 暨南大学 | 一种表面等离子体共振免疫传感芯片及其制备方法与应用 |
| CN105277710A (zh) * | 2014-07-16 | 2016-01-27 | 林宽锯 | 高灵敏度lspr生化感测套组及其应用方法 |
| CN104198734A (zh) * | 2014-09-01 | 2014-12-10 | 深圳出入境检验检疫局食品检验检疫技术中心 | 一种金黄色葡萄球菌的检测方法 |
| CN104198734B (zh) * | 2014-09-01 | 2016-06-08 | 深圳出入境检验检疫局食品检验检疫技术中心 | 一种金黄色葡萄球菌的检测方法 |
| CN104777136A (zh) * | 2015-03-25 | 2015-07-15 | 深圳市前海安测信息技术有限公司 | 基于表面等离子共振技术的生物标志物检测方法与系统 |
| WO2016149982A1 (zh) * | 2015-03-25 | 2016-09-29 | 深圳市贝沃德克生物技术研究院有限公司 | 基于表面等离子共振技术的生物标志物检测方法与系统 |
| CN104777136B (zh) * | 2015-03-25 | 2018-06-19 | 深圳市贝沃德克生物技术研究院有限公司 | 基于表面等离子共振技术的生物标志物检测方法与系统 |
| WO2021093220A1 (zh) * | 2019-11-14 | 2021-05-20 | 量准（上海）医疗器械有限公司 | 一种采用金纳米孔阵列芯片的生物检测装置及检测方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN101514988A (zh) | 一种葡萄球菌肠毒素探测方法 | |
| KR100885074B1 (ko) | 미세유로형 센서 복합 구조물 | |
| EP2154522A3 (en) | Biosensor | |
| JP2011516889A5 (zh) | ||
| ATE423972T1 (de) | Vorrichtung und verfahren um gleichzeitig verschiedene antikörper und antigene nachzuweisen in klinischen, nahrungsmittel- und umwelt-proben | |
| CN107085116A (zh) | 一种检测人粪便样本中钙卫蛋白的试剂盒及其制备方法 | |
| CN101000343A (zh) | 具有改进的对照区的免疫检测件 | |
| EP2309256A3 (en) | Chromatographic measurement apparatus | |
| CN105866105A (zh) | 一种检测多种鸡细胞因子化学发光成像免疫传感器的制备及分析方法 | |
| EP1890149A3 (en) | Self-calibrated flow-through assay devices | |
| CN103575896B (zh) | 高灵敏可抛式多组分化学发光成像免疫传感器 | |
| CN107449898B (zh) | 一种卡那霉素残留荧光免疫层析试纸及其制备方法 | |
| KR102133752B1 (ko) | 측방 유동 분석 스트립 | |
| JP6203638B2 (ja) | ウェル内検量機構を印刷するための方法及びシステム | |
| JP5010374B2 (ja) | 免疫測定装置用の対照系としてのウシアルブミンｐ−アミノフェニルＮ−アセチルβ−Ｄグルコサミニドの使用 | |
| JP2013543981A5 (zh) | ||
| CN104089997B (zh) | 一种电化学免疫传感器及其制备方法和应用 | |
| CN103048471A (zh) | 一种定量检测蛋白乙酰化水平的方法 | |
| CN106323952B (zh) | 一种基于双共反应剂放大信号的电致发光免疫传感器的制备方法及应用 | |
| JP2008309783A (ja) | 抗原検出用センサーチップとその作製方法および抗原検出用センサー | |
| Xu et al. | Multiplex biomarker analysis biosensor for detection of hepatitis B virus | |
| KR20180130640A (ko) | 수용성 코팅층을 이용한 측방유동 분석에서의 신호 증폭 방법 및 이를 이용한 측방유동 분석 장치 | |
| NZ334809A (en) | Assay for the detection of antibodies against p53 | |
| CN104122398A (zh) | 一种多指标并行检测蛋白芯片检测试剂盒、制备方法及检测方法 | |
| CN107966563A (zh) | 一种抗髓过氧化物酶抗体IgG化学发光免疫测定试剂盒及其制备方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20090826 |