KR20180130640A - 수용성 코팅층을 이용한 측방유동 분석에서의 신호 증폭 방법 및 이를 이용한 측방유동 분석 장치 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 분석물(analyte)의 제 1 에피토프 또는 제 1 결합부위에 특이적으로 결합할 수 있는 제 1 항체 또는 제 1 특이적 결합물질이 표지체에 결합되어 있는 접합체와 분석물을 결합하는 단계; 상기 접합체가 결합된 분석물과 상기 분석물의 제 2 에피토프 또는 제 2 결합부위에 특이적으로 결합하는 고정화된 제 2 항체 또는 제 2 특이적 결합물질을 결합하는 단계; 및 신호 증폭 물질이 수용성 물질의 코팅층으로 코팅된 신호 증폭부에서 지연되어 전달된 신호 증폭 물질이 반응하는 단계를 포함하는, 측방유동 (Lateral flow) 분석에서의 신호 증폭 방법; 및 이러한 본 발명의 방법을 수행할 수 있도록 구성된 측방유동 (Lateral flow) 분석 장치에 관한 것이다.
Description
본 발명은 분석물을 고감도로 검출하기 위한 측방유동(Lateral flow) 방식의 분석에서의 신호 증폭 방법 및 이를 이용한 측방유동(Lateral flow) 분석 장치에 관한 것이다. 보다 자세하게, 본 발명은 샌드위치(sandwich) 분석법에 있어서 신호 증폭 물질이 후속적으로 반응하는 구조를 형성하여 신호를 효과적으로 증폭시키는 고감도 측방유동(Lateral flow) 분석에서의 신호 증폭 방법 및 이를 이용한 측방유동(Lateral flow) 분석 장치에 관한 것이다.
면역크로마토그래피 분석법은 생물학적 물질 또는 화학적 물질이 서로 특이적으로 부착하는 성질을 이용하여 분석 물질을 단시간에 정성 및 정량적으로 검사할 수 있는 방법으로, 특히 샌드위치형 면역분석법은 존재 여부 및 농도 조사의 대상이 되는 분석물의 제 1 에피토프(epitope)에 특이적으로 결합할 수 있는 제 1 항체가 고체 지지체에 고정화되고, 분석물의 제 2 에피토프에 특이적인 제 2 항체를 이용하는 것으로서 잘 알려져 있다.
이러한 분석을 위한 장치로는 분석 스트립 또는 상기 분석 스트립을 하우징 내부에 장착해 조립한 형태의 분석 장치가 일반적으로 사용된다. 이때 분석물을 포함하는 유체를 다공성 스트립 한편에 적용하면 모세관 현상에 의해 유체가 흘러가면서 분석 대상물이 표지체를 포함하는 항체 및 고정화 항체에 결합하여 분석법을 완성한다.
보다 상세하게 측방유동(Lateral flow) 장치는 일반적으로 액체 시료가 모세관 현상으로 흐를 수 있는 다공성 막인 멤브레인에 항체가 고정되어 있고, 멤브레인의 상류 측에는 샘플 패드와 접합 패드가 구비되어 있으며, 하류 측에 흡수 패드가 연결되어 있다. 상기 샘플패드는 분석물을 포함하는 액체 시료를 흡수하고 균일한 유동을 보장하며, 접합 패드에는 분석물과 선택적으로 결합할 수 있는 항체가 부착된 표지체가 건조되어 있다. 상기 멤브레인에는 분석물에 선택적으로 결합하는 고정화된 항체 및 표지체에 고정화된 항체와 결합할 수 있는 물질이 각각 다른 위치에 고정화되어 각각 탐지 부 및 컨트롤 부를 형성한다. 상기 분석물과 선택적으로 결합할 수 있는 멤브레인에 고정화된 항체와 표지체에 고정화된 항체는 분석물에 대해 샌드위치 형태로 결합될 수 있도록 구성된다. 상기 흡수패드는 액체시료를 흡수할 수 있는 물질로 구성된다. 이와 같은 면역 크로마토그래피 분석 장치에 있어서 분석물을 포함하는 액체 시료를 샘플패드에 떨어뜨리면, 분석물에 선택성을 가지는 항체-표지체와 멤브레인에 고정화된 항체가 샌드위치 형태로 결합되어 상기 항체가 고정화된 멤브레인 위치에 육안으로 확인할 수 있는 밴드를 형성하게 된다.
종래 기술로서 1차 접합체와 항원이 결합된 후 2차 접합체가 추가로 결합하고 이들이 최종적으로 멤브레인에 고정화된 항체에 결합하는 면역크로마토그래피의 신호증폭 방법이 개시되어 있으나, 종래의 면역 크로마토그래피 방법으로 측정할 수 있는 감도가 낮아 더 높은 감도를 요구하는 시료의 경우 측정하기 어려운 문제가 있다. 나아가, 한국특허출원 제2009-0047004호에서는 접합 패드 및 상기 멤브레인 중 어느 것에도 접촉되지 않도록 구성된 신호 증폭 패드를 이용하여 감도를 향상시키는 방법을 제공하고 있으나, 이 경우 사용자가 신호 증폭 패드를 멤브레인에 접촉시키기 위한 공정이 추가적으로 필요한 문제가 있다.
이에, 측방유동(Lateral flow) 분석에 있어서 제 1 항체 또는 제 1 특이적 결합물질이 표지체에 결합되어 있는 접합체와 분석물이 결합하고 이들이 고정화된 항체 또는 고정화된 특이적 결합물질과 샌드위치 반응으로 결합한 후, 추가적인 공정을 수행하지 않고서도 후속적으로 신호 증폭 물질이 반응하여 신호 증폭의 감도를 향상시키는 방법 및 이러한 방법이 적용된 측방유동(Lateral flow) 분석 장치가 개발되는 경우에는 관련 분야에서 널리 적용될 수 있을 것으로 기대된다.
이에 본 발명의 한 측면은 측방유동(Lateral flow) 분석에서의 신호 증폭 방법을 제공하는 것이다.
이에 본 발명의 또 다른 측면은 상기 신호 증폭 방법을 이용하여 감도가 향상된 측방유동(Lateral flow) 분석 장치를 제공하는 것이다.
본 발명의 일 견지에 의하면, 분석물(analyte)의 제 1 에피토프 또는 제 1 결합부위에 특이적으로 결합할 수 있는 제 1 항체 또는 제 1 특이적 결합물질이 표지체에 결합되어 있는 접합체와 분석물을 결합하는 단계; 상기 접합체가 결합된 분석물과 상기 분석물의 제 2 에피토프 또는 제 2 결합부위에 특이적으로 결합하는 고정화된 제 2 항체 또는 제 2 특이적 결합물질을 결합하는 단계; 및 신호 증폭 물질이 수용성 물질의 코팅층으로 코팅된 신호 증폭부에서 지연되어 전달된 신호 증폭 물질이 반응하는 단계를 포함하는, 측방유동 (Lateral flow) 분석에서의 신호 증폭 방법.
이 제공된다.
본 발명의 다른 견지에 의하면, 분석물(analyte)의 제 1 에피토프 또는 제 1 결합부위에 특이적으로 결합할 수 있는 제 1 항체 또는 제 1 특이적 결합물질이 표지체에 결합되어 있는 접합체를 포함하는 접합 패드; 상기 접합 패드에 접촉하며, 상기 접합체가 결합된 분석물의 제 2 에피토프 또는 제 2 결합부위에 특이적으로 결합하는 제 2 항체 또는 제 2 특이적 결합물질이 고정화 된 탐지부(detection site)를 포함하는 멤브레인; 및 상기 멤브레인의 탐지부의 상류에 형성된 신호 증폭부를 포함하며, 상기 신호 증폭부는 신호 증폭 물질이 수용성 물질의 코팅층으로 코팅된 지연 전달 신호 증폭부인, 측방유동 (Lateral flow) 분석 장치가 제공된다.
본 발명에 의하면 표지체가 시료 내 분석물과 결합하여 다공성 막 멤브레인에 고정된 후 신호 증폭 물질이 후속적으로 지연 전달됨으로써 감도가 향상된 단일 단계 분석 키트가 제공된다. 또한, 본 발명에 의하면 적용될 수 있는 신호 증폭 물질의 제한이 없으며, 신호 증폭을 위한 추가의 작업이 요구되지 않고, 특히 담지 방식을 이용하여 제조하는 경우 신호증폭물질과 수용성 물질의 양을 독립적이고 균질하게 조절할 수 있다.
도 1은 본 발명의 방법에 의해 신호 증폭이 일어나는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 2는 본 발명의 면역 크로마토그래피 장치의 각 구성을 도식적으로 나타낸 모식도이며, (10)은 시료 패드, (11)는 접합 패드, (12)는 멤브레인(다공성 막), (13)는 탐지부(검출 띠), (14)는 컨트롤부(대조군 띠), (15)는 흡수 패드, 그리고 (16) 및 (17)은 지연 전달 신호 증폭부를 나타내는 것으로, (16)은 금 전구체 지연전달막, 그리고 (17)은 환원제 지연전달막을 나타낸다.
도 3은 수용성 물질을 이용한 지연전달막의 제작과정 및 이를 측방 유동 분석 키트에 도입하는 방법을 도식적으로 나타낸 것이다.
도 4는 폴리에틸렌옥사이드 코팅 전(A) 후(B)의 나이트로셀룰로오스 다공성 막의 주사전자현미경 사진을 나타낸 것이다.
도 5는 지연전달막 없이 금 이온의 환원에 따른 신호 증폭 트로포닌 아이 단백질을 검출하는 상용 측방유동 분석 키트의 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 지연전달막을 이용하여 신호 증폭를 증폭한 트로포닌 아이 단백질을 검출하는 상용 측방유동 분석 키트의 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 면역 크로마토그래피 장치의 각 구성을 도식적으로 나타낸 모식도이며, (10)은 시료 패드, (11)는 접합 패드, (12)는 멤브레인(다공성 막), (13)는 탐지부(검출 띠), (14)는 컨트롤부(대조군 띠), (15)는 흡수 패드, 그리고 (16) 및 (17)은 지연 전달 신호 증폭부를 나타내는 것으로, (16)은 금 전구체 지연전달막, 그리고 (17)은 환원제 지연전달막을 나타낸다.
도 3은 수용성 물질을 이용한 지연전달막의 제작과정 및 이를 측방 유동 분석 키트에 도입하는 방법을 도식적으로 나타낸 것이다.
도 4는 폴리에틸렌옥사이드 코팅 전(A) 후(B)의 나이트로셀룰로오스 다공성 막의 주사전자현미경 사진을 나타낸 것이다.
도 5는 지연전달막 없이 금 이온의 환원에 따른 신호 증폭 트로포닌 아이 단백질을 검출하는 상용 측방유동 분석 키트의 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 지연전달막을 이용하여 신호 증폭를 증폭한 트로포닌 아이 단백질을 검출하는 상용 측방유동 분석 키트의 결과를 나타낸 것이다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시 형태를 설명한다. 그러나, 본 발명의 실시 형태는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 이하 설명하는 실시 형태로 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 신호증폭 방법은 측방유동(Lateral flow)에서 제 1항체 또는 제 1 특이적 결합물질, 및 표지체로 구성된 접합체가 분석물과 결합한 후 고정된 포획항체인 제 2항체 또는 고정된 제 2 특이적 결합물질에 결합되며, 후속적으로 신호 증폭 물질이 첨가되어 반응함으로써 표지체를 시드(seed)로 하여 표지체 주위에 신호 증폭 물질이 색과 같은 강한 표지 반응을 나타냄으로써 신호를 증폭시키는 방법이다.
특히, 본 발명에 있어서, 상기 신호 증폭 물질은 수용성 물질의 코팅층으로 코팅되어 신호 증폭부로 형성되어 상기 수용성 물질이 분석물을 포함하는 액체 시료, 특히 혈액 등과 같이 물을 기반으로 하는 액체 시료에 용해되어, 용해가 이루어지는 시간 동안 지연되어 전달되도록 형성된 것으로, 이와 같은 지연된 신호 증폭 물질이 신호 증폭부에서 후속적으로 반응하게 된다.
본 발명에 있어서 상기 "신호 증폭 물질"은 그 자체로 신호를 증폭시킬 수 있는 물질뿐만 아니라 그 자체로 신호를 내지는 못하지만 다른 물질과 반응하여 최종적으로 증폭 신호를 발생할 수 있는 물질을 모두 포함하는 것을 의미하는 것이다. 예를 들어, 발광 신호를 만들 수 있는 루미놀(Luminol)은 그 자체로 신호를 내지는 못하지만 H2O2가 지연전달되면 후속 반응을 통해 발광 신호를 만들 수 있으므로, 본 발명의 신호 증폭 물질에 포함되는 것이다.
보다 상세하게 본 발명의 측방유동 (Lateral flow) 분석에서의 신호 증폭 방법은 분석물(analyte)의 제 1 에피토프 또는 제 1 결합부위에 특이적으로 결합할 수 있는 제 1 항체 또는 제 1 특이적 결합물질이 표지체에 결합되어 있는 접합체와 분석물을 결합하는 단계; 상기 접합체가 결합된 분석물과 상기 분석물의 제 2 에피토프 또는 제 2 결합부위에 특이적으로 결합하는 고정화된 제 2 항체 또는 제 2 특이적 결합물질을 결합하는 단계; 및 신호 증폭 물질이 수용성 물질의 코팅층으로 코팅된 신호 증폭부에서 지연되어 전달된 신호 증폭 물질이 반응하는 단계를 포함하는 것이다.
본 발명의 신호증폭 방법은 측방유동(Lateral flow) 방식의 분석법에 적용될 수 있는 것으로, 상기 측방유동(Lateral flow) 방식은 수직유동(vertical flow)이나 통과유동(flow though) 방식을 포함한다. 상기 수직유동 방식의 경우, 시료는 병렬로 배치된 다공성 막 등에 수직으로 쌓인다.
한편, 상기 측방유동방식은 항체-항원 반응에 국한되지 않는 것으로, 본 명세서에서 언급되는 '결합부위(리간드)'는 다양한 분석물에 있어서 단백질 리간드 (Ligand), 핵산(DNA 또는 RNA) 분자 서열의 결합부위 등을 포함하고, '특이적 결합물질'은 상기 결합부위에 선택적, 특이적으로 결합할 수 있는 단백질, 바이러스 파아지, 핵산분자 앱타머(Aptamer), 합텐(hapten;DNP) 등을 포함하는 생체분자를 모두 포함하는 것으로, 나아가 상기 기재 사항에 특히 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 언급되는 '접합체'는 제 1 항체 또는 제 1 특이적 결합물질, 및 표지체로 이루어진 것을 의미하며, 상기 접합체는 분석물과 결합 후 스트립을 흐르다가 포획 제 2 항체 또는 제 2 특이적 결합물질에 고정된다.
본 발명에 의한 측방유동(Lateral flow) 분석에서의 신호 증폭 방법의 기작을 첨부된 도 1을 참고하면서 보다 상세히 살펴보면 도 1은 측방유동(Lateral flow) 분석에 있어서 항원-항체 반응을 이용한 경우를 예시적으로 나타낸 것이다.
본원발명에 있어서 신호 증폭 반응이 일어나는 과정을 반응물의 이동을 포함하여 전체적으로 살펴보면, 도 1에 도시된 바와 같이 분석물(analyte)의 제 1 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 제 1항체(1)가 표지체(2)에 결합되어 있는, 접합체(3)이 분석물(4)과 결합하고, 상기 접합체와 결합된 분석물이 스트립을 따라 흐르다가 상기 분석물의 제 2 에피토프에 특이적으로 결합하는 고정화된 제 2 항체(5)에 결합하며, 이러한 샌드위치 결합에 후속적으로 코팅층을 이루는 수용성 물질이 녹아 그 내부의 신호 증폭 물질이 상기 표지체(2)를 시드(seed)로 하여 부착됨에 따라 측방유동(Lateral flow) 분석에서의 신호가 증폭되도록 한다.
본 발명에 사용될 수 있는 상기 표지체는 제1 항체와 특이적으로 결합할 수 있고, 이후 신호 증폭 물질과 결합하여 신호를 증폭시킬 수 있는 것이라면 특히 제한되는 것은 아니며, 예를 들면 금나노 입자, 백금나노 입자, 형광 분자, 발광 분자 및 양자점으로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다.
한편, 본 발명에 사용될 수 있는 상기 신호 증폭 물질은 상기 표지체에 특이적으로 결합하여 신호를 증폭시킬 수 있는 것이라면 특히 제한되는 것은 아니며, 예를 들어 사염화금산, 하이드록실아민, 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 및 과산화수소로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있고, 나아가 별도로 코팅되어 이후 접촉하여 배치되는 2종 이상의 물질일 수 있다.
상기 신호 증폭 물질은 1~100 mM 농도로 포함되는 것이 바람직하며, 1mM 농도 미만에서는 신호의 증폭이 원활하게 일어나지 않고, 100mM를 초과하는 너무 높은 농도에서는 측방유동분석의 신호대잡음비를 높이는 문제가 있다. 다만, 상기 신호증폭물질의 적절한 농도는 신호 증폭 반응과 반응 물질의 종류, 그리고 용매의 종류에 따라 달라질 수 있으며, 적절한 농도 범위는 신호증폭물질의 반응성과 용매의 종류에 따라 조절될 수 있다.
상기 수용성 물질의 코팅층은 상기 수용성 물질의 코팅층은 분석물을 포함하는 액체 시료와 접촉하는 경우 녹아서 내부의 신호 증폭 물질이 표지체에 특이적으로 결합하게 하는 것이므로, 수용액과 반응하는 경우 용해되는 재질이라면 특히 제한되는 것은 아니나, 예를 들어 폴리에틸렌 옥사이드, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리비닐 알코올 및 폴리젖산으로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다.
예를 들어 상기 신호 증폭 물질은 단일 물질이거나 또는 2 이상의 물질이 서로 반응하여 신호 증폭을 유도하는 복수의 물질의 조합일 수 있으며, 상기 신호 증폭 물질이 2 이상의 물질이 서로 반응하여 신호 증폭을 유도하는 복수의 물질의 조합인 겨우, 상기 2 이상의 물질은 각각 수용성 물질의 코팅층으로 코팅되는 것일 수 있다.
본 발명의 수용성 물질의 코팅층 형성을 위한 코팅 조성물은 수용액과 접촉 시 녹는 특성을 갖는 한편, 그 외 신호 증폭 물질 등과 같은 다른 물질에 영향을 주지 않는 용매를 사용하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 사염화금산 및 히드록실아민을 각각 담지한 나이트로셀룰로오스 멤브레인의 경우 클로로포름을 용매로 사용하여 폴리에킬렌 옥사이트 코팅 조성물을 제조할 수 있다.
한편, 이때 상기 코팅 조성물은 실제 코팅을 수행하는 물질이 전체 코팅 조성물의중량을 기준으로 0.1 중량% 초과 15 중량% 이내로 포함되는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 0.5 중량% 초과 10 중량% 이내로 포함되는 것이다. 상기 코팅 조성물에 있어서 실제 코팅을 수행하는 물질이 15 중량%을 초과하는 경우에는 다공성 막의 기공을 모두 채워 측방유동분석 시 용액의 확산을 저해하여 코팅물질이 적절히 녹지 않아 신호증폭물질의 방출에 문제가 있고, 0.1 중량% 미만인 경우 신호증폭물질의 지연전달이 이루어지지 않는 문제가 있다. 다만, 상기 수용성 물질 코팅 조성물의 적절한 농도는 수용성 물질의 종류와 몰질량, 그리고 용매의 종류에 따라 달라질 수 있으며, 신호증폭물질 양과 수용성 고분자의 양은 서로 영향을 주지 않는다.
본 발명의 방법에 의해 검출될 수 있는 분석물은 면역학적 반응, 즉 항원항체 반응에 의해 제 1항체 및 제 2항체와 결합하고 샌드위치형 면역 복합체를 형성할 수 있는 것이면 특히 제한되지 아니하며, 예를 들어 단백질 또는 DNA, 환경호르몬 등을 포함하는 환경 오염 물질, 바이러스 등에 대해 적용할 수 있다.
본 발명에 있어서 항원 및 항체는 항원-항체 반응에 의해 분석물과 특이적으로 결합할 수 있는 물질이라면 특별히 제한되지 아니하며, 분석물이 항체인 경우에는 이와 특이적으로 결합하는 물질을 항원으로 할 수 있다. 상기 항원 및 항체는 분석물에 따라 공지의 항원 및 항체를 채용할 수 있다. 나아가, 분석물을 '결합부위(리간드)'로 인식하여 선택적으로 결합하는 '특이적 결합물질'의 반응도 넓은 의미에서 항원-항체 반응에 포함되는 것으로 본다.
한편, 본 발명의 측방유동(Lateral flow) 분석 장치는 분석물(analyte)의 제 1 에피토프 또는 제 1 결합부위에 특이적으로 결합할 수 있는 제 1 항체 또는 제 1 특이적 결합물질이 표지체에 결합되어 있는 접합체를 포함하는 접합 패드; 상기 접합 패드에 접촉하며, 상기 접합체가 결합된 분석물의 제 2 에피토프 또는 제 2 결합부위에 특이적으로 결합하는 제 2 항체 또는 제 2 특이적 결합물질이 고정화 된 탐지부(detection site)를 포함하는 멤브레인; 및 상기 멤브레인의 탐지부의 상류에 형성된 신호 증폭부를 포함하며, 상기 신호 증폭부는 신호 증폭 물질이 수용성 물질의 코팅층으로 코팅된 지연 전달 신호 증폭부인 것이다.
도 2는 본 발명의 측방유동(Lateral flow) 분석 장치 내 각각의 구성의 예시적인 구조를 개략적으로 나타낸 모식도이며, (10)은 샘플 패드, (11)는 접합 패드, (12)은 멤브레인, (13)는 탐지부, (14)는 컨트롤부, (15)은 흡수 패드, 그리고 (16) 및 (17)은 지연 전달 신호 증폭부를 나타낸다.
보다 상세하게 상기 도 2는 지연 전달 신호 증폭부가 제 1 지연 전달 신호 증폭부 (16) 및 제2 지연 전달 신호 증폭부 (17)로 이루어진 경우를 예시하는 것으로, 제 1 지연 전달 신호 증폭부는 금 전구체가 수용성 물질의 코팅층으로 코팅된 것이며, 제 2지연 전달 신호 증폭부는 환원제가 수용성 물질의 코팅층으로 코팅된 것으로, 제 1 지연 전달 신호 증폭부 및 제2 지연 전달 신호 증폭부는 다공성막 위에 병렬적으로 나열된 상태인 것이다.
본 발명의 측방유동(Lateral flow) 분석 장치의 제조에 사용될 수 있는 패드는 다공질 재료로서 천연 또는 합성의 재료로서 특히 제한되지 않는다. 바람직하게는 니트로셀룰로오스를 사용한다.
상기 샘플 패드(sample pad)는 분석물을 포함하는 액체 시료가 처음 흡수되는 부분으로, 멤브레인의 한쪽 끝단을 그대로 사용하거나 별도의 부재로 구성될 수 있고 분석물을 포함하는 시료를 흡수하여 모세관 현상에 의해 분석물을 접합패드로 이동시킨다.
상기 접합패드(conjugate pad)는 접합체가 건조된 상태로 존재하다가 분석물을 포함하는 액체 시료가 흡수되는 경우 유동성을 획득하여 멤브레인(membrane)으로 이동한다. 상기 접합패드는 유리섬유, 셀룰로즈 등과 같은 재질로 이루어질 수 있다.
상기 지연 전달 신호 증폭부는 수용성 도 2에 도시된 바와 같이 멤브레인 상에, 상기 접합 패드와 상기 멤브레인의 탐지부 사이 영역에 형성되는 것이 바람직하다. 이와 같은 구조에 의하여 본 발명에 의하면, 시료 패드에 시료를 적용한 후 추가적인 작업의 수행 없이 증폭된 신호를 획득할 수 있다.
한편, 상기 신호 증폭부는 단일의 부이거나, 도 2와 같이 2 이상의 물질이 서로 반응하여 신호 증폭을 유도하는 복수의 물질이 각각 포함된 2 이상의 부가 접촉되어 배치될 수 있으며, 이때 상기 2 이상의 부는 병렬적으로 접촉하여 배치되거나, 적층될 수 있다.
수용성 물질로 이루어진 코팅층을 포함하는 신호 증폭부는 분석물을 포함하는 액체 시료가 흡수패드에 흡수되어 제 1항체 및 표지체로 구성된 접합체가 항원과 결합하여 고정된 포획항체인 제 2항체에 샌드위치 반응으로 결합된 후, 코팅층이 액체 시료에 의해 용해되어 후속적으로 표지체를 시드(seed)로 하여 표지체 주위에 결합하여 신호를 증폭시킨다.
상기 코팅층은 코팅 조성물에 의해 형성되며, 상기 코팅 조성물은 실제 코팅을 수행하는 물질이 전체 코팅 조성물의중량을 기준으로 0.1 내지 15 중량%로 포함되는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 0.5 내지 10 중량%로 포함되는 것이다.
상기 코팅 조성물에 있어서 실제 코팅을 수행하는 물질이 0.1 중량% 미만인 경우에는 신호증폭물질의 지연전달이 구현되지 않는 문제가 있고, 15 중량%을 초과하는 경우에는 수용성 물질이 다공성막의 기공을 채워 액체의 확산을 막아 신호증폭물질이 전달이 잘 일어나지 않는 문제가 있다.
상기 코팅 조성물을 이용한 코팅층의 제조 방법은 특히 제한되는 것은 아니나, 예를 들어 멤브레인에 신호증폭물질을 적가한 후 건조하는 단계; 건조된 신호증폭물질 상에 코팅 조성물을 적가한 후 건조하는 단계를 통해 제조되어 신호 증폭부를 형성할 수 있다.
한편, 상기 신호증폭부가 2 이상인 경우에는 2 이상의 멤브레인 조각 상에 상술한 바와 같이 신호증폭물질 및 코팅층을 각각 형성한 후 이들을 멤브레인 상에 배치할 수 있다.
상기와 같이 제조된 신호증폭부는 신호증폭물질 및 코팅 조성물이 형성된 면이 멤브레인과 접하도록 배치되는 것이 바람직하다.
상기 멤브레인에 신호증폭물질을 적가한 후 건조하는 단계 및 건조된 신호증폭물질 상에 코팅 조성물을 적가한 후 건조하는 단계는 진공펌프를 이용한 상온감압 건조, 상온상압 건조 등의 건조 방식에 의해 수행될 수 있으며, 이때 건조 온도 및 감압 여부는 코팅 조성물의 용매의 휘발성에 따라 적절한 범위에서 이루어지는 것이 바람직하며, 신호증폭물질의 반응성을 고려하여 결정할 수 있다.
예를 들어 물을 용매로 사염화금산을 적가할 때 건조 온도는 사염화금산의 나이트로셀룰로오스 및 수분과의 반응성을 고려하여 50 oC 미만인 것이 바람직하며 해당 온도에서 건조하기 위해 진공펌프에서 감압하는 것이 바람직하다. 휘발성이 강한 클로로폼을 용매로 하여 폴리에틸렌옥사이드를 적가하는 경우에는 상온상압에서 충분히 건조가 가능하다.
본 발명에 있어서 멤브레인(membrane)은 액체 시료의 유동성을 확보할 수 있는 재질이라면 특히 제한되지 아니하며, 다공성 막으로 이루어지는 것이 바람직하다. 보다 상세하게, 항체 또는 특이적 결합물질, 및 효소 단백질을 고정화하고 비특이적 반응을 최소화하는 니트로셀룰로스, 셀룰로스, PVDF(Poly-vinylidene fluoride), PET(poly(ethylene terephthalate)), PES(polyethersulfone), 유리섬유, 나일론 등과 같이 일정한 미세 구멍(Micropore) 크기의 조절이 가능한 소수성 다공성 막을 사용할 수 있다.
상기 멤브레인은 접합체가 결합된 분석물의 제 2 부위에 특이적으로 결합하는 제 2 항체 또는 제 2 특이적 결합물질이 고정화 되어 있는 탐지부(detection site) 및 이에 대한 대조군으로서 오류로 인한 반응 유무를 파악하기 위한 컨트롤부(control site)를 포함한다. 탐지부는 테스트 결과의 판독을 위해 결과를 보여주는 부분이다. 컨트롤부는 금나노입자 접합체와 포획 항체 또는 고정된 제 2 특이적 결합물질의 오류를 확인하기 위해 구성되며 이동성을 가진 물질들이 탐지부/컨트롤부까지 오류 없이 반응이 제대로 진행되었는지 여부를 확인하기 위한 것이다.
흡수 패드(absorbing pad)는 모세관 현상에 의해 반응 후 남은 잔여물을 충분히 흡수할 수 있는 것이면 특히 제한되지 않으며, 예를 들어 셀룰로오스, 무명. 친수다공성 폴리머 등을 사용할 수 있다.
이하, 구체적인 실시예를 통해 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 예시에 불과하며, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예
1. 시약 및 장비
클로로폼(Chloroform), 사염화금산(Gold(III) chloride, HAuCl4), 하이드록실아민(NH2OH), 인간 혈청(Human Serum), 폴리에틸렌옥사이드(Poly(ethylene oxide), Mv 900,000)은 시그마-알드리치 社에서 구매하였다. 다공성막인 나이트로셀룰로오스(Nitrocellulose) 멤브레인은 밀리포어 社에서 구매하였다. 시험용 검출체인 트로포닌 아이 단백질(TnI protein)은 보레다바이오텍 社에서 구매하였다. 상용 측방유동 분석 키트는 나노엔텍 사 TnI Rapid Card 제품으로 신양화학 社에서 구매하였다.
2.
신호증폭부의
제조
신호증폭물질 상에 수용성 물질을 코팅하여 지연 전달에 의한 신호증폭부를 제조하기 위해서 나이트로셀룰로오스 멤브레인을 1 mm X 4 mm 크기로 자른다.
도 3과 같이 자른 나이트로셀룰로오스 멤브레인에 사염화금산 2.5 밀리몰 농도 수용액 2 마이크로리터와 하이드록실아민 5 밀리몰농도 수용액 2 마이크로리터를 각각 떨어뜨린 후 데시케이터에 넣고 진공펌프를 이용해 두 시간 동안 25 oC 온도에서 건조한다.
이와 같은 금 전구체와 환원제가 각각 담지된 나이트로셀룰로오스 멤브레인에 1 중량퍼센트 폴리에틸렌 옥사이드/클로로폼 용액을 2 마이크로리터 떨어뜨리고 3분 동안 25 oC 온도에서 건조한다.
이렇게 획득된 두 나이트로셀룰로오스를 나란히 측방유동분석 키트 멤브레인의 검출 띠(탐지부)와 접합패드 사이 다공성 막 위에 뒤집어 올려 배치한다.
본 실험에서 클로로폼을 코팅 용매로 사용한 이유는 나이트로셀룰로오스, 사염화금산, 하이드록실아민을 녹이지 않고 폴리에틸렌 옥사이드만을 녹이기 때문이며, 이를 통해서 폴리에틸렌 옥사이드 코팅 시 담지된 사염화금산이나 하이드록실아민이 녹아나오지 않고 코팅할 수 있다. 이와 같이 신호증폭물질, 다공성 막, 수용성 코팅물질와의 용해도를 고려하여 용매를 선택함으로써 본 발명에 사용되는 신호증폭부를 제조할 수 있다.
3.
측방유동
분석
키트의
신호 증폭 효과 확인
트로포닌 아이 용액을 인간 혈청 속에 0.01, 0.1, 1, 10 나노그람 퍼 밀리리터의 농도로 준비한다. 이때 인간 혈청은 0 나노그람 퍼 밀리리터의 농도로 음성대조군이다. 별도의 처리를 하지 않은 측방유동 분석 키트와 상기 2.에서 획득된 신호증폭부가 도 2 및 도 3과 같이 조립된 측방유동 분석 키트의 시료 주입부에 준비한 시료들을 각각 120 마이크로리터를 떨어뜨리고 20분 기다린다.
그 결과 도 5 및 도 6에서 확인할 수 있는 바와 같이 본 발명의 신호 증폭부 구비 여부에 따라 육안으로 식별 가능한 측방유동 분석 키트의 검출한계가 10 나노그람 퍼 밀리리터에서 0.1 나노그람 퍼 밀리리터로 백 배 이상 향상된 것을 확인할 수 있었다.
이상에서 본 발명의 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고, 청구범위에 기재된 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능하다는 것은 당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게는 자명할 것이다.
1 : 제 1항체 2 : 표지체
3 : 접합체 4 : 분석물
5 : 제 2 항체
10 : 시료 패드 11 : 접합 패드
12 : 멤브레인 13 : 탐지부
14 : 컨트롤부 15 : 흡수 패드
16 : 지연 전달 제1 신호 증폭부
17 : 지연 전달 제2 신호 증폭부
3 : 접합체 4 : 분석물
5 : 제 2 항체
10 : 시료 패드 11 : 접합 패드
12 : 멤브레인 13 : 탐지부
14 : 컨트롤부 15 : 흡수 패드
16 : 지연 전달 제1 신호 증폭부
17 : 지연 전달 제2 신호 증폭부
Claims (14)
- 분석물(analyte)의 제 1 에피토프 또는 제 1 결합부위에 특이적으로 결합할 수 있는 제 1 항체 또는 제 1 특이적 결합물질이 표지체에 결합되어 있는 접합체와 분석물을 결합하는 단계;
상기 접합체가 결합된 분석물과 상기 분석물의 제 2 에피토프 또는 제 2 결합부위에 특이적으로 결합하는 고정화된 제 2 항체 또는 제 2 특이적 결합물질을 결합하는 단계; 및
신호 증폭 물질이 수용성 물질의 코팅층으로 코팅된 신호 증폭부에서 지연되어 전달된 신호 증폭 물질이 반응하는 단계
를 포함하는, 측방유동 (Lateral flow) 분석에서의 신호 증폭 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 결합부위는 단백질 리간드(Ligand), DNA 서열 및 RNA 서열로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 1 이상이며, 상기 특이적 결합물질은 상기 결합부위에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질, 바이러스 파아지, 핵산분자 앱타머(Aptamer) 및 합텐(hapten;DNP)으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 1 이상인 것을 특징으로 하는, 측방유동 (Lateral flow) 분석에서의 신호 증폭 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 신호 증폭 물질은 상기 표지체에 특이적으로 결합하는, 측방유동 (Lateral flow) 분석에서의 신호 증폭 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 분석물은 DNA, 환경호르몬, 항원 단백질로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 측방유동 (Lateral flow) 분석에서의 신호 증폭 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 수용성 물질의 코팅층은 분석물을 포함하는 액체 시료와 접촉하는 경우 녹아서 내부의 신호 증폭 물질이 표지체에 특이적으로 결합하는, 측방유동 (Lateral flow) 분석에서의 신호 증폭 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 신호 증폭 물질은 단일 물질이거나 또는 2 이상의 물질이 서로 반응하여 신호 증폭을 유도하는 복수의 물질의 조합인, 측방유동 (Lateral flow) 분석에서의 신호 증폭 방법.
- 제6항에 있어서, 상기 신호 증폭 물질이 2 이상의 물질이 서로 반응하여 신호 증폭을 유도하는 복수의 물질의 조합인 겨우, 상기 2 이상의 물질은 각각 수용성 물질의 코팅층으로 코팅되는, 측방유동 (Lateral flow) 분석에서의 신호 증폭 방법.
- 분석물(analyte)의 제 1 에피토프 또는 제 1 결합부위에 특이적으로 결합할 수 있는 제 1 항체 또는 제 1 특이적 결합물질이 표지체에 결합되어 있는 접합체를 포함하는 접합 패드;
상기 접합 패드에 접촉하며, 상기 접합체가 결합된 분석물의 제 2 에피토프 또는 제 2 결합부위에 특이적으로 결합하는 제 2 항체 또는 제 2 특이적 결합물질이 고정화 된 탐지부(detection site)를 포함하는 멤브레인; 및
상기 멤브레인의 탐지부의 상류에 형성된 신호 증폭부를 포함하며,
상기 신호 증폭부는 신호 증폭 물질이 수용성 물질의 코팅층으로 코팅된 지연 전달 신호 증폭부인, 측방유동 (Lateral flow) 분석 장치.
- 제8항에 있어서, 상기 신호 증폭부는 멤브레인 상에, 상기 접합 패드와 상기 멤브레인의 탐지부 사이 영역에 형성된, 측방유동 (Lateral flow) 분석 장치.
- 제8항에 있어서, 상기 신호 증폭부는 단일의 부이거나, 2 이상의 물질이 서로 반응하여 신호 증폭을 유도하는 복수의 물질이 각각 포함된 2 이상의 부가 접촉되어 배치된, 측방유동(Lateral flow) 분석 장치.
- 제10항에 있어서, 상기 2 이상의 부는 병렬적으로 접촉하여 배치되거나, 적층되는, 측방유동 (Lateral flow) 분석 장치.
- 제8항에 있어서, 상기 분석물은 DNA, 환경호르몬, 항원 단백질로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 측방유동(Lateral flow) 분석 장치.
- 제8항에 있어서, 분석물을 포함하는 액체 시료가 가해지는 샘플 패드를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 측방유동 (Lateral flow) 분석 장치.
- 제8항에 있어서, 상기 멤브레인의 하류에 설치되어 액체 시료를 모세관 현상에 의해 흡수할 수 있는 흡수 패드를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 측방유동 (Lateral flow) 분석 장치.
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