JP2021042983A - 粒状物質をイムノクロマトグラフィー法によって検出する方法及びそのためのキット - Google Patents
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Abstract
Description
〔1〕互いに同じであっても異なってもよい第一の結合対象物質及び第二の結合対象物質を含む結合対象物質を表面上に複数備える粒状物質をイムノクロマトグラフィー法によって検出する方法であって、
(1)前記粒状物質を含む試料と、前記第一の結合対象物質に対する第一の特異的結合物質とを、メンブレン上で接触させ、前記粒状物質を前記第一の特異的結合物質により捕捉する工程、
(2)捕捉された前記粒状物質と、前記第二の結合対象物質に対する第二の特異的結合物質とを接触させ、前記粒状物質を標識する工程、及び、
(3)標識された前記粒状物質を検出する工程
を含み、前記第一の特異的結合物質が、前記メンブレン上に固定されており、前記第二の特異的結合物質が、標識物質に結合していることを特徴とする、方法。
〔2〕前記粒状物質が、細胞外小胞である、前記〔1〕に記載の方法。
〔3〕前記標識物質が、金属ナノ粒子、化学発光物質、又は、蛍光物質である、前記〔1〕又は〔2〕に記載の方法。
〔4〕前記金属ナノ粒子が、異方性金属ナノ粒子である、前記〔3〕に記載の方法。
〔5〕前記異方性金属ナノ粒子が、青色又は黒色であり、かつ前記試料が、血液を含む、前記〔4〕に記載の方法。
〔6〕前記試料に界面活性剤を添加する工程をさらに含む、前記〔1〕〜〔5〕のいずれか一項に記載の方法。
〔7〕前記第一の結合対象物質が、前記第二の結合対象物質と同じである、前記〔1〕〜〔6〕のいずれか一項に記載の方法。
〔8〕前記第一の結合対象物質における前記第一の特異的結合物質の結合部位が、前記第二の結合対象物質における前記第二の特異的結合物質の結合部位と同じである、前記〔7〕に記載の方法。
〔9〕前記検出工程が、前記粒状物質を定量する工程を含む、前記〔1〕〜〔8〕のいずれか一項に記載の方法。
〔10〕前記定量工程が、質量分析装置、イムノクロマトリーダー、又は、画像解析装置で標識シグナルを測定する工程を含む、前記〔9〕に記載の方法。
〔11〕前記質量分析装置のイオン化方法が、誘導結合プラズマ(ICP)又はマトリックス支援レーザー脱離イオン化法(MALDI)である、前記〔10〕に記載の方法。
〔12〕前記〔1〕〜〔11〕のいずれか一項に記載の方法に使用するための、イムノクロマトグラフィー用テストストリップ。
〔13〕互いに同じであっても異なってもよい第一の結合対象物質及び第二の結合対象物質を含む結合対象物質を表面上に複数備える粒状物質を、前記〔1〕〜〔11〕のいずれか一項に記載の方法により検出するためのキットであって、
メンブレンを含むテストストリップと、
前記第一の結合対象物質に対する第一の特異的結合物質と、
前記第二の結合対象物質に対する第二の特異的結合物質と
を含み、前記第一の特異的結合物質が、前記メンブレン上に固定されており、前記第二の特異的結合物質が、標識物質に結合していることを特徴とする、キット。
〔14〕互いに同じであっても異なってもよい第一の結合対象物質及び第二の結合対象物質を含む結合対象物質を表面上に複数備える粒状物質を検出するためのイムノクロマトグラフィー用テストストリップであって、
前記第一の結合対象物質に対する第一の特異的結合物質が固定された検出部位を備えるメンブレンと、
試料流動方向について前記検出部位の上流側の位置で前記メンブレンと接する第一のサンプルパッドと
を含み、
前記第一のサンプルパッドから前記検出部位に至る途中にコンジュゲートパッドが含まれていないことを特徴とする、テストストリップ。
〔15〕前記試料流動方向について前記第一のサンプルパッドのさらに上流側の位置で前記メンブレンと接する第二のサンプルパッドをさらに含み、前記第二のサンプルパッドが、前記第一のサンプルパッドから離間している、前記〔14〕に記載のテストストリップ。
〔16〕前記第二のサンプルパッドが、前記第二の結合対象物質に対する第二の特異的結合物質を含むコンジュゲートパッドを含み、前記第二の特異的結合物質が、標識物質に結合している、前記〔15〕に記載のテストストリップ。
〔17〕前記第一のサンプルパッド及び前記第二のサンプルパッドが、第一のスペーサーを介して互いから離間している、前記〔15〕又は〔16〕に記載のテストストリップ。
〔18〕前記メンブレンが、前記第一のサンプルパッド側から前記第二のサンプルパッド側への前記粒状物質を含む試料の浸透を阻害するように構成されている、前記〔15〕〜〔17〕のいずれか一項に記載のテストストリップ。
〔19〕前記粒状物質が、前記第一の結合対象物質又は前記第二の結合対象物質と同じであっても異なってもよい第三の結合対象物質をさらに備え、
前記メンブレンが、前記第三の結合対象物質に対する第三の特異的結合物質が固定された追加の検出部位と、前記試料流動方向について前記第一のサンプルパッドの下流側の位置で前記試料が流動する経路を分割するように配置された第二のスペーサーと、をさらに備え、
前記検出部位及び前記追加の検出部位が、前記第二のスペーサーによって分割された異なる経路に配置されている、前記〔15〕〜〔18〕のいずれか一項に記載のテストストリップ。
〔20〕互いに同じであっても異なってもよい第一の結合対象物質及び第二の結合対象物質を含む結合対象物質を表面上に複数備える粒状物質を検出するためのイムノクロマトグラフィー用テストストリップであって、
前記第一の結合対象物質に対する第一の特異的結合物質が固定された検出部位を備えるメンブレンと、試料流動方向について前記検出部位の上流側の位置で前記メンブレンと接する第一のサンプルパッドとを含む第一の基板と、
第二のサンプルパッドを含む第二の基板と
を含み、
前記第一の基板及び前記第二の基板は、前記第二のサンプルパッドが前記試料流動方向について前記第一のサンプルパッドのさらに上流側の位置で前記メンブレンと接するように、接近可能であることを特徴とする、テストストリップ。
〔21〕前記第二のサンプルパッドが、前記第二の結合対象物質に対する第二の特異的結合物質を含むコンジュゲートパッドを含み、前記第二の特異的結合物質が、標識物質に結合している、前記〔20〕に記載のテストストリップ。
〔22〕前記第一の基板及び前記第二の基板が、伸縮構造を介して結合されている、前記〔20〕又は〔21〕に記載のテストストリップ。
〔23〕互いに同じであっても異なってもよい第一の結合対象物質及び第二の結合対象物質を含む結合対象物質を表面上に複数備える粒状物質を検出するためのイムノクロマトグラフィー用テストストリップであって、
前記第一の結合対象物質に対する第一の特異的結合物質が固定された検出部位を備えるメンブレンと、
第一の経路における試料流動方向について前記検出部位の上流側の位置で前記メンブレンと接する第一のサンプルパッドと、
前記第一の経路とは異なる第二の経路における試料流動方向について前記検出部位の上流側の位置で前記メンブレンと接する第二のサンプルパッドと
を含み、
前記第二のサンプルパッドが、前記第一のサンプルパッドから離間していることを特徴とする、テストストリップ。
〔24〕前記第二のサンプルパッドが、前記第二の結合対象物質に対する第二の特異的結合物質を含むコンジュゲートパッドを含み、前記第二の特異的結合物質が、標識物質に結合している、前記〔23〕に記載のテストストリップ。
〔25〕前記メンブレンが、短冊形、U字型、又は、V字型である、前記〔23〕又は〔24〕に記載のテストストリップ。
〔26〕前記粒状物質が、前記第一の結合対象物質又は前記第二の結合対象物質と同じであっても異なってもよい第三の結合対象物質をさらに備え、
前記メンブレンが、前記第三の結合対象物質に対する第三の特異的結合物質が固定された追加の検出部位と、前記第一の経路における試料流動方向について前記第一のサンプルパッドの下流側の位置で前記第一の経路を分割するように配置されたスペーサーと、をさらに備え、
前記検出部位及び前記追加の検出部位が、前記スペーサーで分割された異なる経路に配置されている、前記〔23〕又は〔24〕に記載のテストストリップ。
〔27〕前記第一の経路及び前記第二の経路とは異なる第三の経路における試料流動方向について前記追加の検出部位の上流側の位置で前記メンブレンと接する第三のサンプルパッドをさらに含む、前記〔26〕に記載のテストストリップ。
〔28〕前記第二のサンプルパッド及び/又は前記第三のサンプルパッドが、前記第二の特異的結合物質を含むコンジュゲートパッドを含んでいる、前記〔27〕に記載のテストストリップ。
〔29〕互いに同じであっても異なってもよい第一の結合対象物質及び第二の結合対象物質を含む結合対象物質を表面上に複数備える粒状物質を検出するためのイムノクロマトグラフィー用テストストリップであって、
前記第一の結合対象物質に対する第一の特異的結合物質が固定された検出部位を備える第一のメンブレンと、
第一の経路における試料流動方向について前記検出部位の上流側の位置で前記第一のメンブレンと接する第一のサンプルパッドと、
前記検出部位と前記第一のサンプルパッドの間で前記第一のメンブレンと接している第二のメンブレンと、
前記第一の経路とは異なる第二の経路における試料流動方向について前記検出部位の上流側の位置で前記第二のメンブレンと接する第二のサンプルパッドと
を含み、
前記第二のサンプルパッドが、前記第一のサンプルパッドから離間していることを特徴とする、テストストリップ。
〔30〕前記第一のサンプルパッド又は前記第二のサンプルパッドのいずれか一方が、前記第二の結合対象物質に対する第二の特異的結合物質を含むコンジュゲートパッドを含み、前記第二の特異的結合物質が、標識物質に結合している、前記〔29〕に記載のテストストリップ。
〔31〕前記メンブレンが、イムノクロマトグラフィー試験の成否を判定するコントロール部位をさらに備えている、前記〔14〕〜〔30〕のいずれか一項に記載のテストストリップ。
本発明は、粒状物質をイムノクロマトグラフィー法によって検出する方法に関している。本明細書に記載の「イムノクロマトグラフィー法」とは、試料中の対象物質をそれに特異的に結合する物質を使用して検出する方法であって、当該試料をメンブレン上で移動させて対象物質を分離するラテラルフロー型の検出方法だけでなく、当該試料をメンブレンに垂直に移動させて対象物質を分離するフロースルー型(バーティカルフロー型)の検出方法のこともいう。本明細書に記載の「粒状物質」とは、前記イムノクロマトグラフィー法によって検出可能な大きさの粒状の物質のことをいい、前記粒状物質は、表面上に少なくとも1種の結合対象物質を複数備えている。前記結合対象物質は、互いに同じであっても異なってもよい第一の結合対象物質及び第二の結合対象物質を含む。前記粒状物質の粒径は、特に限定されないが、例えば、約10μm以下であってもよく、ある態様では、約5μm以下、約1μm以下、約500nm以下、又は約200nm以下であってもよい。具体的には、前記粒状物質は、例えば、エクソソーム、微小胞、アポトーシス小体、及びラージオンコソームなどの細胞外小胞であってもよく、インフルエンザウイルス、アデノウイルス、RSウイルス、ロタウイルス、ヒトパピローマウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、B型肝炎ウイルス、ジカウイルス、及びデングウイルスなどのウイルスであってもよく、クラミジア、梅毒トレポネーマ、溶連菌、炭疽菌、黄色ブドウ球菌、赤痢菌、大腸菌、サルモネラ菌、ネズミチフス菌、パラチフス菌、緑膿菌、及び腸炎ビブリオ菌などの細菌であってもよい。
(1)前記粒状物質を含む試料と、前記第一の結合対象物質に対する第一の特異的結合物質とを、メンブレン上で接触させ、前記粒状物質を前記第一の特異的結合物質により捕捉する工程、
(2)捕捉された前記粒状物質と、前記第二の結合対象物質に対する第二の特異的結合物質とを接触させ、前記粒状物質を標識する工程、及び、
(3)標識された前記粒状物質を検出する工程
を含む。前記第一の結合対象物質と前記第二の結合対象物質が同じである場合、前記第一の結合対象物質における前記第一の特異的結合物質の結合部位は、前記第二の結合対象物質における前記第二の特異的結合物質の結合部位と同じであってもいいし、異なっていてもよい。両結合部位が同じであっても、前記粒状物質は、前記結合対象物質を表面上に複数備えているので、前記第一の特異的結合物質により捕捉した後にも、前記第二の特異的結合物質により標識することが可能となっている。
前記第一の結合対象物質に対する第一の特異的結合物質が固定された検出部位(b)を備えるメンブレン(a)と、
試料流動方向(x)について前記検出部位(b)の上流側の位置で前記メンブレン(a)と接する第一のサンプルパッド(e1)と
を含み、
前記第一のサンプルパッド(e1)から前記検出部位(b)に至る途中にコンジュゲートパッドが含まれていないことを特徴としており、各構成要素は、基板(バッキングシート)(d)の上に配置され得る(図1)。前記テストストリップは、前記試料流動方向(x)について前記検出部位(b)の下流側の位置で吸水パッド(c)をさらに含んでいてもよい。また、前記テストストリップは、前記試料流動方向(x)について前記第一のサンプルパッド(e1)のさらに上流側の位置で前記メンブレン(a)と接する第二のサンプルパッド(e2)をさらに含んでいてもよく、ここで、前記第二のサンプルパッド(e2)は、前記第一のサンプルパッド(e1)から離間している(図2)。
前記メンブレン(a)は、前記第三の結合対象物質に対する第三の特異的結合物質が固定された追加の検出部位(b’)と、前記試料流動方向について前記第一のサンプルパッドの下流側の位置で前記試料が流動する経路を分割するように配置された第二のスペーサー(g2)と、をさらに備え、
前記検出部位(b)及び前記追加の検出部位(b’)は、前記第二のスペーサー(g2)によって分割された異なる経路に配置されている(図8)。前記第一の結合対象物質と前記第三の結合対象物質が異なる場合、前記検出部位(b)に捕捉された粒状物質の量と前記追加の検出部位(b’)に捕捉された粒状物質の量を比較することにより、前記試料中の粒状物質上の前記第一の結合対象物質と前記第三の結合対象物質の相対的な量を測定することができる。なお、前記検出部位(b)に捕捉された粒状物質と前記追加の検出部位(b’)に捕捉された粒状物質を異なる検出試薬で検出することも可能であり、その場合には、前記検出部位(b)の真上又は前記検出部位(b)と前記第一のサンプルパッド(e1)の間の第一の滴下領域(i1)、及び、前記追加の検出部位(b’)の真上又は前記追加の検出部位(b’)と前記第一のサンプルパッド(e1)の間の第二の滴下領域(i2)に、それぞれ異なる検出試薬を滴下することができる。
前記第一の結合対象物質に対する第一の特異的結合物質が固定された検出部位(b)を備えるメンブレン(a)と、試料流動方向(x)について前記検出部位(b)の上流側の位置で前記メンブレン(a)と接する第一のサンプルパッド(e1)とを含む第一の基板(d1)と、
第二のサンプルパッド(e2)を含む第二の基板(d2)と
を含み、
前記第一の基板(d1)及び前記第二の基板(d2)は、前記第二のサンプルパッド(e2)が前記試料流動方向(x)について前記第一のサンプルパッド(e1)のさらに上流側の位置で前記メンブレン(a)と接するように、接近可能であることを特徴としている(図9)。前記第一のサンプルパッド(e1)から前記粒状物質を含む試料を流動させた後に、前記第二のサンプルパッド(e2)を前記メンブレン(a)と接触させて、当該第二のサンプルパッド(e2)から前記第二の結合対象物質に対する第二の特異的結合物質(標識物質に結合)を含む検出試薬を流動させることで、前記検出部位(b)に捕捉されている前記粒状物質を標識することができる。
前記第一の結合対象物質に対する第一の特異的結合物質が固定された検出部位(b)を備えるメンブレン(a)と、
第一の経路における試料流動方向(x1)について前記検出部位(b)の上流側の位置で前記メンブレン(a)と接する第一のサンプルパッド(e1)と、
前記第一の経路とは異なる第二の経路における試料流動方向(x2)について前記検出部位(b)の上流側の位置で前記メンブレンと接する第二のサンプルパッド(e2)と
を含み、
前記第二のサンプルパッド(e2)が、前記第一のサンプルパッド(e1)から離間していることを特徴としており(図12及び図13)、前記第一の経路及び前記第二の経路は、前記検出部位(b)の周辺を除き、必要な場合にはスペーサー(g)を介して互いから離間している。この具体例のテストストリップにおいては、前記粒状物質を含む試料と、前記第二の結合対象物質に対する第二の特異的結合物質(標識物質に結合)を含む検出試薬とを、別のサンプルパッドから別の経路で流動させることができるため、前記試料の流動が完全に終わる前に前記検出試薬の流動を開始しても、前記検出部位(b)の周辺以外では前記粒状物質と前記第二の特異的物質とが結合することはない。そうすると、前記検出試薬の流動を早くに開始できる分、イムノクロマトグラフィー法の試験に要する時間を短縮することが可能となる。
前記メンブレン(a)は、前記第三の結合対象物質に対する第三の特異的結合物質が固定された追加の検出部位(b’)と、前記第一の経路における試料流動方向について前記第一のサンプルパッド(e1)の下流側の位置で前記第一の経路を分割するように配置されたスペーサー(g)と、をさらに備え、
前記検出部位(b)及び前記追加の検出部位(b’)は、前記スペーサー(g)で分割された異なる経路に配置されている(図16)。前記第一のサンプルパッド(e1)から流動されて前記検出部位(b)で捕捉された前記粒状物質は、前記第二のサンプルパッド(e2)から流動される前記第二の特異的結合物質を含む検出試薬により標識され得る。そして、前記追加の検出部位(b’)に捕捉された前記粒状物質は、その真上、又は、前記追加の検出部位(b’)と前記第一のサンプルパッド(e1)の間の滴下領域(i)に、前記検出試薬を滴下することで標識され得る。前記第一の結合対象物質と前記第三の結合対象物質が異なる場合、前記検出部位(b)に捕捉された粒状物質の量と前記追加の検出部位(b’)に捕捉された粒状物質の量を比較することにより、前記試料中の粒状物質上の前記第一の結合対象物質と前記第三の結合対象物質の相対的な量を測定することができる。
前記第一の結合対象物質に対する第一の特異的結合物質が固定された検出部位(b)を備える第一のメンブレン(a1)と、
第一の経路における試料流動方向(x1)について前記検出部位の上流側の位置で前記第一のメンブレン(a1)と接する第一のサンプルパッド(e1)と、
前記検出部位(b)と前記第一のサンプルパッド(e1)の間で前記第一のメンブレン(a1)と接している第二のメンブレン(a2)と、
前記第一の経路とは異なる第二の経路における試料流動方向(x2)について前記検出部位(b)の上流側の位置で前記第二のメンブレン(a2)と接する第二のサンプルパッド(e2)と
を含み、前記第二のサンプルパッド(e2)が、前記第一のサンプルパッド(e1)から離間していることを特徴としている(図19)。この具体例のテストストリップにおいては、前記第一のサンプルパッド(e1)又は前記第二のサンプルパッド(e2)のいずれか一方に前記粒状物質を含む試料を載せて、他方に前記第二の結合対象物質に対する第二の特異的結合物質(標識物質に結合)を含む検出試薬を載せて使用することができる。前記第二のサンプルパッド(e2)から流動を開始した試料又は検出試薬は、流動しながら前記第二のメンブレン(a2)と接している前記第一のメンブレン(a1)へと移行し、前記検出部位(b)に到達する。前記第二のメンブレン(a2)は、その末端領域で前記第一のメンブレン(a1)と接していてもよい。ある態様では、前記第一のサンプルパッド(e1)又は前記第二のサンプルパッド(e2)のいずれか一方が、前記第二の特異的結合物質を含むコンジュゲートパッド(f)を含んでいる(図20)。
(1)細胞培養上清からの調製
10% FBS(名称:Fetal Bovine Serum、製造元:Life Technologies)、1% PSA(名称:ペニシリン−ストレプトマイシン−アムホテリシンB懸濁液(×100)(抗生物質−抗真菌剤溶液)、製造元:和光純薬工業株式会社)、及び2mM Glutamax(製造元:Life Technologies)含有RPMI1640培地を20mL使用し、150mmディッシュで乳がん細胞株MCF7をディッシュの底面積の80%まで培養した。培地を除去後、りん酸緩衝生理食塩水(PBS)20mLで2回洗浄し、2mM Glutamax含有Advanced RPMI 1640 Medium(製造元:Life Technologies)を20mL添加して、48時間培養した。150mmディッシュ10枚分の細胞培養上清(200mL)を2,000×g、4℃下で10分間遠心分離し、その上清を10,000×g、4℃下で30分間遠心分離して、最終的に得られた上清を孔径0.22μmのフィルターでろ過した。ろ液を175,000×g、4℃下で95分間遠心分離し、上清を除去して沈殿画分を得た。沈殿画分を13mLの1×PBSで分散し、210,000×g、4℃下で95分間遠心分離した。その上清を除去した後、沈殿物を0.2mLのPBSで再分散し、エクソソーム溶液(E溶液1)を調製した。
また、MCF7細胞に代えて、他の乳がん細胞株であるMDA−MB−231(略称:MM231)を使用し、上と同様の方法でエクソソーム溶液(E溶液2)を調製した。
4mLの血清(品番:12181201、販売元:コスモ・バイオ株式会社)を16,500×g、4℃下で20分間遠心分離し、その上清を孔径0.22μmのフィルターでろ過した。ろ液を210,000×g、4℃下で45分間遠心分離し、上清を除去して沈殿画分を得た。沈殿画分を4mLのPBSで分散し、再び210,000×g、4℃下で45分間遠心分離した。その上清を除去した後、沈殿物を0.1mLのPBSで再分散し、エクソソーム溶液(E溶液3)を調製した。
(1)粒径および粒子数濃度測定
各種エクソソーム溶液を希釈し、NanoSightナノ粒子解析システム(Malvern Panalytical製)によりエクソソームの粒径および粒子数濃度を測定した。結果を以下に示す。
[E溶液1]粒径:147nm、粒子数濃度:1.5×1012個/mL
[E溶液2]粒径:143nm、粒子数濃度:1.9×1012個/mL
[E溶液3]粒径:139nm、粒子数濃度:4.9×1010個/mL
エクソソームを2.5×109個含むように調製したE溶液1及び2、並びに、エクソソームを1.3×109個含むように調製したE溶液3を、試料緩衝液(SDS−PAGE用、6倍濃縮、還元剤不含)(品番:09500−64、製造元:ナカライテスク製)を使用して、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。泳動後のSDSポリアクリルアミドゲルをPVDF膜(メルク製)に転写した。転写後のPVDF膜を2%のスキムミルクを含有したTBS−T(20mM Tris−HCl(pH 8.0)、150mM NaCl、0.05% Tween(R)20)中に浸してブロッキングした。ブロッキング終了後、PVDF膜を、0.2%スキムミルク含有TBS−Tで希釈したマウス抗CD9抗体(Hansa Bio Med製)、マウス抗CD63抗体(Hansa Bio Med製)、又はマウス抗CD81抗体(Hansa Bio Med製)と反応させた。そして、PVDF膜をTBS−Tで3回洗浄後、0.2%スキムミルク含有TBS−Tで希釈したHRP標識ヤギ抗マウスIgG抗体(Bio−Rad Laboratories製)と反応させた。最後に、このPVDF膜をTBS−Tで3回洗浄後、イムノスターLD(和光純薬工業製製)に浸し、直後にImageQuant LAS4000(GEヘルスケア製)で化学発光を検出して、得られた画像を目視又は輝度解析により評価した。結果を図22及び表1に示す。
(目視の評価基準)
++:明確にバンドの判別が可能
+ :バンドの判別が可能
− :バンドの判別が不可能
(1)金ナノプレート懸濁液
常法により、金ナノプレート(最大長さ45nm、厚さ23nmの青色板状ナノ粒子、略称:AuPL)を含む懸濁液A(最大吸収波長616nm;青色)を調製した(要すれば特許文献4などを参照)。
市販の球状金コロイド粒子(BBI Solutions社製、粒子径40nm、略称:AuSP)を含む懸濁液B(最大吸収波長524nm;赤色)を、以降の実験で使用した。
最大吸収波長における吸光度が2.0になるように濃度を調整した1mLの懸濁液A又はBに、0.05mg/mLのマウス抗CD9抗体(品番:HBM−CD9−100、製造元:Hansa Bio Med)溶液を0.1mL添加して、1時間静置した。そして、0.5%のポリエチレングリコール(分子量20,000)水溶液を0.05mL、2%のBSA水溶液を0.1mL添加して、金属ナノ粒子表面をブロッキングした。その後、遠心分離機で金属ナノ粒子を沈殿させ、上清を除去し、150mMの塩化ナトリウム及び1%のBSAを含有する10mMのHEPES緩衝液1mLで再分散した。遠心分離操作を再度実施し、上清を除去後、金属ナノ粒子を同じ緩衝液で再度分散して、最大吸収波長における吸光度が1になるように濃度を調整した。これをイムノクロマト試験に使用する展開液A9及びB9とした。
(1)イムノクロマト試験紙への捕捉抗体の固定
マウス抗CD9抗体(品番:HBM−CD9−100、製造元:Hansa Bio Med)を、濃度が0.25g/mLになるように10%スクロース含有PBSで希釈し、その希釈液の0.75μLを、吸水パッドが一方の端に取付けられている短冊形のニトロセルロースメンブレンを備えたイムノクロマト試験紙(株式会社フォーディクス製)の中央部へ滴下して、当該抗体を捕捉抗体としてメンブレン上に固定した。そして、3%のBSA含有PBSを10mL展開し、メンブレン全体をブロッキングした。
捕捉抗体を固定したイムノクロマト試験紙の吸水パッドが取り付けられていない方の端を、エクソソームを含む試験液に浸して、当該試験液を展開した。次に、上記表2に記載の展開液のいずれかを展開した。最後に、捕捉抗体を固定していた部分の発色を、後述する方法のいずれかにより評価した。
エクソソームを含む試験液を、上記表2に記載の展開液のいずれかと混合した。次に、その混合液を、捕捉抗体を固定したイムノクロマト試験紙に展開した。最後に、捕捉抗体を固定していた部分の発色を、後述する方法のいずれかにより評価した。
エクソソーム溶液に界面活性剤を添加する場合には、エクソソーム溶液1μLに界面活性剤溶液を5μL添加し、全量が50μLになるように1%のウシ血清アルブミン(BSA)含有PBSを添加して、試験液を調製した。上記界面活性剤溶液としては、0.01%の(オクチルフェノキシ)ポリエトキシエタノール(名称:NonidetTM P−40,略称:NP40)水溶液又は0.1%のTween(R)20溶液を使用した。
(1)目視
イムノクロマト試験紙のメンブレン上の判定部分(マウス抗CD9抗体が固定化された部位)を目視で確認し、発色の程度を以下の基準で評価した。
++:明確に判別可能
+ :判別可能
+−:僅かに判別可能
− :判別不可能
検出抗体を含む展開液を展開した後のイムノクロマト試験紙をスキャナー(装置名:CanoScan LiDE500F、製造元:キヤノン株式会社)によりスキャニングし、判定部分の輝度と、判定部分以外の部分の最低輝度を、画像解析ソフト(Image−J)で測定することにより検出シグナルを数値化した。より具体的には、各部分をそれぞれ5回ずつ測定し、得られた数値の中央値の差を求めた。そして、エクソソームを含む試験液を展開したときの値から、エクソソームを含まない対照の溶液を展開したときの値を引いて、検出シグナルとしての輝度差を求めた。なお、Image−Jは、アメリカ国立衛生研究所でWayne Rasbandが開発したオープン・ソースで公有の画像処理ソフトウェアである(http://imagej.nih.gov/ij/)。
検出抗体を含む展開液を展開した後のイムノクロマト試験紙をイムノクロマトリーダー(型番:C10066−10、製造元:浜松ホトニクス株式会社)で測定した。金ナノプレート(青色)を使用した際は青色系発色ライン測定モードで測定し、球状金コロイド(赤色)を使用した際は赤色系発色ライン測定モードで測定した。エクソソームを含む試験液を展開したときの値から、エクソソームを含まない対照の溶液を展開したときの値を引いて、検出シグナルとしての吸光度を求めた。
エクソソームを含む試験液として血清(品番:12181201、販売元:コスモ・バイオ株式会社)を25μL使用し、検出抗体を含む展開液として展開液A9、A63、又はA81を60μL使用した。本発明の方法又は比較法によってイムノクロマト試験を行い、目視判定した結果を表3、輝度解析した結果を図23に示す。
(1)がん細胞株由来のエクソソーム
エクソソームを5.0×109個含むE溶液1に、全量が50μLになるように1%のBSA含有PBSを添加した。これをイムノクロマト試験の試験液として使用し、検出抗体を含む展開液として展開液A9又はB9を60μL使用して、本発明の方法によりイムノクロマト試験を行った。輝度解析の結果を図24に示す。
全血(販売元:株式会社ビジコムジャパン)をPBSで5倍に希釈した溶液をイムノクロマト試験の試験液として50μL使用し、検出抗体を含む展開液として展開液A9又はB9を60μL使用して、本発明の方法によりイムノクロマト試験を行った。輝度解析の結果を図25に示す。
乳がん細胞株MCF7をディッシュ底面積の80%になるように培養し、その培地を無血清のRPMI1640培地に交換して、培養上清を経時的に採取した。採取した培養上清を試験液として50μL使用し、検出抗体を含む展開液として展開液A9を60μL使用して、本発明の方法によりイムノクロマト試験を行った。輝度解析した結果を図26に示す。
E溶液1(MCF7細胞由来エクソソーム溶液)及びE溶液2(MM231細胞由来エクソソーム溶液)にNP40溶液を添加して又は添加せずに50μLの試験液を調製した。検出抗体を含む展開液として展開液A9又はB9を60μL使用して、本発明の方法によりイムノクロマト試験を行った。輝度解析した結果を図27に示す。
E溶液1及びE溶液2にTween(R)20溶液を添加して又は添加せずに50μLの試験液を調製した。検出抗体を含む展開液として展開液A9を60μL使用して、本発明の方法によりイムノクロマト試験を行った。輝度解析した結果を図28に示す。
NanoSightナノ粒子解析システムで計測した結果に基づき、E溶液1をエクソソームの数が9.0×108個、1.8×108個、又は0.9×108個になるように1%のBSA含有PBSで希釈し、50μLの希釈液を調製した。この希釈液又はエクソソームを含まないBSA含有PBSを試験液として使用し、検出抗体を含む展開液として展開液A9を60μL使用して、本発明の方法によりイムノクロマト試験を行った。輝度解析した結果を図29、イムノクロマトリーダーで測定した結果を図30に示す。
NanoSightナノ粒子解析システムで計測した結果に基づき、E溶液1をエクソソームの数が50.0×108個、5.0×108個、又は0.5×108個になるように1%のBSA含有PBSで希釈し、50μLの希釈液を調製した。この希釈液又はエクソソームを含まないBSA含有PBSを試験液として使用し、検出抗体を含む展開液として展開液A9を60μL使用して、本発明の方法によりイムノクロマト試験を行った。
Ab−10 Rapid Peroxidase Labeling Kit(株式会社同仁化学研究所製)を使用して、マウス抗CD9抗体(Hansa Bio Med製)をHRPで標識した。HRP標識マウス抗CD9抗体を150mMの塩化ナトリウム及び1%のBSAを含有する10mMのHEPES緩衝液で希釈し、抗体濃度0.2μg/mLの展開液を調製した。また、NanoSightナノ粒子解析システムで計測した結果に基づき、E溶液1をエクソソームの数が100×108個、20×108個、4×108個、又は0.8×108個になるように1%のBSA含有PBSで希釈し、50μLの希釈液を調製した。この希釈液又はエクソソームを含まないBSA含有PBSを試験液として使用し、HRP標識マウス抗CD9抗体を含む展開液を60μL使用して、本発明の方法(項目5(2))に従って展開操作を行った。展開液を展開した後、150mMの塩化ナトリウム及び1%のBSAを含有する10mMのHEPES緩衝液を50μL展開してイムノクロマト試験紙上の検出部位以外に残存するHRP標識マウス抗CD9抗体を洗浄してから、発色基質として50μLのイムノスターLD(富士フイルム和光純薬工業株式会社製)をイムノクロマト試験紙に滴下した。その滴下直後からCCDイメージャーImageQuant LAS 4000(GEヘルスケア製)で、化学発光を測定した。露光時間0.5秒で得られた像を輝度解析した結果を図32に示す。また、エクソソーム数が4×108個の場合について、露光時間を変えて化学発光を測定した結果を図33に示す。
a1 第一のメンブレン
a2 第二のメンブレン
b 検出部位
b’ 追加の検出部位
c 吸水パッド
d 基板
d1 第一の基板
d2 第二の基板
e1 第一のサンプルパッド
e2 第二のサンプルパッド
f コンジュゲートパッド
f1 第一のコンジュゲートパッド
f2 第二のコンジュゲートパッド
g スペーサー
g1 第一のスペーサー
g2 第二のスペーサー
h 阻害領域
i 滴下領域
i1 第一の滴下領域
i2 第二の滴下領域
j 伸縮構造
k コントロールライン
x 試料流動方向
x1 第一の経路における試料流動方向
x2 第二の経路における試料流動方向
x3 第三の経路における試料流動方向
Claims (31)
- 互いに同じであっても異なってもよい第一の結合対象物質及び第二の結合対象物質を含む結合対象物質を表面上に複数備える粒状物質をイムノクロマトグラフィー法によって検出する方法であって、
(1)前記粒状物質を含む試料と、前記第一の結合対象物質に対する第一の特異的結合物質とを、メンブレン上で接触させ、前記粒状物質を前記第一の特異的結合物質により捕捉する工程、
(2)捕捉された前記粒状物質と、前記第二の結合対象物質に対する第二の特異的結合物質とを接触させ、前記粒状物質を標識する工程、及び、
(3)標識された前記粒状物質を検出する工程
を含み、前記第一の特異的結合物質が、前記メンブレン上に固定されており、前記第二の特異的結合物質が、標識物質に結合していることを特徴とする、方法。 - 前記粒状物質が、細胞外小胞である、請求項1に記載の方法。
- 前記標識物質が、金属ナノ粒子、化学発光物質、又は、蛍光物質である、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記金属ナノ粒子が、異方性金属ナノ粒子である、請求項3に記載の方法。
- 前記異方性金属ナノ粒子が、青色又は黒色であり、かつ前記試料が、血液を含む、請求項4に記載の方法。
- 前記試料に界面活性剤を添加する工程をさらに含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第一の結合対象物質が、前記第二の結合対象物質と同じである、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第一の結合対象物質における前記第一の特異的結合物質の結合部位が、前記第二の結合対象物質における前記第二の特異的結合物質の結合部位と同じである、請求項7に記載の方法。
- 前記検出工程が、前記粒状物質を定量する工程を含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記定量工程が、質量分析装置、イムノクロマトリーダー、又は、画像解析装置で標識シグナルを測定する工程を含む、請求項9に記載の方法。
- 前記質量分析装置のイオン化方法が、誘導結合プラズマ(ICP)又はマトリックス支援レーザー脱離イオン化法(MALDI)である、請求項10に記載の方法。
- 請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法に使用するための、イムノクロマトグラフィー用テストストリップ。
- 互いに同じであっても異なってもよい第一の結合対象物質及び第二の結合対象物質を含む結合対象物質を表面上に複数備える粒状物質を、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法により検出するためのキットであって、
メンブレンを含むテストストリップと、
前記第一の結合対象物質に対する第一の特異的結合物質と、
前記第二の結合対象物質に対する第二の特異的結合物質と
を含み、前記第一の特異的結合物質が、前記メンブレン上に固定されており、前記第二の特異的結合物質が、標識物質に結合していることを特徴とする、キット。 - 互いに同じであっても異なってもよい第一の結合対象物質及び第二の結合対象物質を含む結合対象物質を表面上に複数備える粒状物質を検出するためのイムノクロマトグラフィー用テストストリップであって、
前記第一の結合対象物質に対する第一の特異的結合物質が固定された検出部位を備えるメンブレンと、
試料流動方向について前記検出部位の上流側の位置で前記メンブレンと接する第一のサンプルパッドと
を含み、
前記第一のサンプルパッドから前記検出部位に至る途中にコンジュゲートパッドが含まれていないことを特徴とする、テストストリップ。 - 前記試料流動方向について前記第一のサンプルパッドのさらに上流側の位置で前記メンブレンと接する第二のサンプルパッドをさらに含み、前記第二のサンプルパッドが、前記第一のサンプルパッドから離間している、請求項14に記載のテストストリップ。
- 前記第二のサンプルパッドが、前記第二の結合対象物質に対する第二の特異的結合物質を含むコンジュゲートパッドを含み、前記第二の特異的結合物質が、標識物質に結合している、請求項15に記載のテストストリップ。
- 前記第一のサンプルパッド及び前記第二のサンプルパッドが、第一のスペーサーを介して互いから離間している、請求項15又は16に記載のテストストリップ。
- 前記メンブレンが、前記第一のサンプルパッド側から前記第二のサンプルパッド側への前記粒状物質を含む試料の浸透を阻害するように構成されている、請求項15〜17のいずれか一項に記載のテストストリップ。
- 前記粒状物質が、前記第一の結合対象物質又は前記第二の結合対象物質と同じであっても異なってもよい第三の結合対象物質をさらに備え、
前記メンブレンが、前記第三の結合対象物質に対する第三の特異的結合物質が固定された追加の検出部位と、前記試料流動方向について前記第一のサンプルパッドの下流側の位置で前記試料が流動する経路を分割するように配置された第二のスペーサーと、をさらに備え、
前記検出部位及び前記追加の検出部位が、前記第二のスペーサーによって分割された異なる経路に配置されている、請求項15〜18のいずれか一項に記載のテストストリップ。 - 互いに同じであっても異なってもよい第一の結合対象物質及び第二の結合対象物質を含む結合対象物質を表面上に複数備える粒状物質を検出するためのイムノクロマトグラフィー用テストストリップであって、
前記第一の結合対象物質に対する第一の特異的結合物質が固定された検出部位を備えるメンブレンと、試料流動方向について前記検出部位の上流側の位置で前記メンブレンと接する第一のサンプルパッドとを含む第一の基板と、
第二のサンプルパッドを含む第二の基板と
を含み、
前記第一の基板及び前記第二の基板は、前記第二のサンプルパッドが前記試料流動方向について前記第一のサンプルパッドのさらに上流側の位置で前記メンブレンと接するように、接近可能であることを特徴とする、テストストリップ。 - 前記第二のサンプルパッドが、前記第二の結合対象物質に対する第二の特異的結合物質を含むコンジュゲートパッドを含み、前記第二の特異的結合物質が、標識物質に結合している、請求項20に記載のテストストリップ。
- 前記第一の基板及び前記第二の基板が、伸縮構造を介して結合されている、請求項20又は21に記載のテストストリップ。
- 互いに同じであっても異なってもよい第一の結合対象物質及び第二の結合対象物質を含む結合対象物質を表面上に複数備える粒状物質を検出するためのイムノクロマトグラフィー用テストストリップであって、
前記第一の結合対象物質に対する第一の特異的結合物質が固定された検出部位を備えるメンブレンと、
第一の経路における試料流動方向について前記検出部位の上流側の位置で前記メンブレンと接する第一のサンプルパッドと、
前記第一の経路とは異なる第二の経路における試料流動方向について前記検出部位の上流側の位置で前記メンブレンと接する第二のサンプルパッドと
を含み、
前記第二のサンプルパッドが、前記第一のサンプルパッドから離間していることを特徴とする、テストストリップ。 - 前記第二のサンプルパッドが、前記第二の結合対象物質に対する第二の特異的結合物質を含むコンジュゲートパッドを含み、前記第二の特異的結合物質が、標識物質に結合している、請求項23に記載のテストストリップ。
- 前記メンブレンが、短冊形、U字型、又は、V字型である、請求項23又は24に記載のテストストリップ。
- 前記粒状物質が、前記第一の結合対象物質又は前記第二の結合対象物質と同じであっても異なってもよい第三の結合対象物質をさらに備え、
前記メンブレンが、前記第三の結合対象物質に対する第三の特異的結合物質が固定された追加の検出部位と、前記第一の経路における試料流動方向について前記第一のサンプルパッドの下流側の位置で前記第一の経路を分割するように配置されたスペーサーと、をさらに備え、
前記検出部位及び前記追加の検出部位が、前記スペーサーで分割された異なる経路に配置されている、請求項23又は24に記載のテストストリップ。 - 前記第一の経路及び前記第二の経路とは異なる第三の経路における試料流動方向について前記追加の検出部位の上流側の位置で前記メンブレンと接する第三のサンプルパッドをさらに含む、請求項26に記載のテストストリップ。
- 前記第二のサンプルパッド及び/又は前記第三のサンプルパッドが、前記第二の特異的結合物質を含むコンジュゲートパッドを含んでいる、請求項27に記載のテストストリップ。
- 互いに同じであっても異なってもよい第一の結合対象物質及び第二の結合対象物質を含む結合対象物質を表面上に複数備える粒状物質を検出するためのイムノクロマトグラフィー用テストストリップであって、
前記第一の結合対象物質に対する第一の特異的結合物質が固定された検出部位を備える第一のメンブレンと、
第一の経路における試料流動方向について前記検出部位の上流側の位置で前記第一のメンブレンと接する第一のサンプルパッドと、
前記検出部位と前記第一のサンプルパッドの間で前記第一のメンブレンと接している第二のメンブレンと、
前記第一の経路とは異なる第二の経路における試料流動方向について前記検出部位の上流側の位置で前記第二のメンブレンと接する第二のサンプルパッドと
を含み、
前記第二のサンプルパッドが、前記第一のサンプルパッドから離間していることを特徴とする、テストストリップ。 - 前記第一のサンプルパッド又は前記第二のサンプルパッドのいずれか一方が、前記第二の結合対象物質に対する第二の特異的結合物質を含むコンジュゲートパッドを含み、前記第二の特異的結合物質が、標識物質に結合している、請求項29に記載のテストストリップ。
- 前記メンブレンが、イムノクロマトグラフィー試験の成否を判定するコントロール部位をさらに備えている、請求項14〜30のいずれか一項に記載のテストストリップ。
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