JP2017106915A - Ｔ細胞の活性化を体液から捉える方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 様々な疾病の発症や軽重に深く関連する、生体におけるＴ細胞又はその亜群の活性化データを、体液成分を用いて特異的に検出する手段を提供すること。【解決手段】体液検体試料における、Ｔ細胞マーカー陽性、かつ、Ｔｈ１由来の細胞外小胞においてＴｈ２由来の細胞外小胞よりも多く含有されている蛋白質に対して陽性、の細胞外小胞を定量することによる、Ｔｈ１及び細胞傷害性Ｔ細胞の活性化データの取得方法を提供することにより、上記の課題を解決することを見出した。【選択図】 なし

Description

本発明は、特定生体成分に関するデータ取得方法に関する発明である。より具体的には、がん、感染症、自己免疫疾患等の発症に関与しているＴ細胞の活性化や抑制状態を確認することが可能な、特定生体成分に関するデータ取得方法に関する発明である。

Ｔ細胞は免疫応答において中心的な役割を果たすリンパ球であり、ＣＤ４陽性のヘルパーＴ細胞と、ＣＤ８陽性の細胞傷害性Ｔ細胞（以下、細胞傷害性Ｔ細胞をＣＴＬともいう）に大別される。ヘルパーＴ細胞は多様な免疫応答を惹起するエフェクター細胞群と免疫応答に抑制的に働く細胞群に分けられ、エフェクター細胞群はさらに機能的にＴｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ１７等に分類される。Ｔｈ１はＩＦＮγやＴＮＦα等の炎症生サイトカインを分泌しＣＴＬ活性化に代表される細胞性免疫を亢進させる。Ｔｈ２はＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３等を分泌して液性免疫を惹起するとともに好酸球等の活性化を誘導し寄生虫感染に防御的に働く。一方、環境抗原等に応答するＴｈ２はアレルギー発症の原因になる。Ｔｈ１７はＩＬ−１７の分泌を介して好中球性炎症を惹起し細菌感染症の排除に働いているが、自己免疫疾患への関与が示唆されている。ＣＴＬはパーフォリン、グランザイム、グラニュライシン等の細胞傷害物質の分泌や細胞膜のＦａｓＬ等を介して標的細胞を傷害し、体内におけるＴ細胞による細胞傷害機構の主要な担い手である。ＣＴＬはさらにＴｃ１、Ｔｃ２、Ｔｃ１７等に分類され、それぞれＴｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ１７と同様のサイトカインを分泌する。生体では、ＣＴＬの細胞傷害機能の主体はＴｃ１が担っていると考えられている（非特許文献１、２）。

上記の多様なＴ細胞亜群のうち、体内における主要なポピュレーションを占めるＴｈ１及びＣＴＬ（Ｔｃ1）［以下、Ｔｈ１／ＣＴＬ（Ｔｃ１）とも表現する］の活性化はウイ
ルス感染細胞の排除やがん細胞に対する生体防御で特に重要である。Ｔｈ１／ＣＴＬ（Ｔｃ１）の活性化が何らかの原因で抑制されると、ウイルス感染症の重症化や遷延化、がん細胞の増殖を許すことが分かっている。一方、体内でのＴｈ１／ＣＴＬ（Ｔｃ１）の反応が自己の正常抗原に向かった場合は、自己免疫疾患等の発症原因となる（非特許文献１、３）。

これらの知見に基づき、生物学的製剤を中心として、Ｔ細胞を標的とする治療薬の開発が進み、自己免疫疾患やがんの治療成績が大きく向上した。例えば、樹状細胞のＣＤ８０／ＣＤ８６に結合してＴ細胞の活性化を抑制する作用のあるａｂａｔａｃｅｐｔは、関節リウマチ等の自己免疫疾患で使用され、ＴＮＦ阻害剤等に勝るとも劣らない治療成績を挙げている（非特許文献４）。一方、がんの組織においては、ＣＴＬＡ−４やＰＤ−１等の抑制性分子からのシグナルによりＴｈ１やＣＴＬの活性化が抑制された状態にあることが分かっている（非特許文献５）が、近年、これらの抑制性分子を阻害して免疫応答を復活させる作用を狙ったいわゆる免疫チェックポイント阻害剤の開発が進んでいる。例えば、坑ＣＴＬＡ−４抗体や坑ＰＤ−１抗体等の抗体医薬が臨床に供され、悪性黒色腫、肺がん、腎細胞がん、ホジキン白血病等で目覚しい坑がん効果を示している（非特許文献６、７）。

このように自己免疫疾患やがんの領域においては、Ｔ細胞、特にＴｈ１／ＣＴＬ（Ｔｃ１）の活性化や抑制状態を制御することを目的とした治療法が重要な地位を占めるようになってきている。これらの治療薬は自己免疫疾患やがんに留まらず、慢性感染症等の領域での検討も始まっている。しかしながら、Ｔ細胞選択的な作用薬は患者によって効果に個人差があり、治療無効例も決して少なくないことから、患者の感受性を予測するための指標や治療効果を早期に精度よく判断できる指標が求められている（非特許文献８−１０）。

上述した、がん、自己免疫疾患のようなＴｈ１／ＣＴＬ（Ｔｃ１）が関与する病態では、Ｔｈ１／ＣＴＬ（Ｔｃ１）の活性化や抑制の状態を特異的に調べる検査が、治療方針や治療効果の指標として有用であると考えられる。この検査の一つとしてフローサイトメーターを用いた末梢血リンパ球解析法があるが、末梢血におけるＴ細胞亜群の解析結果は必ずしも疾患局所におけるＴ細胞亜群の活性化を反映しないことが分かっている（非特許文献１１）。また、フローサイトメーター法は煩雑な手技を要し、検体は全血であることが多く、血清のように長期保存ができないという欠点がある。

このため、Ｔ細胞あるいはその亜群の活性化を血清等の体液で調べる方法が盛んに研究されている。しかしながら、現在まで、体液成分としてＴ細胞に特異的な指標は認められない。例えば、一般にＴ細胞全体の活性化の指標に用いられる可溶性ＩＬ−２受容体はＴ細胞以外にもＢ細胞や単球等から分泌されることが分かっておりＴ細胞選択的とはいえない。また、ＣＴＬの指標とされる可溶性ＣＤ８は、ＣＤ８陽性のＮＫ細胞、樹状細胞、胸腺上皮細胞からの分泌も否定できないため、やはりＣＴＬ選択的とはいえない。さらに、Ｔｈ１、Ｔｃ１が産生するサイトカインの代表であるＩＦＮγもＴｈ１、Ｔｃ１のみならずＮＫ細胞からも産生される（非特許文献１）。

また、ヘルパーＴ細胞の亜群であるＴｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ１７あるいは制御性Ｔ細胞等に選択的な液性因子の探索も盛んに行われてきたが、未だに臨床的に有用なものは見つかっていない。これらの事実は、単一の可溶性分子でもってＴ細胞あるいはその亜群の活性化を特異的に検出することは困難であることを物語っている。

Murphy K, Janeway’s Immunobiology. 2012; GarlandScience, New York, USA Lai H-Y, et al., Cell Transplantation. 2012; 21: 2033-2045 Pauken KE, Wherry EJ, Trends Immunol. 2015; 36(4): 265-276 Smolen JS, et al., Ann Rheum Dis. 2014; 73:492-509 Rabinovich GA, Gabrilovich D, Sotomayor EM, Annu Rev Immunol. 2007; 25: 267-296 Drake CG, Lipson EJ, Brahmer JR, Nat Rev Clin Oncol. 2014; 11(1):24-37 Ansell SM, et al., N Engl J Med. 2015; 372(4): 311-319 Koura DT, at al. Biol Blood Marrow Transplant. 2013; 19(11):1638-1649 West EE, at al., J Clin Invest. 2013; 23(6): 2604-2615 Tumeh PC, et al., Nature. 2014; 515(7528): 568-571 van Woerken, et al., Ann Rheum Dis. 2005; 64(10):1474-1479

本発明は、上記のように様々な疾病の発症や軽重に深く関連する、生体におけるＴ細胞又はその亜群の活性化データを、体液成分を用いて特異的に検出する手段の提供を課題とするものである。

本発明者は、上記の課題の解決のために、単一の分子に頼るのではなく複数の分子を手がかりにして、Ｔ細胞あるいはその亜群の活性化を特異的に検出することを可能にする体液成分を検討した。

まず、この目的に適う体液中成分として細胞外小胞（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ）に着目した。細胞外小胞は、細胞の活性化やアポトーシスあるいは脱殻（ｓｈｅｄｄｉｎｇ）等で細胞から放出される様々なサイズを持った膜構造体の総称であり、比較的小型の細胞外小胞であるエキソソームを含む概念である。エキソソームは様々な細胞種から分泌される直径３０−１５０ｎｍの微小胞体である。エキソソームは、エキソサイトーシスの経路を介して能動的に細胞外へ放出され体内を循環することが知られている。従って、生体局所の細胞の活性化も、体液中のエキソソーム等の細胞外小胞に反映される可能性が高いと考えた。免疫系の細胞では、樹状細胞、マクロファージ、肥満細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞等からのエキソソーム分泌の報告がある。エキソソームは、由来する細胞を特徴付ける蛋白質や核酸を膜表面あるいは小胞内に保持していることが分かっており、この特徴を利用してがんの診断等への応用が検討されている（例えば、Mathivanan S, et al., J Proteomics. 2010; 73(10); 1907-1920）。

本発明者は、培養Ｔｈ１、Ｔｈ２由来のエキソソームを精製し、Ｔｈ１／ＣＴＬ（Ｔｃ１）の活性化を特徴付けるエキソソーム蛋白質をプロテオミクスの手法で探索した。この過程で、Ｔｈ１由来エキソソームとＴｈ２由来エキソソームの間で、顕著に含量の異なる蛋白質を多数見出した。それらの中から、膜蛋白質に絞って検討した結果、ＨＬＡ−ＤＲが、Ｔｈ２由来エキソソームに比べてＴｈ１由来エキソソームに優勢に保持されていることを確認し、これを特定のエキソソームを含む細胞外小胞の検出の第１のマーカーとすることに想到した。

他方でＨＬＡ−ＤＲは、Ｔ細胞以外に、樹状細胞、Ｂ細胞、単球においても発現しており、これらの細胞から分泌されるエキソソームを含む細胞外小胞にもＨＬＡ−ＤＲが表出していると考えられる。このため、体液中のＨＬＡ−ＤＲ陽性の細胞外小胞に対して、さらにＴ細胞選択性を付加して検出するための第２のマーカーを組み合わせることを見出した。後述するように、このＴ細胞選択性の第２のマーカーとしてＣＤ３ε鎖等のＴＣＲ／ＣＤ３複合体の構成物等が挙げられる。ＴＣＲ／ＣＤ３複合体の構成物の中ではＣＤ３ε鎖が抗原として利用し易く、抗体もＣＤ３ε鎖を認識するものが多く市販されている。

上記の発想と共に、本発明者はさらに培養Ｔｈ１、Ｔｈ２細胞自身においてもＨＬＡ−ＤＲがＴｈ１に優勢に発現することを確認した。従来、ＨＬＡ−ＤＲは活性化Ｔ細胞で発現が亢進することが知られていたが、Ｔｈ１とＴｈ２の間で発現が異なることについては報告がない。

次に本発明者は、末梢血単核球からＣＤ４陽性のヘルパーＴ細胞及びＣＤ８陽性のＣＴＬを精製し、ｉｎ ｖｉｔｒｏで固相化抗ＣＤ３ε鎖抗体と坑ＣＤ２８抗体による刺激、非刺激、の条件下に培養し、その培養上清についてＣＤ３ε鎖陽性かつＨＬＡ−ＤＲ陽性のエキソソームを測定した。この結果、ＣＤ３ε鎖陽性かつＨＬＡ−ＤＲ陽性のエキソソームは、非刺激細胞からは殆ど分泌されないが、刺激により活性化した場合、ヘルパーＴ細胞のみならずＣＴＬからも多量に分泌されることを確認した。このことはＴ細胞マーカー陽性、かつ、ＨＬＡ−ＤＲ等の「Ｔｈ１由来の細胞外小胞においてＴｈ２由来の細胞外小胞よりも多く含有されている蛋白質」に対して陽性のエキソソームの値は、Ｔｈ１／ＣＴＬ（Ｔｃ１）の数ではなくて、活性化を反映することが明らかになった。

本発明者はこのようにして、Ｔ細胞マーカー陽性、かつ、Ｔｈ１由来の細胞外小胞においてＴｈ２由来の細胞外小胞よりも多く含有されている蛋白質が陽性、の細胞外小胞の測定により、Ｔｈ１／ＣＴＬ（Ｔｃ１）の活性化データを取得することができることを見出し、本発明を完成した。

すなわち本発明は、体液検体試料における、Ｔ細胞マーカー陽性、かつ、Ｔｈ１由来の細胞外小胞においてＴｈ２由来の細胞外小胞よりも多く含有されている蛋白質（以下、Ｔｈ１優勢蛋白質ともいう）に対して陽性、の細胞外小胞を定量することによる、Ｔｈ１及び細胞傷害性Ｔ細胞（Ｔｈ１／ＣＴＬ（Ｔｃ１））の活性化データの取得方法（以下、本発明のデータ取得方法ともいう）を提供する。

本発明のデータ取得方法は、例えば、「体液検体試料における、Ｔ細胞マーカー陽性、かつ、Ｔｈ１優勢蛋白質が陽性の細胞外小胞を定量することによる、検体提供者のＴｈ１／ＣＴＬ（Ｔｃ１）の活性化状態の確認方法」、としても表現され得る。

本発明のデータ取得方法の定量対象である細胞外小胞は、上述した通りであり、エキソソームを含む概念である。定量対象となる細胞外小胞の大きさは、直径（投影された細胞小胞像の平均直径）０．２５μｍ以下であることが好適である。この０．２５μｍ以下の細胞外小胞に、エキソソームは含まれる。

体液検体試料とは、検体提供者から採取した体液検体を、必要に応じて細胞外小胞の定量測定に適した状態とするための手段を施した試料を意味するものである。ただし、当該手段を行わない体液検体そのものも、細胞外小胞の定量測定を行う対象であれば、体液検体試料に含まれる。

体液検体は、血液検体が好ましい。当該血液検体としては、血清検体、血漿検体、全血検体等が挙げられるが、これらの中でも血清検体又は血漿検体が好ましく、さらに血清検体は血液検体の中で最も好ましい。これらの体液検体に対して、必要に応じた抗凝固処理、防腐処理、安定化処理等を行うことができる。

Ｔ細胞マーカーは、Ｔ細胞の存在を特異的に示し、エキソソーム等の細胞外小胞の表面に認められる分子であれば特に限定されず、例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体のうち、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を構成するα鎖やβ鎖、ＣＤ３複合体を構成するγ鎖、δ鎖、ε鎖、ζ鎖等が挙げられる。これらのうち、ＣＤ３ε鎖は、一つのＴＣＲ／ＣＤ３複合体に２つの分子が含まれ、かつ、細胞表面に存在し、多型性が比較的少なく、ＴＣＲのような蛋白質多様性がないという理由から免疫測定法の標的に適しており、本発明のＴ細胞マーカーとして用いることが好ましい。

Ｔｈ１優勢蛋白質は、Ｔｈ１由来の細胞外小胞においてＴｈ２由来の細胞外小胞よりも多く含有されている蛋白質であれば特に限定されず、ＨＬＡ−ＤＲ、ＳＴ２Ｌ、ＩＬ−１２受容体β２鎖、Ｔｉｍ−３、Ｐｉｍ−１、Ｐｉｍ−２、ＣＸＣＲ３、ＦａｓＬ等が挙げられる。これらの中でＨＬＡ−ＤＲは、エキソソーム表面での発現レベルが比較的高いという理由で免疫測定に適している。ＨＬＡ−ＤＲのマーカーとしてはα鎖を用いることが好ましい。

定量は、免疫測定法、例えば、上記Ｔ細胞マーカーに対して特異的な抗体、及び、ＨＬＡ−ＤＲ等のＴｈ１優勢蛋白質に対して特異的な抗体と、体液検体中のエキソソームとの間の抗原抗体反応に基づくシグナルを検出することにより行われるのが好適である。抗体は、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよいが、モノクローナル抗体が好ましい。

具体的な免疫測定法としては、例えば、酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、放射免疫測定法、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ（ＬＯＣＩ）法、免疫クロマトグラフィー法等が挙げられる。

本発明のデータ取得方法を疾患血清に適用した結果、Ｔ細胞マーカー陽性かつＴｈ１優勢蛋白質陽性のエキソソームは、Ｔｈ１／ＣＴＬ（Ｔｃ１）が亢進することが周知の疾患であるＥＢウイルス感染症で、健常者に比べて有意に高値を示すことを確認した。ＥＢウイルスは腫瘍ウイルスであり、ＥＢウイルスにより腫瘍化したＢ細胞に対する抗腫瘍免疫、すなわちＴｈ１／ＣＴＬ（Ｔｃ１）の活性化を反映した結果と判断された。一方、Ｔｈ２が亢進しＴｈ１が低下することが分かっている典型的な疾患であるアトピー性皮膚炎では健常者に比べて有意に低い値であった。また、免疫が関与しない疾患である変形性関節炎では健常者と同等の値であった。さらに、Ｔｈ１の亢進が認められる場合と認められない場合がある関節リウマチでは、Ｔｈ１が低値を示す検体から高値を示す検体まで幅広く分布していた。これらの結果はいずれも、Ｔ細胞マーカー陽性かつＴｈ１優勢蛋白質陽性の細胞外小胞の血中レベルが、生体におけるＴｈ１／ＣＴＬ（Ｔｃ１）の活性化のレベルを反映していることを示している。また、関節リウマチの病態は多様であり、Ｔｈ１／ＣＴＬ（Ｔｃ１）の亢進する症例とそうではない症例が存在すること、従ってＴ細胞マーカー陽性かつＴｈ１優勢蛋白質陽性の細胞外小胞のレベルを測定することで、関節リウマチの特定の病形、例えばＴ細胞を標的とした治療薬が効きやすい病形、を選別できることを示している。

本発明により、Ｔｈ１／ＣＴＬ（Ｔｃ１）が介在する疾患における、病態の把握、治療法の選択、治療効果の判定に有用なデータを取得することができる。

Ｔｈ１由来エキソソームの精製の最終段階を示した図面である。 ＨＬＡ−ＤＲがＴｈ１由来エキソソームに優勢に含まれることを示す２Ｄ−ＤＩＧＥ解析の結果を示す図面である。 ＨＬＡ−ＤＲがＴｈ１においてＴｈ２よりも優勢に発現していることを示すフローサイトメトリーの図面である。 ＣＤ３ε鎖陽性かつＨＬＡ−ＤＲα鎖陽性のエキソソームをフローサイトメトリーで測定した容量反応曲線の図面である。 ＣＤ３ε鎖陽性かつＨＬＡ−ＤＲα鎖陽性のエキソソームをＡｌｐｈａＬＩＳＡ法で測定した容量反応曲線の図面である。 ＣＤ３ε鎖陽性かつＨＬＡ−ＤＲα鎖陽性のエキソソームをＥＬＩＳＡで測定した容量反応曲線の図面である。 培養Ｔｈ１、Ｔｈ２の培養上清におけるＣＤ３ε鎖陽性かつＨＬＡ−ＤＲα鎖陽性のエキソソームを経時的に測定した図面である。 末梢血単核球から精製したＣＤ４陽性Ｔ細胞とＣＤ８陽性Ｔ細胞からのＣＤ３ε鎖陽性かつＨＬＡ−ＤＲα鎖陽性のエキソソームの分泌を経時的に調べた図面である。 末梢血単核球中のＣＤ４陽性Ｔ細胞とＣＤ８陽性Ｔ細胞におけるＨＬＡ−ＤＲα鎖陽性ＩＦＮγ陽性細胞、ＨＬＡ−ＤＲα鎖陽性ＩＬ−４陽性細胞、ＨＬＡ−ＤＲα鎖陽性ＩＬ−１７陽性細胞の割合をフローサイトメーターで調べグラフ化した図面である。 健常者と疾患群における血清中のＣＤ３ε鎖陽性かつＨＬＡ−ＤＲα鎖陽性のエキソソームをＡｌｐｈａＬＩＳＡ法で調べた図面である。

本発明のデータ取得方法の好適な態様として、上述したＴ細胞マーカー抗原及びＴｈ１優勢蛋白質の両者を同時に保有する細胞外小胞の定量を、免疫測定法で行う態様が挙げられる。すなわち、Ｔ細胞マーカーに対して特異的な抗体、及び、ＨＬＡ−ＤＲ等のＴｈ１優勢蛋白質に対して特異的な抗体と、体液検体試料中の細胞外小胞との間の抗原抗体反応に基づくシグナルを検出することにより行われる態様である。さらに好適には、試料である体液検体中の細胞外小胞を、Ｔ細胞マーカー抗原に対して特異的な抗体と、Ｔｈ１優勢蛋白質に対して特異的な別の抗体を用いて、サンドイッチする工程を含む態様（以下、サンドイッチ法ともいう）が挙げられる。

上述したようにＴ細胞マーカーとしては、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体の構成要素であり、エキソソーム等の細胞外小胞の表面に表出している分子が好適であり、分子多型が少なく、２つの分子を複合体内に含むことから、ＣＤ３ε鎖がＴ細胞マーカー抗原として特に好適である。

またＴｈ１優勢蛋白質のうち、ＨＬＡ−ＤＲは、α鎖とβ鎖という二つのサブユニットから構成されるが、β鎖には分子多形が多いことから抗体のＨＬＡ−ＤＲ抗原としてはα鎖が好ましい。

細胞外小胞の定量対象である体液検体試料は、エキソソーム等の細胞外小胞を基礎的に含有する体液であれば特に限定されず、上述したように、血清、血漿、全血等の血液検体であることが好適であり、特に、血清又は血漿が好適である。これ以外にも、尿、汗、唾液、母乳、精液、リンパ液、脳脊髄液、涙液等が体液検体試料の由来体液として挙げられる。

本発明の測定に供する体液検体試料は、体液をそのまま測定に用いることができる場合もあるが、必要に応じて濃縮や精製のステップを前処理として行ってもよい。試料中のエキソソーム等の細胞外小胞を濃縮・精製する手段としては超遠心による濃縮・精製が古典的な方法であるが、近年多数の報告がある共沈法あるいは分子篩等の原理に基づく方法を用いてもよい。これらの原理を用いた市販の試薬としてはＥｘｏＱｕｉｃｋ Ｅｘｏｓｏｍｅ Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＳＢＩ社）、Ｔｏｔａｌ Ｅｘｏｓｏｍｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）、Ｅｘｏｓｏｍｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（タカラバイオ社）等が例示される。

細胞外小胞は生体において凝集した形態で存在する場合が報告されている。このため測定に先立って軽めの超音波処理等で凝集をほぐす操作を加えることが好ましい。

また、大型の細胞外小体を除外するのであれば、例えば、体液検体試料を、好ましくはポアサイズ０．２５μｍ以下程度のフィルターでろ過する方法が簡便である。なお、後述するＡｌｐｈａＬＩＳＡ法による測定では、原理的に約０．２μｍを超えるサイズの粒子は反応に関与しないので、このような前処理を行う必要性に乏しく、効率的である。

上記したサンドイッチ法等の免疫測定法に用いる２種類の抗体（抗Ｔ細胞マーカー抗体、抗Ｔｈ１優勢蛋白質抗体）は、市販品を用いることもできるが、常法に従い製造することが可能である。抗原は、抗Ｔ細胞マーカー抗体の場合にはＣＤ３ε鎖等を、抗Ｔｈ１優勢蛋白質抗体の場合にはＨＬＡ−ＤＲα鎖等を、特に好適に用いることができるが、これら以外を抗原として用いる場合にも、製造方法は実質的に同一である。

前述したように、用いる抗体はモノクローナル抗体であっても、ポリクローナル抗体であってもよいが、特異性を担保するためには、定量工程の全部又は一部として、モノクローナル抗体を用いることが好適である。

抗体の製造方法は、常法に従って行うことが可能である。抗体を作るための抗原としては、上記好適例であるＣＤ３ε鎖及びＨＬＡ−ＤＲα鎖の場合には、これらの抗原蛋白質の全部又は一部のペプチドを用いることができるが、より親和性の高い抗体を得るためには、天然のＣＤ３ε鎖及びＨＬＡ−ＤＲα鎖の立体構造を保持した抗原を用いることが望ましい。この目的には、精製したＴｈ１由来エキソソームやＣＴＬ由来エキソソームを用いることができる。また、免疫する動物種と同じ種に由来する細胞あるいは細胞株に目的の蛋白質を強制発現させたものを免疫に使用することもできる。さらには、免疫動物に目的の蛋白質を発現する発現ベクターを注入する遺伝子免疫法もこの目的に適している。また、市販のＭｅｍｂｒａｎｅＰｒｏ^TM Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）に示されるように、目的の蛋白質あるいはその一部をウイルス様粒子上に発現したものを免疫に使用することもできる。

所望の抗体が、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であるにかかわらず、免疫は一般的方法により、例えば、免疫対象動物に静脈内、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内等で投与することにより行うことができる。免疫対象動物は特に限定されるものではなく、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ニワトリ等を広く用いることができる。

ＣＤ３ε鎖又はＨＬＡ−ＤＲα鎖、さらにその他の抗原に対するポリクローナル抗体は、当該抗原蛋白質の全部又は一部を免疫抗原として、免疫した動物に由来する免疫血清から製造することができる。

ＣＤ３ε鎖又はＨＬＡ−ＤＲα鎖さらにその他の抗原に対するモノクローナル抗体は、免疫した動物の免疫細胞と動物の骨髄腫細胞とのハイブリドーマを作出し、これにより目的の分子を認識する抗体を産生するクローンを選択し、このクローンを培養することにより製造することができる。また、免疫される動物は特に限定されるものではなく、前述した通りに、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ニワトリ等を広く用いることができるが、モノクローナル抗体を製造する場合には、細胞融合に用いる骨髄腫細胞との適合性を考慮して選択することが望ましい。モノクローナル抗体を調製する場合、公知のモノクローナル抗体調製方法、例えば、安藤民衛、千葉 丈、共著、「単クローン抗体実験操作入門」講談社（１９９１年）や、Ed Harlow and David Lane,“Antibodies: A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988に従い調製することができる。

このようにして得られるポリクローナル抗体ないしモノクローナル抗体は、ＣＤ３ε鎖又はＨＬＡ−ＤＲα鎖等の抗原に特異反応性を有する抗体である。

これらの抗体に、必要に応じて、酵素標識処理、蛍光標識処理、ビオチン標識処理、金コロイド粒子標識処理、アイソトープ標識処理等を、常法に従い行うことができる。

ＣＤ３ε鎖等のＴ細胞マーカー陽性、かつ、ＨＬＡ−ＤＲα鎖等のＴｈ１優勢蛋白質陽性の細胞外小体の定量検出は、上述した２種類の抗体を用いて、抗原抗体反応を利用する検出手段を用いて行う。具体的には、例えば、酵素免疫測定（ＥＬＩＳＡ）法、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）法、免疫クロマトグラフィー法、フローサイトメトリー法、Ｌｕｍｉｎｅｘ技術に代表される蛍光ビーズマイクロアレイ法、テックス凝集比濁法、免疫電顕法、標識抗体を用いたナノトラッキング法、Ｓｉｅｍｅｎｓ社のＡｌｐｈａScreenに代表されるＬＯＣＩ（Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ＯｘｙｇｅｎＣｈａｎｎｅｌｉｎｇ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）法等を試料の種類や測定の用途に応じて使用することができる。

例えば、緊急を要する感染症等の検査に使用する場合は、ベッドサイドの検査に向いた免疫クロマトグラフィー法が好適である。それほど緊急を要しないが感度や正確性が求められる場合はＥＬＩＳＡ法やＡｌｐｈａＬＩＳＡ法の使用が適している。ＥＬＩＳＡ法の範疇に入るが、従来の可視光ではなくて、蛍光や化学発光等を検出に利用した免疫測定法であるＦＥＩＡ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｅｎｚｙｍｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）法、ＣＬＥＩＡ（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｅｎｚｙｍｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）法、ＥＣＬＩＡ（ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）法等も同様の目的に好適である。

Ｔｈ１／ＣＴＬ（Ｔｃ１）の活性化が観察される感染症としてはウイルス感染症、結核等の細胞内微生物による感染症が挙げられるが、細菌感染症では、Ｔｈ１／ＣＴＬ（Ｔｃ１）の亢進は少ない。従って、感染症を疑う疾患において、本発明のデータ取得方法をプロカルシトニン等の細菌感染症の指標と組み合わせて行うことで、ウイルス感染症と細菌感染症との鑑別が可能になる。

Ｔｈ１／ＣＴＬ（Ｔｃ１）が亢進する自己免疫疾患としては、クローン病等の炎症性腸疾患、多発性硬化症、乾癬、炎症性皮膚疾患、糖尿病等が挙げられる。わが国で罹患者が多い自己免疫疾患である関節リウマチにおいては、Ｔｈ１が亢進する症例とそうでない症例が報告されている。これらの自己免疫疾患では、本発明のデータ取得方法を用いることで、Ｔ細胞選択的な治療に感受性のある患者を選択するうえで重要な情報を得ることが可能であり、また治療の効果をＴ細胞レベルでモニターすることが可能になる。

一方、がんの領域では、抗ＣＴＬＡ−４抗体や抗ＰＤ−１抗体等の免疫チェックポイント阻害剤の効果予測に重要な情報を与えることができる。これらの免疫チェックポイント阻害剤は、がんを標的としたＴｈ１／ＣＴＬ（Ｔｃ１）応答を獲得しているにも拘わらず、がんの組織環境で強い免疫抑制を受けているような患者において効果的であると考えられている。従って、本発明のデータ取得方法で、がん患者におけるＴｈ１／ＣＴＬ（Ｔｃ１）のレベルを調べ、健常者あるいは他のがん患者におけるレベルと比較したときに、相対的に高いレベルを示す患者ほど免疫チェックポイント阻害剤が効きやすいと考えられる。もちろん、免疫チェックポイント阻害剤に拘わらず、がんワクチン療法、養子免疫療法、遺伝子改変Ｔ細胞移入療法、活性化リンパ球移入療法等の、近年発展しているがん免疫療法一般においてＴｈ１／ＣＴＬ（Ｔｃ１）の活性化は治療効果に繋がることから、本発明のデータ取得方法は、広くがん免疫療法の効果の予測やモニターに有用である。

さらに自己免疫疾患等において免疫抑制治療を受けている患者において、その患者の免疫能が感染症のリスクを伴うほど過度の抑制状態に陥っていないかどうかをモニターする、感染症のリスク管理の用途に使用できる。

本発明においては、上記のデータ取得方法を行うためのキットを提供する。すなわち本発明は、上記の検出を行うための要素を含むキットを提供する発明でもある。これらのキットの要素は、具体的な検出方式や、グレード等に応じて選択可能であるが、ＣＤ３ε鎖等のＴ細胞マーカーに対する抗体、及び、ＨＬＡ−ＤＲα鎖等のＴｈ１優勢蛋白質に対する抗体は、最低限のキットの要素として挙げられる。これらの抗体は、必要に応じてモノクローナル抗体であっても、ポリクローナル抗体であっても良く、標識抗体であっても、非標識抗体であっても良く、固相に固定化された固定化抗体であっても、非固定化抗体であっても良い。その他、検出に用いる希釈液や緩衝液等が、キットの要素として挙げられる。

以下、本発明を実施例により、具体的に説明するが、この実施例により、本発明の技術的範囲は限定されない。本実施例で使用した抗体は特に記載しない限り全てモノクローナル抗体である。

１．ヒトＴｈ１、Ｔｈ２の調製
健常者のヘパリン加静脈血よりＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（ＧＥヘルスケア社）を用いて末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を分離し、ＣＤ１４及びＣＤ４５ＲＯに対する磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社）を用いたネガチブセレクションの後にＣＤ４に対する磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社）を用いたポジチブセレクションを行い、ＣＤ４陽性ＣＤ４５ＲＯ陰性のナイーブＣＤ４Ｔ細胞を得た。次に、ナイーブＣＤ４Ｔ細胞を１０％牛退治血清添加ＲＰＭＩ１６４０倍地（Ｇｉｂｃｏ社）中に１０⁶細胞／ｍＬの細胞密度で３７℃、５％ＣＯ₂下に培養し、固相化抗ＣＤ３ε鎖抗体ＯＫＴ３（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）及び抗ＣＤ２８抗体ＣＤ２８．２（日本ＢＤ社）０．３−１μｇ／ｍＬで刺激した。Ｔｈ１を誘導する場合は、この培養にＩＬ−１２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）１０ｎｇ／ｍＬ及び抗ＩＬ−４抗体３００７（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）１０μｇ／ｍＬを添加し、一方、Ｔｈ２の誘導にはＩＬ−４（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）１００ｎｇ／ｍＬ及び抗ＩＬ−１２抗体２４９１０（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）１０μｇ／ｍＬと抗ＩＦＮγ抗体２５７１８（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）１０μｇ／ｍＬを添加した。刺激した培養には３日後にＩＬ−２（イムネース、塩野義社）１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬを添加して増殖を促進させた。このようにして得た培養１０日から１４日の増殖が停止した時期の細胞を回収し、上記と同様に固相化抗ＣＤ３ε鎖抗体と抗ＣＤ２８抗体及びＩＬ−１２（Ｔｈ１の場合）とＩＬ−４（Ｔｈ２の場合）を添加して２次刺激を行い、培養をさらに拡大した。この２次刺激培養の場合は、ＩＬ−２を最初から添加し、抗サイトカイン抗体は添加しなかった。

２．Ｔｈ１、Ｔｈ２培養上清からのエキソソームの分離精製
上記１のようにして得たＴｈ１及びＴｈ２の２次刺激培養１０日−１４日目の細胞を無血清ＲＰＭＩ１６４０倍地で洗浄し、２％のエキソソームフリー牛胎児血清添加Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地（Ｇｉｂｃｏ社）中で、１０⁶細胞／ｍＬの細胞密度で３次刺激を行った。３次刺激培養における刺激条件は１次刺激の場合と同じであるがＩＬ−４は１０ｎｇ／ｍＬ、ＩＬ−１２は５ｎｇ／ｍＬを添加し、ＩＬ−２は最初から培養に添加した。ここで記載したエキソソームフリー牛胎児血清は、牛胎児血清を１００，０００ｘｇで１６時間超遠心をした上澄みを用いた。上記の培養３−４日目に低速遠心で培養上清を回収した。回収した培養上清から以下の工程を経てエキソソームを精製した。まず、１０，０００ｘｇで３０分の遠心で遠心上清を得た。この培養上清を０．２２μｍのフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）に通し、そのろ液を１４２，７００ｘｇで２時間超遠心し、３０％蔗糖を含むＰＢＳ／重水のクッション中にエキソソームを回収した。ここでＰＢＳ／重水とは重水（和光純薬）にて調製したＰＢＳを示す。３０％蔗糖／ＰＢＳ／重水中のエキソソームはＰＢＳにて２回超遠心（１４２，７００ｘｇで２時間）にて洗浄し、３０％蔗糖／ＰＢＳ／重水中に回収した。次に０−６０％蔗糖密度勾配／ＰＢＳ／重水に重層し１４２，７００ｘｇで１６時間超遠心分画を行った。各分画についてウエスタンブロッティングにてエキソソームマーカーであるＬＡＭＰ−１、ＬＡＭＰ−２の存在を確認し、エキソソームマーカー陽性の分画をプールしてエキソソーム標品とした（図１）。

３．Ｔｈ１、Ｔｈ２エキソソームのプロテオミクス解析
同一ドナー由来のＴｈ１エキソソーム及びＴｈ２エキソソーム標品を１ペアとして蛍光標識二次元ディファレンスゲル電気泳動（２Ｄ−ＤＩＧＥ）にて解析した。２Ｄ−ＤＩＧＥの方法は試薬メーカーのガイドブックである「２−Ｄ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｕｓｉｎｇ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｐＨ ｇｒａｄｉｅｎｔｓ」（アマシャム・ファルマシア社）や「ＲｅａｄｙＳｔｒｉｐ ＩＰＧ Ｓｔｒｉｐ Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｍａｎｕａｌ」（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）、及び研究機関のガイドブックである老人研・二次元電気泳動マニュアル http://proteome.tmig.or.jp/2D/J_2DEmethod.htmlやＤＩＧＥ道場 http://www.gelifesciences.co.jp/technologies/ettan_dige/dojo_top.htmlを参考にした。Ｔｈ１エキソソーム及びＴｈ２エキソソームの蛋白質標識にはＩＣ３−Ｏｓｕ（ＤＯＪＩＮＤＯ社）及びＩＣ５−Ｏｓｕ（ＤＯＪＩＮＤＯ社）を用いた。二次元電気泳動後のゲル中の蛍光標識蛋白質の検出はＴＹＰＨＯＯＮ ９４００（ＧＥヘルスケア社）を用いた。２Ｄ−ＤＩＧＥの結果、Ｔｈ１エキソソームとＴｈ２エキソソームの間で蛋白量に差の見られたスポットについては質量分析（ｎａｎｏ ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ、日本バイオサービス社）にて蛋白質を同定した。その１例を図２に示す。図２は２Ｄ−ＤＩＧＥ解析を行った同一ポリアクリルアミドゲルの一部についてＴｈ１由来エキソソーム蛋白質のスポット画像（上段パネル）とＴｈ２由来エキソソーム蛋白質のスポット画像（下段パネル）を並べて示す。破線サークルで示したＨＬＡ−ＤＲα１（分子量２８，６０７、等電点４．９１）（左パネル）及びＨＬＡ−ＤＲβ１（分子量２９，８２６、等電点７．６７）（右パネル）が、Ｔｈ２由来エキソソームに比べてＴｈ１由来エキソソームに優勢に含まれていることを示している。

４．Ｔｈ１、Ｔｈ２細胞におけるＨＬＡ−ＤＲの発現
同一ドナー由来のＴｈ１、Ｔｈ２細胞について２次刺激３日後の細胞表面抗原の発現をフローサイトメトリーで調べた。細胞をいずれもＰＥ標識した抗ＣＤ３ε鎖抗体（日本ＢＤ社）、抗ＣＤ４抗体（日本ＢＤ社）、抗ＣＤ４０Ｌ抗体（日本ＢＤ社）、抗ＣＤ４３抗体（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）、抗ＣＤ６３抗体（日本ＢＤ社）、抗ＨＬＡ−ＤＲα鎖抗体（日本ＢＤ社）、対照マウスＩｇＧ１（日本ＢＤ社）及び対照マウスＩｇＧ２ａ（日本ＢＤ社）のそれぞれで室温２０分間染色し、フローサイトメーターＦＡＣＳＶｅｒｓｅ（日本ＢＤ社）にて解析した結果を図３に示す。ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４３、ＣＤ６３の発現はＴｈ１、Ｔｈ２の両者で差が認められなかったが、ＨＬＡ−ＤＲの発現はＴｈ１で優勢であった（図３）。この結果は細胞表面の抗原の発現を比較したものでありＴｈ１、Ｔｈ２のそれぞれから分泌されるエキソソームを直接比較したものではないが、細胞表面での発現の違いは細胞内部で形成されるエキソソームの表面の違いにも反映されると思われることからＨＬＡ−ＤＲがＴｈ１エキソソームに優勢に含まれていることを示唆する結果である。図３の各パネル内の数字は平均蛍光強度を示す。

５．ＣＤ３ε鎖陽性かつＨＬＡ−ＤＲ陽性のエキソソームの検出系の構築
ＣＤ３ε鎖陽性かつＨＬＡ−ＤＲ陽性のエキソソームを測定する目的で、抗ＣＤ３ε鎖抗体を補足抗体とし、抗ＨＬＡ−ＤＲα鎖抗体を検出抗体とした３つの異なるサンドイッチ測定系を構築した。ここで、抗ＣＤ３ε鎖抗体としてはＯＫＴ３を共通に用いた。

５−１．フローサイトメトリーによる測定系
１．５ｍＬチューブに、後述の反応液で希釈したエキソソーム試料２０μＬ及び抗ＣＤ３ε鎖抗体ＯＫＴ３を結合させた直径６ミクロンのカルボキシル基結合ポリスチレンビーズ（Ｍｉｃｒｏｍｏｄ社）を３ｘ１０⁴個（２．５μＬ）入れ、室温で９０分振とうした。反応液は１％ＢＳＡ、０．２％デキストラン（Ｓｉｇｍａ社）、０．１％ ｎ−ｏｃｔｙｌ−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ （ＤＯＪＩＮＤＯ社） を含むＰＢＳを使用した。ＯＫＴ３のカルボキシル基結合ポリスチレンビーズへの結合にはＥＤＣ（ＰＩＥＲＣＥ社）とＳｕｌｆｏ−ＮＨＳ（ＰＩＥＲＣＥ社）を用い、ＰＩＥＲＣＥ社のマニュアルに従って結合させた。反応後、ビーズを、０．３％ＢＳＡを含むＰＢＳ（洗浄液）にて２回洗浄し、１０％正常マウス血清を含む洗浄液にて１０倍に希釈したＰＥ標識抗ＨＬＡ−ＤＲα鎖抗体ＭＥＭ−１２（ａｂｃａｍ社）２０μＬを加え、室温で６０分振とうした。反応後、ビーズを洗浄液にて２回洗浄し、１％ホルマリンを含むＰＢＳ２５０μＬに懸濁後にＦＡＣＳＶｅｒｓｅ（日本ＢＤ社）にてビーズの平均蛍光強度（Ｍ．Ｆ．Ｉ．）を測定した。測定は日本ＢＤのマニュアルに従って行った。Ｔｈ１由来の精製エキソソームをサンプルとして容量反応曲線を描いた結果を図４に示す。

５−２．ＡｌｐｈａＬＩＳＡによる測定系
ＡｌｐｈａＬＩＳＡ法による測定はＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社のガイドブック「ＡｌｐｈａＬＩＳＡ Ａｓｓａｙ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｇｕｉｄｅ」及び「Ａｌｐｈａ Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ」に従って行った。１／２ Ａｒｅａ ｐｌａｔｅ−９６ （ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）の各ウエルにエキソソーム試料を５μＬ入れ、それに、抗ＣＤ３ε鎖抗体ＯＫＴ３あるいは対照のマウスモノクローナル抗体７Ｈ７（自家製のＩｇＧ２ａモノクローナル抗体）を含む反応液を１０μＬ加え、室温で３０分振とうした。次にＯＫＴ３を結合させたＡｌｐｈａＬＩＳＡ Ａｃｃｅｐｔｏｒ Ｂｅａｄｓ （ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）（５０μｇ／ｍＬ）とビオチン標識抗ＨＬＡ−ＤＲα鎖抗体Ｌ２４３（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社）（０．７５μｇ／ｍＬ）の混合物を１０μＬ加え、室温で１時間振とうした。最後にＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ｃｏａｔｅｄ Ｄｏｎｏｒ Ｂｅａｄｓ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）（４０μｇ／ｍＬ）を２５μＬ加え、遮光下に室温で３０分振とうした。全工程を通して反応液は上記５−１フローサイトメーターによる測定系と同じものを使用した。反応後のプレートはＥｎＳｐｉｒｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）で測定し、ＯＫＴ３抗体存在下の反応の値をバックグラウンドとし、その値を７Ｈ７抗体存在下の反応の値から引いたものを正味の値とした。Ｔｈ１由来の精製エキソソームをサンプルとして容量反応曲線を描いた結果を図５に示す。

５−３．ＥＬＩＳＡによる測定系
Ｂ＆Ｗ ＩｓｏＰｌａｔｅ−９６プレート（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）の各ウエルに抗ＣＤ３ε鎖抗体ＯＫＴ３（５μｇ／ｍＬ、１００μＬ／ウエル）を４℃で一晩固相化した。プレートの各ウエルをＰＢＳにて５回洗浄後、２％ＢＳＡを含むＰＢＳで室温２時間ブロックした。各ウエルに上記フローサイトメーターによる測定系と同じ反応液で希釈したエキソソームサンプルを６０μＬ加え、室温で２時間振とうした。２時間反応後に同じ反応液にて希釈したビオチン標識抗ＨＬＡ−ＤＲα鎖抗体Ｌ２４３（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社）（１．２５μｇ／ｍＬ）を２０μＬ加え、室温でさらに１時間振とうした。プレートをＰＢＳにて５回洗浄後、２％ＢＳＡを含むＰＢＳで１０，０００倍に希釈したストレプトアビジン標識パーオキシダーゼ（Ｖｅｃｔｏｒ社）を１００μＬ加え、室温で４０分振とうした。ＰＢＳにて１０回洗浄後、基質液ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ ＥＬＩＳＡ Ｆｅｍｔｏ Ｍａｘｉｍｕｍ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を５０μＬ加え室温で遮光下に４分間振とうした後にＥｎＳｐｉｒｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）で化学発光を測定した。Ｔｈ１由来の精製エキソソームをサンプルとして容量反応曲線を描いた結果を図６に示す。

６．Ｔｈ１、Ｔｈ２細胞培養上清中のＣＤ３ε鎖陽性かつＨＬＡ−ＤＲ陽性のエキソソームの検出
健常者３名（Ａ、Ｂ、Ｃ）のＰＢＭＣから誘導したＴｈ１、Ｔｈ２細胞の１次刺激後１０日から１４日の増殖が止まった時期の細胞を回収し、上記１のごとく２次刺激を行った。ここでは牛胎児血清はエキソソームフリーのものを用いた。２次刺激後３日及び５日目の培養上清を低速遠心で回収し、０．２２μｍのフィルターを通したろ過液についてｐｈａＬＩＳＡ法でＣＤ３ε鎖陽性かつＨＬＡ−ＤＲα鎖陽性のエキソソームのレベルを測定した。ＡｌｐｈａＬＩＳＡの測定は上記５−２と同様の方法を用いた。図７に示すように、健常者Ａ、Ｂ、Ｃ由来の３つのＴｈ１、Ｔｈ２ペアのいずれにおいてもＴｈ２細胞に比べてＴｈ１細胞から優勢に、ＣＤ３ε鎖陽性かつＨＬＡ−ＤＲα鎖陽性のエキソソームが分泌されることが明らかになった。

７．末梢血ＣＤ４Ｔ細胞及びＣＤ８Ｔ細胞からのＣＤ３ε鎖陽性かつＨＬＡ−ＤＲ陽性のエキソソームの分泌
健常者ＰＢＭＣより磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社）を用いてＣＤ４陽性Ｔ細胞及びＣＤ８陽性Ｔ細胞を分離し、１０％エキソソームフリー牛胎児血清添加ＲＰＭＩ１６４０倍地中で１０⁶細胞／ｍＬの細胞密度で培養した。培養の半分については固相化抗ＣＤ３ε鎖抗体及び抗ＣＤ２８抗体とＩＬ−２（２００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ）で刺激した。刺激及び非刺激の培養から経時的に培養上清を回収し、０．２２μｍのフィルターを通したろ過液についてＡｌｐｈａＬＩＳＡ法でＣＤ３ε鎖陽性かつＨＬＡ−ＤＲα鎖陽性のエキソソームのレベルを測定した。ＡｌｐｈａＬＩＳＡの測定は上記５−２と同様に行った。結果を図８に示す。図８に示されるように、ＣＤ３ε鎖陽性かつＨＬＡ−ＤＲα鎖陽性のエキソソームは活性化していないＴ細胞からは殆ど分泌されないが、刺激を受け活性化した場合には、ＣＤ４Ｔ細胞とＣＤ８Ｔ細胞の両者から多量に分泌されること、また、ＣＤ４陽性Ｔ細胞に比べてＣＤ８陽性Ｔ細胞からの分泌が優勢であることが分かった。同様の結果は別の健常者由来ＣＤ４Ｔ細胞、ＣＤ８Ｔ細胞でも観察された（結果示さず）。

８．末梢血中のＩＦＮγ、ＩＬ−４、ＩＬ−１７産生細胞におけるＨＬＡ−ＤＲの発現
健常者（Ｄ、Ｅ）由来ＰＢＭＣを１０％牛退治血清添加ＲＰＭＩ１６４０倍地中に１０⁶細胞／ｍＬの細胞密度で懸濁し、Ｐｈｏｒｂｏｌ １２−ｍｙｒｉｓｔａｔｅ １３−ａｃｅｔａｔｅ（ＢＩＯＭＯＬ社）を５０ｎｇ／ｍＬ及びｉｏｎｏｍｙｃｉｎ（Ｓｉｇｍａ社）を１μｇ／ｍＬ添加し３７℃、５％ＣＯ₂下に培養した。培養１時間後にｂｒｅｆｅｌｄｉｎＡ（Ｓｉｇｍａ社）を１０μｇ／ｍＬ添加し、サイトカインの分泌を止めた。培養３時間後に細胞を回収し、ＰＥ−Ｃｙ７標識抗ＣＤ３ε鎖抗体（日本ＢＤ社）、ＰｅｒＣＰ標識抗ＣＤ４抗体（日本ＢＤ社）、ＰｅｒＣＰ標識抗ＣＤ８抗体（日本ＢＤ社）、ＡＰＣ標識抗ＨＬＡ−ＤＲα鎖（日本ＢＤ社）抗体で室温２０分染色した。細胞を洗浄後に３．７％ホルマリンで５分間固定し、さらにＦＡＣＳ Ｐｅｒｍｉａｂｉｌｉｚｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ２（日本ＢＤ社）で処理して細胞の透過性を高め、最後に、ＦＩＴＣ標識抗ＩＦＮγ抗体（日本ＢＤ社）、ＰＥ標識抗ＩＬ−４抗体（日本ＢＤ社）あるいはＰＥ標識抗ＩＬ−１７抗体（日本ＢＤ社）で細胞内サイトカインを染色した。細胞はＦＡＣＳＶｅｒｓｅにて解析し、ＣＤ３ε鎖陽性かつＣＤ４陽性のリンパ球（ＣＤ４Ｔ細胞）及びＣＤ３ε鎖陽性かつＣＤ８陽性のリンパ球（ＣＤ８Ｔ細胞）中のＨＬＡ−ＤＲα鎖陽性かつＩＦＮγ陽性の細胞、ＨＬＡ−ＤＲα鎖陽性かつＩＬ−４陽性の細胞、ＨＬＡ−ＤＲα鎖陽性かつＩＬ−１７陽性の細胞の陽性率を算出した。結果を図９に示す。図９の結果は、健常者末梢血中のＴ細胞亜群を比較した場合、ＩＦＮγを産生するＴｈ１及びＴｃ１がＨＬＡ−ＤＲ陽性Ｔ細胞の主体を占めることを示している。このことはＣＤ３ε鎖陽性かつＨＬＡ−ＤＲ陽性のエキソソームは、生体においてＴｈ１やＴｃ１から主に分泌されることを示唆している。

９．健常者及び疾患血清におけるＣＤ３ε鎖陽性かつＨＬＡ−ＤＲ陽性のエキソソームのレベル
ＥＢウイルス感染症（初感染ｎ＝８、再活性化ｎ＝５）、関節リウマチ（ｎ＝２０）及び変形性関節炎患者（ｎ＝１５）の血清は株式会社サンフコから、アトピー性皮膚炎患者血清（ｎ＝１０）はオーラス・バイオサイエンス株式会社から入手した。これらの血清と健常成人血清（ｎ＝２０）におけるＣＤ３ε鎖陽性かつＨＬＡ−ＤＲα鎖陽性のエキソソームのレベルをＡｌｐｈａＬＩＳＡ法にて調べた。ＡｌｐｈａＬＩＳＡの測定は上記５−２と同様に行った。図１０に示すように、ＣＤ３ε鎖陽性かつＨＬＡ−ＤＲα鎖陽性のエキソソームはＴｈ１／ＣＴＬ（Ｔｃ１）が亢進することが知られているＥＢウイルス感染症で顕著に亢進した。ＥＢウイルスはヒトＢ細胞を腫瘍化する腫瘍ウイルスであるが、通常の初感染においては、ＥＢウイルスで腫瘍化したＢ細胞はＣＴＬを中心とした抗腫瘍免疫により効率的に排除される。細胞内に潜伏したＥＢウイルスは免疫抑制状態になると再活性化し、Ｂ細胞の他にＴ、ＮＫ細胞や上皮系細胞の腫瘍化に関わるが、これも同様の抗腫瘍免疫により排除される。図１０に示したＣＤ３ε鎖陽性かつＨＬＡ−ＤＲα鎖陽性のエキソソームの亢進は、ＥＢウイルスによって腫瘍化したＢ細胞に対する宿主の抗腫瘍免疫の亢進を反映した結果であると考えられる。

Ｔｈ２が亢進することが知られているアトピー性皮膚炎における、ＣＤ３ε鎖陽性かつＨＬＡ−ＤＲα鎖陽性のエキソソームは、健常者より有意に低値であった（図１０）。

免疫が発症に関与しない疾患と考えられている変形性関節炎においては、健常者と同等の値であった。関節リウマチには多様な病形が存在すると考えられており、実際、Ｔｈ１の活性化に関しては報告により一定しない。ＣＤ３ε鎖陽性かつＨＬＡ−ＤＲα鎖陽性のエキソソームは、関節リウマチでは低値を示す検体から高値を示す検体まで広く分布しており（図１０）、この検査によって関節リウマチのなかでＴｈ１／ＣＴＬ（Ｔｃ１）が亢進するタイプの症例を区別できる可能性が示された。

Claims (10)

1. 体液検体試料における、Ｔ細胞マーカー陽性、かつ、Ｔｈ１由来の細胞外小胞においてＴｈ２由来の細胞外小胞よりも多く含有されている蛋白質に対して陽性、の細胞外小胞を定量することによる、Ｔｈ１及び細胞傷害性Ｔ細胞の活性化データの取得方法。
2. 細胞外小胞の大きさが０．２５μｍ以下である、請求項１に記載のデータ取得方法。
3. 細胞外小胞はエキソソームである、請求項１又は２に記載のデータ取得方法。
4. Ｔ細胞マーカーはＣＤ３ε鎖である、請求項１−３のいずれか１項に記載のデータの取得方法。
5. Ｔｈ１由来の細胞外小胞においてＴｈ２由来の細胞外小胞よりも多く含有されている蛋白質のマーカーは、ＨＬＡ−ＤＲα鎖である、請求項１−４のいずれか１項に記載のデータ取得方法。
6. 定量は、Ｔ細胞マーカーに対して特異的な抗体、及び、Ｔｈ１由来の細胞外小胞においてＴｈ２由来の細胞外小胞よりも多く含有されている蛋白質に対して特異的な抗体と、体液検体中の細胞外小胞との間の抗原抗体反応に基づくシグナルを検出することにより行われる、請求項１−５のいずれか１項に記載のデータの取得方法。
7. 定量は、酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、放射免疫測定法、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ（ＬＯＣＩ）法、又は、免疫クロマトグラフィー法、により行われる、請求項６に記載のデータの取得方法。
8. 体液検体は血液検体である、請求項１−７のいずれか１項に記載のデータ取得方法。
9. 血液検体は、血清検体又は血漿検体である、請求項８に記載のデータ取得方法。
10. 請求項１−９のいずれか１項のデータ取得方法を行うための要素を含む、Ｔｈ１及び細胞傷害性Ｔ細胞の活性化データを取得するためのキット。