CN116547537A - SARS-CoV-2抗体免疫测定 - Google Patents

Abstract

严重急性呼吸综合征冠状病毒2型(SARS‑CoV‑2)是导致负责COVID‑19大流行的呼吸道疾病——2019年冠状病毒病(COVID‑19)——的冠状病毒株，2019年冠状病毒病是。可以使用从针对SARS‑CoV‑2感染的免疫反应产生的抗体，来分析先前病毒暴露的情况。本发明提供用于在单个多重免疫测定中检测响应SARS‑CoV‑2感染产生的抗体的方法。

Description

SARS-CoV-2抗体免疫测定

技术领域

本发明一般涉及多重免疫测定，尤其涉及响应SARS-CoV-2感染而产生的SARS-CoV-2抗体的检测。

背景技术

严重急性呼吸综合征冠状病毒2型(SARS-CoV-2)是导致引发COVID-19大流行的呼吸道疾病——2019年冠状病毒病(COVID-19)——的冠状病毒株。SARS-CoV-2是一种在人类中具有传染性的第四组正链单链RNA病毒。

每个SARS-CoV-2病毒粒子的直径为50-200纳米。与其他冠状病毒一样，SARS-CoV-2有四种结构蛋白，称为SP(刺突)、E(包膜)、M(膜)和NP(核衣壳)蛋白；NP蛋白包裹RNA基因组，SP、E和M蛋白一起形成病毒包膜。已用低温电子显微镜在原子水平成像了刺突蛋白，其是负责使病毒附着到宿主细胞膜并与宿主细胞膜融合的蛋白；具体而言，其S1亚基催化附着，S2亚基催化融合。

对病毒刺突蛋白的蛋白质建模实验很快表明，SARS-CoV-2对人细胞上的受体血管紧张素转换酶2(ACE2)具有足够的亲和力，可以将其用作细胞进入的机制。已经表明ACE2可能充当了SARS-CoV-2的受体。研究表明，SARS-CoV-2对人ACE2的亲和力高于原始SARS病毒株。SARS-CoV-2也可以使用蛋白basigin(CD147)来帮助进入细胞。

跨膜丝氨酸蛋白酶2(TMPRSS2)的初始SP引发对SARS-CoV-2的进入至关重要。SARS-CoV-2病毒粒子附着到靶细胞后，细胞的蛋白酶TMPRSS2切开病毒的SP，暴露S2亚基中的融合肽和宿主受体ACE2。融合后，围绕病毒粒子形成内体，将其与宿主细胞的其他部分分开。在内体的pH值下降时或在组织蛋白酶(一种宿主半胱氨酸蛋白酶)切割它时，病毒粒子逃逸。然后，病毒粒子将RNA释放到细胞中，迫使细胞产生并传播病毒拷贝，感染更多细胞。SARS-CoV-2产生至少三种毒力因子，促进新病毒粒子从宿主细胞脱落并抑制免疫反应。

需要用于检测SARS-CoV-2感染的快速和准确的诊断试验。理想情况下，该诊断试验将检测先前感染的证据，例如针对SARS-CoV-2病毒产生的抗体。

发明概述

本发明基于使用多重免疫测定试验来检测由SARS-CoV-2引起的感染(例如COVID-19)的开创性发现。具体而言，本发明提供了一种可以用于检测响应SARS-CoV-2感染而产生的抗体的免疫测定试验。

在一个实施方案中，本发明提供了一种基底，该基底上具有至少两个对SARS-CoV-2特异的捕获元件，每个捕获元件对应于并能够结合目标分析物，该基底还可选地具有多个对照元件，该对照元件包括：至少一个基准标记(fiduciary marker)、至少一个用于监测背景信号的阴性对照、至少一个用于监测测定试验的特异性的阴性对照、至少一个阳性比色对照、至少一个用于监测测定试验的性能的阳性对照、及其任何组合。在一个方面，该捕获元件结合目标分析物，其中该目标分析物指示SARS-CoV-2和/或COVID-19暴露。在一个方面，该目标分析物是抗体、抗体片段、抗体结合结构域或其任何组合。在另一个方面，该目标分析物是SARS-CoV-2抗体、其片段或结合结构域。在另一个方面，该捕获元件是蛋白质、蛋白质片段、结合蛋白(BP)、结合蛋白片段、抗原、病毒蛋白或其任何组合。在一个方面，该捕获元件是病毒结构蛋白或其表位。在另一个方面，该病毒结构蛋白或其表位选自SARS-CoV-2膜蛋白(MP)、核衣壳蛋白(NP)、刺突蛋白(SP)、其片段或其任何组合。在另一个方面，该病毒结构蛋白或其表位是核衣壳蛋白或核衣壳蛋白片段。在一个方面，该基底是固体或多孔基底。在另一个方面，该固体基底是顺磁珠、微量滴定板、微粒或磁珠。在另一个方面，该多孔基底是膜。

在另一个实施方案中，本发明提供了一种用于检测样品中的多种目标分析物的试剂盒，该试剂盒包含基底、以及可选地，降背景试剂和比色检测系统中的一者或两者。在一个方面，该试剂盒还包含来自以下的一项或多项：洗涤溶液；用于检测结合到捕获元件的抗原、配体或抗体或用于检测阳性对照的一种或多种抗体；用于分析所捕获的目标分析物的软件，以及用于测量样品中目标分析物的存在的流程。在另一个方面，用于检测的抗体是抗体-结合蛋白(BP)缀合物、抗体-酶标记缀合物或其任何组合。在另一个方面，该样品是鼻拭子或血液样品，例如血清和/或血浆。在一个方面，该基底是固体或多孔基底。在另一个方面，该固体基底是顺磁珠、微量滴定板、微粒或磁珠。在另一个方面，该多孔基底是膜。

在另一个实施方案中，本发明提供了检测个体的SARS-CoV-2暴露的方法，其通过使基底与来自该个体的生物样品接触，其中该个体疑似患有COVID-19或有罹患COVID-19的风险；并检测结合SARS-CoV-2的抗体或其组合的存在，从而检测该个体的SARS-CoV-2暴露。在一个方面，该检测方法是比色、吸光度、化学发光或荧光信号。在某些方面，该检测方法是电化学、表面等离子体共振、局部表面等离子体共振或干涉测量。在另一个方面，该抗体是IgG和/或IgM。在另一个方面，该样品是血液样品，例如血清和/或血浆。

在另一个实施方案中，本发明提供了用于处理微阵列的方法，其通过提供基底、向该基底加入至少一个样品、和处理该基底，使得通过至少一个基准标记、至少一个阳性比色对照和至少一个用于监测测定试验性能的阳性对照中的两个或多个给出可检测结果。

在一个实施方案中，本发明提供了用于检测样品中的分析物的方法，其包括提供基底、向该基底加入至少一个样品、和处理该基底以提供可检测结果。在一个方面，该可检测结果包括至少一个基准标记、至少一个阳性比色对照和至少一个用于样品中分析物检测的阳性对照中的两个或多个。

附图简述

图1显示COVID-19多重免疫测定试验(MIA)的概览。用于检测SARS-CoV-2抗体(IgM和IgG)的间接免疫测定试验(IA)。

图2A-E显示COVID-19MIA流程设计。图2A.将SARS-CoV-2结构蛋白印刷在测定表面上。图2B.在蛋白/Ab印刷后封闭测定表面。图2C.检测患者样品中的目标COVID-19分析物。图2D.通过与HRP标记的、抗分析物的检测Ab结合，来检测特异结合的COVID-19分析物。图2E.通过加入HRP底物(TMB)产生比色阵列斑点。

图3A-B显示COVID-19MIA-膜基、单孔测定。图3A.利用硝酸纤维素膜作为印刷斑点的基底的16孔平台。图3B.抗NP的捕获抗体和SARS-CoV-2结构蛋白(即，NP、MP和SP)一式两份印刷。阳性对照斑点印刷在孔中。白色圆圈表示在该特定位置上未印刷任何物质。

图4A-B显示COVID-19MIA-膜基、单孔、使用分组SARS-CoV-2结构蛋白的测定。图4A.利用硝酸纤维素膜作为印刷斑点的基底的16孔平台。图4B.将分组SARS-CoV-2结构蛋白(即，NP、MP和SP)的混合物一式两份印刷在同一孔中。阳性对照斑点印刷在孔中。白色圆圈表示在该特定位置上未印刷任何物质。

图5A-B显示COVID-19MIA-无膜、单孔测定。图5A.用96孔微量滴定板(每块板12个8孔的可拆卸条)作为印刷斑点的基底。图5B.将抗NP的捕获抗体和SARS-CoV-2结构蛋白(即NP、MP和SP)一式两份印刷在另一个条的每个孔中。阳性对照斑点印刷在孔中。白色圆圈表示在该特定位置上未印刷任何物质。

图6A-B显示COVID-19MIA-无膜、单孔、使用分组SARS-CoV-2结构蛋白的测定。图6A.用96孔微量滴定板(每块板12个8孔的可拆卸条)作为印刷斑点的基底。图6B.将分组SARS-CoV-2结构蛋白(即NP、MP和SP)的混合物一式两份印刷在另一个条的每个孔中。阳性对照斑点印刷在所有孔中。白色圆圈表示在该特定位置上未印刷任何物质。

图7A-B显示COVID-19MIA(膜基、单孔测定)。图7A.利用硝酸纤维素膜作为印刷斑点的基底的16孔平台。图7B.SARS-CoV-2结构蛋白(即NP和SP)一式两份印刷。

图8显示用COVID-19MIA对第一个WHO国际抗SARS-CoV-2免疫球蛋白参考组(FirstWHO International Reference Panel for anti-SARS-Cov-2 Immunoglobulin)进行的评估。

图9A-B显示COVID-19多重免疫测定试验基于ELISA的型式——常规96孔ELISA板(每块板12个8孔的条)——无膜。图9A.常规96孔ELISA板。图9B.NP和SP SARS-CoV-2蛋白一式两份印刷。

图10显示用于计算测定背景的孔区域。测定背景计算为在黑色圆圈内区域获得的强度的中值。

图11A-E显示印刷布局和测定结束时的孔。图11A.印刷布局。图11B.使用1μg/ml的抗N蛋白重组人mAb IgG作为样品进行的测定。图11C.使用1μg/ml的抗刺突RBD人重组mAbIgG作为样品进行的测定。图11D.使用对SARS-CoV-2核衣壳蛋白和SARS-CoV-2刺突糖蛋白(S1)都有反应的样品(Panel#18)进行的测定。图11E.使用对两种印刷的抗原均无反应的样品(Panel#34)进行的测定。SARS-CoV-2NP斑点处的可见信号是在所有测试的非反应性样品中观察到的最高背景。

图12显示用COVID-19MIA-无膜、单孔型式对第一个WHO国际抗SARS-CoV-2免疫球蛋白参考组进行的评估。

图13A-B显示COVID-19多重免疫测定试验基于ELISA的型式——96孔ELISA板(每块板12个8孔的条)——无膜。图13A.常规96孔ELISA板。图13B.将NP和SP SARS-CoV-2蛋白混合，然后一式两份印刷。

图14显示用于计算测定背景的孔区域。测定背景计算为在黑色园圈内区域获得的强度的中值。

图15A-E显示印刷布局和测定结束时的孔。图15A.印刷布局。图15B.使用1μg/ml的抗N蛋白重组人mAb IgG作为样品进行的测定。图15C.使用1μg/ml的抗刺突RBD人重组mAbIgG作为样品进行的测定。图15D.使用对SARS-CoV-2核衣壳蛋白和SARS-CoV-2刺突糖蛋白(S1)都有反应的样品(Panel#18)进行的测定。图15E.使用对两种印刷的抗原均无反应的样品(Panel#34)进行的测定。在SARS-CoV-2NP&SP混合斑点处的可见信号是所有测试的非反应性样品中观察到的最高背景。

图16显示，使用COVID-19MIA-无膜、单孔、使用分组SARS-CoV-2结构蛋白的型式，对第一个WHO国际抗SARS-CoV-2免疫球蛋白参考组进行的评估。

发明详述

本发明基于使用多重免疫测定试验检测响应SARS-CoV-2感染而产生的抗体的开创性发现。

在描述本发明的组合物和方法之前，应理解，本发明不限于所描述的具体组合物、方法和实验条件，因为这类组合物、方法和条件可以变化。还应理解，本文使用的术语仅用于描述具体实施方案的目的，而并非旨在限制，因为本发明的范围将仅在所附权利要求书中限定。

除非上下文另有明确规定，本说明书和所附权利要求书中所用的单数形式“一”、“一个”和“该”包括对复数形式的述及。因此，例如，提到“该方法”，将涵盖本文中描述的该类型的一个或多个方法和/或步骤，其对本领域技术人员而言将通过阅读本公开等而变得显而易见。

本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请通过引用并入本文，就如同明确和单独地指出每一个单独的出版物、专利或专利申请通过引用而并入一样。

除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。虽然与本文中所述的方法和材料相似或等同的任何方法和材料都可以用于实施或测试本发明，但应理解，修改和变化包含在本公开的精神和范围之内。现在描述优选方法和材料。

本发明通过检测针对SARS-CoV-2感染产生的抗体(例如IgG和IgM)的多重免疫测定试验(MIA)，使得能够在体外诊断COVID-19。由此，COVID-19可以在感染开始后约3天起、在核衣壳蛋白(NP)在患者体内脱落时的非常早期阶段，被诊断出来。在感染开始后约10天，在人类中观察到NP的峰值水平，该水平在患者中持续降低，并变得检测不到。已显示，抗SARS-CoV-2的抗体(IgG、IgM和IgA)的血清转化，发生在感染开始后约16-23天之间。

在一个实施方案中，本发明提供了一种基底，该基底上具有至少两个对SARS-CoV-2特异的捕获元件，每个捕获元件对应于并能够结合目标分析物，该基底还可选地具有多个对照元件，该对照元件包括至少一个基准标记、至少一个用于监测背景信号的阴性对照、至少一个用于监测测定试验的特异性的阴性对照、至少一个阳性比色对照、至少一个用于监测测定试验的性能的阳性对照、及其任何组合。在一个方面，该捕获元件结合目标分析物，其中该目标分析物指示COVID-19。在另一个方面，该目标分析物是SARS-CoV-2抗体、其片段或结合结构域。在另一个方面，该捕获元件是蛋白质、蛋白质片段、结合蛋白(BP)、结合蛋白片段、抗原、抗原决定簇、病毒蛋白或其任何组合。在一个方面，该捕获元件是病毒结构蛋白或其表位。在另一个方面，该病毒结构蛋白或其表位选自SARS-CoV-2膜蛋白(MP)、核衣壳蛋白(NP)、刺突蛋白(SP)或其任何组合。在另一个方面，该病毒结构蛋白或其表位是核衣壳蛋白或核衣壳蛋白片段。在一个方面，该基底是固体或多孔基底。在另一个方面，该固体基底是顺磁珠、微量滴定板、微粒或磁珠。在另一个方面，该多孔基底是膜。

本文所用的术语“基底”是支持免疫测定试验的任何表面。例如，本发明的基底可以是固体基底或多孔基底。

在某些方面，该基底是固体基底。固体基底的实例包括但不限于，96孔微量滴定板、玻璃、微珠、纳米/微米颗粒和磁珠。在一个方面，96孔微量滴定板是聚苯乙烯、PDMS、PMMA、聚碳酸酯、环状聚烯烃、Zeonor、Zeonex或乙酸纤维素。在多个方面，该固体基底可以是玻璃珠、纳米/微米颗粒、磁珠或顺磁珠。

在一些方面，该多孔基底是膜。术语“多孔膜”是指具有蛋白质结合特性和窄孔径分布(例如微孔)的膜。在一个实施方案中，该膜的孔隙率可以通过控制流过该膜的流速来确定试剂对膜结合组分的暴露时间。用于本发明的微孔膜包括例如，硝酸纤维素、尼龙、聚偏二氟乙烯、聚酯、聚苯乙烯、聚醚砜、乙酸纤维素、混合纤维素酯和聚碳酸酯。例如，PictArray^TM(美国专利号9625453)。

膜的选择通常取决于三个主要的膜特性：蛋白质结合能力、孔隙率和强度。由于膜作为测定中使用的固相起作用，因此膜固定大分子尤其是蛋白质的能力是重要的。然而，这种能力必须与用于封闭膜上非特异性相互作用的适当试剂(例如封闭剂)的可得性相平衡。类似地，在流穿配置(flow-through configuration)中，膜的孔隙率可以通过控制试剂流过膜的流速来确定试剂对膜结合组分的暴露时间。然而，孔隙率必须与阵列制备期间阵列斑点扩展的程度相平衡，该扩展程度可能导致信号强度降低或相邻斑点之间的交叉污染。膜的强度对于装置的制备和最终使用，是重要的。有多种不同特征的膜可供选择，允许根据测定的要求选择特定的膜。

在优选实施方案中，用于本发明的微孔膜包括硝酸纤维素、尼龙、聚偏二氟乙烯、聚酯、聚苯乙烯、聚醚砜、乙酸纤维素、混合纤维素酯和聚碳酸酯。

虽然一些膜如乙酸纤维素可能对诊断免疫测定试验不具有充足的结合能力，但此类膜的特征可适用于较低水平的准确度或灵敏度即足够的测定试验。

可以将微孔膜，可移除地附着到例如无底微量滴定板。因此，可以将膜分到各单独的微量滴定孔中，这些微量滴定孔通过物理屏障彼此分开，以防止孔间样品混合。此外，不同的测定可以在分开的孔中进行，由此需要较小体积的测定试剂。

测定元件(对照和捕获元件)被放置在基底表面，在膜和元件之间具有或不具有衔接分子。优选地，测定元件通过共价或非共价相互作用与基底结合。本领域技术人员将认识到，将测定元件放置在基底上的方法包括印刷、点斑或本领域已知的其他技术。为了本申请的目的，术语“印刷”可用于包括将测定元件放置在膜上的任何方法。

本文中所用的术语“阵列”或“微阵列”是指基底上的多个测定元件的集合。特别地，阵列是基底上的捕获元件和/或对照元件的集合。

在多个方面，阵列上的元件被放置在基底上直径100μm至500μm的离散区域中。更优选地，离散区域的直径在350μm至400μm之间。在某些方面，将阵列的离散区域放置在5×5网格中。在一个方面，阵列包括至多9个对照元件以及8个不同捕获元件之每一个的两个重复。在一个方面，以4个不同捕获元件及其组合的两个或更多个重复，印刷捕获元件。

本文所用的术语“测定元件”是指用于本发明阵列中的多个不同元件中的任一个。示例性测定元件包括但不限于捕获元件和对照元件。

术语“捕获元件”是指能够与目标分析物结合的分子。有用的捕获元件的实例包括蛋白质、蛋白质片段、多肽、多肽片段、结合蛋白、结合蛋白片段、抗体(多克隆、单克隆或嵌合)、抗体片段、抗体重链、抗体轻链、单链抗体、单结构域抗体(例如VHH)、Fab抗体片段、Fc抗体片段、Fv抗体片段、F(ab')2抗体片段、Fab'抗体片段、单链Fv(scFv)抗体片段、抗体结合结构域、抗原、抗原决定簇、表位、半抗原、免疫原、免疫原片段、结合结构域、金属离子、金属离子包被的分子、生物素、抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白；底物、酶、抗体酶、辅因子、受体、受体片段、受体亚基、受体亚基片段、配体、抑制剂、激素、结合位点、凝集素、多组氨酸、偶联结构域、寡核苷酸和病毒蛋白。有用的捕获元件将对应于并能够结合特定的目标分析物，如待测试样品中存在的分子或一类分子。

在一个实施方案中，该捕获元件选自蛋白质、蛋白质片段、结合蛋白、结合蛋白片段、抗体、抗体片段、抗体重链、抗体轻链、单链抗体、单结构域抗体(例如VHH)、Fab抗体片段、Fc抗体片段、Fv抗体片段、F(ab')2抗体片段、Fab'抗体片段、单链Fv(scFv)抗体片段、抗体结合结构域、抗原、抗原决定簇、表位、半抗原、免疫原、免疫原片段、结合结构域；金属离子或金属离子包被分子、生物素、抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白；底物、酶、抗体酶、辅因子、受体、受体片段、受体亚基、受体亚基片段、配体、抑制剂、激素、结合位点、凝集素、多组氨酸、偶联结构域、寡核苷酸、病毒蛋白、或其任意两种或多种的组合。

特别的，该捕获元件可以是SARS-CoV-2病毒结构蛋白。SARS-CoV-2结构蛋白包括核衣壳蛋白(NP)、膜蛋白(MP)、刺突蛋白(SP)或其表位。捕获元件可以是NP/MP/SP或NP/MP/SP的片段。

本文所用的术语“生物标志物”是指用作生物学状态的指示物的任何物质。因此，生物标志物可以是其检测结果指示特定疾病状态的任何物质(例如，抗体的存在可以指示感染)。此外，生物标志物可以指示与疾病的风险或进展相关的、或者与疾病对给定治疗的易感性相关的、蛋白质的表达或状态的变化。一旦所提出的生物标志物得到验证，即可以用于诊断疾病风险、个体疾病的存在，或为个体疾病定制疗法(例如，药物治疗或施用方案的选择)。在评估潜在的药物治疗时，生物标志物可作为自然终点(如生存率或不可逆发病)的替代物。如果治疗改变了与改善的健康直接关联的生物标志物，则该生物标志物可以作为评价临床益处的“替代终点”使用。在一个方面，目标分析物是生物标志物。

在一个实施方案中，目标分析物选自蛋白质、蛋白质片段、肽、多肽、多肽片段、抗体、抗体片段、抗体结合结构域、抗原、抗原片段、抗原决定簇、表位、半抗原、免疫原、免疫原片段、病毒蛋白、病毒外壳蛋白、病毒、病毒蛋白或其表位、或其任意两种或多种的任何组合。

在一个方面，目标分析物是SARS-CoV-2抗体、抗体片段或其结合结构域。

对目标分析物特异的捕获元件用于检测样品中该分析物的存在或不存在。已知多种的互补结合或偶联配偶体，其中捕获元件的选择取决于待检测的分析物、对衔接分子的要求以及测定所需的特异性水平。在多个方面，该捕获元件对结合/检测SARS-CoV-2感染产生的IgG或IgM抗体是特异的。

术语“对照元件”是指这样的元件，其用于提供有关测定试验的功能的信息，例如结合特异性、非特异性背景结合水平、结合的交叉反应性程度、以及测定试剂和检测系统的性能。用于本文的优选对照包括，至少一个用于监测背景信号的阴性对照、至少一个用于监测测定试验的特异性的阴性对照、至少一个阳性比色对照、和至少一个用于监测测定试验的性能的阳性对照。

本发明的基底包括至少一个在基底上总是可检测到的基准标记，优选地，无论测定试验的性能或基底的处理如何，都可检测到该基准标记。

术语“基准标记”是指基底上，优选无论测定试验的性能或基底的处理如何，都始终可检测到的有色标记或标记物。与阳性比色对照相比，至少一个基准标记的使用将消除基于成功的阵列处理来检测此元件的必要性。因此，基准标记是“真正”的阳性对照，无论阵列处理如何，它都可被检测到，并可用于定向和帮助网格化阵列。

在优选的方面，该基准标记是染料、染料缀合蛋白或生色蛋白如血红蛋白。

术语“阴性对照”是指，包含印刷缓冲液或无关蛋白(即，在测定中旨在不存在与之互补的结合配偶体)的元件。来自阴性对照的任何可检测信号，可用于确定测定的背景阈值和任何阳性结果的准确度。在一个方面，用于监测背景信号的阴性对照是印刷缓冲液。印刷缓冲液是用于将捕获元件和对照元件携带并印刷到基底上的溶液，并且可以包括缓冲盐水、甘油和表面活性剂，优选聚山梨酯表面活性剂如吐温20。封闭溶液用于减少与基底表面的非特异性蛋白质结合，并优选包含脱脂牛奶、酪蛋白、牛血清白蛋白、来自鱼、猪或其他物种的明胶、葡聚糖、或其任何两种或多种的任何混合物，优选在磷酸缓冲盐水和表面活性剂如吐温20的溶液中。

术语“对照捕获元件”是指用作对照的捕获元件，即不应结合任何分析物的阴性对照或将结合非目标分析物的阳性对照。

本发明的基底还可以包括至少一个用于监测测定试验的性能的对照。该对照旨在提供有关互补结合相互作用的效率或所用试剂的质量或性能的信息。

术语“用于监测测定试验的性能的对照”是指，在测定过程中形成互补结合相互作用的一部分的元件，其旨在提供关于测定结果准确度的信息。在一个实施方案中，用于监测测定试验性能的阳性对照包括互补结合对的一个结合配偶体，而另一个结合配偶体是样品组分或测定试剂。该测定试验性能对照优选选自：目标分析物、对应于并能够结合将存在于样品中的非目标分析物的结合配偶体、对应于并能够结合测定试剂的结合配偶体、和比色酶标记，或其任意两种或多种的任何组合。对应于并能够结合存在于样品中的非目标分析物的、结合配偶体的一个实例是抗Ig抗体，该抗体将结合存在于血清样品中的免疫球蛋白，从而确认已加入了样品。对应于并能够结合测定试剂的、结合配偶体的一个实例是抗Ig抗体，其将结合用于处理测定的第二免疫球蛋白，如生物素化抗目标分析物抗体。对应于并能够结合测定试剂的、结合配偶体的另一个实例是生物素化抗体，其将结合用于处理测定的链霉抗生物素蛋白-过氧化物酶缀合物。

在一个方面，该测定试验性能对照包括互补结合对的一个结合配偶体，其中另一结合配偶体是测定试剂。该测定试验性能对照优选选自：目标分析物、非特异性结合配偶体或比色酶标记。

在另一个方面，该互补结合配偶体包括抗体-抗原相互作用或抗体-配体相互作用。

本发明的基底还可以包括至少一个用于监测测定试验的特异性的对照。该对照旨在提供捕获元件与目标分析物之间或测定检测步骤的结合配偶体之间的结合特异性的信息。

术语“用于监测测定试验特异性的对照”是指与测定中存在的互补结合对的至少一个结合配偶体密切相关的元件，其旨在提供互补结合的特异性信息。此对照是阴性对照，在正常测定处理期间预期不会产生可检测到的结果。例如，在用于抗体检测的抗原阵列中，该测定试验特异性对照将包含不应与样品中的任何抗体结合的抗原。

在一个方面，该测定试验特异性对照包括一种或多种抗体同种型、来自不同动物物种的相应抗体或抗体同种型、或密切相关的配体。例如，在人抗体阵列中，人IgM和抗人IgM可用作监测测定试验特异性的对照。

本文中所用的术语“阳性比色对照”是指在添加酶底物时提供可检测信号的酶或酶缀合物。

在一个实施方案中，该阳性比色对照是能够与比色底物反应的酶标记缀合物，其包含选自辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-D-半乳糖苷酶或葡萄糖氧化酶的酶。

测定试验对照的性质将取决于阵列的类型、目标分析物的性质和待分析样品的类型。

例如，抗人IgG-HRP或抗小鼠IgG-HRP可以分别用于印刷有抗原和抗体的阵列。抗原阵列中的最终检测抗体通常是抗人IgG-HRP，而对于抗体阵列，其通常是生物素化的小鼠IgG。除了提供关于HRP底物的性能或质量的信息之外，这些对照可以提供阳性对照。

除提供测定试验的特异性的信息外，取决于阵列型式，存在于抗原或抗体阵列上的小鼠IgG、人IgG和抗人IgG可以用作阳性或阴性对照。例如，小鼠IgG应在抗体阵列中提供阳性信号，而后两者应在抗原阵列中提供阳性信号。这些对照也可以用作总体测定试验性能的对照。

本文中所用的术语“样品”和“样本”在其最广义上使用，包括从生物或环境来源以及接触生物或环境样品的取样装置(例如拭子)获得和/或产生的任何组合物。“生物样品”包括尿液、血液、血浆、粪便、脑脊液(CSF)和唾液等体液。在一个实施方案中，该生物样品是从哺乳动物获得的细胞、组织和/或体液，包括从上呼吸道组织(例如鼻咽冲洗液、鼻咽抽吸液、鼻咽拭子和口咽拭子)、从下呼吸道组织(如细支气管灌洗液、气管抽吸液、胸膜穿刺物、痰液)、血液、血浆、血清和粪便获得的样品。这些实例是举例说明性的，不应解释为限制适用于本发明的样品类型。

在本发明的多个方面，该样品是血液样品，包括血浆或血清样品。

结合本发明的基底使用的测定技术包括，许多众所周知的比色酶联测定试验中的任何一种。此类系统的实例在本领域中是众所周知的。这些测定技术基于：在互补结合对之间形成复合物，然后用包括酶-缀合物标记和比色底物的比色检测系统进行检测。将参考酶联免疫吸附测定(ELISA)来描述检测系统，但技术人员将理解，这类技术不限于抗体的使用，而是同等地适用于任何比色测定。

在一个实施方案中，ELISA采用“夹心”测定型式。在这种型式中，待测量的目标分析物结合在两种抗体(即捕获抗体和检测抗体)之间。在另一个实施方案中，ELISA是非竞争性测定，其中抗体与捕获抗原结合，并通过第二检测抗体来测定所结合的抗体的量。

单克隆抗体或多克隆抗体可以用作夹心ELISA系统中的捕获和检测抗体。单克隆抗体对单个表位具有固有的单特异性，允许对抗原中的微小差异进行精细检测和定量。多克隆抗体也可用作捕获抗体以结合尽可能多的抗原，随后在夹心测定中使用单克隆抗体作为检测抗体以提供改善的特异性。单克隆抗体也可以用作捕获抗体以提供特异性分析物捕获，随后在夹心测定中使用多克隆抗体作为检测抗体。此外，捕获抗体和检测抗体都可以是单克隆抗体。

本文中所用的术语“抗体”包括天然存在的抗体以及非天然存在的抗体，包括例如单链抗体、嵌合、双功能和人源化抗体以及其抗原结合片段。这类非天然存在的抗体可以使用固相肽合成来构建，可以重组生产，或者可以通过例如筛选由可变重链和可变轻链组成的组合文库来获得(参见Huse等,Science 246:1275-1281,1989，其在此引入作为参考)。制备例如嵌合、人源化、CDR移植、单链和双功能抗体的这些和其他方法是众所周知的(Winter和Harris,Immunol.Today 14:243-246,1993；Ward等,Nature 341:544-546,1989；Harlow和Lane,Antibodies:Alaboratory manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1999)；Hilyard等,ProteinEngineering:Apractical approach(IRL Press 1992)；Borrabeck,Antibody Engineering,第2版(Oxford University Press 1995)；其各自在此引入作为参考)。此外，修饰的或衍生化的抗体或抗体的抗原结合片段，如聚乙二醇化(聚乙二醇修饰的)抗体，可用于本方法。因此，保留特异性结合活性的抗体的Fab、F(ab')2、Fd和Fv片段包含在抗体的定义之内。

术语“二抗”或“第二抗体”是指将结合目标分析物并与衔接分子(如生物素)或酶标记物(如辣根过氧化物酶(HRP))缀合的抗体。可以通过使抗体-衔接物缀合物与衔接物-酶缀合物接触、然后与酶底物接触，来处理抗体-衔接物缀合物，从而产生可检测结果；例如，抗体-生物素缀合物将结合链霉抗生物素蛋白-HRP缀合物。抗体-酶标记缀合物包括抗体-HRP缀合物。下文讨论并举例说明了二抗的使用。

术语“特异性结合”或“特异性结合活性”等是指，两个分子形成在生理条件下相对稳定的复合物。该术语也适用于抗原结合结构域对特定表位特异的情况，其中所述特定表位由多种抗原携带，由此携带该抗原结合结构域的抗体将能够与携带该表位的多种抗原结合。特异性结合可以通过高亲和力和低至中等容量(capacity)表征。通常，在亲和力常数为约1×10^-6M，通常至少约1×10^-7M，通常至少约1×10^-8M，尤其是至少约1×10^-9M或1×10^–10M或更小时，认为结合是特异性的。

在阵列制备之后和样品加入之前，通过加入并孵育一种或一组试剂来封闭基底表面上所有可用的蛋白质结合位点。这些试剂称为“封闭剂”，用于减少或最好消除样品在基底表面上的非特异性蛋白质结合，从而降低总体背景信号。这增加了信噪比，从而提高了测定试验的总体灵敏度。在样品和其他测定试剂与基底上的固定化蛋白之间的后续反应中，封闭剂不起作用。示例性封闭剂包括但不限于牛血清白蛋白、酪蛋白、脱脂奶粉、源自鱼、猪和其他来源的明胶、葡聚糖、源自所分析样品以外的来源的血清如源自硬头鳟、豚鼠、仓鼠、兔和其他来源的血清、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮，以及商业制剂，包括HeteroBlock(OmegaBiologicals,Bozeman,Mont.)、SuperBlock、StartingBlock、SEA BLOCK(Pierce,Rockford,Il1.)。通常，封闭剂在缓冲溶液中制备，例如磷酸盐缓冲液、磷酸缓冲盐溶液、Tris缓冲液、醋酸盐缓冲液等。封闭剂还可补充有洗涤剂，例如吐温20、吐温80、NonidetP40、十二烷基硫酸钠等。

设计阵列时的一个重要考虑是，每个结合对的捕获和检测抗体必须识别两个不重叠的表位，从而在抗原与捕获抗体结合时，检测抗体识别的表位不被掩盖或改变。已经开发了许多用于ELISA的互补结合对，并且可以用于本发明。

对于多重测定，重要的是，每个结合对之间没有重叠以消除交叉反应性。已经开发了许多的多重ELISA，并且预期可以通过测试来配置结合对的其他组合。

在一个方面，酶-缀合物标记物包含选自辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-D-半乳糖苷酶或葡萄糖氧化酶的酶。

在另一个方面，酶标记物可以直接与一抗缀合或通过识别一抗的二抗引入。如果一抗是生物素标记的，它也可以与蛋白质如链霉抗生物素蛋白缀合。

在另一个方面，该测定试验的检测系统包括选自以下的检测比色底物：3,3′,5,5′-四甲基联苯胺、二氨基联苯胺、金属增强的二氨基联苯胺、4-氯-1-萘酚、胶体金、氯化硝基四氮唑蓝、5-溴-4-氯-3′-吲哚基磷酸对甲苯胺盐和萘酚AS-MX磷酸盐+Fast Red TR盐。

在某些方面，可以使用图像捕获设备(如连接到计算机的数码相机或台式扫描仪)来检测并可选地定量和分析比色反应。可以使用已知的图像分析方法。例如，已知标准元件的浓度值可用于产生标准曲线。可以使用每个分析物的标准曲线，分析未知分析物的浓度值，以计算实际浓度。可以基于阵列内每个捕获元件的点斑位置，来识别每个分析物的值。

本发明的基底尤其适用于检测目标分析物的试剂盒。此类试剂盒可包括基底、说明书和所需的任何测定耗材。针对不同的目标分析物和阵列类型，设想不同的试剂盒。因此，在另一个实施方案中，本发明提供一种用于检测样品中的多种目标分析物的试剂盒，该试剂盒包含基底以及可选的降背景试剂和比色检测系统中的一者或两者。在一个方面，该试剂盒还包含来自以下的一项或多项：洗涤溶液，用于检测结合到捕获元件的抗原、配体或抗体或用于检测阳性对照的一种或多种抗体，用于分析所捕获的目标分析物的软件，以及用于测量样品中目标分析物的存在的流程。在另一个方面，用于检测的抗体是抗体-结合蛋白(BP)缀合物、抗体-酶标记缀合物或其任何组合。在另一个方面，该样品是血液样品，例如血清或血浆。在一个方面，该基底是固体或多孔基底。在另一个方面，该固体基底是顺磁珠、微量滴定板、微粒或磁珠。在某些方面，该多孔基底是膜。

在另一个方面，本发明还涉及处理本发明的基底的方法。这种方法包括提供如上所述的本发明的基底，向该基底中加入至少一个样品，并处理该基底，由此通过至少一个基准标记、至少一个阳性比色对照和iii)至少一个用于监测测定试验性能的阳性对照中的两个或多个给出可检测结果。

在另一个方面，本发明提供了用于处理微阵列的方法，其通过提供基底、向该基底加入至少一个样品、并处理该基底，由此通过至少一个基准标记、至少一个阳性比色对照和至少一个用于监测测定试验性能的阳性对照中的两个或更多个给出可检测结果。

在一个方面，处理基底或微阵列的步骤包括：封闭步骤(在封闭步骤期间，用封闭剂封闭基底或微阵列上的可用蛋白质结合位点)，可选的洗涤步骤，使该基底或微阵列与含有一种或多种待测量的分析物的样品接触，洗涤步骤以从该基质或微阵列去除未结合的物质，使该基底或微阵列与一种或多种二抗接触(该二抗对应于并将结合一种或多种目标分析物以及与测定试验性能对照结合的非目标分析物)，洗涤步骤，以及使该基底或微阵列与酶缀合物或酶底物中的一种或两种接触以产生可检测结果。

在一个实施方案中，本发明提供用于检测样品中分析物的方法，其包括提供基底、向该基底中加入至少一个样品并处理该基底，使得提供可检测结果。在一个方面，该可检测结果包括至少一个基准标记、至少一个阳性比色对照和至少一个用于检测样品中分析物的阳性对照中的两个或多个。

在另一个方面，本发明的基底可用于同时检测样品中的至少一个目标分析物，优选样品中的多个不同目标分析物，并可用于诊断和筛选测定。

因此，本发明的基底提供了这样的优势，即它们可以适用于高通量(或超高通量)分析，因此，取决于所使用的具体支持物，可以平行检查任意数量的样品(例如96、1024、10,000、100,000或更多)。使基底适应高通量分析的一个具体优势是，自动化系统可用于在不同时间在一个或多个样品中添加或移除试剂，用于向特定样品中添加不同的试剂，或用于使样品接受多种热循环。

例如，自动化系统可以由一个或多个温度控制室和安装在台面上的一个或更多个机械臂组成，该台面具有配置为容纳96孔板的平台。机械臂的移动和腔室中的温度由中央计算机单元控制。阵列平板堆叠在仪器的台面上。在一个实施方案中，将包含待分析样品的平板堆叠在温度为4℃的腔室中。然后一个机械臂顺次转移每个单独的阵列平板到一个平台上，而另一个臂顺次转移每块单独的样品板到第二平台上。然后，含有96个一次性吸头的喷嘴从样品板的每个孔抽吸预定体积的样品，并将样品转移到阵列平板的相应孔中。然后，包含样品的阵列平板被转移到温度为37℃的腔室中。重复此过程，直到将样品添加到堆叠在台面上的所有阵列平板中。将阵列平板孵育预定的时间，然后将每个平板转移到平台上，用含有96个一次性吸头的喷嘴加入洗涤缓冲液。在预定的时间之后抽吸洗涤缓冲液，并重复该洗涤过程多次(即两次或更多次)。然后，每个阵列平板接收二抗，然后转移到温度为37℃的腔室中。将阵列平板孵育预定的时间，然后将每个平板转移到平台上，用含有96个一次性吸头的喷嘴加入洗涤缓冲液。在预定的时间之后吸出洗涤缓冲液，并重复该洗涤过程多次(即两次或更多次)。然后，每个阵列平板接收检测试剂，随后孵育预定的时间，然后将每个平板转移到平台上，用含有96个一次性吸头的喷嘴加入洗涤缓冲液。在预定的时间后抽吸洗涤缓冲液，并将平板转移至37℃腔室进行干燥。在预定的时间后，将平板转移回台面，并手动处理进行数据分析。

除了同时检查多个测试试剂和/或样品的方便性之外，这类高通量测定还提供了检查单个样品的两个重复、三个重复或更多个等分试样的手段，从而提高了所获得结果的有效性；并提供了用于在和测试样品相同的条件下检查对照样品的手段，从而提供了可用于比较来自不同测定试验的结果的内部标准。

在另一个实施方案中，本发明提供检测个体的SARS-CoV-2暴露的方法，其通过使基底与来自个体的生物样品接触，其中该个体疑似患有COVID-19；并检测结合SARS-CoV-2的抗体的存在。在一个方面，该检测方法是自动的、手动的、侧流的、固相的、化学发光的、微流控的、基于芯片实验室的免疫测定试验、ELISA或其组合。在另一个方面，该抗体是IgG和/或IgM。在另一个方面，该样品是血液样品，例如血清或血浆。

本发明提供了用于检测响应SARS-CoV-2感染而产生的抗体的体外诊断应用的方法，如手动多重免疫测定试验、自动多重免疫测定试验(MIA)、手动单重ELISA(固相)、自动化学发光免疫测定试验(CLIA)、免洗免疫测定试验(手动或自动)、基于离心式微流控的自动免疫测定试验、基于芯片实验室的免疫测定试验、基于顺磁珠的手动ELISA、基于纸的手动ELISA、护理点(POC)免疫测定试验和其他免疫测定试验型式。在一个方面，通过比色成像(例如PictArray^TM,美国专利号9625453)、吸光度(例如手动ELISA)、化学发光(例如自动CLIA、CRET)、荧光(例如手动免疫测定试验、ELISA、FRET)和肉眼(例如侧流免疫测定试验)进行检测。

COVID-19MIA可用于使用不同免疫测定试验型式临床诊断SARS-CoV-2感染者。例如，可以使用膜(例如PictArray^TM，美国专利号9625453)或在96孔微量滴定板(MTP)的固体表面上进行COVID-19MIA。SARS-CoV-2感染个体中的抗体(IgG和IgM)可通过间接免疫测定试验检测，其中将SARS-CoV-2的多种重组结构蛋白(例如NP、SP和/或MP)包被在膜或MTP的固体表面上。可以使用自动执行手动MIA中的所有步骤并使用比色读取仪和图像分析软件(例如PictImager^TM和)的分析仪，使COVID-19MIA自动化。COVID-19MIA可作为侧流免疫测定试验(LFIA)或手动单重ELISA测定进行。

此外，可以使用多重以及单重的化学发光免疫测定试验(CLIAs)进行COVID-19MIA。SARS-CoV-2的多种结构蛋白可以共价结合到顺磁珠(微米-亚微米大小)上，并用于通过间接免疫测定试验检测针对SARS-CoV-2的IgG和IgM抗体。通过将检测抗体与吖啶或其他化学发光标记偶联并产生化学发光信号来产生检测信号。

COVID-19MIA可通过用于检测IgG和IgM的手动和自动免洗测定来进行。

COIVD-19MIA也可以作为免洗电化学发光ELISA来进行。样品中的分析物可以使用基于生物分子包被(抗原包被)的碳电极表面的微孔板和在电化学刺激时发光的SULTO-TAG标记的检测Ab来检测。

此外，COVID-19MIA可以通过基于离心式微流控的自动免疫测定试验来进行。SARS-CoV-2的多种结构蛋白可以共价结合到顺磁珠上，并用于检测个体中响应SARS-CoV-2感染而产生的IgG和IgM抗体。分析物的检测在反应室中进行，随后洗涤顺磁珠上形成的特异性免疫复合物，并将顺磁珠转移到检测室，以产生和读取测定信号，该测定信号可以是化学发光、吸光度或荧光。

COVID-19MIA也可以作为芯片实验室(LOC)测定来进行。顺磁珠或固体表面可用于共价附着SARS-CoV-2的多种结构蛋白。检测信号可以是化学发光、荧光、吸光度、电化学或比色信号。

此外，COVID-19MIA可以使用手动单重ELISA进行。顺磁珠可以共价结合SARS-CoV-2的多种结构蛋白，以检测针对SARS-CoV-2产生的抗体。

此外，COVID-19MIA可以是护理点(POC)免疫测定试验。POC免疫测定试验可以是使用一次性试条进行的无标记测定，其中使用电化学读取仪或基于智能手机的读取仪检测抗体。

除上述测定型式外，COVID-19MIA还可以使用以下的免疫测定试验来进行：基于荧光共振能量转移(FRET)或化学发光共振能量转移(CRET)的免洗涤免疫测定试验；基于使用纳米颗粒基信号检测步骤或使用微珠和亚微珠结合捕获抗体/抗原的信号增强性免疫测定试验；以及基于管内实验室技术或垂直微流控的快速多重免疫测定试验。

提供以下实施例以进一步举例说明本发明的实施方案，但不旨在限制本发明的范围。虽然它们是可使用的典型流程、方法或技术，但也可以替代地使用本领域技术人员已知的其他流程、方法或技术。

实施例

实施例1

COVID-19MIA

该COVID-19MIA型式涉及检测人暴露于SARS-CoV-2病毒后产生的IgG和/或IgM抗体(Ab)。

该型式将SARS-CoV-2结构蛋白(例如核衣壳蛋白(NP)、刺突蛋白(SP)和膜蛋白(MP))点斑到膜(例如，硝酸纤维素、尼龙；如PictArray^TM,美国专利号9625453)或无膜(例如聚苯乙烯微量滴定板)测定表面上。如表1所示，已经鉴定出用于开发COVID-19MIA的捕获抗原(Ag)和Ab以及检测Ab。

表1鉴定的待筛选用于COVID-19MIA的测定材料

图1总结了COVID-19MIA的通用测定型式。抗SARS-CoV-2的IgG和/或IgM抗体将通过间接IA检测(图1A)(图1B)。使用微阵列印刷机，将SARS-CoV-2结构蛋白(NP、SP和MP)以斑点形式印刷在单孔的测定表面上。而且，NP、SP和MP可以作为分开的离散斑点印刷，或全部三种病毒结构蛋白的混合物可以印刷为单个斑点。

COVID-19试剂盒涉及，将SARS-CoV-2结构蛋白印刷在测定表面(图2A)，然后用适当的封闭溶液封闭每个孔以消除任何非特异性结合(图2B)。所开发的印刷阵列，将与用于检测抗SARS-CoV-2的Ab的测定组分一起，提供给终端用户。还将提供内部阳性和阴性对照，其可与患者样品一起进行测试，以确保最佳测定性能。用于检测Ab的免疫测定试验(IA)流程涉及：向孔中加入经稀释的患者血清，并在37℃下孵育数十分钟，以便在Ag和Ab之间形成特异性免疫复合物，例如，IgG/IgM与SARS-CoV-2结构蛋白的结合(图2C)。然后通过用洗涤缓冲液洗涤孔来除去过量和非特异性结合的分析物。随后，向孔中加入HRP标记的检测Ab，例如抗人IgG/IgM HRP和抗NP HRP，并在37℃下孵育数十分钟(图2D)。它导致检测Ab和COVID-19分析物之间形成生物分子免疫复合物。随后是使用洗涤缓冲液的第二洗涤步骤，该步骤从孔中去除过量和非特异性结合的分析物。最后，向孔中加入HRP底物，并在室温下孵育几分钟。如果目标分析物存在于患者血清中，则它将通过酶底物反应后产生的比色产物的沉淀，导致比色阵列斑点的形成(图2E)。随后是使用洗涤缓冲液的第三洗涤步骤。在基于膜的IA的情况下，将使用3,3′-二氨基联苯胺(DAB)作为HRP底物，孵育后，用洗涤缓冲液洗涤孔，然后在分析前在37℃下干燥。但对于无膜IA，将使用沉淀的3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)溶液作为HRP底物，孵育后，在分析前洗涤孔一次。

COVID-19MIA导致形成比色斑点，其强度与患者样品中的Ab(IgG和/或IgM)浓度成正比。取决于所使用的测定表面，可以通过使用本地开发的手持式或便携式台式比色读取设备，对比色阵列进行成像。也可以通过商业比色读取仪读取，如可从德国Scienion AG获得的比色读取仪。

成像软件分析来自多重比色读取仪的图像，以检测来自每个孔的微阵列斑点，并生成输出结果。软件首先识别孔，然后检测每个孔内在MIA后出现的阳性对照斑点。阳性对照斑点作为对齐锚定物使用，软件使用其来放置用于每个孔内所有斑点的微阵列网格。然后，软件算法分析阵列的比色图像并提取每个斑点的像素强度。然后将从每个斑点产生的数据，与阵列布局和患者样品进行核对，以提供所分析样品的最终测试报告。此类成像软件的一个实例是

实施例2

COVID-19MIA-膜基、单孔

COVID-19MIA-膜基、单孔型式，使用16孔ArraySlide，其包含固定在每个孔底部作为测定表面的膜盘。SARS-CoV-2结构蛋白(NP、SP和MP)各自作为分开的斑点一式两份固定在每个孔中。

将患者样品稀释并加至ArraySlide，在37℃下孵育，然后用洗涤缓冲液洗涤。然后将HRP标记的抗人IgG和/或IgM检测Ab添加到ArraySlide的所有孔中。在37℃下孵育孔，然后洗涤，然后加入DAB底物。短暂孵育后，将孔洗涤一次，然后在分析前在37℃下干燥。

实施例3

COVID-19MIA-膜基、单孔、使用分组SARS-CoV-2结构蛋白

COVID-19MIA-膜基、单孔、使用分组SARS-CoV-2结构蛋白的型式，使用16孔ArraySlide，其包含固定在每个孔底部作为测定表面的膜盘。SARS-CoV-2结构蛋白(NP、SP和MP)的混合物一式两份固定在每个孔中。

将患者样品稀释并加至ArraySlide，在37℃下孵育，然后用洗涤缓冲液洗涤。然后将HRP标记的抗人IgG和/或IgM检测Ab添加到ArraySlide的所有孔中。在37℃下孵育孔，然后洗涤，然后加入DAB底物。短暂孵育后，将孔洗涤一次，然后在分析前在37℃下干燥。

实施例4

COVID-19MIA-无膜、单孔

COVID-19MIA(无膜、单孔)型式使用96孔微量滴定板作为测定表面。对于96孔板中的每个孔，SARS-CoV-2结构蛋白(NP、SP和MP)作为分开的斑点一式两份固定。

将患者样品稀释并加至该96孔板，在37℃下孵育，然后用洗涤缓冲液洗涤。然后将HRP标记的抗人IgG和/或IgM检测Ab添加到所有孔中。在37℃下孵育孔，然后洗涤，然后加入TMB底物。短暂孵育后，将孔洗涤一次，然后分析。

实施例5

COVID-19MIA-无膜、单孔、使用分组SARS-CoV-2结构蛋白

COVID-19MIA(无膜、单孔、使用分组SARS-CoV-2结构蛋白)型式，使用96孔微量滴定板作为测定表面。对于96孔板中的每个孔，SARS-CoV-2结构蛋白(NP、SP和MP)的混合物一式两份固定。

将患者样品稀释并加至该96孔板，在37℃下孵育，然后用洗涤缓冲液洗涤。然后将HRP标记的抗NP检测Ab和HRP标记的抗人IgG和/或IgM检测Ab的混合物添加到所有孔中。在37℃下孵育孔，然后洗涤，然后加入TMB底物。短暂孵育后，将孔洗涤一次，然后分析。

实施例6

自动化COVID-19MIA-无膜、96孔MTP

自动化MIA将在分析仪内进行，其中手动MIA中的所有步骤都将自动执行。试剂的分配和抽吸由附着到机械臂上的针头完成。测定组分将以即用型测定筒的形式提供，将该测定筒简单地插入分析仪中，即可进行多达100次的MIA测试。MTP孔的洗涤将由机械针头使用特定的洗涤程序完成。类似地，在每个分配步骤之后，洗涤针头。然而，也可以使用一次性吸头，这将避免在每个分配步骤之后清洁针头。IA的所有步骤都将针对自动化MIA进行优化。使用集成的比色读取仪和图像分析软件，进行经处理的96孔MTP中的比色阵列斑点的读取。分析仪将有一个用于放置患者样品瓶的专用区室、以及用于放置洗涤缓冲液、TMB底物和其他缓冲液的专用空间。分析仪需要进行每日、每周和每月维护。

实施例7

自动化的化学发光免疫测定试验(CLIA)

用于开发MIA的测定型式可进一步用于开发多重以及单重的自动化CLIA，用于诊断SARS-CoV-2感染。SARS-CoV-2的多种结构蛋白可以共价结合到顺磁珠(微米-亚微米大小)上，并用于通过间接免疫测定试验来检测针对SARS-CoV-2的IgG和IgM抗体。可以向磁珠提供多种结构蛋白的混合物，或者可以用每种结构蛋白分别包被磁珠的不同制剂，然后混合在一起用于测定。它可以是总IgG+IgM抗体测试，或者IgG和IgM可以分开检测。自动化CLIA情况下的检测信号，可以通过将检测抗体与吖啶或其他化学发光标记物偶联、并提供用于产生化学发光信号的适当触发溶液，来产生。所有自动化CLIA都使用高通量分析仪进行。测定试剂可以存储在可用于多达100次测试的测定筒中。缓冲液、洗涤溶液和触发溶液分别储存在分析仪的不同位置。患者样品瓶放置在分析仪内的专用位置，而测定/反应瓶作为耗材自动提供给每个CLIA测试。

实施例8

COVID-19ELISA

可以使用所开发的MIA流程，开发手动ELISA用于检测IgM和IgG，并定制ELISA的一些步骤。被动地或者使用基于硅烷化学的防浸生物分子固定流程(Vashist等,Sci Rep,4:4407,2014,DOI:10.1038/srep04407)，用NP、SP和/或MP的混合物包被96孔MTP。然后，除最后一步外，将完全按照MIA中的描述，实施用于IgG和IgM ELISA检测的所有免疫测定试验步骤。在ELISA的情况下，通过向HRP标记的检测Ab提供TMB和H₂O₂，通过酶-底物反应产生信号。通过提供包含1N H₂SO₄的终止溶液，终止酶-底物反应。然后以650nm为参照，读取比色溶液在450nm处的光密度。通过间接测定，进行IgG和IgM的检测。

材料：IgG检测试剂：SARS-CoV-2NP、SARS-CoV-2SP和山羊抗人IgG-HRP；NP；HRP标记的兔/小鼠抗SARS-CoV Ab(检测Ab)。

试剂设置：PBS：将BupH磷酸缓冲盐溶液包加到100mL高压灭菌DIW中，充分溶解并使用高压灭菌DIW将体积补足500mL。每个包装制备500mL pH为7.2的PBS，可在室温(RT)下储存一周，在4℃下储存至多四周。APTES：采购的APTES溶液纯度为99％，并临在与捕获抗HFAAb混合前，在高压灭菌DIW中重新配制成1％(v/v)APTES。

实施例9

COVID-19IgG/IgM ELISA

将COVID-19结构抗原溶液(NP、SP和/或MP的混合物)与0.5-2％(v/v)APTES以1:1(v/v)的比例混合。用100μL新配制的抗NP捕获Ab溶液在室温下孵育96孔MTP的每个所需孔30分钟。用300μL 0.1M PBS(pH 7.4)洗涤五次。也可以使用自动洗板机进行洗涤。(也可以通过在4℃下用Ab孵育过夜来被动固定Ab)。使用300μL 1-5％(w/v)BSA在37℃下封闭COVID-19Ag结合孔30分钟，然后进行充分的PBS洗涤(如前所述)。将100μL不同浓度的人IgG/IgM或患者血清/血浆样品(优化后确定的稀释度)添加到不同的BSA封闭孔中。在37℃下孵育1小时，并用PBS(如前所述)充分洗涤。在每个NP捕获孔中加入100μLHRP标记的抗人IgG/IgM检测Ab(200ng mL^-1)。在37℃下孵育1小时，并用PBS充分洗涤。向每个孔中加入100μL TMB-H₂O₂混合物，并在RT下孵育以显色15分钟。通过向每个孔加入50μL 1N H₂SO₄来终止酶-底物反应。在微孔板读取仪中以540nm作为参考波长测定450nm主波长下的吸光度。

实施例10

基于动力学的快速一步ELISA

如Vashist等,Biosensors and Bioelectronics 67,73-78,2015中所述，定制基于动力学的快速一步ELISA流程，用于检测IgG/IgM。

实施例16

使用顺磁珠的基于动力学的快速一步ELISA

如Vashist等,Analytical Biochemistry 456,32-37,2014中所述，使用顺磁珠，开发定制的基于动力学的快速一步ELISA流程，用于检测IgG/IgM。

实施例17

基于离心式微流控的自动化护理点免疫测定试验

如Czilwik等,RSC Advances 5(76),61906-61912,2015中所设想，使用顺磁珠，开发定制的基于离心式微流控的自动化护理点免疫测定试验流程，用于检测IgG/IgM。

实施例18

无洗涤免疫测定试验

可开发手动和自动无洗涤MIA用于检测IgG和IgM。作为实例，IgG/IgM的IA将涉及NP/SP/MP包被的供体磁珠与另一山羊/兔/小鼠抗人Ab包被的受体珠在样品中存在IgG/IgM的情况下的特异性生物分子相互作用，在供体磁珠和受体磁珠接近时，这将形成免疫复合物并产生化学发光信号。这种型式将大大减少测定持续时间和复杂性(不需要洗涤步骤)，并且具有高灵敏度和宽动态范围。

实施例19

COVID-19多重免疫测定试验(MIA)总结

该MIA型式涉及同时检测在暴露于SARS-CoV-2病毒后人体中产生的IgG抗体。该型式采用PictArray^TM技术，在无膜(即聚苯乙烯)测定表面上，点斑SARS-CoV-2结构蛋白(核衣壳蛋白(NP)、刺突蛋白(SP))。

图1总结了COVID-19MIA的总体测定型式。通过间接免疫测定试验，检测抗SARS-CoV-2的IgG抗体。使用微阵列印刷机，将SARS-CoV-2结构蛋白(NP和SP)作为斑点印刷在测定表面上，两种蛋白都印刷在同一测定孔内。而且，NP和SP可以作为分开的离散斑点印刷，也可以作为两种蛋白质的混合物印刷为单个斑点。

在测定表面印刷SARS-CoV-2蛋白后(图2A)，用适当的封闭溶液封闭每个孔，以消除任何非特异性结合(图2B)。测定分为三个不同的步骤，持续时间为1小时5分钟。在测定的第一步中，加入稀释的患者血清，并在37℃下孵育孔30分钟，以使目标分析物即IgG抗体与SARS-CoV-2蛋白结合(图2C)。用洗涤缓冲液洗涤孔以去除任何未结合的血清组分，然后进行第二步，加入HRP标记的检测抗体，即抗人IgG-HRP，并在37℃下孵育孔15分钟，以检测目标分析物(图2D)。第二次洗涤孔以去除任何未结合的检测抗体。在第三步中，加入HRP底物(沉淀的3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)溶液)，并在室温(21℃-25℃)下孵育孔20分钟，以允许血清中存在的目标分析物所结合的阵列斑点显色(图2E)。

实施例20

COVID-19MIA-膜基、SARS CoV-2结构蛋白一式两份印刷

COVID-19MIA中的印刷斑点显示为画线条的圆圈，其中具有特定线条的每个圆圈对应于印刷在膜或固体表面上的特定SARS-CoV-2结构蛋白(图7A-B)。白色圆圈表示该特定位置未印刷任何东西。

平板制备和点斑按如下进行。将每种抗原(SARS-CoV-2NP和SARS-CoV-2SP(S1))稀释在NP-40 0.05％(1体积的NP-40 0.05％，9体积的抗原)中，并在室温(20℃至25℃)下孵育15分钟，然后加入2X印刷缓冲液(2X PB)和RO水。对于SARS-CoV-2NP和SARS-CoV-2SP，最终溶液具有在1X印刷缓冲液(1X PB)中分别为200μg/ml和200μg/ml的抗原浓度。生物素化的山羊抗小鼠IgG用作阳性对照，以确认二抗溶液的加入，并帮助结果分析过程中图像分析软件的比对。在PB和RO水中以20μg/ml的浓度印刷生物素化山羊抗小鼠IgG。印刷缓冲液作为测定中的阴性对照印刷。它指示总体测定背景。将28μL每种制备的蛋白质和印刷缓冲液转移到384孔PCR板中进行印刷。使用Thomas^TM微阵列仪在以下条件下进行印刷：温度23℃，相对湿度56％。在印刷每个斑点之前，在RO水中清洗Pin。对印刷的阵列进行目检质量控制，以检查斑点定位和形态。然后将玻片在37℃下干燥30分钟。向每个玻片孔中加入75μL封闭溶液，并在37℃下孵育30分钟。将玻片倒置并轻敲以去除封闭溶液，并在37℃下干燥15分钟。干燥的玻片在2-8℃下储存在装有干燥剂的塑料盒中。

在使用之前，将玻片置于室温。将1体积的血清/血浆样品添加到9体积的测定稀释液(1:10稀释)中。将50μL稀释的样品分配到每个孔中，然后覆盖玻片(使用平板盖)，在37℃下孵育1小时，然后洗涤3次，每次洗涤每孔使用60μL洗涤溶液。通过倒置玻片去除多余液体。将50μL二抗(0.5μg/ml)添加到每个玻片孔中，然后将其覆盖并在37℃下孵育30分钟。每孔用60μL洗涤溶液洗涤玻片，进行三个洗涤步骤。通过倒置玻片去除任何多余的液体。将50μL在过氧化氢(H₂O₂)中稀释的DAB底物(19体积H₂O₂中的1体积DAB)添加到玻片的每个孔中，并在室温下避光孵育5分钟。然后通过倒置玻片并在吸水薄纸上轻敲，以去除DAB，使用洗涤溶液洗涤玻片一次，倒置，然后在37℃下干燥15分钟。使用PictImager^TM读取仪读取玻片，并在扫描玻片后通过软件自动处理数据。

针对第一个WHO国际抗SARS-CoV-2免疫球蛋白参考组，评估了COVID-19MIA，该参考组由五个对印刷在我们的平台上的NP和SP具有不同反应性的参考样品组成。使用SARS-CoV-2核衣壳蛋白作为靶标，参考组的测定信号与提供者所指示的反应性水平相关，即信号从高反应性样品到低反应性样品降低，而阴性样品没有反应性(图8)。

实施例21

COVID-19MIA-无膜、单孔

COVID-19MIA中的印刷斑点显示为画线条的圆圈，其中具有特定线条的每个圆圈对应于印刷在膜或固体表面上的特定SARS-CoV-2结构蛋白(图9A-B)。白色圆圈表示在该特定位置未印刷任何东西。

平板制备和点斑按如下进行。将每种抗原(SARS-CoV-2NP和SARS-CoV-2SP(S1))稀释在NP-40 0.05％(1体积的NP-40 0.05％，9体积的抗原)中，并在室温下孵育15分钟，然后加入2X印刷缓冲液(2X PB)和RO水。对于SARS-CoV-2NP和SARS-CoV-2SP，1X印刷缓冲液(1XPB)中最终溶液的抗原浓度分别为100μg/ml和200μg/ml。生物素化的山羊抗小鼠IgG用作阳性对照，以确认二抗溶液的加入，并帮助最终结果分析过程中图像分析软件的对齐。在PB和RO水中以20μg/ml的浓度印刷生物素化山羊抗小鼠IgG作为阳性对照。印刷缓冲液作为测定中的阴性对照印刷。它显示了总体测定背景。将28μL每种制备的蛋白质和印刷缓冲液转移到384孔PCR板中进行印刷。使用Thomas^TM微阵列仪在以下条件下进行印刷：温度21.6℃，相对湿度40-43％。在印刷每个斑点之前，在RO水中清洗Pin。对印刷的阵列进行目检质量控制，以检查斑点定位和形态，然后密封(石蜡膜)，并在2-8℃下孵育～22小时。向微量滴定板的每个孔中加入200μL封闭溶液，并在室温下孵育1小时。然后用300μL洗涤溶液洗涤平板三次。除去任何多余的液体，并使平板在室温下干燥20分钟。将干燥的平板密封并储存在2-8℃。

在使用之前，将平板置于室温。将一体积的血清/血浆样品添加到100体积的测定稀释液(1:101稀释)中。调整抗N蛋白重组人mAb IgG和抗刺突RBD人重组mAb IgG的稀释比，使每种Ab的终浓度为1μg/ml。通过多次抽吸和分配操作，将添加的样品与测定稀释液混合，在1.1ml试管中制备样品。然后将100μL的每个样品分配到微量滴定板上的特定孔中。然后密封平板(石蜡膜)，在37℃下孵育30分钟，然后洗涤平板3次，每次洗涤每个孔使用300μL洗涤溶液。通过轻敲平板去除任何多余液体。将100μL的二抗(0.2μg/ml)添加到微量滴定板的每个孔中，然后密封(石蜡膜)并在37℃下孵育15分钟，然后使用每个孔300μL的洗涤溶液进行平板洗涤，进行三个洗涤步骤。通过倒置并轻敲平板，去除任何多余的液体。向微量滴定板的每个孔中加入100μL Pierce一步超TMB印迹溶液，并在室温下避光孵育20分钟。然后通过将平板倒置在吸水薄纸上并轻敲来去除任何残留液体，以去除TMB。在5min内读取平板。使用sciREADER CL2和“R&D Imaging&Analysis”软件读取平板。在读取期间，相机焦点设置为270。基于孔的四个选定位置计算测定背景。

结果表明，用于清洁Pin的方法有效。清洁方法的效率如图10所示，其中在印刷缓冲液的地方没有出现有色斑点。

所使用的基于酪蛋白的封闭剂在防止孔内非特异性结合方面非常有效，同时保持斑点形态。这在图11D-E中得到了证明，其中将对两个印刷靶标均具有反应性的血浆样品与非反应性样品进行了比较。对于两种样品，孔中没有过量的背景；对于反应性样品，测定斑点与背景可以明显区分。

分析结果期间获得的信号由软件自动处理，软件计算每个斑点强度的平均值并减去背景(图10)。在孔底空气传播颗粒的存在偶尔会增加背景信号，在这些情况下，用72AU的绝对值作为背景中值。由于每种蛋白质在每个孔中一式两份印刷，因此用两个重复信号的中值作为孔强度。对于所呈现的结果，每个样品在两个孔中进行，因此结果是四个反应斑点(来自两个孔的重复斑点)的平均值。

使用抗-N蛋白重组人mAb IgG(抗-N蛋白mAb)和抗刺突RBD人重组mAb IgG(抗刺突RBD)，测试了该测定试验区分SARS-CoV-2核衣壳蛋白IgG抗体和抗-SARS-CoV-2刺突糖蛋白S1 IgG抗体的能力。在使用抗N蛋白mAb作为样品时，只有印刷了SARS-CoV-2核衣壳蛋白的测定斑点产生了阳性反应(图11B)。相反，在使用抗刺突RBD mAb作为样品时，只有具有抗SARS-CoV-2SP的测定斑点给出阳性反应(图11C)。

两个对照样品用于评价COVID-19MIA的性能。其中一个是抗SARS-CoV-2抗体，这是从症状后至少4周和恢复的COVID-19PCR确认阳性的患者采集的样品。此对照在SARS-CoV-2核衣壳蛋白和SARS-CoV-2刺突糖蛋白S1靶标上均显示出良好的反应性和小于10％的CV(表1)。第二个对照材料是抗SARS-CoV-2QC1，这是从两个已知SARS-CoV 2阳性的恢复期血浆Pack获得的样品。此样品显示出对SARS-CoV-2NP的强反应性，但对SARS-CoV-2SP的低反应性，结果显示对NP和SP靶标的CV均小于5％(表1)。

表1.一些阳性对照和第一个WHO国际抗SARS-CoV-2IgG(人)标准品的评估

使用第一个WHO国际抗SARS-CoV-2免疫球蛋白(人)标准品，对该测定进行评价。在两个靶标上获得的反应性都很高，然而SARS-CoV-2刺突糖蛋白S1的CV约为16％(表1)。尽管结果很有希望，但使用另一个参考组评估了该测定。第一个WHO国际抗SARS-CoV-2免疫球蛋白参考组由五个对NP和SP具有不同反应性的参考样品组成。用SARS-CoV-2刺突糖蛋白S1作为靶标，该参考组的测定信号与提供者所指示的反应性水平相关，即信号从高反应性样品到低反应性样品降低，而阴性样品没有反应性(图12)。

使用该NIBSC抗SARS-CoV-2验证组中的样品，将所开发的测定试验的性能与其他商业测定的性能进行了比较。该组包括37个样品，23个样品来自已知抗SARS-CoV-2阳性的恢复期血浆Pack，14个样品来自已知抗SARS-CoV-2阴性的恢复期血清Pack。所有样品均采用几种商业测定进行测试。所获得的结果总结在表2中。由于所开发的测定试验可以在单个孔中检测抗SARS-CoV-2核衣壳蛋白的IgG抗体和抗SARS-CoV-2刺突糖蛋白S1的IgG抗体，因此，将用每个靶标获得的结果与在其测定中使用相同靶标(对于NP和SP，即SARS-CoV-2NP和SARS-CoV-1SP(S1、S1/S2或S1-RBD))的商业测试进行比较。除Pictor测定外，表中报告的值取自NIBSC Panel的数据表。Pictor测定的值是两个重复的平均值。请注意，每个公司的值都不同，因为它们采用不同的读出机制，故无法进行比较。

对于两种病毒蛋白，23个阳性样品产生了非常强的信号，这可以与使用14个阴性样品获得的可忽略信号明显区分。所获得的结果与通过其他商业测试获得的结果相关。对于SARS-CoV-2NP斑点，阴性样品的信号低于3AU(任意单位)。唯一的例外是#34组，其具有5.8的信号，考虑到对于#16组从阳性样品获得的最低信号是52.3AU，该信号仍然非常低。而对于SARS-CoV-2刺突糖蛋白(S1)斑点，在任何测试的阴性样品上都没有获得反应性。

表2.对用于血清学测定的抗-SARS-CoV-2NIBSC验证组的评估。

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实施例22

COVID-19MIA-无膜、单孔、具有分组SARS-CoV-2结构蛋白

COVID-19MIA中的印刷斑点显示为画线条圆圈，其中具有特定线条的每个圆圈对应于印刷在膜或固体表面上的特定SARS-CoV-2结构蛋白(图13A-B)。白色圆圈表示该特定位置未印刷任何东西。

平板制备和点斑按如下进行。将1体积NP-40 0.05％添加到9体积由SARS-CoV-2NP&SARS-CoV-2SP(S1)制成的抗原溶液中。将该制备物在室温下孵育15分钟。随后向溶液中加入2X PB和所需体积的RO水，使得达到目标抗原和印刷缓冲液浓度。最终溶液在1X PB中含有100μg/ml的SARS-CoV-2NP和200μg/ml的SARS-CoV-2SP(S1)。生物素化山羊抗小鼠IgG用作阳性对照。它用于确定二抗溶液加到孔中，并帮助图像分析软件检测所印刷的阵列。它以20μg/ml的浓度印刷，这是通过在2X PB和RO水中稀释达到的。将印刷缓冲液同样印刷在阵列上，并用作测定的阴性对照。它指示印刷质量、仅由印刷缓冲液引起的背景强度以及总体测定背景。将28μL每种制备的蛋白质和印刷缓冲液转移到384孔PCR板中进行印刷。使用Thomas^TM微阵列仪进行印刷。印刷期间，阵列内部的温度为22.8℃，而湿度在40％之间。该阵列分三个步骤印刷：1)首先印刷斑点A1、C1、E1，然后依次印刷斑点A2和A3，以及E2、E3和E5。在印刷每个斑点之前，阵列仪在洗涤室中用RO水洗涤Pin，并在干燥室中干燥。连续的洗涤和干燥步骤进行三次，然后Pin进入下一个来源平板的孔中收集制备物并开始印刷相应的斑点。对所印刷的阵列进行目检质量控制，以确保斑点位于正确位置并具有良好的形态。然后用石蜡膜密封平板，并在冰箱中2-8℃下孵育约～19小时。封闭剂自制备日起储存在2至8℃之间(平均温度为4℃)。在使用前将其在室温下放置25分钟；同时在封闭前将平板在相同温度下放置5分钟。向微量滴定板的每个孔中加入200μL的封闭溶液，然后使用石蜡膜密封，并在室温下孵育1小时。随后，用300μL的洗涤溶液在洗板机上洗涤平板三次。然后将洗涤过的平板在吸水薄纸上轻敲以去除任何剩余的液体，并在室温下在生物安全柜中放置20分钟。将干燥的平板密封并储存在2-8℃的冰箱中。

在使用之前，将平板在室温下放置30分钟。将1体积的样品添加到100体积的测定稀释液(1:101稀释)中。然而，对抗N蛋白重组人mAb IgG和抗刺突RBD人重组mAb IgG，使用适当的稀释比，使每种Ab的终浓度为1μg/ml。通过多次抽吸和分配操作，将添加的样品与测定稀释液混合，在1.1ml管中制备样品。然后将100μL的每个样品分配到微量滴定板上的特定孔中。然后使用石蜡膜密封平板，并在37℃下孵育30分钟。随后，洗涤平板3次，每次洗涤每个孔使用300μL洗涤溶液。然后将洗涤后的平板在吸水薄纸上轻敲以去除任何残留液体。将100μL二抗(0.2μg/ml)添加到微量滴定板的每个孔中，然后使用石蜡膜密封，并在37℃下孵育15分钟。随后，洗涤平板3次，每次洗涤每个孔使用300μL洗涤溶液。然后将洗涤后的平板在吸水薄纸上轻敲以去除任何残留液体。向微量滴定板的每个孔中加入100μL Pierce一步超TMB印迹溶液，然后将其覆盖并在室温下避光孵育20分钟。然后通过倒置平板并在吸水薄纸上轻敲来去除任何剩余液体，以去除TMB，并在5分钟内读取。使用sciREADER CL2读取平板，并使用软件的“R&D Imaging&Analysis”部分读取平板。读取期间相机焦点为270。基于孔的四个选定位置计算测定背景。

结果表明，用于清洁Pin的方法有效。清洁方法的效率如图14所示，其中在印刷缓冲液的印刷位置没有出现有色斑点。

所使用的基于酪蛋白的封闭剂在防止孔内非特异性结合方面非常有效，同时保持斑点形态。这在图15D-E中得到了证明，其中测试了对两个印刷靶标均具有反应性的血浆样品和非反应性样品。对于两种样品，孔中没有过量的背景，且对于反应性样品，测定斑点与背景明显可区分。

分析结果期间获得的信号由软件自动处理，软件计算每个斑点强度的平均值并减去背景(图14)。孔底一些空气传播颗粒的存在可能会增加背景信号。对于这些情况，用72AU的绝对值作为背景中值。由于每种蛋白质在每个孔中一式两份印刷，因此用两个重复信号的中值作为孔强度。每个样品在两个孔中进行。因此，此处报告的值是这些重复的总结。

为了证明在样品仅为抗SARS-CoV-2核衣壳蛋白IgG抗体或抗SARS-CoV-2刺突糖蛋白S1 IgG抗体阳性的情况下该平台产生信号的能力，针对以下单克隆抗体进行了测试：抗N蛋白重组人mAb IgG(抗N蛋白mAb)和抗刺突RBD人重组mAb IgG(抗刺突RBD)。在使用抗N蛋白mAb(图15B)和抗刺突RBD mAb作为样品时，测定斑点均可见(图15C)。

使用了两个对照样品。抗-SARS-CoV-2抗体给出了CV小于10％的良好结果(表3)。类似地，抗SARS-CoV-2QC1也显示出良好的结果，CV约为12％(表3)。

表3.一些阳性对照和第一个WHO国际抗SARS-CoV-2IgG(人)标准品的评估。

使用第一个WHO国际抗SARS-CoV-2免疫球蛋白(人)标准品，对所开发的测定进行了评估，显示结果良好，CV约为12％(表3)。此外，还测试了第一个WHO国际抗SARS-CoV-2免疫球蛋白参考组。测定信号与提供者所指示的水平相关，即信号从高反应性组样品到低反应性组样品降低，而阴性样品没有信号。然而，重要的是，考虑样品的标准偏差(图16)。

使用该抗-SARS-CoV-2验证组中的样品，将所开发的测定的性能与其他商业测试的性能进行了比较。该组包括37个样品，其中23个样品来自已知抗SARS-CoV-2阳性的恢复期血浆pack，14个样品来自已知抗SARS-CoV-2阴性的恢复期血清pack。所有样品均采用几种商业测试进行测定。所获得的结果总结在表4中。由于所开发的测定可以在单个孔中检测抗SARS-CoV-2核衣壳蛋白的IgG抗体和抗SARS-CoV-2刺突糖蛋白S1的IgG抗体，因此将用每个靶标获得的结果与在其测定中使用相同靶标(对于NP和SP，即SARS-CoV-2NP和SARS-CoV-1SP(S1、S1/S2或S1-RBD))的商业测试进行比较。

对于两种病毒蛋白，23个阳性样品产生了非常强的信号，这可以与使用14个阴性样品获得的可忽略信号明显区分。所获得的结果与通过其他商业测试获得的结果相关。阴性样品的信号小于1AU。

除Pictor外，表中报告的值取自NIBSC Panel的数据表。Pictor的值是两个重复的平均值。请注意，每个公司的值都不同，因为它们采用不同的读出机制无，故无法进行比较。

表4.对用于血清学测定的抗-SARS-CoV-2验证组的评估。

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虽然已经参考上述实施例描述了本发明，但应理解，修改和变化包含在本发明的精神和范围之内。因此，本发明仅受以下权利要求书的限制。

Claims (29)

1.一种基底，在该基底上包含至少两个对SARS-CoV-2特异的捕获元件，每个捕获元件对应于并能够结合目标分析物，该基底还可选地包含多个对照元件，该对照元件包括：a)至少一个基准标记、b)至少一个用于监测背景信号的阴性对照、c)至少一个用于监测测定试验特异性的阴性对照、d)至少一个阳性比色对照、e)至少一个用于监测测定试验性能的阳性对照、及其任何组合。

2.权利要求1的基底，其中该捕获元件结合目标分析物，其中该目标分析物指示响应SARS-CoV-2感染而产生的抗体。

3.权利要求1的基底，其中该捕获元件选自蛋白质、蛋白质片段、肽、多肽、多肽片段、抗体、抗体片段、抗体结合结构域或其任何组合。

4.权利要求3的基底，其中该捕获元件选自SARS-CoV-2的膜蛋白(MP)、核衣壳蛋白(NP)、刺突蛋白(SP)或其任何组合。

5.权利要求3的基底，其中该目标分析物是SARS-CoV-2抗体、其片段或结合结构域。

6.权利要求1的基底，其中该目标分析物选自蛋白质、蛋白质片段、抗原、抗原决定簇、表位、半抗原、免疫原、免疫原片段、病毒蛋白或其任何组合。

7.权利要求6的基底，其中该捕获元件是病毒结构蛋白或其表位。

8.权利要求7的基底，其中该病毒结构蛋白或其表位选自SARS-CoV-2的膜蛋白(MP)、核衣壳蛋白(NP)、刺突蛋白(SP)、其片段或其任何组合。

9.权利要求4或7的基底，其中该病毒结构蛋白或其表位是核衣壳/刺突/膜蛋白或其片段。

10.权利要求1的基底，其中该基底是固体或多孔基底。

11.权利要求10的基底，其中该固体基底是顺磁珠、微量滴定板、微粒或磁珠。

12.权利要求10的基底，其中该多孔基底是膜。

13.用于检测样品中的多种目标分析物的试剂盒，其包含a)权利要求1的基底以及可选的b)降背景试剂和c)比色检测系统中的一者或两者。

14.权利要求13的试剂盒，其进一步包含选自以下的一项或多项：a)洗涤溶液，b)用于检测结合到捕获元件的抗原、配体或抗体或用于检测阳性对照的一种或多种抗体，c)用于分析所捕获的目标分析物的软件，以及d)用于测量样品中目标分析物的存在的流程。

15.权利要求14的试剂盒，其中用于检测的抗体包括抗体-结合蛋白(BP)缀合物、抗体-酶标记缀合物或其任何组合。

16.权利要求14的试剂盒，其中该样品是血液样品。

17.权利要求16的试剂盒，其中该血液样品是血清或血浆。

18.权利要求13的试剂盒，其中该基底是固体或多孔基底。

19.权利要求18的试剂盒，其中该固体基底是顺磁珠、微量滴定板或微粒。

20.权利要求18的试剂盒，其中该多孔基底是膜。

21.检测个体中响应SARS-CoV-2感染而产生的抗体的方法，其包括：

使权利要求1的基底与来自该个体的生物样品接触，其中该个体疑似患有COVID-19或暴露于SARS-CoV-2；并检测响应SARS-CoV-2感染而产生的抗体的存在。

22.权利要求21的方法，其中该检测方法是比色、吸光度、化学发光或荧光信号。

23.权利要求21的方法，其中该检测方法是电化学、表面等离子体共振、局部表面等离子体共振或干涉测量。

24.权利要求21的方法，其中该抗体是IgG和/或IgM。

25.权利要求21的方法，其中该样品是血液样品。

26.权利要求27的方法，其中该血液样品是血清或血浆。

27.用于处理微阵列的方法，其包括：

a)提供权利要求1的基底；

b)向该基底加入至少一个样品；和

c)处理该基底，使得通过i)至少一个基准标记、ii)至少一个阳性比色对照和iii)至少一个用于监测测定试验性能的阳性对照中的两个或多个给出可检测结果。

28.用于检测样品中分析物的方法，其包括提供权利要求1的基底、向该基底加入至少一个样品，并处理该基底，使得提供可检测结果。

29.权利要求28的方法，其中该可检测结果包括至少一个基准标记、至少一个阳性比色对照和至少一个用于样品中分析物检测的阳性对照中的两个或多个。